(19)國家知識產(chǎn)權(quán)局(12)發(fā)明專利(72)發(fā)明人余輝楊玉婷曾強(qiáng)moleculesensingbyactivelytunibindingkineticsforultrasebiomarkerdetectione2120379119.審查員李若琳(74)專利代理機(jī)構(gòu)上海弼興律師事務(wù)所31283ss本發(fā)明公開了一種基于外力調(diào)控的單分子成像系統(tǒng)獲得單分子成像信息并分析所述目標(biāo)21.一種單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，其使用外力調(diào)控模塊來調(diào)節(jié)目標(biāo)分子與“檢測探針、捕獲探針和納米顆?！敝g的結(jié)合與解離，并采用單分子成像系統(tǒng)獲得單分子成像信息并分析所述目標(biāo)分子的動態(tài)；其中，所述捕獲探針的末端與目標(biāo)分子的頭部互補(bǔ)，所述目標(biāo)分子的末端與檢測探針互補(bǔ)；所述捕獲探針或檢測探針與所述納米顆粒形成納米顆粒復(fù)合物；當(dāng)所述納米顆粒復(fù)合物與目標(biāo)分子結(jié)合后，在所述外力調(diào)控模塊驅(qū)動下被牽引到檢測探針或捕獲探針附近，與所述捕獲探針或檢測探針特異性結(jié)合，再在所述外力調(diào)控模塊驅(qū)動下被提拉離開所述檢測探針或捕獲探針；其中，所述外力調(diào)控模塊包括電場調(diào)控、磁力調(diào)控和非接觸力發(fā)生裝2.如權(quán)利要求1所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述電場調(diào)控使用雙電極或力調(diào)控使用電磁鐵或永磁體；所述非接觸力發(fā)生裝置包括光鑷、聲鑷、熱泳和原子力顯微鏡所述外力調(diào)控模塊施加的外力范圍在0.01-1000pN。3.如權(quán)利要求2所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，電場調(diào)控使用電化學(xué)工作4.如權(quán)利要求2所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述磁力調(diào)控使用鎳鉻磁鐵或磁鑷。5.如權(quán)利要求2所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述外力調(diào)控模塊施加的外力范圍在20-60pN。6.如權(quán)利要求1所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述目標(biāo)分子包括蛋白和核酸；和/或，所述捕獲探針和檢測探針包括與所述目標(biāo)分子結(jié)合的任意化學(xué)物質(zhì)。7.如權(quán)利要求1所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述捕獲探針和檢測探針包括與所述目標(biāo)分子結(jié)合的任意代謝產(chǎn)物。8.如權(quán)利要求1所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述捕獲探針和檢測探針包括天然或工程化的抗體、核酸和適配體。9.如權(quán)利要求1所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述單分子成像系統(tǒng)包括10.如權(quán)利要求9所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述SPRi的結(jié)構(gòu)包括物鏡耦合型SPRi和棱鏡耦合型SPRi;和/或，所述SPRi的光源包括SLED光源或600-800nm的激光11.如權(quán)利要求10所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述物鏡耦合型SPRi為物12.如權(quán)利要求11所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述物鏡耦合型SPRi為全13.如權(quán)利要求10所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述SPRi的結(jié)構(gòu)為棱鏡耦合型SPRi;和/或，所述納米顆粒的粒徑為50nm~300nm。14.如權(quán)利要求13所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述納米顆粒的粒徑為315.如權(quán)利要求10所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述棱鏡耦合型SPRi為Kretschmann棱鏡耦合結(jié)構(gòu)。16.如權(quán)利要求1~15任一項所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述捕獲探針或檢測探針吸附于檢測芯片。17.如權(quán)利要求16所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，當(dāng)所述目標(biāo)分子為核酸時：所述捕獲探針末端的12~25個核苷酸與目標(biāo)分子一端的核苷酸互補(bǔ)，目標(biāo)分子另一端的核苷酸與檢測探針互補(bǔ)；或，所述捕獲探針和檢測探針其中之一為鎖核酸，另一端被生物素修飾的單鏈核酸ssDNA,所述納米顆粒為鏈霉親和素包被的納米顆粒；當(dāng)所述目標(biāo)分子為蛋白或小分子時：所述檢測探針為與目標(biāo)分子結(jié)合的抗體，所述捕獲探針為與所述目標(biāo)分子牢固結(jié)合的抗體。18.如權(quán)利要求17所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，當(dāng)所述目標(biāo)分子為蛋白或小分子時，所述檢測探針為Fc端修飾了生物素的抗目標(biāo)分子的抗體，所述捕獲探針為Fc端生物素功能化的抗體。19.如權(quán)利要求18所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，當(dāng)所述目標(biāo)分子為蛋白或小分子時，所述捕獲探針與目標(biāo)分子的結(jié)合常數(shù)k。≥101?M1s?1,解離常數(shù)kof≤0.0002s1,解離平衡常數(shù)KD≤0.2fM;檢測探針與目標(biāo)分子的結(jié)合常數(shù)k。n≤5×108M1s1,解離常數(shù)kof≥0.05s?1;解離平衡常數(shù)KD≥1.56pM。20.如權(quán)利要求16所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，(1)所述檢測芯片的制備包括以下步驟：在鍍有2-3nm鉻和47nm金的玻片上，先除去表面顆粒雜質(zhì)并提升金膜平整度，再將檢測腔室或硅基細(xì)胞培養(yǎng)板固定在金片表面并制成工作電極；其后，用還原溶液還原巰基修飾的檢測探針或捕獲探針、脫鹽并除去還原溶液，加入鈍化劑鈍化金片表面，清洗后加入還原后的檢測探針或捕獲探針并孵育；最后清洗并加入溶液減少非特異性吸附并清洗，即得(2)所述納米顆粒復(fù)合物的制備包括以下步驟：用鹽老化法制備核酸包被的納米金顆粒，即，將納米金顆粒與巰基還原后的捕獲探針用生物素-親和素系統(tǒng)制備核酸包被的納米顆粒，即，將鏈霉親和素包被的金納米顆粒用生物素-親和素系統(tǒng)制備抗體包被的納米顆粒，即，將鏈霉親和素包被的納米顆粒與所述(1)和(2)無先后次序。21.如權(quán)利要求20所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述檢測腔室為PDMS腔22.如權(quán)利要求20所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，在所述鹽老化法制備核酸包被的納米顆粒的步驟中，所述共孵育在梯度氯化鈉溶液中進(jìn)行。23.如權(quán)利要求22所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述梯度氯化鈉溶液的424.如權(quán)利要求23所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述梯度氯化鈉溶液每25.