(19)國家知識產(chǎn)權(quán)局(10)申請公布號CN120082601A(21)申請?zhí)?02510578990.5(22)申請日2025.05.07(71)申請人江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院50號(74)專利代理機構(gòu)北京東方盛凡知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11562A61P31/14(2006.01)C12N15/113(2010序列表(電子公布)附圖4頁(54)發(fā)明名稱一種低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用(57)摘要本發(fā)明公開了一種低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。該構(gòu)建方法包括將豬流行性腹瀉病毒AH2012/12的S蛋白的第1347和1348位氨基酸突變成絲氨酸，構(gòu)建得到重組病毒的步驟；該重組病毒即為低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒。本發(fā)明通過評估該重組病毒的免疫原性，結(jié)果顯示重組病毒能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的PEDVS蛋白IgG抗體和中和抗體，且產(chǎn)生抗體水平在免疫28天后超過其親本毒株AH2012/12。這些結(jié)果說明重組病毒的2個棕櫚?；揎椢稽c能讓抗體水平升高，是AB21.一種低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒的構(gòu)建方法，其特征在于，包括將豬流行性腹瀉病毒AH2012/12的S蛋白的第1347和1348位氨基酸突變成絲氨酸，構(gòu)建得到重組病毒的步驟；所述重組病毒即為所述低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9基因編輯方法將所述第1347和1348位氨基酸突變成絲氨酸。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因編輯方法包括以pBAC-AH2012/12感染性克隆質(zhì)粒為模板，用引物C1347+1348S-F和C1347+1348增得到片段1,用引物C1347+1348S-M-F和C1347+1348S-M-R擴增得到片段2;以所述片段1和所述片段2為模板，用引物C1347+1348S-F和C1347+1348S-M-R擴增得到利用sgRNA-F和sgRNA-R,對pBAC-AH2012/12感染性克隆質(zhì)粒進行CRISPR/Cas9體外切通過同源重組方式，將所述目的片段克隆至所述酶切產(chǎn)物中，得到重組質(zhì)粒；將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至宿主細胞，得到所述低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒；所述sgRNA-F和所述sgRNA-R的核苷酸序列所述C1347+1348S-F、所述C1347+1348S-RM-R的核苷酸序列分別如SEQIDNO.4-7所示。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9體外切割的反應(yīng)體克隆質(zhì)粒2-5μg,無菌無酶水補充至50μL;和/或所述CRISPR/Cas9體外切割的反應(yīng)條件為37℃孵育2.5h。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述同源重組的反應(yīng)體系為：2×無縫所述同源重組的反應(yīng)條件為50℃孵育15-30min。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述宿主細胞為非洲綠猴腎細胞。7.一種根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒。8.一種如權(quán)利要求7所述的低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒在制備豬流行性腹瀉減毒疫苗中的應(yīng)用。9.一種豬流行性腹瀉減毒疫苗，其特征在于，活性成分包括權(quán)利要求7所述的低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的豬流行性腹瀉減毒疫苗，其特征在于，所述豬流行性腹瀉減毒疫苗還包括疫苗佐劑。3一種低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]豬流行性腹瀉(PorcineEpidemicDiarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)引起的高度傳染性腸道疾病，以仔豬急性水樣腹瀉、嘔吐和可達80%-100%的高死亡率為特征。[0003]PEDV的S蛋白是介導(dǎo)病毒入侵和誘導(dǎo)中和抗體的關(guān)鍵靶點，其S1亞基負責(zé)與豬腸體水平與免疫保護效果呈正相關(guān)。因此，基于S蛋白的疫苗開發(fā)成為研究重點。