(19)國家知識產(chǎn)權局(12)發(fā)明專利(72)發(fā)明人余輝楊玉婷曾強moleculesensingbyactivelytunibindingkineticsforultrasebiomarkerdetectione2120379119.審查員李若琳(74)專利代理機構上海弼興律師事務所31283ss本發(fā)明公開了一種基于外力調控的單分子成像系統(tǒng)獲得單分子成像信息并分析所述目標21.一種單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，其使用外力調控模塊來調節(jié)目標分子與“檢測探針、捕獲探針和納米顆?！敝g的結合與解離，并采用單分子成像系統(tǒng)獲得單分子成像信息并分析所述目標分子的動態(tài)；其中，所述捕獲探針的末端與目標分子的頭部互補，所述目標分子的末端與檢測探針互補；所述捕獲探針或檢測探針與所述納米顆粒形成納米顆粒復合物；當所述納米顆粒復合物與目標分子結合后，在所述外力調控模塊驅動下被牽引到檢測探針或捕獲探針附近，與所述捕獲探針或檢測探針特異性結合，再在所述外力調控模塊驅動下被提拉離開所述檢測探針或捕獲探針；其中，所述外力調控模塊包括電場調控、磁力調控和非接觸力發(fā)生裝2.如權利要求1所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述電場調控使用雙電極或力調控使用電磁鐵或永磁體；所述非接觸力發(fā)生裝置包括光鑷、聲鑷、熱泳和原子力顯微鏡所述外力調控模塊施加的外力范圍在0.01-1000pN。3.如權利要求2所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，電場調控使用電化學工作4.如權利要求2所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述磁力調控使用鎳鉻磁鐵或磁鑷。5.如權利要求2所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述外力調控模塊施加的外力范圍在20-60pN。6.如權利要求1所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述目標分子包括蛋白和核酸；和/或，所述捕獲探針和檢測探針包括與所述目標分子結合的任意化學物質。7.如權利要求1所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述捕獲探針和檢測探針包括與所述目標分子結合的任意代謝產(chǎn)物。8.如權利要求1所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述捕獲探針和檢測探針包括天然或工程化的抗體、核酸和適配體。9.如權利要求1所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述單分子成像系統(tǒng)包括10.如權利要求9所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述SPRi的結構包括物鏡耦合型SPRi和棱鏡耦合型SPRi;和/或，所述SPRi的光源包括SLED光源或600-800nm的激光11.如權利要求10所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述物鏡耦合型SPRi為物12.如權利要求11所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述物鏡耦合型SPRi為全13.如權利要求10所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述SPRi的結構為棱鏡耦合型SPRi;和/或，所述納米顆粒的粒徑為50nm~300nm。14.如權利要求13所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述納米顆粒的粒徑為315.如權利要求10所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述棱鏡耦合型SPRi為Kretschmann棱鏡耦合結構。16.如權利要求1~15任一項所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述捕獲探針或檢測探針吸附于檢測芯片。17.如權利要求16所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，當所述目標分子為核酸時：所述捕獲探針末端的12~25個核苷酸與目標分子一端的核苷酸互補，目標分子另一端的核苷酸與檢測探針互補；或，所述捕獲探針和檢測探針其中之一為鎖核酸，另一端被生物素修飾的單鏈核酸ssDNA,所述納米顆粒為鏈霉親和素包被的納米顆粒；當所述目標分子為蛋白或小分子時：所述檢測探針為與目標分子結合的抗體，所述捕獲探針為與所述目標分子牢固結合的抗體。18.如權利要求17所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，當所述目標分子為蛋白或小分子時，所述檢測探針為Fc端修飾了生物素的抗目標分子的抗體，所述捕獲探針為Fc端生物素功能化的抗體。19.如權利要求18所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，當所述目標分子為蛋白或小分子時，所述捕獲探針與目標分子的結合常數(shù)k?！?01?M1s?1,解離常數(shù)kof≤0.0002s1,解離平衡常數(shù)KD≤0.2fM;檢測探針與目標分子的結合常數(shù)k。n≤5×108M1s1,解離常數(shù)kof≥0.05s?1;解離平衡常數(shù)KD≥1.56pM。20.如權利要求16所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，(1)所述檢測芯片的制備包括以下步驟：在鍍有2-3nm鉻和47nm金的玻片上，先除去表面顆粒雜質并提升金膜平整度，再將檢測腔室或硅基細胞培養(yǎng)板固定在金片表面并制成工作電極；其后，用還原溶液還原巰基修飾的檢測探針或捕獲探針、脫鹽并除去還原溶液，加入鈍化劑鈍化金片表面，清洗后加入還原后的檢測探針或捕獲探針并孵育；最后清洗并加入溶液減少非特異性吸附并清洗，即得(2)所述納米顆粒復合物的制備包括以下步驟：用鹽老化法制備核酸包被的納米金顆粒，即，將納米金顆粒與巰基還原后的捕獲探針用生物素-親和素系統(tǒng)制備核酸包被的納米顆粒，即，將鏈霉親和素包被的金納米顆粒用生物素-親和素系統(tǒng)制備抗體包被的納米顆粒，即，將鏈霉親和素包被的納米顆粒與所述(1)和(2)無先后次序。21.如權利要求20所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述檢測腔室為PDMS腔22.如權利要求20所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，在所述鹽老化法制備核酸包被的納米顆粒的步驟中，所述共孵育在梯度氯化鈉溶液中進行。23.如權利要求22所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述梯度氯化鈉溶液的424.如權利要求23所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述梯度氯化鈉溶液每25.