如權(quán)利要求20所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述用生物素-親和素系統(tǒng)制備核酸包被的納米顆粒為金納米顆粒。26.如權(quán)利要求20所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，在所述用生物素-親和素系統(tǒng)制備核酸包被的納米顆粒的步驟中，所述生物素功能化檢測分子為一端被生物素修飾的單鏈核酸ssDNA。27.如權(quán)利要求20所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，在所述用生物素-親和素系統(tǒng)制備核酸包被的納米顆粒的步驟中，所述共孵育在梯度氯化鈉溶液中進(jìn)行。28.如權(quán)利要求27所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述梯度氯化鈉溶液的29.如權(quán)利要求28所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述梯度氯化鈉溶液每30.如權(quán)利要求20所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述用生物素-親和素系統(tǒng)制備抗體包被的納米顆粒為金納米顆粒和磁納米顆粒。31.如權(quán)利要求20所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，其包括以下步驟：(a)將檢測芯片置于所述單分子成像系統(tǒng)的觀測位置，往檢測腔室中加入所述納米顆粒復(fù)合物和所述目標(biāo)分子；(b)使用所述外力調(diào)控模塊施加外力，以15-60FPS的幀率采集單分子的成像數(shù)據(jù)并分析所述目標(biāo)分子的動態(tài)：首先，對納米顆粒復(fù)合物施加吸引力加速目標(biāo)分子和納米顆粒復(fù)合物的擴(kuò)散；其后，對納米顆粒復(fù)合物施加斥力；調(diào)整目標(biāo)分子與檢測探針或捕獲探針之間(c)采集記錄SPRi數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行差分處理，得到去除背景噪聲的單分子成像信息；統(tǒng)計同一位置上顆粒結(jié)合和解離的信息，獲得每個分子的結(jié)合時間；最后，篩選出特異性結(jié)合占主導(dǎo)的結(jié)合時間內(nèi)的事件，進(jìn)行濃度響應(yīng)擬合，得到特異性更高的濃度響應(yīng)曲線。32.如權(quán)利要求31所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，在加入所述納米顆粒復(fù)合物和所述目標(biāo)分子前，先加入PBS緩沖液或SSC緩沖液或含300mMNaCl的Tris-HCL緩沖液。33.如權(quán)利要求32所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述SSC緩沖液為1×或234.如權(quán)利要求31所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，采集單分子的成像數(shù)據(jù)并分析所述目標(biāo)分子的動態(tài)的幀率為16.7或30FPS。35.如權(quán)利要求31所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述結(jié)合時間為25-25036.如權(quán)利要求31所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述結(jié)合時間為對總體結(jié)合時間分布進(jìn)行單指數(shù)擬合所得的估算值，通過origin-指數(shù)擬合-ExpGo1模型擬合而37.如權(quán)利要求31所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，當(dāng)所述外力調(diào)控模塊施加的外力為電場力時，施加-0.6v-+1.0v;5當(dāng)所述外力調(diào)控模塊施加的外力為磁場力時，使用12vDC、占空比25%、20s的電源驅(qū)動磁鑷，先對納米顆粒施加吸引力15min;后對納米顆粒施加斥力15min。38.如權(quán)利要求37所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，當(dāng)所述外力調(diào)控模塊施加的外力為電場力時，施加0.4V-+0.8V的電壓。39.如權(quán)利要求37所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，當(dāng)所述外力調(diào)控模塊施加的外力為電場力時，先使用正電場，對納米顆粒施加吸引力5min-20min;后使用負(fù)電場，對納米顆粒施加斥力10-45min。40.如權(quán)利要求39所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述正電場為0-0.8V;所述負(fù)電場為-0.4-0V。41.如權(quán)利要求40所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述正電場為+0.4V,負(fù)電場為-0.2V。42.如權(quán)利要求20所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，(1)所述檢測芯片的制備具有以下特征中的一種或多種：所述玻片為BK-4或BK-7玻片；使用洗液與氫焰除去表面顆粒雜質(zhì)并提升金膜平整度，所述洗液為食人魚洗液，或酒精和純水的組合；所述還原溶液為TCEP或DTT;所述鈍化劑為巰基聚乙二醇、巰基乙醇，或巰基聚乙二醇甲氧基和巰基聚乙二醇生物素的組合；所述清洗使用PBS;所述減少非特異性吸附使用巰基乙醇或BSA;捕獲探針或檢測探針與鈍化分子的比例為1:100-1:1000;和/或，所述捕獲探針或檢測探針的濃度為50nM;和/或，所述捕獲探針為鎖核酸單鏈。43.如權(quán)利要求42所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述還原溶液為5μM的44.如權(quán)利要求42所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述鈍化劑為1μM巰基聚乙二醇。45.如權(quán)利要求42所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述減少非特異性吸附46.如權(quán)利要求42所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述鎖核酸單鏈中，鎖核酸分子占單鏈的10~50%。47.如權(quán)利要求46所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述鎖核酸單鏈中，鎖核酸分子占單鏈的20%。48.一種檢測單分子動態(tài)的系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括：(i)如權(quán)利要求1~47任一項所述的單分子動態(tài)檢測方法中所定義的納米顆粒復(fù)合物；(ii)如權(quán)利要求1~47任一項所述的單分子動態(tài)檢測方法中所定義的檢測探針或捕獲探針。49.如權(quán)利要求48所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)還包括如權(quán)利要求16~47任一項所述的單分子動態(tài)檢測方法中所定義的檢測芯片；和/或，如權(quán)利要求1~47任一項所述的單分子動態(tài)檢測方法中所定義的單分子成像系統(tǒng)和/或所定義的外力調(diào)控模塊。50.如權(quán)利要求48或49所述的系統(tǒng)在檢測單分子動態(tài)中的應(yīng)用。6一種基于外力調(diào)控的單分子動態(tài)檢測方法和系統(tǒng)技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢測、處理與分析領(lǐng)域，涉及一種基于外力調(diào)控的單分子動態(tài)檢測方法和系統(tǒng)，用于低豐度蛋白、核酸和生物小分子的檢測。背景技術(shù)[0002]體外診斷技術(shù)(Invitrodiagnosis,IVD)在許多疾病和癌癥的早期診斷、預(yù)后檢測和治療評估中發(fā)揮著重要作用。