當(dāng)前市售疫苗(如滅活疫苗或傳統(tǒng)減毒株)存在免疫原性不足或毒力返祖風(fēng)險?；诖耍_發(fā)新的PEDV減毒株是非常必要的。[0004]近年來，反向遺傳學(xué)技術(shù)被用于構(gòu)建PEDV重組病毒，通過靶向修飾毒力相關(guān)基因?qū)崿F(xiàn)可控減毒。然而，現(xiàn)有技術(shù)仍面臨一些問題：一是過度減毒(如刪除整個S蛋白結(jié)構(gòu)域)會導(dǎo)致病毒復(fù)制能力喪失無法有效激活體液免疫，部分突變雖能維持免疫原性但減毒效果不穩(wěn)定；二是多數(shù)研究聚焦于S蛋白的糖基化修飾，對其余修飾研究較少。[0005]蛋白質(zhì)需要經(jīng)過多個復(fù)雜過程后才具有生理功能，包括基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后修飾及轉(zhuǎn)運等。其中翻譯后修飾(PTM)是指蛋白質(zhì)合成后由特定酶催化的一種共價修飾，以共價鍵的形式在蛋白質(zhì)的一個或多個氨基酸殘基上添加相應(yīng)的官能團，從而在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶解度、活性、穩(wěn)定性、亞細胞定位和介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用方面發(fā)揮重要作用。N-豆蔻?；?N-Myristoylation)、棕櫚酰化(Palmitoylation)和法尼基化(Farnesylation)。根據(jù)連接方式，棕櫚?；煞譃镹-棕櫚?；?-棕櫚?；蚐-棕櫚?；皟煞N類型是不可逆修飾，而S-棕櫚酰化是唯一一種可逆的脂質(zhì)化修飾，因此文獻報道的棕櫚?；揎椫饕荢-棕櫚?；-棕櫚?；揎検侵搁L鏈脂肪酸(通常是指16個碳的棕櫚酸)通過硫酯鍵共價修飾到蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基上，可以通過棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶和棕櫚酰[0006]目前已有研究表明，嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)、嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)、小鼠肝炎冠狀病毒(MHV)都存在棕櫚?；鞍?。CEMcBride等突變了SARS-CoVS蛋白上9個可能棕櫚酰化的半胱氨酸殘基后，發(fā)現(xiàn)S蛋白的穩(wěn)定性、定位、轉(zhuǎn)運以及與M蛋白的互作不受影響，但病毒的膜融合功能被抑制.Li?；瘜τ诓《窘M裝至關(guān)重要。迄今為止，對SARS-C究證明SARS-CoV-2的S蛋白在C15處和細胞質(zhì)尾部均被棕櫚?；?，且對于S介導(dǎo)的合胞體形4成和SARS-CoV-2假病毒顆粒進入至關(guān)重要；有研究發(fā)現(xiàn)2-BP能降低SARS-CoV-2膜融合能力及病毒感染力有研究發(fā)現(xiàn)E蛋白棕櫚?；笫刮寰垠w兩邊的靜電力更有利于吸引并釋放腔內(nèi)的陽離子到細胞膜。而關(guān)于PEDV的棕櫚酰化研發(fā)明內(nèi)容[0007]本發(fā)明的目的是提供一種低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。該低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒的2個棕櫚?；揎椢稽c能讓抗體水平升高，是減弱病毒復(fù)制能力的重要靶點。本發(fā)明為豬流行性腹瀉病毒減毒新疫苗研發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。[0009]本發(fā)明提供一種低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒的構(gòu)建方法，包括將豬流行性腹瀉病毒AH2012/12的S蛋白的第1347和1348位氨基酸突變成絲氨酸，構(gòu)建得到重組病毒的步驟；所述重組病毒即為所述低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒。[0010]進一步地，采用CRISPR/Cas9基因編輯方法將所述第1347和1348位氨基酸突變成絲氨酸。[0011]進一步地，所述CRISPR/Cas9基因編輯方法包括以下步驟：[0012]以pBAC-AH2012/12感染性克隆質(zhì)粒為模板，用引物C1347+1348S-F和C1347+1348S-R擴增得到片段1,用引物C1347+1348S-M-F和C1347+1348S-M-R擴增得到片段2;得到目的片段；[0014]利用sgRNA-F和sgRNA-R,對pBAC-AH2012/12感染性克隆質(zhì)粒進行CRISPR/Cas9體[0015]通過同源重組方式，將所述目的片段克隆至所述酶切產(chǎn)物中，得到重組質(zhì)粒；[0016]將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至宿主細胞，得到所述低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒；[0018]所述C1347+1348S-F、所述C1347+1348S-1348S-M-R的核苷酸序列分別如SEQIDNO.4-7所示。