如權利要求20所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述用生物素-親和素系統(tǒng)制備核酸包被的納米顆粒為金納米顆粒。26.如權利要求20所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，在所述用生物素-親和素系統(tǒng)制備核酸包被的納米顆粒的步驟中，所述生物素功能化檢測分子為一端被生物素修飾的單鏈核酸ssDNA。27.如權利要求20所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，在所述用生物素-親和素系統(tǒng)制備核酸包被的納米顆粒的步驟中，所述共孵育在梯度氯化鈉溶液中進行。28.如權利要求27所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述梯度氯化鈉溶液的29.如權利要求28所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述梯度氯化鈉溶液每30.如權利要求20所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述用生物素-親和素系統(tǒng)制備抗體包被的納米顆粒為金納米顆粒和磁納米顆粒。31.如權利要求20所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，其包括以下步驟：(a)將檢測芯片置于所述單分子成像系統(tǒng)的觀測位置，往檢測腔室中加入所述納米顆粒復合物和所述目標分子；(b)使用所述外力調控模塊施加外力，以15-60FPS的幀率采集單分子的成像數(shù)據(jù)并分析所述目標分子的動態(tài)：首先，對納米顆粒復合物施加吸引力加速目標分子和納米顆粒復合物的擴散；其后，對納米顆粒復合物施加斥力；調整目標分子與檢測探針或捕獲探針之間(c)采集記錄SPRi數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進行差分處理，得到去除背景噪聲的單分子成像信息；統(tǒng)計同一位置上顆粒結合和解離的信息，獲得每個分子的結合時間；最后，篩選出特異性結合占主導的結合時間內的事件，進行濃度響應擬合，得到特異性更高的濃度響應曲線。32.如權利要求31所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，在加入所述納米顆粒復合物和所述目標分子前，先加入PBS緩沖液或SSC緩沖液或含300mMNaCl的Tris-HCL緩沖液。33.如權利要求32所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述SSC緩沖液為1×或234.如權利要求31所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，采集單分子的成像數(shù)據(jù)并分析所述目標分子的動態(tài)的幀率為16.7或30FPS。35.如權利要求31所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述結合時間為25-25036.如權利要求31所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述結合時間為對總體結合時間分布進行單指數(shù)擬合所得的估算值，通過origin-指數(shù)擬合-ExpGo1模型擬合而37.如權利要求31所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，當所述外力調控模塊施加的外力為電場力時，施加-0.6v-+1.0v;5當所述外力調控模塊施加的外力為磁場力時，使用12vDC、占空比25%、20s的電源驅動磁鑷，先對納米顆粒施加吸引力15min;后對納米顆粒施加斥力15min。38.如權利要求37所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，當所述外力調控模塊施加的外力為電場力時，施加0.4V-+0.8V的電壓。39.如權利要求37所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，當所述外力調控模塊施加的外力為電場力時，先使用正電場，對納米顆粒施加吸引力5min-20min;后使用負電場，對納米顆粒施加斥力10-45min。40.如權利要求39所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述正電場為0-0.8V;所述負電場為-0.4-0V。41.如權利要求40所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述正電場為+0.4V,負電場為-0.2V。42.如權利要求20所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，(1)所述檢測芯片的制備具有以下特征中的一種或多種：所述玻片為BK-4或BK-7玻片；使用洗液與氫焰除去表面顆粒雜質并提升金膜平整度，所述洗液為食人魚洗液，或酒精和純水的組合；所述還原溶液為TCEP或DTT;所述鈍化劑為巰基聚乙二醇、巰基乙醇，或巰基聚乙二醇甲氧基和巰基聚乙二醇生物素的組合；所述清洗使用PBS;所述減少非特異性吸附使用巰基乙醇或BSA;捕獲探針或檢測探針與鈍化分子的比例為1:100-1:1000;和/或，所述捕獲探針或檢測探針的濃度為50nM;和/或，所述捕獲探針為鎖核酸單鏈。43.如權利要求42所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述還原溶液為5μM的44.如權利要求42所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述鈍化劑為1μM巰基聚乙二醇。45.如權利要求42所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述減少非特異性吸附46.如權利要求42所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述鎖核酸單鏈中，鎖核酸分子占單鏈的10~50%。47.如權利要求46所述的單分子動態(tài)檢測方法，其特征在于，所述鎖核酸單鏈中，鎖核酸分子占單鏈的20%。48.一種檢測單分子動態(tài)的系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括：(i)如權利要求1~47任一項所述的單分子動態(tài)檢測方法中所定義的納米顆粒復合物；(ii)如權利要求1~47任一項所述的單分子動態(tài)檢測方法中所定義的檢測探針或捕獲探針。49.如權利要求48所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)還包括如權利要求16~47任一項所述的單分子動態(tài)檢測方法中所定義的檢測芯片；和/或，如權利要求1~47任一項所述的單分子動態(tài)檢測方法中所定義的單分子成像系統(tǒng)和/或所定義的外力調控模塊。50.如權利要求48或49所述的系統(tǒng)在檢測單分子動態(tài)中的應用。6一種基于外力調控的單分子動態(tài)檢測方法和系統(tǒng)技術領域[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學檢測、處理與分析領域，涉及一種基于外力調控的單分子動態(tài)檢測方法和系統(tǒng)，用于低豐度蛋白、核酸和生物小分子的檢測。