基因工程1.闡明重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具的作用。2.闡明基因工程的基本操作程序，理解PCR過程、原理及引物設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)。3.識(shí)別并分析電泳圖譜，進(jìn)行DNA、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)鑒定的判斷。4.通過加深基因工程中核心技術(shù)難點(diǎn)的理解，運(yùn)用所學(xué)解決具體問題。學(xué)習(xí)目標(biāo)

（2023山東卷，T25）科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J-V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測(cè)，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。（1）與圖甲中啟動(dòng)子結(jié)合的酶是____________。除圖甲中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有

（答出2個(gè)結(jié)構(gòu)即可）。（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物___________。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的_____________（填“a鏈”或“b鏈”）相應(yīng)部分的序列相同。（3）重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)相應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了__________，條帶2所檢出的蛋白______________（填“是”或“不是”）由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。

RNA聚合酶限制酶切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)等F2和R1或F1與R2

a鏈

J-V5融合蛋白不是【真題體驗(yàn)】

基因工程的操作工具基因表達(dá)載體PCR擴(kuò)增目的基因中引物的選擇目的基因的檢測(cè)與鑒定2.右圖所示PCR三次循環(huán)的過程，據(jù)圖分析。（1）PCR過程為什么需要引物？引物的本質(zhì)？（2）如何設(shè)計(jì)引物？（3）擴(kuò)增目的基因時(shí),如果目的基因位于片段的中間，至少經(jīng)過幾次循環(huán)才能得到等長(zhǎng)的目的基因？(4)如何用電泳鑒定PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物？考點(diǎn)1利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因圖1瓊脂糖凝膠電泳圖2聚丙烯酰胺凝膠電泳?規(guī)律方法引物的選?。?種，序列不同（而且不能互補(bǔ)），分別與兩條母鏈互補(bǔ)。每對(duì)引物延伸方向相對(duì)（每條均從5’端向3’端）。(2020·北京，12)為了對(duì)重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動(dòng)子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中(如圖)。為檢測(cè)獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因，同時(shí)避免內(nèi)源HMA3基因的干擾，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)選擇的引物組合是A.①＋③ B.①＋②C.③＋② D.③＋④★例題11.為研究干旱脅迫基因LEA和VOC對(duì)甘藍(lán)型油菜油脂的積累機(jī)制，科研人員構(gòu)建了兩個(gè)基因表達(dá)載體。其中基因LEA與熒光素酶基因（Luc）

構(gòu)建成基因表達(dá)載體甲，基因VOC和標(biāo)記基因構(gòu)建成基因表達(dá)載體乙，相關(guān)序列及酶切位點(diǎn)如圖所示。箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向。(1)利用PCR擴(kuò)增LEA基因時(shí)，需要在引物的______（填“3'端”或“5'端”）添加限制酶識(shí)別序列。(2)為了構(gòu)建基因表達(dá)載體甲，依據(jù)圖中已知堿基序列，在PCR擴(kuò)增儀中加入的引物的堿基序列為____________________________________________________________。

5'端

5'-GATATCATGGGC-3'和5'-TCTAGACTAGTG-3'

★[對(duì)點(diǎn)訓(xùn)練]2.利用重疊延伸PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變可以實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素酶基因進(jìn)行合理性改造，其過程如下圖所示。下列分析不正確的是()A.PCR1過程中的產(chǎn)物AB是依賴引物a和引

物b擴(kuò)增的結(jié)果B.引物c和引物b上均含有與模板鏈不能互

補(bǔ)的堿基C.①過程需要先加熱至90℃以上后再冷卻

至50℃左右D.②過程需要利用引物a和引物d獲得突變產(chǎn)物ADD★[拓展延伸]考點(diǎn)2基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.為什么不直接把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，而要用載體？使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2.在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，需要用到哪些工具？(2021·山東，25節(jié)選)人類γ基因啟動(dòng)子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變?cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對(duì)γ基因表達(dá)的抑制，可對(duì)某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療?？蒲腥藛T擴(kuò)增了γ基因上游不同長(zhǎng)度的片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測(cè)，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。(1)為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，需在引物末端添加限制酶識(shí)別序列。據(jù)圖可知，在F1～F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是______，在R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是________。本實(shí)驗(yàn)中，從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過程共需要____種酶。SalⅠEcoRⅠ6考點(diǎn)2基因表達(dá)載體的構(gòu)建★例題2構(gòu)建基因表達(dá)載體注意問題[歸納總結(jié)]1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。2.導(dǎo)入目的基因，可能存在于細(xì)胞質(zhì)中，也可能集合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進(jìn)入雜草或其他作物中，造成“基因污染”?？键c(diǎn)3將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞真核生物的基因有內(nèi)含子，原核生物沒有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列的機(jī)制，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列不能被切除，因此無法表達(dá)出該蛋白原核生物缺少高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，無法對(duì)真核生物的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的加工3.當(dāng)將真核生物的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后直接導(dǎo)入原核生物的細(xì)胞時(shí)：（1）若無法獲得該蛋白，原因可能是什么？（2）若可以獲得該蛋白，但是蛋白質(zhì)無活性，原因可能是？檢測(cè)方法完成思考討論（P3下）。?規(guī)律方法（1）載體進(jìn)入受體細(xì)胞的檢測(cè)：主要依據(jù)標(biāo)記基因的正常功能。含有載體的細(xì)胞具有相應(yīng)的抗生素抗性、熒光標(biāo)記等，否則無。（2）重組DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的檢測(cè)：主要依據(jù)標(biāo)記基因的完整情況。重組DNA的標(biāo)記基因因插入目的基因被破壞喪失功能，未插入則具有正常功能。如抗生素抗性、熒光標(biāo)記、LacZ輔助序列等。考點(diǎn)4目的基因的檢測(cè)與鑒定RNA聚合酶BamHI和SacⅠ將強(qiáng)啟動(dòng)子和P基因帶入玉米細(xì)胞并整合到玉米細(xì)胞染色體DNA上潮霉素al、a2、a3玉米株系的P蛋白表達(dá)量顯著高于野生型玉米

【課堂小結(jié)】1．（2023湖北,T4）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒），并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落D

【當(dāng)堂達(dá)標(biāo)】

2.現(xiàn)有一長(zhǎng)度為3000堿基對(duì)(bp)的線性DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，進(jìn)行凝膠電泳，使降解產(chǎn)物分開。用酶H單獨(dú)酶切，結(jié)果如圖1。用酶B單獨(dú)酶切，結(jié)果如圖2。用酶H和酶B同時(shí)酶切，結(jié)果如圖3。該DNA分子的結(jié)構(gòu)及其酶切圖譜是()

A電泳條帶表示不同長(zhǎng)度的DNA片段！BCD選項(xiàng)與用酶B單獨(dú)酶切結(jié)果不符!說明有2個(gè)酶B切口3.(2021全國(guó)乙卷，T38)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中_________________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中_________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。EcoR

Ⅰ、Pst

ⅠEcoRⅠ、Sma

Ⅰ、Pst

Ⅰ、EcoRⅤ(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是

。(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征。如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能

；質(zhì)粒DNA分子上有

，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是__________