目前臨床中80%以上的疾病診斷都依靠體外診斷技術(shù)。傳統(tǒng)IVD技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)的檢測限(limitofdetection,LoD)在pM水平(10小分子無法被傳統(tǒng)IVD技術(shù)檢出(J.Am.Chem.Soc.2019,141,1162-1170)。因此開發(fā)具有單分子水平(<pM)的超靈敏生物傳感器具有重大意義。單分子陣列SiMoA和單分子計數(shù)SMC是目前商業(yè)化最成功的單分子檢測技術(shù)，前者是在ELISA原理的基礎(chǔ)上，通過納米孔陣列技術(shù)構(gòu)建超低的反應(yīng)體系，實現(xiàn)單分子酶促反應(yīng)熒光信號的數(shù)字化檢測，其基本原理與數(shù)字PCR技術(shù)類似(NatureBiotechnology.2010,28,595-599);而后者則是通過將激光聚焦于艾里斑，提高熒光分子的光子產(chǎn)量來實現(xiàn)單分子的計數(shù)測量，相當(dāng)于一臺超靈敏的流式分子檢子檢測技術(shù)都存在一定的局限性，導(dǎo)致目前單分子檢測技術(shù)主要服務(wù)于實驗室，無法推廣到臨床IVD中。SiMoA技術(shù)的操作流程SMC的檢測通量不足，對光學(xué)系統(tǒng)和環(huán)境穩(wěn)定性要求嚴(yán)苛，且兩項技術(shù)的檢測時間普遍過久；這是因為目前的單分子檢測技術(shù)仍然無法突破傳統(tǒng)檢測的理論極限。在傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)中，檢測限依賴于抗體的親和力以及非特異吸附的抑制處理，同時在終點讀出檢測(Endpointreadoutassay),這帶來了濃度限制(concentrationlimit)和熱動力學(xué)限制(thermodynamicslimit)兩個關(guān)鍵問題，導(dǎo)致其檢測靈敏度在pg/mL水平。[0003]動態(tài)分析作為一種新型的檢測策略，有望突破單分子檢測的熱動力學(xué)限制，實現(xiàn)更靈敏的檢測，其原理在于在分子結(jié)合的熱力學(xué)平衡狀態(tài)下，分子的結(jié)合和解離事件仍在持續(xù)發(fā)生，對過程的持續(xù)記錄能實現(xiàn)檢測信號的放大，最終實現(xiàn)fM水平的檢測，優(yōu)于ELISA技術(shù)1000倍。[0004]遺憾的是動態(tài)分析尚不具有普適性，這是因為動態(tài)分析在免疫檢測中需要抗體與抗原能快速結(jié)合和解離，利用不斷反復(fù)的結(jié)合解離事件的累計實現(xiàn)信號放大，因此在免疫檢測中需要繁瑣的流程篩選合適的抗體(弱親和力，快速結(jié)合快速解離),而商用的抗體試劑往往對目標(biāo)蛋白的親和力很高，分子雖能快速結(jié)合但解離事件發(fā)生緩慢，進(jìn)而導(dǎo)致動態(tài)分析免疫檢測的耗時過長?；诓此善胶獾膯畏肿幼R別技術(shù)SiMREPS作為一種動態(tài)檢測技術(shù)，在檢測親和力易于調(diào)控的核酸檢測中實現(xiàn)了15-30分鐘的單分子檢測，檢測限達(dá)到了fM水平(NatureBiotechnology,2015,33,7,730-732),但該技術(shù)在蛋白檢測的應(yīng)用中受限于復(fù)雜的抗體篩選的流程以及不合適抗體導(dǎo)致的較長耗時(>2h)。[0005]隨著醫(yī)療水平的提升，社會對臨床診斷有了更高的要求，如對群眾的病毒攜帶檢7測需盡可能的快，傳統(tǒng)PCR難以滿足快速檢測的需求，目前國內(nèi)外所售賣的診斷試劑盒也基本依賴于對病毒的蛋白識別，檢測總時間在15-30分鐘以內(nèi)。當(dāng)前的單分子檢測技術(shù)總的檢4小時以上，動態(tài)檢測更是存在固有的檢測耗時問題。因此開發(fā)一種快速超靈敏的單分子檢測技術(shù)具有極大的研究意義和實踐價值。技術(shù)依賴于檢測芯片和聚焦成艾里斑的激光光源，其成本較高，不利于臨床IVD的運用。其適的親和力抗體來提升，但復(fù)雜的抗體篩選過程導(dǎo)致了該方法不具備普適性。最后，目前所有單分子檢測技術(shù)都存在檢測通量過低的問題，限制了其在臨床實踐中的推廣。發(fā)明內(nèi)容[0007]如背景所述，單分子檢測中目前存在兩個關(guān)鍵的科學(xué)問題急需解決，分別是濃度限制和熱動力學(xué)限制。濃度限制是由于單分子檢測中待檢測分子的濃度都低于pM水平，而待檢測分子抵達(dá)傳感器表面在低濃度下耗時更久(遠(yuǎn)大于60min,ELISA中為最可能低的檢測限一般過夜孵育)。此外就是熱動力學(xué)限制帶來的檢測極限，對于終點檢測來說，其檢測結(jié)果為讀出某一時刻(經(jīng)孵育后達(dá)到熱力學(xué)平衡態(tài))結(jié)合的目標(biāo)分子。其檢測極限可以定義為臨界濃度：在該濃度下無論平衡多久都無法檢測到一個待檢測分子。濃度限制可以通過微流控芯片技術(shù)加速目標(biāo)分子擴(kuò)散到傳感器表面，如SiMoA,但高精度的芯片加工帶來的是檢測芯片的成本高昂；熱動力學(xué)的限制SiMREPS技術(shù)已經(jīng)解決了一部分，其動態(tài)(過程)的檢測能真正的突破熱動力學(xué)檢測的理論極限，靈敏度比ELISA提高1000倍以上，但是受限于抗體篩選不具有普適性，且SiMREPS并未解決濃度限制帶來的孵育時間過久的問題。[0008]本發(fā)明所要解決的問題是：突破濃度限制和抗體篩選的瓶頸，開發(fā)出快速、超靈敏且高通量的一種基于外力調(diào)控的單分子動態(tài)檢測方法。[0009]本發(fā)明的第一方面提供了一種單分子動態(tài)檢測方法，其使用外力調(diào)控模塊來調(diào)節(jié)目標(biāo)分子與檢測探針、捕獲探針、納米顆粒之間的結(jié)合與解離，并采用單分子成像系統(tǒng)獲得單分子成像信息并分析所述待檢測分子的動態(tài)；[0010]其中，所述捕獲探針的末端與目標(biāo)分子的頭部互補(bǔ)，所述目標(biāo)分子的末端與檢測探針互補(bǔ)；所述捕獲探針或檢測探針與所述納米顆粒形成納米顆粒復(fù)合物；當(dāng)所述納米顆粒復(fù)合物與目標(biāo)分子結(jié)合后，在所述外力調(diào)控模塊驅(qū)動下被牽引到檢測探針或捕獲探針附近，與所述捕獲探針或檢測探針特異性結(jié)合，再在所述外力調(diào)控模塊驅(qū)動下被提拉離開所述檢測探針或捕獲探針。[0011]本發(fā)明中，捕獲探針、納米顆粒、檢測探針和目標(biāo)分子構(gòu)成了夾心體系。其中檢測探針和捕獲探針的位置可以互換，不會對檢測結(jié)果產(chǎn)生本質(zhì)影響。例如，當(dāng)捕獲探針與納米顆粒形成納米顆粒復(fù)合物時，檢測探針結(jié)合至檢測芯片上；當(dāng)檢測探針與納米顆粒形成納米顆粒復(fù)合物時，捕獲探針結(jié)合至檢測芯片上。[0012]在一些優(yōu)選的實施例中，所述外力調(diào)控模塊包括電場調(diào)控、磁力調(diào)控和非接觸力發(fā)生裝置。[0013]較佳地，所述電場調(diào)控使用雙電極、三電極電場發(fā)生裝置例如電化學(xué)工作站，工作8電極可選用的材料選自玻碳電極、鉑(Pt)、金(Au)、銀(Ag)、鉛(Pb)、導(dǎo)電玻璃(ITO)和汞(Hg),所述磁力調(diào)控使用電磁鐵或永磁體例如鎳鉻磁鐵或磁鑷，所述非接觸力發(fā)生裝置包[0014]所述外力調(diào)控模塊施加的外力范圍在0.01-1000pN例如20-60pN。[0015]此外，本發(fā)明中，捕獲探針又稱捕獲分子；檢測探針又稱檢測分子；目標(biāo)分子又稱待檢測分子。這些術(shù)語分別可以無差別地使用。[0016]在一些優(yōu)選的實施例中，所述目標(biāo)分子包括蛋白和核酸；和/或，所述捕獲探針和檢測探針包括天然或工程化的抗體、核酸和適配體，或與目標(biāo)分子結(jié)合的任意化學(xué)物質(zhì)或代謝產(chǎn)物。[0017]在一些優(yōu)選的實施例中，所述單分子成像系統(tǒng)包括SPRi、TIRFM、暗場成像和iSCAT;和/或，所述納米顆粒的粒徑為30nm-5μm,材質(zhì)選自包括但不限于納米硅、納米金、納米銀、聚苯乙烯和包被超順磁顆粒的二氧化硅磁珠。