背景技術[0002]體外診斷技術(Invitrodiagnosis,IVD)在許多疾病和癌癥的早期診斷、預后檢測和治療評估中發(fā)揮著重要作用。目前臨床中80%以上的疾病診斷都依靠體外診斷技術。傳統(tǒng)IVD技術，如酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)的檢測限(limitofdetection,LoD)在pM水平(10小分子無法被傳統(tǒng)IVD技術檢出(J.Am.Chem.Soc.2019,141,1162-1170)。因此開發(fā)具有單分子水平(<pM)的超靈敏生物傳感器具有重大意義。單分子陣列SiMoA和單分子計數(shù)SMC是目前商業(yè)化最成功的單分子檢測技術，前者是在ELISA原理的基礎上，通過納米孔陣列技術構建超低的反應體系，實現(xiàn)單分子酶促反應熒光信號的數(shù)字化檢測，其基本原理與數(shù)字PCR技術類似(NatureBiotechnology.2010,28,595-599);而后者則是通過將激光聚焦于艾里斑，提高熒光分子的光子產(chǎn)量來實現(xiàn)單分子的計數(shù)測量，相當于一臺超靈敏的流式分子檢子檢測技術都存在一定的局限性，導致目前單分子檢測技術主要服務于實驗室，無法推廣到臨床IVD中。SiMoA技術的操作流程SMC的檢測通量不足，對光學系統(tǒng)和環(huán)境穩(wěn)定性要求嚴苛，且兩項技術的檢測時間普遍過久；這是因為目前的單分子檢測技術仍然無法突破傳統(tǒng)檢測的理論極限。在傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)中，檢測限依賴于抗體的親和力以及非特異吸附的抑制處理，同時在終點讀出檢測(Endpointreadoutassay),這帶來了濃度限制(concentrationlimit)和熱動力學限制(thermodynamicslimit)兩個關鍵問題，導致其檢測靈敏度在pg/mL水平。[0003]動態(tài)分析作為一種新型的檢測策略，有望突破單分子檢測的熱動力學限制，實現(xiàn)更靈敏的檢測，其原理在于在分子結合的熱力學平衡狀態(tài)下，分子的結合和解離事件仍在持續(xù)發(fā)生，對過程的持續(xù)記錄能實現(xiàn)檢測信號的放大，最終實現(xiàn)fM水平的檢測，優(yōu)于ELISA技術1000倍。[0004]遺憾的是動態(tài)分析尚不具有普適性，這是因為動態(tài)分析在免疫檢測中需要抗體與抗原能快速結合和解離，利用不斷反復的結合解離事件的累計實現(xiàn)信號放大，因此在免疫檢測中需要繁瑣的流程篩選合適的抗體(弱親和力，快速結合快速解離),而商用的抗體試劑往往對目標蛋白的親和力很高，分子雖能快速結合但解離事件發(fā)生緩慢，進而導致動態(tài)分析免疫檢測的耗時過長?；诓此善胶獾膯畏肿幼R別技術SiMREPS作為一種動態(tài)檢測技術，在檢測親和力易于調控的核酸檢測中實現(xiàn)了15-30分鐘的單分子檢測，檢測限達到了fM水平(NatureBiotechnology,2015,33,7,730-732),但該技術在蛋白檢測的應用中受限于復雜的抗體篩選的流程以及不合適抗體導致的較長耗時(>2h)。[0005]隨著醫(yī)療水平的提升，社會對臨床診斷有了更高的要求，如對群眾的病毒攜帶檢7測需盡可能的快，傳統(tǒng)PCR難以滿足快速檢測的需求，目前國內外所售賣的診斷試劑盒也基本依賴于對病毒的蛋白識別，檢測總時間在15-30分鐘以內。當前的單分子檢測技術總的檢4小時以上，動態(tài)檢測更是存在固有的檢測耗時問題。因此開發(fā)一種快速超靈敏的單分子檢測技術具有極大的研究意義和實踐價值。技術依賴于檢測芯片和聚焦成艾里斑的激光光源，其成本較高，不利于臨床IVD的運用。其適的親和力抗體來提升，但復雜的抗體篩選過程導致了該方法不具備普適性。最后，目前所有單分子檢測技術都存在檢測通量過低的問題，限制了其在臨床實踐中的推廣。發(fā)明內容[0007]如背景所述，單分子檢測中目前存在兩個關鍵的科學問題急需解決，分別是濃度限制和熱動力學限制。濃度限制是由于單分子檢測中待檢測分子的濃度都低于pM水平，而待檢測分子抵達傳感器表面在低濃度下耗時更久(遠大于60min,ELISA中為最可能低的檢測限一般過夜孵育)。此外就是熱動力學限制帶來的檢測極限，對于終點檢測來說，其檢測結果為讀出某一時刻(經(jīng)孵育后達到熱力學平衡態(tài))結合的目標分子。其檢測極限可以定義為臨界濃度：在該濃度下無論平衡多久都無法檢測到一個待檢測分子。濃度限制可以通過微流控芯片技術加速目標分子擴散到傳感器表面，如SiMoA,但高精度的芯片加工帶來的是檢測芯片的成本高昂；熱動力學的限制SiMREPS技術已經(jīng)解決了一部分，其動態(tài)(過程)的檢測能真正的突破熱動力學檢測的理論極限，靈敏度比ELISA提高1000倍以上，但是受限于抗體篩選不具有普適性，且SiMREPS并未解決濃度限制帶來的孵育時間過久的問題。[0008]本發(fā)明所要解決的問題是：突破濃度限制和抗體篩選的瓶頸，開發(fā)出快速、超靈敏且高通量的一種基于外力調控的單分子動態(tài)檢測方法。[0009]本發(fā)明的第一方面提供了一種單分子動態(tài)檢測方法，其使用外力調控模塊來調節(jié)目標分子與檢測探針、捕獲探針、納米顆粒之間的結合與解離，并采用單分子成像系統(tǒng)獲得單分子成像信息并分析所述待檢測分子的動態(tài)；[0010]其中，所述捕獲探針的末端與目標分子的頭部互補，所述目標分子的末端與檢測探針互補；所述捕獲探針或檢測探針與所述納米顆粒形成納米顆粒復合物；當所述納米顆粒復合物與目標分子結合后，在所述外力調控模塊驅動下被牽引到檢測探針或捕獲探針附近，與所述捕獲探針或檢測探針特異性結合，再在所述外力調控模塊驅動下被提拉離開所述檢測探針或捕獲探針。[0011]本發(fā)明中，捕獲探針、納米顆粒、檢測探針和目標分子構成了夾心體系。其中檢測探針和捕獲探針的位置可以互換，不會對檢測結果產(chǎn)生本質影響。例如，當捕獲探針與納米顆粒形成納米顆粒復合物時，檢測探針結合至檢測芯片上；當檢測探針與納米顆粒形成納米顆粒復合物時，捕獲探針結合至檢測芯片上。[0012]在一些優(yōu)選的實施例中，所述外力調控模塊包括電場調控、磁力調控和非接觸力發(fā)生裝置。[0013]較佳地，所述電場調控使用雙電極、三電極電場發(fā)生裝置例如電化學工作站，工作8電極可選用的材料選自玻碳電極、鉑(Pt)、金(Au)、銀(Ag)、鉛(Pb)、導電玻璃(ITO)和汞(Hg),所述磁力調控使用電磁鐵或永磁體例如鎳鉻磁鐵或磁鑷，所述非接觸力發(fā)生裝置包[0014]所述外力調控模塊施加的外力范圍在0.01-1000pN例如20-60pN。[0015]此外，本發(fā)明中，捕獲探針又稱捕獲分子；檢測探針又稱檢測分子；目標分子又稱待檢測分子。這些術語分別可以無差別地使用。[0016]在一些優(yōu)選的實施例中，所述目標分子包括蛋白和核酸；和/或，所述捕獲探針和檢測探針包括天然或工程化的抗體、核酸和適配體，或與目標分子結合的任意化學物質或代謝產(chǎn)物。[0017]在一些優(yōu)選的實施例中，所述單分子成像系統(tǒng)包括SPRi、TIRFM、暗場成像和iSCAT;和/或，所述納米顆粒的粒徑為30nm-5μm,材質選自包括但不限于納米硅、納米金、納米銀、聚苯乙烯和包被超順磁顆粒的二氧化硅磁珠。