ICS65.020DB6111楊凌農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)示范區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)Technicalstandardforvirusidentificationinkiwifruitse楊凌示范區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB6111/T172—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》起草。本文件由西北農(nóng)林科技大學(xué)提出。本文件由楊凌示范區(qū)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：西北農(nóng)林科技大學(xué)、陜西省農(nóng)村科技開發(fā)中心。本文件起草人：趙磊、徐明、劉佩、吳云鋒、雷玉山。本文件由西北農(nóng)林科技大學(xué)和陜西省農(nóng)村科技開發(fā)中心負(fù)責(zé)解釋。聯(lián)系人：趙磊聯(lián)系方式系地址：楊凌示范區(qū)邰城路3號(hào)DB6111/T172—20211獼猴桃病毒鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了獼猴桃病毒鑒定技術(shù)的術(shù)語和定義、檢測(cè)對(duì)象、取樣部位、抽樣、鑒定方法和判定規(guī)本文件適用于楊凌示范區(qū)獼猴桃母本樹、獼猴桃苗木的病毒鑒定。環(huán)境相似的獼猴桃產(chǎn)區(qū)可參照?qǐng)?zhí)2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1獼猴桃母本樹stockplantofkiwifruit提供獼猴桃種條或建外植體所需要幼嫩枝條的獼猴桃母株。3.2獼猴桃苗木Kiwifruitseedling經(jīng)扦插、嫁接、組培等方式繁育的獼猴桃種苗。3.3逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Reversetranscription-polymerasechainreaction（RT-PCR）提取獼猴桃檢材的總RNA，以其中的mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。4檢測(cè)對(duì)象獼猴桃主要病毒：a)獼猴桃病毒A（ActinidiavirusA,AcVA）；b)獼猴桃病毒B（ActinidiavirusB，AcVB）；c)獼猴桃病毒C（ActinidiavirusC，AcVC）；d)獼猴桃褪綠環(huán)斑相關(guān)病毒（Actinidiachloroticringspot-associatedvirus,AcCRaV）；2DB6111/T172—2021e)黃瓜花葉病毒（cucumbermosaicvirus,CMV）；f)蘋果莖溝病毒（applestemgroovingvirus,ASGV）；g)馬鈴薯X病毒（potatovirusX,PVX）；h)柑橘葉斑駁病毒（citrusleafblotchvirus，CLBV）；i)獼猴桃病毒1（Actinidiavirus1，AcV-1）；j)獼猴桃褪綠環(huán)斑病毒(Actinidiayellowingringspotvirus,AYRSpV）；k)獼猴桃黃化病毒1（Actinidiayellowingvirus1,AcYV1）；l)獼猴桃黃化病毒2（Actinidiayellowingvirus2,AcYV2）；m)獼猴桃種傳潛隱病毒（Actinidiaseed-bornelatentvirus,ASbLV)。4.1抽樣4.1.1猴桃母本樹每株均需檢測(cè)。4.1.2出圃苗木采用5點(diǎn)取樣法隨機(jī)抽取。1萬株以內(nèi)抽檢100株（含1萬株）；1萬株～10萬株（含10萬株），首個(gè)1萬株抽100株，之后每增加1萬株增檢50株，不足1萬株按1萬株計(jì)；超過10萬株，第1萬～10萬株按上述方法抽樣，之后每增加1萬株增檢20株，不足1萬株按1萬株計(jì)。5取樣部位生長(zhǎng)季節(jié)取幼嫩葉片放置于自封袋內(nèi)，4℃保存不超過24h或放置于-80℃長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?；休眠季?jié)剪下枝條，撕開表皮用小刀刮取1g左右韌皮部組織，立即使用或放置于-80℃保存?zhèn)溆谩?鑒定方法6.1雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（DAS-ELISA法）詳見附錄A。6.2逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT-PCR法）詳見附錄B。7判定規(guī)則酶聯(lián)免疫檢測(cè)或RT-PCR檢測(cè)呈陽性反應(yīng)的判定為攜帶病毒。脫毒母本樹帶毒率為0、出圃苗木帶毒率≤3.0%判定為合格苗木。DB6111/T172—20213（規(guī)范性附錄）雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（DAS-ELISA法）A.1溶液配制A.1.1所用化學(xué)試劑均為分析純級(jí)規(guī)格，用水為蒸餾水。A.1.2抽提緩沖液抽提緩沖液的配制見表A.1。表A.1抽提緩沖液的配制g溶于900mL蒸餾水中，用鹽酸將溶液pH值調(diào)整到8.2，再用蒸餾水定容至1000mL，4℃下A.1.3洗滌緩沖液洗滌緩沖液的配制見表A.2。