[0018]較佳地，所述SPRi的結(jié)構(gòu)包括物鏡耦合型SPRi和棱鏡耦合型SPRi,物鏡耦合型SPRi優(yōu)選物鏡式SPRM,例如全內(nèi)反射顯微鏡改建的物鏡式SPRM,棱鏡耦合型SPRi例如Kretschmann棱鏡耦合結(jié)構(gòu)；和/或，所述SPRi的光源包括SLED光源或600-800nm的激光光源；和/或，所述納米顆粒包括納米金或磁納米顆粒。本發(fā)明的物鏡耦合型SPRi的放大倍數(shù)通常為60～100倍。[0019]更佳地，所述SPRi的結(jié)構(gòu)為棱鏡耦合型SPRi;和/或，所述納米顆粒的粒徑為50nm~300nm,例如50nm、150nm或300nm。本發(fā)明的棱鏡耦合型SPRi的放大倍數(shù)通常為2～60倍，[0020]在一些優(yōu)選的實施例中，所述捕獲探針或檢測探針吸附于檢測芯片上。[0021]較佳地，當(dāng)所述目標(biāo)分子為核酸時：所述捕獲探針末端的12～25個核苷酸與目標(biāo)分子一端的核苷酸互補(bǔ)，目標(biāo)分子另一端的核苷酸與檢測探針互補(bǔ)；或，所述捕獲探針和檢測探針其中之一為鎖核酸，另一為生物素功能化的目標(biāo)分子例如一端被生物素修飾的單鏈核酸ssDNA,所述納米顆粒為鏈霉親和素包被的納米顆粒。本發(fā)明中，所述核酸可以為單鏈核酸，例如單鏈的DNA,RNA包括mRN酶或加熱等方法打開雙鏈，使其成為可檢測的單鏈DNA片段。[0022]當(dāng)所述目標(biāo)分子為蛋白或多肽或小分子時：所述檢測探針為與目標(biāo)分子結(jié)合的抗體，所述捕獲探針為與所述目標(biāo)分子牢固結(jié)合的抗體；優(yōu)選所述檢測探針為Fc端修飾了生物素的抗目標(biāo)分子的抗體，所述捕獲探針為Fc端生物素功能化的抗體。其中捕獲探針與目標(biāo)分子的結(jié)合常數(shù)k?≥101?m1s?1,解離常數(shù)k。f≤0.0002s?1,解離平衡常數(shù)KD≤0.2fM。檢測探針與目標(biāo)分子的結(jié)合常數(shù)k?！?×108M1s?1,解離常數(shù)k。f≥0.05s1;解離平衡常數(shù)KD≥1.56pM;標(biāo)準(zhǔn)情況下的分子結(jié)合自由能(standardfreeenergy)≥-12kcal/mol。[0023]生物小分子的化學(xué)探針的原理與對miRNA等核酸類目標(biāo)分子并無本質(zhì)區(qū)別，如對別構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子(allosterictranscriptionfactor,aTF)的檢測，aTF上存在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和小分子識別結(jié)構(gòu)域，小分子的結(jié)合能夠使aTF從特定的DNA序列上解離，通過競爭抑制的相互作用實現(xiàn)對生物小分子的檢測。[0024]在一些優(yōu)選的實施例中，(1)所述檢測芯片的制備包括以下步驟：[0025]在鍍有2-3nm鉻、47nm金的玻片上，先除去表面顆粒雜質(zhì)并提升金膜平整度，再將9檢測腔室例如PDMS腔室或硅基細(xì)胞培養(yǎng)板固定在金片表面并制成工作電極；其后，用還原溶液還原巰基修飾的檢測探針或捕獲探針、脫鹽并除去還原溶液，加入鈍化劑鈍化金片表面，清洗后加入還原后的檢測探針或捕獲探針并孵育；最后清洗并加入溶液減少非特異性[0026]上述步驟中，檢測芯片只吸附檢測探針和捕獲探針的其中之一。即，當(dāng)檢測芯片吸附有檢測探針時，捕獲探針與納米顆粒形成納米顆粒復(fù)合物；當(dāng)檢測芯片吸附有捕獲探針時，檢測探針與納米顆粒形成納米顆粒復(fù)合物。[0027](2)所述納米顆粒復(fù)合物的制備包括以下步驟：[0028]用鹽老化法制備核酸包被的納米金顆粒，即，將納米金顆粒與巰基還原后的捕獲探針或檢測探針共孵育，離心、重懸即得；優(yōu)選地，所述共孵育在梯度氯化鈉溶液例如50~維持鹽濃度不變孵育24h;或，[0029]用生物素-親和素系統(tǒng)制備核酸包被的納米顆粒例如納米金顆粒，即，將鏈霉親和素包被的金納米顆粒與生物素功能化檢測分子共孵育，離心、重懸即得；所述生物素功能化檢測分子例如一端被生物素修飾的單鏈核酸ssDNA;優(yōu)選地，所述共孵育在梯度濃度的氯化鈉溶液例如50～500mM中進(jìn)行；更優(yōu)選地，每隔4h提高50mM濃度，直至氯化鈉濃度達(dá)到500mM[0030]用生物素-親和素系統(tǒng)制備抗體包被的納米顆粒例如金納米顆粒和或磁納米顆粒，即，將鏈霉親和素包被的金納米顆粒與Fc端生物素功能化檢測抗體共孵育，離心、重懸即得。[0031]所述(1)和(2)無先后次序。[0032]在一些更優(yōu)選的實施例中，所述單分子動態(tài)檢測方法包括以下步驟：[0033](a)將制備好的檢測芯片置于所述單分子成像系統(tǒng)的觀測位置，往檢測腔室中加入所述納米顆粒復(fù)合物和所述目標(biāo)分子；優(yōu)選地，在加入所述納米顆粒復(fù)合物和所述目標(biāo)例如為1×或2×SSC緩沖液。[0034](b)使用所述外力調(diào)控模塊施加外力，以15-60FPS例如16.7或30FPS的幀率采集單分子的成像數(shù)據(jù)并分析所述目標(biāo)分子的動態(tài)：首先，對納米顆粒復(fù)合物施加吸引力加速目標(biāo)分子和納米顆粒復(fù)合物的擴(kuò)散；其后，對納米顆粒復(fù)合物施加斥力；調(diào)整目標(biāo)分子與檢測探針或捕獲探針之間的結(jié)合時間，所述結(jié)合時間為5-500s優(yōu)選25-250s。[0035]同樣地，調(diào)整所述結(jié)合時間時，只需調(diào)整目標(biāo)分子與檢測探針，或目標(biāo)分子與捕獲探針之間的結(jié)合時間。調(diào)整的目標(biāo)取決于納米顆粒復(fù)合物上結(jié)合的時檢測探針還是捕獲探[0036](c)采集記錄SPRi數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行差分處理，得到去除背景噪聲的單分子成像信息；統(tǒng)計同一位置上顆粒結(jié)合和解離的信息，獲得每個分子的結(jié)合時間；最后，篩選出特異性結(jié)合占主導(dǎo)的結(jié)合時間內(nèi)的事件，進(jìn)行濃度響應(yīng)擬合，得到特異性更高的濃度響應(yīng)曲線；優(yōu)選地，所述結(jié)合時間為對總體結(jié)合時間分布進(jìn)行單指數(shù)擬合所得的估算值，通過origin-指數(shù)擬合-ExpGo1模型擬合而來，迭代算法為正交距離回歸。[0037]在一些更優(yōu)選的實施例中，當(dāng)所述外力調(diào)控模塊施加的外力為電場力時，施加-0.6v-+1.0v例如-0.4V-+0.8V的電壓；較佳地，先使用正電場例如0-0.8V(不含0)優(yōu)選+0.4V,對納米顆粒施加吸引力5min-20min;后使用負(fù)電場例如-0.4-0V(不含0)優(yōu)選-0.2V,對納米顆粒施加斥力10-45min。[0038]本發(fā)明中，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在金表面施加過大的電壓時會發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致預(yù)期之外的實驗結(jié)果。如在小于-0.6v的電壓下，捕獲探針與金表面的Au-s鍵將被還原會巰基-SH。磁場力由電磁鐵或永磁體貢獻(xiàn)，磁場強(qiáng)度恒定，磁場力大小主要受磁鐵與粒子的距離(1-3cm,本發(fā)明優(yōu)選1.5cm)決定。[0039]當(dāng)所述外力調(diào)控模塊施加的外力為磁場力時，使用12vDC、占空比25%、20s的電源驅(qū)動磁鑷，先對納米顆粒施加吸引力15min;后對納米顆粒施加斥力15min。[0040]在一些具體的實施例中，(1)所述檢測芯片的制備具有以下特征中的一種或多種：所述玻片為BK-4或BK-7玻片；使用洗液與氫焰除去表面顆粒雜質(zhì)并提升金膜平整度，所述洗液為食人魚洗液，或酒精和純水；所述還原溶液為TCEP或DTT例如5μM的TCEP或0.1MDTT;所述鈍化劑為巰基聚乙二醇、巰基乙醇，或巰基聚乙二醇甲氧基和巰基聚乙二醇生物素，例如1μM巰基聚乙二醇；所述清洗使用PBS;所述減少非特異性吸附使用巰基乙醇或BSA,例如1μM巰基聚乙二醇；捕獲探針或檢測探針與鈍化分子的比例為1:100-1:1000;和/或，[0041]所述捕獲探針或檢測探針的濃度例如為50nM;和/或，[0042]所述捕獲探針為鎖核酸單鏈，例如鎖核酸分子占單鏈的10～50%優(yōu)選20%。[0043]本發(fā)明的洗液為具有強(qiáng)氧化性，可清潔玻片表面的有機(jī)物。