[0018]較佳地，所述SPRi的結構包括物鏡耦合型SPRi和棱鏡耦合型SPRi,物鏡耦合型SPRi優(yōu)選物鏡式SPRM,例如全內反射顯微鏡改建的物鏡式SPRM,棱鏡耦合型SPRi例如Kretschmann棱鏡耦合結構；和/或，所述SPRi的光源包括SLED光源或600-800nm的激光光源；和/或，所述納米顆粒包括納米金或磁納米顆粒。本發(fā)明的物鏡耦合型SPRi的放大倍數(shù)通常為60～100倍。[0019]更佳地，所述SPRi的結構為棱鏡耦合型SPRi;和/或，所述納米顆粒的粒徑為50nm~300nm,例如50nm、150nm或300nm。本發(fā)明的棱鏡耦合型SPRi的放大倍數(shù)通常為2～60倍，[0020]在一些優(yōu)選的實施例中，所述捕獲探針或檢測探針吸附于檢測芯片上。[0021]較佳地，當所述目標分子為核酸時：所述捕獲探針末端的12～25個核苷酸與目標分子一端的核苷酸互補，目標分子另一端的核苷酸與檢測探針互補；或，所述捕獲探針和檢測探針其中之一為鎖核酸，另一為生物素功能化的目標分子例如一端被生物素修飾的單鏈核酸ssDNA,所述納米顆粒為鏈霉親和素包被的納米顆粒。本發(fā)明中，所述核酸可以為單鏈核酸，例如單鏈的DNA,RNA包括mRN酶或加熱等方法打開雙鏈，使其成為可檢測的單鏈DNA片段。[0022]當所述目標分子為蛋白或多肽或小分子時：所述檢測探針為與目標分子結合的抗體，所述捕獲探針為與所述目標分子牢固結合的抗體；優(yōu)選所述檢測探針為Fc端修飾了生物素的抗目標分子的抗體，所述捕獲探針為Fc端生物素功能化的抗體。其中捕獲探針與目標分子的結合常數(shù)k?≥101?m1s?1,解離常數(shù)k。f≤0.0002s?1,解離平衡常數(shù)KD≤0.2fM。檢測探針與目標分子的結合常數(shù)k?！?×108M1s?1,解離常數(shù)k。f≥0.05s1;解離平衡常數(shù)KD≥1.56pM;標準情況下的分子結合自由能(standardfreeenergy)≥-12kcal/mol。[0023]生物小分子的化學探針的原理與對miRNA等核酸類目標分子并無本質區(qū)別，如對別構轉錄因子(allosterictranscriptionfactor,aTF)的檢測，aTF上存在DNA結合結構域和小分子識別結構域，小分子的結合能夠使aTF從特定的DNA序列上解離，通過競爭抑制的相互作用實現(xiàn)對生物小分子的檢測。[0024]在一些優(yōu)選的實施例中，(1)所述檢測芯片的制備包括以下步驟：[0025]在鍍有2-3nm鉻、47nm金的玻片上，先除去表面顆粒雜質并提升金膜平整度，再將9檢測腔室例如PDMS腔室或硅基細胞培養(yǎng)板固定在金片表面并制成工作電極；其后，用還原溶液還原巰基修飾的檢測探針或捕獲探針、脫鹽并除去還原溶液，加入鈍化劑鈍化金片表面，清洗后加入還原后的檢測探針或捕獲探針并孵育；最后清洗并加入溶液減少非特異性[0026]上述步驟中，檢測芯片只吸附檢測探針和捕獲探針的其中之一。即，當檢測芯片吸附有檢測探針時，捕獲探針與納米顆粒形成納米顆粒復合物；當檢測芯片吸附有捕獲探針時，檢測探針與納米顆粒形成納米顆粒復合物。[0027](2)所述納米顆粒復合物的制備包括以下步驟：[0028]用鹽老化法制備核酸包被的納米金顆粒，即，將納米金顆粒與巰基還原后的捕獲探針或檢測探針共孵育，離心、重懸即得；優(yōu)選地，所述共孵育在梯度氯化鈉溶液例如50~維持鹽濃度不變孵育24h;或，[0029]用生物素-親和素系統(tǒng)制備核酸包被的納米顆粒例如納米金顆粒，即，將鏈霉親和素包被的金納米顆粒與生物素功能化檢測分子共孵育，離心、重懸即得；所述生物素功能化檢測分子例如一端被生物素修飾的單鏈核酸ssDNA;優(yōu)選地，所述共孵育在梯度濃度的氯化鈉溶液例如50～500mM中進行；更優(yōu)選地，每隔4h提高50mM濃度，直至氯化鈉濃度達到500mM[0030]用生物素-親和素系統(tǒng)制備抗體包被的納米顆粒例如金納米顆粒和或磁納米顆粒，即，將鏈霉親和素包被的金納米顆粒與Fc端生物素功能化檢測抗體共孵育，離心、重懸即得。[0031]所述(1)和(2)無先后次序。[0032]在一些更優(yōu)選的實施例中，所述單分子動態(tài)檢測方法包括以下步驟：[0033](a)將制備好的檢測芯片置于所述單分子成像系統(tǒng)的觀測位置，往檢測腔室中加入所述納米顆粒復合物和所述目標分子；優(yōu)選地，在加入所述納米顆粒復合物和所述目標例如為1×或2×SSC緩沖液。[0034](b)使用所述外力調控模塊施加外力，以15-60FPS例如16.7或30FPS的幀率采集單分子的成像數(shù)據(jù)并分析所述目標分子的動態(tài)：首先，對納米顆粒復合物施加吸引力加速目標分子和納米顆粒復合物的擴散；其后，對納米顆粒復合物施加斥力；調整目標分子與檢測探針或捕獲探針之間的結合時間，所述結合時間為5-500s優(yōu)選25-250s。[0035]同樣地，調整所述結合時間時，只需調整目標分子與檢測探針，或目標分子與捕獲探針之間的結合時間。調整的目標取決于納米顆粒復合物上結合的時檢測探針還是捕獲探[0036](c)采集記錄SPRi數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進行差分處理，得到去除背景噪聲的單分子成像信息；統(tǒng)計同一位置上顆粒結合和解離的信息，獲得每個分子的結合時間；最后，篩選出特異性結合占主導的結合時間內的事件，進行濃度響應擬合，得到特異性更高的濃度響應曲線；優(yōu)選地，所述結合時間為對總體結合時間分布進行單指數(shù)擬合所得的估算值，通過origin-指數(shù)擬合-ExpGo1模型擬合而來，迭代算法為正交距離回歸。[0037]在一些更優(yōu)選的實施例中，當所述外力調控模塊施加的外力為電場力時，施加-0.6v-+1.0v例如-0.4V-+0.8V的電壓；較佳地，先使用正電場例如0-0.8V(不含0)優(yōu)選+0.4V,對納米顆粒施加吸引力5min-20min;后使用負電場例如-0.4-0V(不含0)優(yōu)選-0.2V,對納米顆粒施加斥力10-45min。[0038]本發(fā)明中，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在金表面施加過大的電壓時會發(fā)生電化學反應，導致預期之外的實驗結果。如在小于-0.6v的電壓下，捕獲探針與金表面的Au-s鍵將被還原會巰基-SH。磁場力由電磁鐵或永磁體貢獻，磁場強度恒定，磁場力大小主要受磁鐵與粒子的距離(1-3cm,本發(fā)明優(yōu)選1.5cm)決定。[0039]當所述外力調控模塊施加的外力為磁場力時，使用12vDC、占空比25%、20s的電源驅動磁鑷，先對納米顆粒施加吸引力15min;后對納米顆粒施加斥力15min。[0040]在一些具體的實施例中，(1)所述檢測芯片的制備具有以下特征中的一種或多種：所述玻片為BK-4或BK-7玻片；使用洗液與氫焰除去表面顆粒雜質并提升金膜平整度，所述洗液為食人魚洗液，或酒精和純水；所述還原溶液為TCEP或DTT例如5μM的TCEP或0.1MDTT;所述鈍化劑為巰基聚乙二醇、巰基乙醇，或巰基聚乙二醇甲氧基和巰基聚乙二醇生物素，例如1μM巰基聚乙二醇；所述清洗使用PBS;所述減少非特異性吸附使用巰基乙醇或BSA,例如1μM巰基聚乙二醇；捕獲探針或檢測探針與鈍化分子的比例為1:100-1:1000;和/或，[0041]所述捕獲探針或檢測探針的濃度例如為50nM;和/或，[0042]所述捕獲探針為鎖核酸單鏈，例如鎖核酸分子占單鏈的10～50%優(yōu)選20%。[0043]本發(fā)明的洗液為具有強氧化性，可清潔玻片表面的有機物。