μL,sgRNA-F和sgRNA-R各10μL,pBAC-AH2012/12感染性克隆質(zhì)粒2-5μg,無菌無酶水補充[0020]所述CRISPR/Cas9體外切割的反應(yīng)條件為37℃孵育2[0021]進一步地，所述同源重組的反應(yīng)體系為：2×無縫克隆[0022]所述同源重組的反應(yīng)條件為50℃孵育15-30min。[0023]進一步地，所述宿主細胞為非洲綠猴腎細胞。[0024]本發(fā)明還提供一種根據(jù)上述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒。[0025]本發(fā)明還提供上述的低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒在制備豬流行性腹瀉減毒疫苗中的應(yīng)用。5[0026]本發(fā)明還提供一種豬流行性腹瀉減毒疫苗，活性成分包括上述的低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒。[0027]進一步地，所述豬流行性腹瀉減毒疫苗還包括疫苗佐劑。[0028]本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：[0029]本發(fā)明通過靶向設(shè)計2條sgRNA對AH2012/12全基因BAC重組質(zhì)粒進行切割及同源重組，將S蛋白能發(fā)生棕櫚?；揎椀牡?347和1348位半胱氨酸突變成了絲氨酸，獲得了重組BAC質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至Vero細胞，拯救出S蛋白棕櫚?；揎椢稽c突變的重組病毒r12-C1347+1348S。經(jīng)病毒基因序列分析、間接免疫熒光試驗、空斑試驗及生長曲線測定等證明該重組病毒株拯救成功。通過小鼠實驗評估該重組病毒的免疫原性，結(jié)果顯示重組病毒株r12-C1347+1348S能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的PEDVS蛋白IgG抗體和中和抗體，且產(chǎn)生抗體水平在免疫28天后超過其親本毒株AH2012/12。這些結(jié)果說明r12-C1347+1348S突變的2個棕櫚?；揎椢稽c能讓小鼠血清中的抗體水平升高，是減弱病毒復(fù)制能力的重要靶點。本發(fā)明為PEDV減毒新疫苗研發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。附圖說明[0030]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。[0031]圖1為目的片段的電泳檢測圖；其中，A為擴增片段1和擴增片段2的電泳檢測圖；B為最終目的片段的電泳檢測圖；在A中，M:DL2000Marker;1:擴增片段1;2:擴增片段2;在B[0033]圖3為同源重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)陰性對照組；[0035]圖5為基因測序結(jié)果圖；[0036]圖6為間接免疫熒光鑒定結(jié)果圖；[0037]圖7為空斑生長試驗的結(jié)果圖；[0038]圖8為生長曲線測定結(jié)果圖；具體實施方式[0040]現(xiàn)詳細說明本發(fā)明的多種示例性實施方式，該詳細說明不應(yīng)認(rèn)為是對本發(fā)明的限制，而應(yīng)理解為是對本發(fā)明的某些方面、特性和實施方案的更詳細的描述。[0041]應(yīng)理解本發(fā)明中所述的術(shù)語僅僅是為描述特別的實施方式，并非用于限制本發(fā)明。另外，對于本發(fā)明中的數(shù)值范圍，應(yīng)理解為還具體公開了該范圍的上限和下限之間的每6個中間值。在任何陳述值或陳述范圍內(nèi)的中間值，以及任何其他陳述值或在所述范圍內(nèi)的中間值之間的每個較小的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨立地包括或排除在范圍內(nèi)。[0042]除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所述領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然本發(fā)明僅描述了優(yōu)選的方法和材料，但是在本發(fā)明的實施或測試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法和材料。本說明書中提到的所有文獻通過引用并入，用以公開和描述與所述文獻相關(guān)的方法和/或材料。在與任何并入的文獻沖突時，以本說明書的內(nèi)容為準(zhǔn)。[0043]在不背離本發(fā)明的范圍或精神的情況下，可對本發(fā)明說明書的具體實施方式做多種改進和變化，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。由本發(fā)明的說明書得到的其他實施方式對技術(shù)人員而言是顯而易見的。本發(fā)明說明書和實施例僅是示例性的。意指包含但不限于。[0048]豬流行性腹瀉病毒AH2012/12毒株、PEDVN單克隆抗體(PEDVNmAb)和非洲綠猴腎細胞(Vero)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)所提供。