其可以為無水乙醇和純水，也可以為食人魚洗液。食人魚洗液制備方法如下：用量筒量取70mL濃硫酸倒進(jìn)燒杯中，再用量筒量取30mL雙氧水，緩慢倒進(jìn)裝有濃硫酸的燒杯中，邊倒邊用玻棒攪拌。食人魚洗液能有效清潔玻片表面，有利于后續(xù)的探針修飾。[0044]本發(fā)明的檢測腔為具有抗氧化、抗水性和良好的熱穩(wěn)定性的帶孔模具，能較牢固的固定在鍍金芯片表面，必要時可以用環(huán)氧樹脂粘牢。所述檢測腔例如PDMS腔室的制備方法是用道康寧SYLGARDDC184,其中A、B膠以10:1體積比混合，抽真空后在37度烘箱中靜置[0045]由于ssDNA-SH和mEPG-SH等物質(zhì)的巰基能相互反應(yīng)變成雙硫鍵-S-S-,本發(fā)明的還原溶液目的是還原巰基-SH。考慮到還原溶液對修飾效果的影響，優(yōu)選為三-(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽TCEP和二硫蘇糖醇DTT,其中后者在運用中需要葡聚糖凝膠柱(比如NAP-25)進(jìn)行[0047]本發(fā)明的第二方面提供一種檢測單分子動態(tài)的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包括：[0048](i)如本發(fā)明的第一方面中所定義的納米顆粒復(fù)合物；[0049](ii)如本發(fā)明的第一方面中所定義的檢測探針或捕獲探針。[0050]較佳地，所述系統(tǒng)還包括如本發(fā)明的第一方面中所定義的檢測芯片；和/或，如本發(fā)明的第一方面所定義的單分子成像系統(tǒng)和/或如本發(fā)明的第一方面所定義的外力調(diào)控模塊。[0051]本發(fā)明的第三方面提供一種如本發(fā)明第二方面所述的系統(tǒng)在檢測單分子動態(tài)中的應(yīng)用。[0052]在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實[0056]2.通過外力調(diào)控解決了動態(tài)檢測方案中目標(biāo)分子例如抗體分子不具有普適性的附圖說明[0059]圖1為基于Kretschmann棱鏡耦合結(jié)構(gòu)的表面等離子體共振成像SPRi平臺改建的[0060]圖2為基于蒙特卡洛仿真得到的不同外力介導(dǎo)下的結(jié)合時間的概率分布：a.有外力下的勢壘0.048×K?T;b.無外力下的勢壘0.193×KT。[0064]圖6顯示了本發(fā)明的工作流程和miRNA的濃度響應(yīng)曲線：a.基于電場力調(diào)控下[0066]現(xiàn)有單分子動態(tài)分析技術(shù)受限于抗體的篩選不能成為一種通用的檢測技術(shù)去取代終點檢測，同時經(jīng)過復(fù)雜設(shè)計和篩選的抗體的弱親和力進(jìn)一步加劇了濃度限制的問題，案的核心原理在于運用外力去調(diào)控與納米顆粒結(jié)合的目標(biāo)分子與芯片表面的受體結(jié)合解能量為0.8×1021J,1KgT=4.1操縱分子(manipulatingagent)[0079]a)下方是修飾在芯片表面的捕獲探針，是能與目標(biāo)分子特異性牢固結(jié)合的受體探針。芯片表面除了捕獲探針外還有鈍化分子用來抑制非特異性吸附，兩者的比例在1:100-1:1000之間；[0080]b)中間是目標(biāo)分子(即待檢測分子),如低豐度蛋白、核酸和生物小分子。捕獲探針和檢測探針分別結(jié)合于目標(biāo)分子的不同位點，如捕獲探針和檢測探針分別結(jié)合在多肽的N端(N-terminus)和C端(C-terminus),若目標(biāo)分子是核酸，則分別結(jié)合在5'和3'端。[0081]c)上方采用能與目標(biāo)分子反復(fù)結(jié)合解離的探針作為檢測探針，檢測探針錨定在作為報告分子和操縱分子的納米顆粒上，通過報告分子實現(xiàn)對信號的放大，并借助外力調(diào)控以實現(xiàn)對目標(biāo)分子的快速超靈敏檢測；[0082]d)在構(gòu)建的夾心體系中，檢測探針和捕獲探針的位置可以互換，不會對系統(tǒng)產(chǎn)生本質(zhì)影響。[0083]3)本發(fā)明提出的表面等離子共振成像(Surfaceplasmonresonanceimaging,SPRi)技術(shù)可分為基于Kretschmann棱鏡耦合結(jié)構(gòu)搭建的SPRi,以及油鏡耦合結(jié)構(gòu)的物鏡式SPRM,其中棱鏡型SPRi具有大視野，能高通量的記錄目標(biāo)分子特異性結(jié)合解離帶來的信號放大，更加適合臨床實踐中對檢測技術(shù)的通量需求。為了實現(xiàn)大視野、高通量的單分子動態(tài)檢測，本發(fā)明對光路和檢測系統(tǒng)進(jìn)行了以下優(yōu)化：[0084]a)選用超輻射發(fā)光二極管SLED作為光源，相較于相干性極高的激光光源，SLED光源有著更少的相干條紋，為成像帶來了更純凈的背景。[0085]b)選用棱鏡耦合實現(xiàn)表面等離子共振SPR,有著比物鏡式耦合更大的視野，但其缺點是分辨率不足，因此棱鏡型SPRi往往更常用于對大量樣品(bulksolutionsample)的檢測。本發(fā)明通過光源改進(jìn)和差分的圖像處理，極大的提高了圖像的信噪比SNR,最終使棱鏡型SPRi能實時檢測到金納米顆粒(粒徑≥30nm)和磁納米顆粒(超順磁顆粒內(nèi)核，外殼二氧[0086]c)生物分子的相互作用(如核酸雜交和抗原抗體結(jié)合)需要在鹽溶液中進(jìn)行，而金納米顆粒在高鹽溶液中極其不穩(wěn)定。這是由于高鹽溶液下，金顆粒的德拜雙電層會被壓縮，顆粒間的穩(wěn)定性由此打破，這對本發(fā)明所提出的基于外力的動態(tài)檢測造成了極大干擾。為此，本發(fā)明優(yōu)選了合適的鹽濃度用于50nm和150nm的金納米顆粒的單分子動態(tài)檢測，在該濃度下，生物分子間的相互作用依然能進(jìn)行，同時金納米顆粒也能穩(wěn)定存在。[0087]d)在開源軟件imageJ上對數(shù)據(jù)進(jìn)行差分處理(后一幀減前一幀),即可得到去除背景噪聲的單分子成像信息，通過手動統(tǒng)計同一位置上顆粒結(jié)合和解離的信息，可以獲得每個分子的結(jié)合時間，進(jìn)一步篩選更符合特異性結(jié)合的結(jié)合壽命的事件進(jìn)行濃度響應(yīng)的擬合[0088]4)本發(fā)明提出的外力調(diào)控的力場發(fā)生裝置，為了滿足高通量的調(diào)控和低成本的要外力調(diào)控，原本高親和力的受體-目標(biāo)分子的結(jié)合時間會減少，有別于非特異結(jié)合的結(jié)合時間(<5s或>300s),能在一定時間內(nèi)觀察到反復(fù)的結(jié)合解離事件，實現(xiàn)了普適的動態(tài)檢測(圖[0089]5)為了驗證仿真結(jié)合及外力調(diào)控理論，先基于易于設(shè)計親和力的核酸鏈探針構(gòu)建了外力調(diào)控的單分子動態(tài)檢測，對25個堿基配對長度的核酸目標(biāo)分子和檢測探針施加-0.4V-+0.8V的電壓，通過分子對結(jié)合和解離的總事件以及分子結(jié)合時間的兩者的變化證明外力調(diào)控確實能起到調(diào)控分子運動及動力學(xué)行為的作用(圖4的a和b)。[0090]6)本發(fā)明基于外力調(diào)控的單分子動態(tài)檢測，涉及到對分子動力學(xué)參數(shù)的調(diào)節(jié)，而研究分子相互作用的經(jīng)典研究工具表面等離子共振SPR,從SPR發(fā)展而來的單分子成像系統(tǒng)表面等離子共振成像SPRi不單能離散的觀察到單個顆粒的信號，同時還能極好的反映單個分子的結(jié)合解離事件，因此基于SPRi構(gòu)建本發(fā)明實例。[0091]7)本發(fā)明中為了更好的識別外力調(diào)控的分子動力學(xué)變化，以及減少非特異性吸附帶來的干擾，設(shè)置了結(jié)合時間窗口來篩選合適的分子結(jié)合時間，對特異性結(jié)合時間范圍的顆粒繪制的濃度響應(yīng)曲線圖證明，5-500s(優(yōu)選25-250s)范圍內(nèi)的結(jié)合時間更傾向于是外力調(diào)控下的分子特異性結(jié)合所產(chǎn)生。