其可以為無水乙醇和純水，也可以為食人魚洗液。食人魚洗液制備方法如下：用量筒量取70mL濃硫酸倒進燒杯中，再用量筒量取30mL雙氧水，緩慢倒進裝有濃硫酸的燒杯中，邊倒邊用玻棒攪拌。食人魚洗液能有效清潔玻片表面，有利于后續(xù)的探針修飾。[0044]本發(fā)明的檢測腔為具有抗氧化、抗水性和良好的熱穩(wěn)定性的帶孔模具，能較牢固的固定在鍍金芯片表面，必要時可以用環(huán)氧樹脂粘牢。所述檢測腔例如PDMS腔室的制備方法是用道康寧SYLGARDDC184,其中A、B膠以10:1體積比混合，抽真空后在37度烘箱中靜置[0045]由于ssDNA-SH和mEPG-SH等物質的巰基能相互反應變成雙硫鍵-S-S-,本發(fā)明的還原溶液目的是還原巰基-SH?？紤]到還原溶液對修飾效果的影響，優(yōu)選為三-(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽TCEP和二硫蘇糖醇DTT,其中后者在運用中需要葡聚糖凝膠柱(比如NAP-25)進行[0047]本發(fā)明的第二方面提供一種檢測單分子動態(tài)的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包括：[0048](i)如本發(fā)明的第一方面中所定義的納米顆粒復合物；[0049](ii)如本發(fā)明的第一方面中所定義的檢測探針或捕獲探針。[0050]較佳地，所述系統(tǒng)還包括如本發(fā)明的第一方面中所定義的檢測芯片；和/或，如本發(fā)明的第一方面所定義的單分子成像系統(tǒng)和/或如本發(fā)明的第一方面所定義的外力調控模塊。[0051]本發(fā)明的第三方面提供一種如本發(fā)明第二方面所述的系統(tǒng)在檢測單分子動態(tài)中的應用。[0052]在符合本領域常識的基礎上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實[0056]2.通過外力調控解決了動態(tài)檢測方案中目標分子例如抗體分子不具有普適性的附圖說明[0059]圖1為基于Kretschmann棱鏡耦合結構的表面等離子體共振成像SPRi平臺改建的[0060]圖2為基于蒙特卡洛仿真得到的不同外力介導下的結合時間的概率分布：a.有外力下的勢壘0.048×K?T;b.無外力下的勢壘0.193×KT。[0064]圖6顯示了本發(fā)明的工作流程和miRNA的濃度響應曲線：a.基于電場力調控下[0066]現(xiàn)有單分子動態(tài)分析技術受限于抗體的篩選不能成為一種通用的檢測技術去取代終點檢測，同時經(jīng)過復雜設計和篩選的抗體的弱親和力進一步加劇了濃度限制的問題，案的核心原理在于運用外力去調控與納米顆粒結合的目標分子與芯片表面的受體結合解能量為0.8×1021J,1KgT=4.1操縱分子(manipulatingagent)[0079]a)下方是修飾在芯片表面的捕獲探針，是能與目標分子特異性牢固結合的受體探針。芯片表面除了捕獲探針外還有鈍化分子用來抑制非特異性吸附，兩者的比例在1:100-1:1000之間；[0080]b)中間是目標分子(即待檢測分子),如低豐度蛋白、核酸和生物小分子。捕獲探針和檢測探針分別結合于目標分子的不同位點，如捕獲探針和檢測探針分別結合在多肽的N端(N-terminus)和C端(C-terminus),若目標分子是核酸，則分別結合在5'和3'端。[0081]c)上方采用能與目標分子反復結合解離的探針作為檢測探針，檢測探針錨定在作為報告分子和操縱分子的納米顆粒上，通過報告分子實現(xiàn)對信號的放大，并借助外力調控以實現(xiàn)對目標分子的快速超靈敏檢測；[0082]d)在構建的夾心體系中，檢測探針和捕獲探針的位置可以互換，不會對系統(tǒng)產(chǎn)生本質影響。[0083]3)本發(fā)明提出的表面等離子共振成像(Surfaceplasmonresonanceimaging,SPRi)技術可分為基于Kretschmann棱鏡耦合結構搭建的SPRi,以及油鏡耦合結構的物鏡式SPRM,其中棱鏡型SPRi具有大視野，能高通量的記錄目標分子特異性結合解離帶來的信號放大，更加適合臨床實踐中對檢測技術的通量需求。為了實現(xiàn)大視野、高通量的單分子動態(tài)檢測，本發(fā)明對光路和檢測系統(tǒng)進行了以下優(yōu)化：[0084]a)選用超輻射發(fā)光二極管SLED作為光源，相較于相干性極高的激光光源，SLED光源有著更少的相干條紋，為成像帶來了更純凈的背景。[0085]b)選用棱鏡耦合實現(xiàn)表面等離子共振SPR,有著比物鏡式耦合更大的視野，但其缺點是分辨率不足，因此棱鏡型SPRi往往更常用于對大量樣品(bulksolutionsample)的檢測。本發(fā)明通過光源改進和差分的圖像處理，極大的提高了圖像的信噪比SNR,最終使棱鏡型SPRi能實時檢測到金納米顆粒(粒徑≥30nm)和磁納米顆粒(超順磁顆粒內核，外殼二氧[0086]c)生物分子的相互作用(如核酸雜交和抗原抗體結合)需要在鹽溶液中進行，而金納米顆粒在高鹽溶液中極其不穩(wěn)定。這是由于高鹽溶液下，金顆粒的德拜雙電層會被壓縮，顆粒間的穩(wěn)定性由此打破，這對本發(fā)明所提出的基于外力的動態(tài)檢測造成了極大干擾。為此，本發(fā)明優(yōu)選了合適的鹽濃度用于50nm和150nm的金納米顆粒的單分子動態(tài)檢測，在該濃度下，生物分子間的相互作用依然能進行，同時金納米顆粒也能穩(wěn)定存在。[0087]d)在開源軟件imageJ上對數(shù)據(jù)進行差分處理(后一幀減前一幀),即可得到去除背景噪聲的單分子成像信息，通過手動統(tǒng)計同一位置上顆粒結合和解離的信息，可以獲得每個分子的結合時間，進一步篩選更符合特異性結合的結合壽命的事件進行濃度響應的擬合[0088]4)本發(fā)明提出的外力調控的力場發(fā)生裝置，為了滿足高通量的調控和低成本的要外力調控，原本高親和力的受體-目標分子的結合時間會減少，有別于非特異結合的結合時間(<5s或>300s),能在一定時間內觀察到反復的結合解離事件，實現(xiàn)了普適的動態(tài)檢測(圖[0089]5)為了驗證仿真結合及外力調控理論，先基于易于設計親和力的核酸鏈探針構建了外力調控的單分子動態(tài)檢測，對25個堿基配對長度的核酸目標分子和檢測探針施加-0.4V-+0.8V的電壓，通過分子對結合和解離的總事件以及分子結合時間的兩者的變化證明外力調控確實能起到調控分子運動及動力學行為的作用(圖4的a和b)。[0090]6)本發(fā)明基于外力調控的單分子動態(tài)檢測，涉及到對分子動力學參數(shù)的調節(jié)，而研究分子相互作用的經(jīng)典研究工具表面等離子共振SPR,從SPR發(fā)展而來的單分子成像系統(tǒng)表面等離子共振成像SPRi不單能離散的觀察到單個顆粒的信號，同時還能極好的反映單個分子的結合解離事件，因此基于SPRi構建本發(fā)明實例。[0091]7)本發(fā)明中為了更好的識別外力調控的分子動力學變化，以及減少非特異性吸附帶來的干擾，設置了結合時間窗口來篩選合適的分子結合時間，對特異性結合時間范圍的顆粒繪制的濃度響應曲線圖證明，5-500s(優(yōu)選25-250s)范圍內的結合時間更傾向于是外力調控下的分子特異性結合所產(chǎn)生。