BAC質(zhì)粒載體由本實驗室保存。pBAC-AH2012/12感染性克隆質(zhì)粒是AH2012/12毒株的全基因BAC重組質(zhì)粒由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸行毒株S基因嵌合毒株的構(gòu)建[J/OL].中國獸醫(yī)科學(xué)，1-8[2025-04-30].”中公開。NEB10-beta感受態(tài)細胞購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。0.25%胰酶、胎牛血清(FBS)、MEM(2×)Mix)和總RNA小提試劑盒購自Vazyme公司；2×無縫克隆重組酶混合液(SeamLessCloningMix)購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；DNA純化試劑盒、膠回收試劑盒由廣州Omega公司Pyogenes)和T7RNA聚合酶購自NEB(北京)公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000、酵母提取物、胰蛋白胨購自賽默飛世爾科技公司；DAPI染液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體購自Beyotime公司；甲基纖維素購自Sigma公司。15只6周齡雄性BALB/c小鼠購自揚州大學(xué)動物實驗中心。HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自abcam公司；單組份TMB顯色液生物科技有限公司；硫酸購自科龍化工試劑廠；吐溫20購自索萊寶公司。[0049]1.2引物序列[0050]以pBAC-AH2012/12感染性克隆質(zhì)粒為模板，設(shè)計特異性的引導(dǎo)RNA(sgRNAs)來靶分別得到sgRNA-F和sgRNA-R的雙鏈DNA形式，其中scafold-oligo用于提供sgRNA-F和min,35個循環(huán)，72℃5min,4℃循環(huán)。生成長度約100bp的雙鏈DNA。使用DNA純化試劑盒7(OmegeaBio-Tek,廣州，中國)按照說明書分別對擴增產(chǎn)物進行純化。[0051]以pBAC-AH2012/12感染性克隆質(zhì)粒為模板，設(shè)計一對特異性引物C1347+1348S-F和C1347+1348S-R擴增片段1,設(shè)計特異性引物C1347+1348S-M-F和C1347+1348S-M-R擴增片段2,最后以片段1和片段2為模板，用C1347+1348S-F和C1347+1348S-M-R擴增出最終目的片引物名稱核苷酸序列(5’-3’)AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTAAAGCTTCGTAAGGTTGAAGTCTAGGACCCCTACAAC[0054]1.3含有突變的目的片段擴增[0055]以pBAC-AH2012/12感染性克隆質(zhì)粒為模板，用特異性引物C1347+1348S-F和C1347+1348S-R擴增片段1,用特異性引物C1347+1348S-M-F和C1347+1348S-M-R擴增片段2,最后以片段1和片段2為模板，用特異性引物C1347+1348S-F和C1347+1348S-M-R擴增出最終目的物。[0058]使用Cas9核酸酶對pBAC-AH2012/12感染性克隆質(zhì)粒進行體外切割。PCR產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。反應(yīng)體系如下：NE緩沖液(NEBufferr3.1)(10×)5μL;Cas9酶5[0059]1.5同源重組及連接轉(zhuǎn)化[0060]使用同源重組酶，連接含有單點突變的DNA片段(即1.3部分?jǐn)U增得到的最終目的片段)和酶切純化后的線性化BAC質(zhì)粒(即1.4部分切割后的pBAC-AH2012/12質(zhì)粒)。反應(yīng)體20min(時間控制在15-30min,可達相同效果)。連接完成后于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。把NEB10-beta感受態(tài)細胞置于冰水混合體系中，使其緩緩融化后，在超凈工作臺環(huán)境下，將完成連接操作的產(chǎn)物悉數(shù)添加至感受態(tài)細胞內(nèi)。隨后，輕輕彈擊離心管，促使兩者均勻混合，再將其置于冰水中靜置30min。靜置結(jié)束后，迅速將感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移至溫度設(shè)定為42℃的水浴鍋中，進行50s的熱激處理。再重新置于冰水混合物中冰水浴2min后，加入600μL無抗8全被平板吸收后，倒置放于37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。[0061]1.6菌液PCR鑒定及重組質(zhì)粒提取[0062]從平板上挑單菌落，放渾濁后使用引物PEDV-F和PEDV-R進行菌液PCR.將有條帶的PCR產(chǎn)物送至生工測序。