隨著時間范圍的縮小，特異性會進(jìn)一步增高，但會損失一部分檢測事件，在優(yōu)選的時間范圍25-250s內(nèi)，線性擬合的擬合優(yōu)度可以達(dá)到0.98(圖5的[0092]8)本發(fā)明不同于SiMoA和SMC的一大特點是低成本和快速高通量地實現(xiàn)超靈敏檢測，SiMoA的檢測芯片售價為2000美元，而本技術(shù)所用檢測芯片總成本在50元人民幣內(nèi)；此外能將檢測時間控制在15-30分鐘，通過對兩種miRNA(hsa-miR-155,hsa-miR-21)的超靈敏檢測，證明本技術(shù)能在15分鐘內(nèi)實現(xiàn)亞fM水平的檢測(圖6的a和b)。[0093]9)本發(fā)明與SiMREPS不同在于，SiMREPS的目標(biāo)分析物和探針都是親和力易于調(diào)節(jié)通過篩選抗體Fab和FcR來滿足動態(tài)分析的需求。本發(fā)明的外力調(diào)控方法能兼容現(xiàn)有的商業(yè)試劑，抗體試劑盒所用的檢測抗體，與目標(biāo)分子的結(jié)合常數(shù)k?！?01?m1s?1,解離常數(shù)k。f≤0.0002s?1;解離平衡常數(shù)KD≤0.2fM;標(biāo)準(zhǔn)情況下的分子結(jié)合自由能(standardfreeenergy)≤-25kcal/mol的各種抗體的結(jié)合解離進(jìn)行微調(diào)。[0094]下面通過實施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。[0096]使用表面等離子共振顯微鏡SPRM進(jìn)行動態(tài)分析檢測，聯(lián)用電化學(xué)工作站，利用電化學(xué)工作站為檢測體系提供電場力。目標(biāo)核酸與檢測探針的堿基互補(bǔ)鏈長為25basepair的目標(biāo)核酸的外力調(diào)控動態(tài)分析核酸檢測方法如下：[0097](1)使用基于商業(yè)全內(nèi)反射顯微鏡(0lympusIX-81)作為檢測儀器，選用放大倍數(shù)60倍，數(shù)值孔徑N.A=1.49的物鏡，光源為超寬帶光源SLED,光源控制電流的強(qiáng)度在140mA,觀察視野為512×512pixels(fullfieldofview:33.28×33.28μm2)。采用micromanager控制CCD相機(jī)(Photometrics)記錄SPRM的成像信號。Cellsens軟件用以控制光路的入射角度。電化學(xué)工作站為上海辰華的CHI660e,采用三電極法。[0098](2)在鍍有3nm鉻，47nm金的BK-7玻片上，依次用用無水乙醇著用氫焰處理，除去表面顆粒雜質(zhì)同時進(jìn)一步提升金膜平整度；之后用環(huán)氧樹脂膠水將自制的聚二甲基硅氧烷PDMS腔室(道康寧SYLGARDDC184,A、B膠以10:1體積比混合，抽真空后在37度烘箱中靜置2h以上，用直徑1mm的打孔器在固化的PDMS上制造出檢測腔室)固定在金片表面并用導(dǎo)電銀膠將導(dǎo)線固定在金表面構(gòu)成工作電極。其后，用0.1M的二硫蘇糖醇DTT溶液(購于上海生工，產(chǎn)品編號A100281)還原捕獲探針(巰基修飾的單鏈核酸)內(nèi)二硫鍵1h,之后葡聚糖凝膠柱(比如NAP-25)進(jìn)行脫鹽處理，去除DTT,緊接著在PDMS與金片構(gòu)成的檢測腔室內(nèi)加入濃度為1μM巰基聚乙二醇的孵育30s以鈍化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有濃度為50nM的捕獲探針(與目標(biāo)核酸的互補(bǔ)長度為25bp)的溶液，孵育2h。孵育完成后移去PBS清洗后得到檢測芯片。巰基功能化檢測探針(與目標(biāo)核酸的另一端的25bp特異性結(jié)合)在50mM的氯化鈉NaCl溶液在室溫?fù)u床孵育24h,最后離心重懸收集包被檢測核酸分子的金納米顆粒。巰基修飾的檢測探針在使用前用DTT溶液還原1h,隨后脫鹽并除去還原溶液。粒表面已通過鹽老化法連接上巰基功能化的25bp檢測探針和含有目標(biāo)核酸的樣品溶液1μ[0101](5)完成實驗的準(zhǔn)備工作后，進(jìn)行檢測，先對顆粒施加向下的吸引力5min,加速目標(biāo)核酸和納米顆粒的擴(kuò)散，后對顆粒施加向上的斥力10min,調(diào)整分子的結(jié)合時間，以16.7FPS的幀率采集記錄SPRM數(shù)據(jù)。之后在開源軟件imageJ上對數(shù)據(jù)進(jìn)行差分處理(后一幀減前一幀),即可得到去除背景噪聲的單分子成像信息，通過手動統(tǒng)計同一位置上顆粒結(jié)合和解離的信息，可以獲得每個分子的結(jié)合時間，進(jìn)一步篩選更符合特異性結(jié)合的結(jié)合壽命的事件進(jìn)行濃度響應(yīng)的擬合，可得到擬合優(yōu)度R2更好的曲線。[0103]實施例1中使用高分辨率的表面等離子共振顯微鏡SPRM作為單分子成像平臺進(jìn)行基于外力調(diào)控的單分子動態(tài)檢測，對顆粒粒徑有著極高的靈敏度，可以看到并區(qū)分粒徑30-160nm的納米顆粒，但本發(fā)明基于夾心結(jié)構(gòu)進(jìn)行的單分子動態(tài)檢測中，沒有必要用粒徑非常統(tǒng)，使用具有大視野的表面等離子共振成像平臺SPRi進(jìn)行動態(tài)分析檢測，聯(lián)用電化學(xué)工作站，利用電化學(xué)工作站為檢測體系提供電場力。目標(biāo)分子(本實施例中目標(biāo)分子為核酸，因此又稱目標(biāo)核酸)與檢測探針的堿基互補(bǔ)鏈長為25basepair(以下簡稱bp,互補(bǔ)鏈長可以為12～50bp或更長)的目標(biāo)核酸的外力調(diào)控動態(tài)分析核酸檢測方法如下：[0104](1)在光學(xué)平臺上基于Kretschmann棱鏡耦合結(jié)構(gòu)的表面等離子體共振成像SPRi改建而來的外力調(diào)控下的單分子動態(tài)檢測平臺作為檢測儀器，其中光路中所用光學(xué)器件均采購自Thorlabs和大恒光電，氣浮光學(xué)平臺來自麓邦技術(shù)(LBTEK)。選用放大倍數(shù)2-12倍(優(yōu)選地用于觀測50nm~5μm的金顆粒),數(shù)值孔徑N.A=0.06-0.40的可變透鏡組，光源為Superlum的超寬帶光源SLED(Qphotonics),光源控制電流的強(qiáng)度在140mA,功率為2mW,觀察相機(jī)(PhotometricsPrime)記錄SPRi的成像信號。電化學(xué)工作站為上海辰華的CHI660e,采用三電極法。[0105](2)在鍍有3院納米所通過磁控濺射工藝完成鍍膜)上，優(yōu)選地，先用濃硫酸(國藥-滬試，53100368)和30%過氧化氫(國藥-滬試，80070961)以7:3體積比混合出的食人魚洗液(制備方法：用量筒倒邊用玻棒攪拌。食人魚洗液能有效清潔玻片表面，有利于后續(xù)的探著用氫焰處理，除去表面顆粒雜質(zhì)同時進(jìn)一步提升金膜平整度；之后用環(huán)氧樹脂膠水將自制的聚二甲基硅氧烷PDMS腔室(道康寧SYLGARDDC184,A、B膠以10:1體積比混合，抽真空后在37度烘箱中靜置2h以上，用直徑1mm的打孔器在固化的PDMS上制造出檢測腔室)固定在金溶液還原捕獲探針內(nèi)二硫鍵1h,緊接著在PDMS與金片構(gòu)成的檢測腔室內(nèi)加入濃度為1μM巰基聚乙二醇的孵育30s以鈍化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有濃度為50nM的捕獲探針(與目標(biāo)核酸的互補(bǔ)長度為25bp的鎖核酸單鏈，其中鎖核酸占整體鏈段的10-50%,優(yōu)選醇孵育30min減少非特異吸附；最后1×PBS清洗后得到檢測芯片。[0106](3)制備核酸探針包被的金納米顆粒，優(yōu)選地，使用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)取代經(jīng)典鹽老化法中的金硫鍵Au-S,使修飾流程更加簡便和穩(wěn)定。將1012NPs/mL的鏈霉親和素包被金納米顆粒(Nanopartz,C11-150-TS-PBS-50-1,粒徑150nm)與1μM的巰基功能化檢測探針(上海生工合成，一端被生物素修飾的單鏈核酸ssDNA,能與目標(biāo)核酸互補(bǔ)配對結(jié)合，配對鈉濃度達(dá)到500mM后，維持鹽濃度不變在室溫?fù)u床孵育24h,最后離心重懸收集包被檢測探針的金納米顆粒。經(jīng)本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，由于核酸鏈的包被，會使原本不耐鹽的金納米顆粒在[0107](4)將檢測芯片置于棱鏡上觀測位置，兩者間滴加折射率匹配液(0lympus,F30CC,折射率n=1.518),改變?nèi)肷涔饨嵌戎?9-72度(優(yōu)選71度),即可產(chǎn)生SPR效應(yīng)。隨著SPR效應(yīng)進(jìn)行。