隨著時間范圍的縮小，特異性會進一步增高，但會損失一部分檢測事件，在優(yōu)選的時間范圍25-250s內，線性擬合的擬合優(yōu)度可以達到0.98(圖5的[0092]8)本發(fā)明不同于SiMoA和SMC的一大特點是低成本和快速高通量地實現(xiàn)超靈敏檢測，SiMoA的檢測芯片售價為2000美元，而本技術所用檢測芯片總成本在50元人民幣內；此外能將檢測時間控制在15-30分鐘，通過對兩種miRNA(hsa-miR-155,hsa-miR-21)的超靈敏檢測，證明本技術能在15分鐘內實現(xiàn)亞fM水平的檢測(圖6的a和b)。[0093]9)本發(fā)明與SiMREPS不同在于，SiMREPS的目標分析物和探針都是親和力易于調節(jié)通過篩選抗體Fab和FcR來滿足動態(tài)分析的需求。本發(fā)明的外力調控方法能兼容現(xiàn)有的商業(yè)試劑，抗體試劑盒所用的檢測抗體，與目標分子的結合常數(shù)k?！?01?m1s?1,解離常數(shù)k。f≤0.0002s?1;解離平衡常數(shù)KD≤0.2fM;標準情況下的分子結合自由能(standardfreeenergy)≤-25kcal/mol的各種抗體的結合解離進行微調。[0094]下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。[0096]使用表面等離子共振顯微鏡SPRM進行動態(tài)分析檢測，聯(lián)用電化學工作站，利用電化學工作站為檢測體系提供電場力。目標核酸與檢測探針的堿基互補鏈長為25basepair的目標核酸的外力調控動態(tài)分析核酸檢測方法如下：[0097](1)使用基于商業(yè)全內反射顯微鏡(0lympusIX-81)作為檢測儀器，選用放大倍數(shù)60倍，數(shù)值孔徑N.A=1.49的物鏡，光源為超寬帶光源SLED,光源控制電流的強度在140mA,觀察視野為512×512pixels(fullfieldofview:33.28×33.28μm2)。采用micromanager控制CCD相機(Photometrics)記錄SPRM的成像信號。Cellsens軟件用以控制光路的入射角度。電化學工作站為上海辰華的CHI660e,采用三電極法。[0098](2)在鍍有3nm鉻，47nm金的BK-7玻片上，依次用用無水乙醇著用氫焰處理，除去表面顆粒雜質同時進一步提升金膜平整度；之后用環(huán)氧樹脂膠水將自制的聚二甲基硅氧烷PDMS腔室(道康寧SYLGARDDC184,A、B膠以10:1體積比混合，抽真空后在37度烘箱中靜置2h以上，用直徑1mm的打孔器在固化的PDMS上制造出檢測腔室)固定在金片表面并用導電銀膠將導線固定在金表面構成工作電極。其后，用0.1M的二硫蘇糖醇DTT溶液(購于上海生工，產(chǎn)品編號A100281)還原捕獲探針(巰基修飾的單鏈核酸)內二硫鍵1h,之后葡聚糖凝膠柱(比如NAP-25)進行脫鹽處理，去除DTT,緊接著在PDMS與金片構成的檢測腔室內加入濃度為1μM巰基聚乙二醇的孵育30s以鈍化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有濃度為50nM的捕獲探針(與目標核酸的互補長度為25bp)的溶液，孵育2h。孵育完成后移去PBS清洗后得到檢測芯片。巰基功能化檢測探針(與目標核酸的另一端的25bp特異性結合)在50mM的氯化鈉NaCl溶液在室溫搖床孵育24h,最后離心重懸收集包被檢測核酸分子的金納米顆粒。巰基修飾的檢測探針在使用前用DTT溶液還原1h,隨后脫鹽并除去還原溶液。粒表面已通過鹽老化法連接上巰基功能化的25bp檢測探針和含有目標核酸的樣品溶液1μ[0101](5)完成實驗的準備工作后，進行檢測，先對顆粒施加向下的吸引力5min,加速目標核酸和納米顆粒的擴散，后對顆粒施加向上的斥力10min,調整分子的結合時間，以16.7FPS的幀率采集記錄SPRM數(shù)據(jù)。之后在開源軟件imageJ上對數(shù)據(jù)進行差分處理(后一幀減前一幀),即可得到去除背景噪聲的單分子成像信息，通過手動統(tǒng)計同一位置上顆粒結合和解離的信息，可以獲得每個分子的結合時間，進一步篩選更符合特異性結合的結合壽命的事件進行濃度響應的擬合，可得到擬合優(yōu)度R2更好的曲線。[0103]實施例1中使用高分辨率的表面等離子共振顯微鏡SPRM作為單分子成像平臺進行基于外力調控的單分子動態(tài)檢測，對顆粒粒徑有著極高的靈敏度，可以看到并區(qū)分粒徑30-160nm的納米顆粒，但本發(fā)明基于夾心結構進行的單分子動態(tài)檢測中，沒有必要用粒徑非常統(tǒng)，使用具有大視野的表面等離子共振成像平臺SPRi進行動態(tài)分析檢測，聯(lián)用電化學工作站，利用電化學工作站為檢測體系提供電場力。目標分子(本實施例中目標分子為核酸，因此又稱目標核酸)與檢測探針的堿基互補鏈長為25basepair(以下簡稱bp,互補鏈長可以為12～50bp或更長)的目標核酸的外力調控動態(tài)分析核酸檢測方法如下：[0104](1)在光學平臺上基于Kretschmann棱鏡耦合結構的表面等離子體共振成像SPRi改建而來的外力調控下的單分子動態(tài)檢測平臺作為檢測儀器，其中光路中所用光學器件均采購自Thorlabs和大恒光電，氣浮光學平臺來自麓邦技術(LBTEK)。選用放大倍數(shù)2-12倍(優(yōu)選地用于觀測50nm~5μm的金顆粒),數(shù)值孔徑N.A=0.06-0.40的可變透鏡組，光源為Superlum的超寬帶光源SLED(Qphotonics),光源控制電流的強度在140mA,功率為2mW,觀察相機(PhotometricsPrime)記錄SPRi的成像信號。電化學工作站為上海辰華的CHI660e,采用三電極法。[0105](2)在鍍有3院納米所通過磁控濺射工藝完成鍍膜)上，優(yōu)選地，先用濃硫酸(國藥-滬試，53100368)和30%過氧化氫(國藥-滬試，80070961)以7:3體積比混合出的食人魚洗液(制備方法：用量筒倒邊用玻棒攪拌。食人魚洗液能有效清潔玻片表面，有利于后續(xù)的探著用氫焰處理，除去表面顆粒雜質同時進一步提升金膜平整度；之后用環(huán)氧樹脂膠水將自制的聚二甲基硅氧烷PDMS腔室(道康寧SYLGARDDC184,A、B膠以10:1體積比混合，抽真空后在37度烘箱中靜置2h以上，用直徑1mm的打孔器在固化的PDMS上制造出檢測腔室)固定在金溶液還原捕獲探針內二硫鍵1h,緊接著在PDMS與金片構成的檢測腔室內加入濃度為1μM巰基聚乙二醇的孵育30s以鈍化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有濃度為50nM的捕獲探針(與目標核酸的互補長度為25bp的鎖核酸單鏈，其中鎖核酸占整體鏈段的10-50%,優(yōu)選醇孵育30min減少非特異吸附；最后1×PBS清洗后得到檢測芯片。[0106](3)制備核酸探針包被的金納米顆粒，優(yōu)選地，使用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)取代經(jīng)典鹽老化法中的金硫鍵Au-S,使修飾流程更加簡便和穩(wěn)定。將1012NPs/mL的鏈霉親和素包被金納米顆粒(Nanopartz,C11-150-TS-PBS-50-1,粒徑150nm)與1μM的巰基功能化檢測探針(上海生工合成，一端被生物素修飾的單鏈核酸ssDNA,能與目標核酸互補配對結合，配對鈉濃度達到500mM后，維持鹽濃度不變在室溫搖床孵育24h,最后離心重懸收集包被檢測探針的金納米顆粒。經(jīng)本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，由于核酸鏈的包被，會使原本不耐鹽的金納米顆粒在[0107](4)將檢測芯片置于棱鏡上觀測位置，兩者間滴加折射率匹配液(0lympus,F30CC,折射率n=1.518),改變入射光角度至69-72度(優(yōu)選71度),即可產(chǎn)生SPR效應。