表A.2洗滌緩沖液的配制g磷酸氫二鈉（NaHPO）磷酸二氫鉀（KHPO）溶于900mL蒸餾水中，用鹽酸將溶液pH值調(diào)整到7.4，再用蒸餾水定容至1000mL，4A.1.4包被緩沖液包被緩沖液的配制見表A.3。DB6111/T172—20214表A.3包被緩沖液的配制gA.1.5酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液的配制見表A.4。表A.4酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液的配制gA.1.6底物緩沖液底物緩沖液的配制見表A.5。表A.5底物緩沖液的配制A.1.7底物溶液秤取5mg4-硝基苯基磷酸二鈉鹽（PNP）溶解于5mL底物緩沖液，現(xiàn)配現(xiàn)用。A.2操作步驟A.2.1樣品制備取待檢樣品0.4g，加入2mL抽提緩沖液，用研缽研磨至無可見顆粒的糊狀，4℃,10000rpm離心10min，取上清液備用。A.2.2包被抗體用抗體包被緩沖液，按相應(yīng)病毒抗體稀釋倍數(shù)稀釋。酶標(biāo)板每孔加入120μL抗體稀釋液，37℃保濕孵育2h或4℃保濕過夜。DB6111/T172—20215A.2.3洗板用洗滌緩沖液浸泡洗滌抗體孵育的酶標(biāo)板3次，每次3min～5min。A.2.4包被樣品酶標(biāo)板每孔加110μL制備的樣品，37℃保濕孵育2h或4℃保濕過夜。同時(shí)設(shè)陰性、陽性和空白對(duì)照，設(shè)置3次重復(fù)。陽性對(duì)照為含有目標(biāo)病毒的材料；陰性對(duì)照為不含有目標(biāo)病毒的健康獼猴桃葉片；空白對(duì)照為包被緩沖液。A.2.5洗板同A.2.3。A.2.6包被酶標(biāo)抗體用酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液按照酶標(biāo)抗體說明書的稀釋倍數(shù)將其稀釋，每加樣孔加100μL經(jīng)過稀釋的酶標(biāo)抗體，37℃保濕孵育2h或4℃保濕過夜。A.2.7洗板同A.2.3。A.3加底物酶標(biāo)板每孔加入90μL底物溶液，室溫避光反應(yīng)1h。A.4終止反應(yīng)酶標(biāo)板每孔加入3mol/L的NaOH溶液50μL終止反應(yīng)。A.5酶聯(lián)檢測(cè)用酶標(biāo)儀檢測(cè)終止反應(yīng)的酶標(biāo)板，讀取405nm的光吸收值（OD405），記錄數(shù)據(jù)。A.5.1判斷規(guī)則按照表A.6判定結(jié)果：表A.1結(jié)果判定（檢測(cè)樣品OD-空白對(duì)照OD）/（陰性對(duì)照OD-空白對(duì)照OD）注：疑似陽性樣品用RT-PCR法核驗(yàn)檢測(cè)確定DB6111/T172—20216（規(guī)范性附錄）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT-PCR法）B.1試劑盒B.1.1植物RNA提取試劑盒：選擇適合提取含有多糖多酚材料的RNA試劑盒。B.1.2反轉(zhuǎn)錄試劑盒：使用市售的商品反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明進(jìn)行操作。B.1.3PCR擴(kuò)增試劑盒：使用市售的商品PCR擴(kuò)增試劑盒，按照說明進(jìn)行操作。病毒PCR檢測(cè)特異性引物見表B.1表B.1獼猴桃病毒的特異性引物CACCTGCTTCTCACAAACAAAAACAACTCAACAGAAACGCACTTCCCTGAAGTAGACAGAATAcVAFAcVARAGATCCAACCCAGAGTTGAAGTTAAGTGCTCTYGGRGGTGCCATCTATATCTCAACAGCCATCCAAGAATTCCTTAACAGCCCGCTGTTGGATTTGATAGGAATTTCACACGACTCCTAACGAGTCGTGCGTTTTCTTTGTAATGGCGAGGGTTTTATTGAGAGTGCGCGAGGTTTACCAAB.3操作步驟B.3.1獼猴桃RNA提取DB6111/T172—20217B.3.1.1提取方法按照試劑盒操作說明書提取。B.3.1.2判定規(guī)則采用電泳法檢測(cè)，RNA有兩條條帶，條帶清晰明亮；紫外分光光度計(jì)測(cè)得OD260/OD280比值2.0以上、濃度50ng/μL以上的，以此為模板直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或置于-80℃條件下保存。不符合以上指標(biāo)的需重新提取。B.3.2逆轉(zhuǎn)錄按照試劑盒操作說明書提取。B.3.3病毒檢測(cè)B.3.3.1PCR擴(kuò)增B.3.3.1.1PCR的反應(yīng)體系在PCR反應(yīng)管中依次加入12.5μL2×MIX、病毒特異性檢測(cè)上下游引物各1μL、cDNA模板0.5μL、無菌蒸餾水10μL，PCR反應(yīng)體系為25μL。目標(biāo)病毒對(duì)應(yīng)檢測(cè)引物見表B.1。B.3.3.1.2PCR反應(yīng)程序?qū)CR管放入PCR儀中，95℃3min；進(jìn)行35次循環(huán)（95℃30s，52℃30s，72℃50s72℃5min，取出PCR反應(yīng)管，采用凝膠電泳法檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。B.3.3.2電泳檢測(cè)制備1%的瓊脂糖凝膠，每個(gè)泳道加入10μL的PCR產(chǎn)物，100V恒壓電泳30min。B.3.3.3凝膠成像分析電泳結(jié)束后