通過流體通道先往檢測腔室內(nèi)注入內(nèi)含濃度為150mM的NaCl的檸檬酸鈉緩沖液，即1×SSC緩沖液，然后緩慢通入混有納米顆粒和目標(biāo)分子的樣品溶液，其中，顆粒濃度為化學(xué)工作站施加電場力。[0108](5)樣品檢測，優(yōu)選地，先對帶負(fù)電的金納米顆粒施加向下的吸引力15min(正電場，優(yōu)選+0.4V),加速目標(biāo)核酸和納米顆粒的擴(kuò)散，后對顆粒施加向上的斥力45min(負(fù)電場，優(yōu)選-0.2V),調(diào)節(jié)目標(biāo)分子與探針的結(jié)合時間，以16.7FPS的幀率采集記錄SPRi數(shù)據(jù)。[0109](6)對所采集的圖像進(jìn)行處理，包括通過開源軟件imageJ對圖像進(jìn)行差分處理(后一幀減前一幀),得到去除背景噪聲的單分子成像信息；通過手動統(tǒng)計同一位置上顆粒結(jié)合和解離的信息，可以獲得每個分子的結(jié)合時間，進(jìn)一步篩選更符合特異性結(jié)合的結(jié)合壽命的事件，根據(jù)顆粒的特異性吸附和非特異性吸附的時間不同，可以區(qū)分兩者進(jìn)行分析。[0110](7)對特異性吸附的結(jié)合和解離事件進(jìn)行累積統(tǒng)計以得到動態(tài)分析結(jié)果，結(jié)合解離事件的總數(shù)和結(jié)合時間(該結(jié)合時間為對總體結(jié)合時間分布進(jìn)行單指數(shù)擬合所得的估算值，通過origin-指數(shù)擬合-ExpGo1模型擬合而來，迭代算法為正交距離回歸)隨外加電壓的變化的結(jié)果證明外力調(diào)控的效果(圖4a和b)。[0111]實施例3:[0112]微小核酸miRNA作為腫瘤早篩的一項生物標(biāo)志物具有廣闊的應(yīng)用前景，本實例選用hsa-miR-29a(miR-29a)作為目標(biāo)核酸，其與檢測探針的堿基互補(bǔ)鏈長為12bp,其外力調(diào)控動態(tài)分析核酸快速檢測方法如下：[0113](1)在光學(xué)平臺上基于Kretschmann棱鏡耦合結(jié)構(gòu)的表面等離子體共振成像SPRi改建而來的外力調(diào)控下的單分子動態(tài)檢測平臺作為檢測儀器，其中光路中所用光學(xué)器件均采購自Thorlabs和大恒光電，氣浮光學(xué)平臺來自麓邦技術(shù)(LBTEK)。選用放大倍數(shù)60倍，數(shù)值孔徑N.A=1.49的透鏡，光源為Superlum的超寬帶光源SLED(Qphotonics),光源控制電流的強(qiáng)度在140mA,功率為2mW,觀察視野為2048×2048pixels(fieldofview:221.2×221.2μm2)。采用micromanager控制CCD相機(jī)(Photome學(xué)工作站為上海辰華的CHI660e,采用三電極法。[0114](2)在鍍有3nm鉻，47nm金的BK-7玻片(BK-7玻片購于賽默飛院納米所通過磁控濺射工藝完成鍍膜)上，先用濃硫酸(國藥-滬試，53100368)和30%過氧化氫(國藥-滬試，80070961)以7:3體積比混合出的食人魚洗液沖洗吹干，接著用氫焰處理，除去表面顆粒雜質(zhì)同時進(jìn)一步提升金膜平整度；之后用環(huán)氧樹脂膠水將自制的聚二甲基硅徑0.2mm的打孔器在固化的PDMS上制造出檢測腔室)固定在金片表面并用導(dǎo)電銀膠將導(dǎo)線固定在金表面構(gòu)成工作電極。其后，用1μM-50μM選的濃度為5μM),緊接著在PDMS與金片構(gòu)成的檢測腔室內(nèi)加入濃度為1μM巰基聚乙二醇的孵育30s以鈍化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有濃度為10-500nM(優(yōu)選50nM)的捕獲探針(與目標(biāo)miRNA的互補(bǔ)長度為12bp的鎖核酸單鏈，插入整體鏈段的10-50%的鎖核酸分子，鎖核酸比例優(yōu)選20%)的溶液，孵育6h。孵育完成后移去溶液，用1×PBS溶液清洗三遍，再用1μM巰基聚乙二醇孵育30min減少非特異吸附；最后1×PBS清洗后得到檢測芯片。[0115](3)用生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-streptavidinsystem,BAS)制備核酸包被的金納米顆粒。將1012NPs/mL鏈霉親和素包被的金納米顆粒(Nanopartz,C11-50-TS-PBS-50-1,粒徑50nm)與1μM的生物素功能化檢測分子(單鏈核酸ssDNA)在TE緩沖液中共孵育30min,最后離心重懸收集包被檢測探針的金納米顆粒。[0116](4)將檢測芯片置于棱鏡上觀測位置，兩者間滴加折射率匹配液(0lympus,F30CC,機(jī)收集到的光強(qiáng)急劇下降，光強(qiáng)在SPR角附后緩慢通入混有納米顆粒和目標(biāo)分子的樣品溶液，其中，顆粒濃度為101?NPs/mL,流速為5μL/min。同時，將對電極和參比電極插入檢測樣品中，形成回路，用于電化學(xué)工作站施加電場[0117](5)樣品檢測，優(yōu)選地，先對帶負(fù)電的金納米顆粒施加向下的吸引力5min(正電場，+0.4V),加速目標(biāo)核酸和納米顆粒的擴(kuò)散，后對顆粒施加向上的斥力15min(負(fù)電場，-0.2V),調(diào)節(jié)目標(biāo)分子與探針的結(jié)合時間，以16.7FPS的幀率采集記錄SPRi數(shù)據(jù)。[0118](6)對所采集的圖像進(jìn)行處理，通過開源軟件imageJ對圖像進(jìn)行差分處理(后一幀減前一幀),得到去除背景噪聲的單分子成像信息；手動統(tǒng)計統(tǒng)一位置下顆粒的結(jié)合和解離事件，由此獲得每個分子結(jié)合的壽命；最后根據(jù)結(jié)合時間篩選出特異性結(jié)合的事件。根據(jù)顆粒的特異性吸附和非特異性吸附的時間不同，可以區(qū)分兩者進(jìn)行分析。[0119](7)對特異性吸附的結(jié)合和解離事件進(jìn)行累積統(tǒng)計以得到動態(tài)分析結(jié)果。miR-29a的結(jié)合時間分布圖可以分特異性吸附和非特異性吸附，通過進(jìn)一步優(yōu)化參數(shù)可以得到，在25-250s的時間窗口內(nèi)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線有著較好的線性擬合優(yōu)度R2=0.98(圖5的a),圖5的b中虛線代表空白組時檢測到的顆粒事件，通過虛線和濃度響應(yīng)曲線的交點獲得樣品的檢測[0120]實施例4:[0121]為了證明本發(fā)明具有快速超靈敏檢測核酸的能力，本實例選取兩種癌癥相關(guān)miRNA,hsa-miR-21(miR-21)和hsa-miR-155(miR-155)作為目標(biāo)核酸，與檢測探針的堿基互[0122](1)在光學(xué)平臺上基于Kretschmann棱鏡耦合結(jié)構(gòu)的表面等離子體共振成像SPRi改建而來的外力調(diào)控下的單分子動態(tài)檢測平臺作為檢測儀器，其中光路中所用光學(xué)器件均采購自Thorlabs和大恒光電，氣浮光學(xué)平臺來自麓邦技術(shù)(LBTEK)。選用放大倍數(shù)40倍，數(shù)值孔徑N.A=0.65的透鏡，光源為Superlum的超寬帶光源SLED(Qphotonics),光源控制電流的強(qiáng)度在140mA,功率為2mW,觀察視野為2048×2048pixels(fieldofview:1106×1106μ工作站為上海辰華的CHI660e,采用三電極法。院納米所通過磁控濺射工藝完成鍍膜)上，先用濃硫酸(國藥-滬試，53100368)和30%過氧化氫(國藥-滬試，80070961)以7:3體積比混合出的食人魚洗液沖洗吹干，接著用氫焰處理，除去表面顆粒雜質(zhì)同時進(jìn)一步提升金膜平整度；之后把可重復(fù)使用的硅基細(xì)胞培養(yǎng)板(SARSTEDT,flexiPERM)固定lμM-50μM的TCEP(三羧乙基膦)溶液還原捕獲探針內(nèi)二硫鍵1h(TCEP物質(zhì)的量需要在DNA物質(zhì)的量的100倍或以上，優(yōu)選的濃度為5μM),緊接著在硅基培養(yǎng)板與金片構(gòu)成的檢測腔室內(nèi)加入濃度為1μM巰基聚乙二醇的孵育30s以鈍化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有濃度為10-500nM(優(yōu)選50nM)的捕獲探針(與目標(biāo)miRNA的互補(bǔ)長度為12bp的鎖核酸單鏈，插入整體鏈段的10-50%的鎖核酸分子，鎖核酸比例優(yōu)選20%)的溶液，孵育6h。