隨著SPR效應進行。通過流體通道先往檢測腔室內注入內含濃度為150mM的NaCl的檸檬酸鈉緩沖液，即1×SSC緩沖液，然后緩慢通入混有納米顆粒和目標分子的樣品溶液，其中，顆粒濃度為化學工作站施加電場力。[0108](5)樣品檢測，優(yōu)選地，先對帶負電的金納米顆粒施加向下的吸引力15min(正電場，優(yōu)選+0.4V),加速目標核酸和納米顆粒的擴散，后對顆粒施加向上的斥力45min(負電場，優(yōu)選-0.2V),調節(jié)目標分子與探針的結合時間，以16.7FPS的幀率采集記錄SPRi數(shù)據(jù)。[0109](6)對所采集的圖像進行處理，包括通過開源軟件imageJ對圖像進行差分處理(后一幀減前一幀),得到去除背景噪聲的單分子成像信息；通過手動統(tǒng)計同一位置上顆粒結合和解離的信息，可以獲得每個分子的結合時間，進一步篩選更符合特異性結合的結合壽命的事件，根據(jù)顆粒的特異性吸附和非特異性吸附的時間不同，可以區(qū)分兩者進行分析。[0110](7)對特異性吸附的結合和解離事件進行累積統(tǒng)計以得到動態(tài)分析結果，結合解離事件的總數(shù)和結合時間(該結合時間為對總體結合時間分布進行單指數(shù)擬合所得的估算值，通過origin-指數(shù)擬合-ExpGo1模型擬合而來，迭代算法為正交距離回歸)隨外加電壓的變化的結果證明外力調控的效果(圖4a和b)。[0111]實施例3:[0112]微小核酸miRNA作為腫瘤早篩的一項生物標志物具有廣闊的應用前景，本實例選用hsa-miR-29a(miR-29a)作為目標核酸，其與檢測探針的堿基互補鏈長為12bp,其外力調控動態(tài)分析核酸快速檢測方法如下：[0113](1)在光學平臺上基于Kretschmann棱鏡耦合結構的表面等離子體共振成像SPRi改建而來的外力調控下的單分子動態(tài)檢測平臺作為檢測儀器，其中光路中所用光學器件均采購自Thorlabs和大恒光電，氣浮光學平臺來自麓邦技術(LBTEK)。選用放大倍數(shù)60倍，數(shù)值孔徑N.A=1.49的透鏡，光源為Superlum的超寬帶光源SLED(Qphotonics),光源控制電流的強度在140mA,功率為2mW,觀察視野為2048×2048pixels(fieldofview:221.2×221.2μm2)。采用micromanager控制CCD相機(Photome學工作站為上海辰華的CHI660e,采用三電極法。[0114](2)在鍍有3nm鉻，47nm金的BK-7玻片(BK-7玻片購于賽默飛院納米所通過磁控濺射工藝完成鍍膜)上，先用濃硫酸(國藥-滬試，53100368)和30%過氧化氫(國藥-滬試，80070961)以7:3體積比混合出的食人魚洗液沖洗吹干，接著用氫焰處理，除去表面顆粒雜質同時進一步提升金膜平整度；之后用環(huán)氧樹脂膠水將自制的聚二甲基硅徑0.2mm的打孔器在固化的PDMS上制造出檢測腔室)固定在金片表面并用導電銀膠將導線固定在金表面構成工作電極。其后，用1μM-50μM選的濃度為5μM),緊接著在PDMS與金片構成的檢測腔室內加入濃度為1μM巰基聚乙二醇的孵育30s以鈍化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有濃度為10-500nM(優(yōu)選50nM)的捕獲探針(與目標miRNA的互補長度為12bp的鎖核酸單鏈，插入整體鏈段的10-50%的鎖核酸分子，鎖核酸比例優(yōu)選20%)的溶液，孵育6h。孵育完成后移去溶液，用1×PBS溶液清洗三遍，再用1μM巰基聚乙二醇孵育30min減少非特異吸附；最后1×PBS清洗后得到檢測芯片。[0115](3)用生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-streptavidinsystem,BAS)制備核酸包被的金納米顆粒。將1012NPs/mL鏈霉親和素包被的金納米顆粒(Nanopartz,C11-50-TS-PBS-50-1,粒徑50nm)與1μM的生物素功能化檢測分子(單鏈核酸ssDNA)在TE緩沖液中共孵育30min,最后離心重懸收集包被檢測探針的金納米顆粒。[0116](4)將檢測芯片置于棱鏡上觀測位置，兩者間滴加折射率匹配液(0lympus,F30CC,機收集到的光強急劇下降，光強在SPR角附后緩慢通入混有納米顆粒和目標分子的樣品溶液，其中，顆粒濃度為101?NPs/mL,流速為5μL/min。同時，將對電極和參比電極插入檢測樣品中，形成回路，用于電化學工作站施加電場[0117](5)樣品檢測，優(yōu)選地，先對帶負電的金納米顆粒施加向下的吸引力5min(正電場，+0.4V),加速目標核酸和納米顆粒的擴散，后對顆粒施加向上的斥力15min(負電場，-0.2V),調節(jié)目標分子與探針的結合時間，以16.7FPS的幀率采集記錄SPRi數(shù)據(jù)。[0118](6)對所采集的圖像進行處理，通過開源軟件imageJ對圖像進行差分處理(后一幀減前一幀),得到去除背景噪聲的單分子成像信息；手動統(tǒng)計統(tǒng)一位置下顆粒的結合和解離事件，由此獲得每個分子結合的壽命；最后根據(jù)結合時間篩選出特異性結合的事件。根據(jù)顆粒的特異性吸附和非特異性吸附的時間不同，可以區(qū)分兩者進行分析。[0119](7)對特異性吸附的結合和解離事件進行累積統(tǒng)計以得到動態(tài)分析結果。miR-29a的結合時間分布圖可以分特異性吸附和非特異性吸附，通過進一步優(yōu)化參數(shù)可以得到，在25-250s的時間窗口內濃度標準曲線有著較好的線性擬合優(yōu)度R2=0.98(圖5的a),圖5的b中虛線代表空白組時檢測到的顆粒事件，通過虛線和濃度響應曲線的交點獲得樣品的檢測[0120]實施例4:[0121]為了證明本發(fā)明具有快速超靈敏檢測核酸的能力，本實例選取兩種癌癥相關miRNA,hsa-miR-21(miR-21)和hsa-miR-155(miR-155)作為目標核酸，與檢測探針的堿基互[0122](1)在光學平臺上基于Kretschmann棱鏡耦合結構的表面等離子體共振成像SPRi改建而來的外力調控下的單分子動態(tài)檢測平臺作為檢測儀器，其中光路中所用光學器件均采購自Thorlabs和大恒光電，氣浮光學平臺來自麓邦技術(LBTEK)。選用放大倍數(shù)40倍，數(shù)值孔徑N.A=0.65的透鏡，光源為Superlum的超寬帶光源SLED(Qphotonics),光源控制電流的強度在140mA,功率為2mW,觀察視野為2048×2048pixels(fieldofview:1106×1106μ工作站為上海辰華的CHI660e,采用三電極法。院納米所通過磁控濺射工藝完成鍍膜)上，先用濃硫酸(國藥-滬試，53100368)和30%過氧化氫(國藥-滬試，80070961)以7:3體積比混合出的食人魚洗液沖洗吹干，接著用氫焰處理，除去表面顆粒雜質同時進一步提升金膜平整度；之后把可重復使用的硅基細胞培養(yǎng)板(SARSTEDT,flexiPERM)固定lμM-50μM的TCEP(三羧乙基膦)溶液還原捕獲探針內二硫鍵1h(TCEP物質的量需要在DNA物質的量的100倍或以上，優(yōu)選的濃度為5μM),緊接著在硅基培養(yǎng)板與金片構成的檢測腔室內加入濃度為1μM巰基聚乙二醇的孵育30s以鈍化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有濃度為10-500nM(優(yōu)選50nM)的捕獲探針(與目標miRNA的互補長度為12bp的鎖核酸單鏈，插入整體鏈段的10-50%的鎖核酸分子，鎖核酸比例優(yōu)選20%)的溶液，孵育6h。