選擇測序鑒定正確的單菌落擴增并進行質(zhì)粒大提，按照QIAGENLargeConstructkit說明書進[0063]1.7含突變的BAC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染拯救[0064]提前一天用Vero細胞鋪六孔板，長滿70%后轉(zhuǎn)染6μg1.6部分提取得到的重組質(zhì)12000rpm離心10min,收集上清得到重組病毒，即低復(fù)制能力的豬流行性腹瀉病毒(命名為r12-C1347+1348S),-80℃保存。[0065]1.8間接免疫熒光測定[0066]長滿Vero細胞的24孔板感染MOI=0.01的重組病毒，24h后棄上清。細胞用固定液稀釋),37℃孵育1.5h后棄液；PBS洗滌，每孔加入500μL的FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1:2000稀釋),37℃避光孵育1h;PBS洗3次后，熒光顯微鏡觀察，判定結(jié)果。[0068]將六孔板中長滿單層的Vero細胞的培養(yǎng)液棄掉，用無血清DMEM清洗Vero細胞兩次。將重組病毒分別進行10倍稀釋，從10?1直至10??,不同稀釋度的病毒液各取500μL感染次，最后加入2mL空斑固定液覆蓋Vero細胞。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h,每日觀察細胞條件下避光染色1-2h,棄掉結(jié)晶紫染料，觀察空斑形態(tài)。[0069]1.10病毒半數(shù)組織細胞感染劑量(TCID??)測定h內(nèi)觀察病變。按Reed-Muench法計算[0071]1.11生長曲線鑒定[0072]用MOI=0.01的親本毒和10株重組病毒感染Vero細胞的24孔板，在接毒后6h、12h、24h和36h四個時間點分別收毒，并設(shè)置3個重復(fù)孔。在37℃培養(yǎng)箱中孵育1.5h,棄掉病續(xù)培育。分別在感染后6h、12h、24h和36h收集細胞上清液，測定其TCID?0根據(jù)所測得的病毒TCID??繪制各個病毒毒株的生長曲線。[0073]1.12重組病毒小鼠試驗設(shè)計[0074]將重組病毒株r12-C1347+1348S、親本毒株AH2012/12分別接種6周齡BALB/c小鼠，同時設(shè)立DMEM接種的陰性對照組，探究突變PEDVS蛋白棕櫚酰化位點的病毒的免疫原性變化，從而為理解PEDV的致病機制和開發(fā)新型疫苗提供重要線索。小鼠試驗設(shè)計如表2所示。9將親本株AH2012/12以及重組病毒r12-C1347+1348S都稀釋到1×105.50TCID?/mL,免疫當(dāng)疫前采血檢測小鼠血清中抗體水平，首免后記為第0天，首免后第14天采血并進行第二次免疫，首免后第28天采血并進行第三次免疫，首免后42天采血并進行第四次免疫，首免后56天進行終末采血和處死。用ELISA測定小鼠血清中抗體水平。表2小鼠試驗設(shè)計組別5552.1含有突變的目的片段擴增+1348S-R擴增片段1,用特異性引物C1347+1348S-M-F和C1347+1348S-M-R擴增片段2,最后以片段1和片段2為模板，用特異性引物C1347+1348S-F和C1347+1348S-M-R擴增出最終目的片段。最終目的片段長約1000bp(圖1)。[0081]使用NEB公司的Cas9核酸酶對pBAC-AH2012/12感染性克隆質(zhì)粒進行體外切割。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(圖2)顯示，切割出約1000bp的條帶。[0082]2.3同源重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后菌液PCR鑒定[0083]含有突變的擴增產(chǎn)物通過同源重組方式克隆至切割后的pBAC-AH2012/12線性質(zhì)平板進行篩選。挑取5個單菌落使用PEDV-F和PEDV-R引物進行PCR鑒定。電泳結(jié)果(圖3)顯示，5個菌落在1000bp左右出現(xiàn)較亮的條帶，與預(yù)期相符。[0084]2.4嵌合重組病毒的拯救、序列分析及IFA鑒定[0085]將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Vero細胞，36h后細胞出現(xiàn)合胞體病變(圖4),說明拯救成功。工生物測序，結(jié)果(圖5)顯示序列正確，第1347、1348位半胱氨疫熒光試驗結(jié)果確定該病毒為PEDV(圖6)。[0086]2.5重組病毒生物學(xué)特性比較[0087]空斑試驗結(jié)果(圖7)顯示，重組病毒r12-C1347+1348S形成空斑的能力比親本毒AH2012/12相對較弱，空斑面積更小。生長曲線檢測結(jié)果(圖8)顯示，重組病毒r12-C1347+1348S的病毒滴度較親本毒AH2012/12而言顯著下降，在12hpi下降約2個滴度。[0088]2.6小鼠血清抗體水平的檢測[0089]在免疫接種后的14、28、42及56日進行尾靜脈采血并制備血清樣本。實驗采用豬流行性腹瀉病毒刺突蛋白(PEDVS)進行96孔板抗原包被，通過間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)定量檢測實驗組小鼠血清中S蛋白特異性免疫球蛋白G(IgG)的抗體動態(tài)變化。結(jié)果(圖9)顯示，親本毒AH2012/12和重組病毒r12-C1347+1348S與陰性對照組相比，都誘導(dǎo)了高水平的S