孵育完成后移去溶清洗后得到檢測芯片。[0124](3)用生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-streptavidinsystem,BAS)制備核酸包被的金納米顆粒。將1012NPs/mL鏈霉親和素包被的金納米顆粒(Nanopartz,C11-50-TS-PBS-50-1,粒徑50nm)與1μM的生物素功能化檢測分子(單鏈核酸ssDNA)在TE緩沖液中共孵育30min,最后離心重懸收集包被檢測探針的金納米顆粒。[0125](4)將檢測芯片置于棱鏡上觀測位置，兩者間滴加折射率匹配液(0lympus,F30CC,機(jī)收集到的光強(qiáng)急劇下降，光強(qiáng)在SPR角附通道先往檢測腔室內(nèi)注入內(nèi)含濃度為300mM的NaCl的檸后緩慢通入混有納米顆粒和目標(biāo)分子的樣品溶液，其中，顆粒濃度為101?NPs/mL,流速為5μL/min。同時，將對電極和參比電極插入檢測樣品中，形成回路，用于電化學(xué)工作站施加電場[0126](5)樣品檢測，優(yōu)選地，先對帶負(fù)電的金納米顆粒施加向下的吸引力5min(正電場，+0.4V),加速目標(biāo)核酸和納米顆粒的擴(kuò)散，后對顆粒施加向上的斥力15min(負(fù)電場，-0.2V),調(diào)節(jié)目標(biāo)分子與探針的結(jié)合時間，以30FPS的幀率采集記錄SPRi數(shù)據(jù)。[0127](6)對所采集的圖像進(jìn)行處理，通過開源軟件imageJ對圖像進(jìn)行差分處理(后一幀減前一幀),得到去除背景噪聲的單分子成像信息；手動統(tǒng)計統(tǒng)一位置下顆粒的結(jié)合和解離事件，由此獲得每個分子結(jié)合的壽命；最后根據(jù)結(jié)合時間篩選出特異性結(jié)合的事件。根據(jù)顆粒的特異性吸附和非特異性吸附的時間不同，可以區(qū)分兩者進(jìn)行分析。[0128](7)統(tǒng)計特異性結(jié)合時間內(nèi)的結(jié)合解離事件，可以得到兩種miRNA的結(jié)合解離事件隨濃度變化曲線，擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線(standardcurve),并根據(jù)空白對照組(blank)的結(jié)合解Detection,LoD)。miR-21和miR-155的檢測限分別為0.26和0.17fM(圖6的a和b),其中，miR-21的R2為0.96,miR-155的R2為0.83。[0130]使用表面等離子共振成像系統(tǒng)SPRi進(jìn)行基于外力調(diào)控的高通量動態(tài)分析檢測，聯(lián)用電化學(xué)工作站，利用電化學(xué)工作站為檢測體系提供電場力。對阿茲海默癥的生物標(biāo)志物A[0131](1)在光學(xué)平臺上基于Kretschmann棱鏡耦合結(jié)構(gòu)的表面等離子體共振成像SPRi改建而來的外力調(diào)控下的單分子動態(tài)檢測平臺作為檢測儀器，其中光路中所用光學(xué)器件均采購自Thorlabs和大恒光電，氣浮光學(xué)平臺來自麓邦技術(shù)(LBTEK)。選用放大倍數(shù)10倍，數(shù)值孔徑N.A=0.25的透鏡，光源為Superlum的超寬帶光源SLED(Qphotonics),光源控制電流的強(qiáng)度在140mA,功率為2mW,觀察視野為2048×2048pixels(fieldofview:1.33×電化學(xué)工作站為上海辰華的CHI660e,采用三電極法。院納米所通過磁控濺射工藝完成鍍膜)上，先用濃硫酸(國藥-滬試，53100368)和30%過氧化氫(國藥-滬試，80070961)以7:3體積比混合出的食人魚洗液沖洗吹干，接著用氫焰處理，除去表面顆粒雜質(zhì)同時進(jìn)一步提升金膜平整度；之后把可重復(fù)使用的硅基細(xì)胞培養(yǎng)板lμM-50μM的TCEP(三羧乙基膦)溶液還原捕獲探針內(nèi)二硫鍵1h(本發(fā)明中，TCEP物質(zhì)的量需要在DNA物質(zhì)的量的100倍或以上，本實施例優(yōu)選的濃度為5μM),緊接著在硅基培養(yǎng)板與金片構(gòu)成的檢測腔室內(nèi)加入濃度比例為50:1～500:1(優(yōu)選100:1)的巰基聚乙二醇甲氧基(HS-mPEG,Mw=500Da)和巰基聚乙二醇生物素(HS-PEG5K-biotin,Mw=3400-15000Da,優(yōu)選5000、7000Da)孵育4h修飾金表面。之后加入濃度為1mg/mL鏈霉親和素孵育1h,接著加入Fc端修飾了生物素的捕獲抗體(多克隆抗體clone12F4,特異性結(jié)合Aβ1-42的C-terminus,BioLegend,Inc.)溶液，濃度5-50ng/mL(優(yōu)選10ng/mL)孵育2h。最后用1%BSA封閉30min以減少非特異性吸附。其中，上述每個步驟前先移除上一步驟的原液并用1×PBS溶液清洗三遍。[0133](3)制備檢測抗體包被的金納米顆粒。將1012NPs/mL鏈霉親和素包被的金納米顆粒(Nanopartz,C11-50-TS-PBS-50-1,粒徑50nm)與500ng/mL-5μg/mL(優(yōu)選2μg/mL)的Fc端生物素功能化檢測抗體(多克隆抗體clone6E10,特異性結(jié)合Aβ1-42的N-terminus,BioLegend,Inc.)共孵育30min,最后離心重懸收集包被檢測抗體的金納米顆粒。[0134](4)將檢測芯片置于棱鏡上觀測位置，兩者間滴加折射率匹配液(0lympus,F30CC,折射率n=1.518),調(diào)節(jié)入射光角度至71度，即可產(chǎn)生SPR效應(yīng)。隨著SPR效應(yīng)的增強(qiáng)，CCD相機(jī)收集到的光強(qiáng)急劇下降，光強(qiáng)在SPR角附近達(dá)到最低值。檢測在SPR角附近進(jìn)行。通過流體通道先往檢測腔室內(nèi)注入內(nèi)含濃度為300mM的NaCl的Tris-HCL緩沖液，然后緩慢通入混有μL/min。同時，將對電極和參比電極插入檢測樣品溶液中，形成回路，通過電化加電場力。[0135](5)樣品檢測，優(yōu)選地，先對帶負(fù)電的金納米顆粒施加向下的吸引力5min(正電場，+0.4V),加速目標(biāo)蛋白和納米顆粒的擴(kuò)散，后對顆粒施加向上的斥力15min(負(fù)電場，-0.2V),調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白與檢測探針的結(jié)合時間，以15-60FPS(優(yōu)選16.7FPS)的幀率采集記錄SPRi數(shù)據(jù)。[0136](6)對所采集的圖像進(jìn)行處理，通過開源軟件imageJ對圖像進(jìn)行差分處理(后一幀減前一幀),得到去除背景噪聲的單分子成像信息；手動統(tǒng)計統(tǒng)一位置下顆粒的結(jié)合和解離事件，由此獲得每個分子結(jié)合的壽命；最后根據(jù)結(jié)合時間篩選出特異性結(jié)合的事件。根據(jù)顆粒的特異性吸附和非特異性吸附的時間不同，可以區(qū)分兩者進(jìn)行分析。[0137](7)對特異性吸附的結(jié)合和解離事件進(jìn)行累積統(tǒng)計以得到動態(tài)分析結(jié)果(圖7的a)。電場調(diào)控下目標(biāo)多肽的檢測限為4.34fg/mL(～1.08fM),可見電場力調(diào)節(jié)范圍較小，對親和力較強(qiáng)的抗原抗體的結(jié)合難以實現(xiàn)滿意的調(diào)控，后續(xù)選用更大的外力對顆粒進(jìn)行調(diào)控。[0138]實施例6:[0139]本實例在實例5的基礎(chǔ)上，將電場調(diào)控變?yōu)榇艌稣{(diào)控，通過更大的外力來調(diào)節(jié)高親和力抗體與目標(biāo)蛋白的結(jié)合時間，其外力調(diào)控的通用動態(tài)分析方法如下：[0140](1)在光學(xué)平臺上基于Kretschmann棱鏡耦合結(jié)構(gòu)的表面等離子體共振成像SPRi改建而來的外力調(diào)控下的單分子動態(tài)檢測平臺作為檢測儀器，其中光路中所用光學(xué)器件均孔徑N.A=0.25的透鏡，光源為Superlum的超寬帶光源SLED(Qphotonics),光源控制電流的強(qiáng)度在140mA,功率為2mW,觀察視野為2048×2048pixels(fieldofview:3.325×磁場力用磁鑷提供，磁鑷為MagnetechCorpora