孵育完成后移去溶清洗后得到檢測芯片。[0124](3)用生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-streptavidinsystem,BAS)制備核酸包被的金納米顆粒。將1012NPs/mL鏈霉親和素包被的金納米顆粒(Nanopartz,C11-50-TS-PBS-50-1,粒徑50nm)與1μM的生物素功能化檢測分子(單鏈核酸ssDNA)在TE緩沖液中共孵育30min,最后離心重懸收集包被檢測探針的金納米顆粒。[0125](4)將檢測芯片置于棱鏡上觀測位置，兩者間滴加折射率匹配液(0lympus,F30CC,機收集到的光強急劇下降，光強在SPR角附通道先往檢測腔室內注入內含濃度為300mM的NaCl的檸后緩慢通入混有納米顆粒和目標分子的樣品溶液，其中，顆粒濃度為101?NPs/mL,流速為5μL/min。同時，將對電極和參比電極插入檢測樣品中，形成回路，用于電化學工作站施加電場[0126](5)樣品檢測，優(yōu)選地，先對帶負電的金納米顆粒施加向下的吸引力5min(正電場，+0.4V),加速目標核酸和納米顆粒的擴散，后對顆粒施加向上的斥力15min(負電場，-0.2V),調節(jié)目標分子與探針的結合時間，以30FPS的幀率采集記錄SPRi數(shù)據(jù)。[0127](6)對所采集的圖像進行處理，通過開源軟件imageJ對圖像進行差分處理(后一幀減前一幀),得到去除背景噪聲的單分子成像信息；手動統(tǒng)計統(tǒng)一位置下顆粒的結合和解離事件，由此獲得每個分子結合的壽命；最后根據(jù)結合時間篩選出特異性結合的事件。根據(jù)顆粒的特異性吸附和非特異性吸附的時間不同，可以區(qū)分兩者進行分析。[0128](7)統(tǒng)計特異性結合時間內的結合解離事件，可以得到兩種miRNA的結合解離事件隨濃度變化曲線，擬合出標準曲線(standardcurve),并根據(jù)空白對照組(blank)的結合解Detection,LoD)。miR-21和miR-155的檢測限分別為0.26和0.17fM(圖6的a和b),其中，miR-21的R2為0.96,miR-155的R2為0.83。[0130]使用表面等離子共振成像系統(tǒng)SPRi進行基于外力調控的高通量動態(tài)分析檢測，聯(lián)用電化學工作站，利用電化學工作站為檢測體系提供電場力。對阿茲海默癥的生物標志物A[0131](1)在光學平臺上基于Kretschmann棱鏡耦合結構的表面等離子體共振成像SPRi改建而來的外力調控下的單分子動態(tài)檢測平臺作為檢測儀器，其中光路中所用光學器件均采購自Thorlabs和大恒光電，氣浮光學平臺來自麓邦技術(LBTEK)。選用放大倍數(shù)10倍，數(shù)值孔徑N.A=0.25的透鏡，光源為Superlum的超寬帶光源SLED(Qphotonics),光源控制電流的強度在140mA,功率為2mW,觀察視野為2048×2048pixels(fieldofview:1.33×電化學工作站為上海辰華的CHI660e,采用三電極法。院納米所通過磁控濺射工藝完成鍍膜)上，先用濃硫酸(國藥-滬試，53100368)和30%過氧化氫(國藥-滬試，80070961)以7:3體積比混合出的食人魚洗液沖洗吹干，接著用氫焰處理，除去表面顆粒雜質同時進一步提升金膜平整度；之后把可重復使用的硅基細胞培養(yǎng)板lμM-50μM的TCEP(三羧乙基膦)溶液還原捕獲探針內二硫鍵1h(本發(fā)明中，TCEP物質的量需要在DNA物質的量的100倍或以上，本實施例優(yōu)選的濃度為5μM),緊接著在硅基培養(yǎng)板與金片構成的檢測腔室內加入濃度比例為50:1～500:1(優(yōu)選100:1)的巰基聚乙二醇甲氧基(HS-mPEG,Mw=500Da)和巰基聚乙二醇生物素(HS-PEG5K-biotin,Mw=3400-15000Da,優(yōu)選5000、7000Da)孵育4h修飾金表面。之后加入濃度為1mg/mL鏈霉親和素孵育1h,接著加入Fc端修飾了生物素的捕獲抗體(多克隆抗體clone12F4,特異性結合Aβ1-42的C-terminus,BioLegend,Inc.)溶液，濃度5-50ng/mL(優(yōu)選10ng/mL)孵育2h。最后用1%BSA封閉30min以減少非特異性吸附。其中，上述每個步驟前先移除上一步驟的原液并用1×PBS溶液清洗三遍。[0133](3)制備檢測抗體包被的金納米顆粒。將1012NPs/mL鏈霉親和素包被的金納米顆粒(Nanopartz,C11-50-TS-PBS-50-1,粒徑50nm)與500ng/mL-5μg/mL(優(yōu)選2μg/mL)的Fc端生物素功能化檢測抗體(多克隆抗體clone6E10,特異性結合Aβ1-42的N-terminus,BioLegend,Inc.)共孵育30min,最后離心重懸收集包被檢測抗體的金納米顆粒。[0134](4)將檢測芯片置于棱鏡上觀測位置，兩者間滴加折射率匹配液(0lympus,F30CC,折射率n=1.518),調節(jié)入射光角度至71度，即可產(chǎn)生SPR效應。隨著SPR效應的增強，CCD相機收集到的光強急劇下降，光強在SPR角附近達到最低值。檢測在SPR角附近進行。通過流體通道先往檢測腔室內注入內含濃度為300mM的NaCl的Tris-HCL緩沖液，然后緩慢通入混有μL/min。同時，將對電極和參比電極插入檢測樣品溶液中，形成回路，通過電化加電場力。[0135](5)樣品檢測，優(yōu)選地，先對帶負電的金納米顆粒施加向下的吸引力5min(正電場，+0.4V),加速目標蛋白和納米顆粒的擴散，后對顆粒施加向上的斥力15min(負電場，-0.2V),調節(jié)目標蛋白與檢測探針的結合時間，以15-60FPS(優(yōu)選16.7FPS)的幀率采集記錄SPRi數(shù)據(jù)。[0136](6)對所采集的圖像進行處理，通過開源軟件imageJ對圖像進行差分處理(后一幀減前一幀),得到去除背景噪聲的單分子成像信息；手動統(tǒng)計統(tǒng)一位置下顆粒的結合和解離事件，由此獲得每個分子結合的壽命；最后根據(jù)結合時間篩選出特異性結合的事件。根據(jù)顆粒的特異性吸附和非特異性吸附的時間不同，可以區(qū)分兩者進行分析。[0137](7)對特異性吸附的結合和解離事件進行累積統(tǒng)計以得到動態(tài)分析結果(圖7的a)。電場調控下目標多肽的檢測限為4.34fg/mL(～1.08fM),可見電場力調節(jié)范圍較小，對親和力較強的抗原抗體的結合難以實現(xiàn)滿意的調控，后續(xù)選用更大的外力對顆粒進行調控。[0138]實施例6:[0139]本實例在實例5的基礎上，將電場調控變?yōu)榇艌稣{控，通過更大的外力來調節(jié)高親和力抗體與目標蛋白的結合時間，其外力調控的通用動態(tài)分析方法如下：[0140](1)在光學平臺上基于Kretschmann棱鏡耦合結構的表面等離子體共振成像SPRi改建而來的外力調控下的單分子動態(tài)檢測平臺作為檢測儀器，其中光路中所用光學器件均孔徑N.A=0.25的透鏡，光源為Superlum的超寬帶光源SLED(Qphotonics),光源控制電流的強度在140mA,功率為2mW,觀察視野為2048×2048pixels(fieldofview:3.325×磁場力用磁鑷提供，磁鑷為MagnetechCorpora