題目：Endomucin在結腸癌中的表達及其對結腸癌細胞增殖、轉移能力的影響Endomucin在結腸癌中的表達及其對結腸癌細胞增殖、轉移能力的影響前言結腸癌(Coloncancer，CC)是世界上疾病死亡率排名第三的惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界范圍內都正在逐年升高[1]。盡管近幾十年來對CC轉移機制的研究已經取得了實質性的進展，但仍然缺乏預防CC和治療腫瘤轉移的有效方法。據報道，當患者就診時已約有50％的CC患者已經發(fā)生遠處轉移，結腸癌發(fā)生遠處轉移后可顯著降低CC患者的5年生存率[2]，由此可見，腫瘤發(fā)生遠處轉移已成為結腸癌患者死亡的重要原因之一。結腸癌與正常結腸組織相比，其發(fā)生的病理性改變主要原因之一是細胞表面分泌的黏蛋白的數(shù)量和結構發(fā)生改變[3]，導致細胞與細胞之間、細胞與基質之間相互作用發(fā)生改變，最終影響到腫瘤細胞與內皮細胞的黏附、侵襲及轉移[4]。黏蛋白(Mucin)是由上皮細胞分泌的、具有高度O-糖基化修飾的糖蛋白，大多數(shù)黏蛋白核心聚糖是由N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖(Gal)，巖藻糖(Fuc)和與絲氨酸連接的神經氨酸(唾液酸，NeuNAc)組成的O-連接寡糖[5]。截止目前已經發(fā)現(xiàn)超過20種黏蛋白，按存在形式分為膜結合黏蛋白和分泌型黏蛋白[6,7]，MUC2，MUC5AC，MUC5B，MUC6，MUC7，MUC9和MUC19是分泌型粘蛋白，它們的主要功能是參與粘液形成以保護下面的上皮細胞免受與炎癥和感染相關的損傷。膜結合的粘蛋白包括MUC1，MUC3A/B，MUC4，MUC12，MUC13，MUC15，MUC16，MUC17，MUC20和MUC21。它們被認為在細胞相互作用，分子細胞信號傳導和生物過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌，肺癌，乳腺癌，結腸，卵巢癌和前列腺癌中均觀察到了黏蛋白失調，其中MUC1表現(xiàn)出過表達特征[8]。MUC4在結腸腺癌和胰腺癌中過表達[9,10]。MUC16在卵巢癌和胰腺癌中表達升高[11]。Gronnier等人發(fā)現(xiàn)，缺乏MUC1的食道癌細胞的增殖，遷移和侵襲能力減弱。當細胞不表達MUC1時，皮下種植的腫瘤大小也隨之減小[12]。類似的，在不含MUC13基因的胰腺癌細胞系中表達全長MUC13基因能夠顯著增加細胞運動性，侵襲，增殖和克隆形成。外源性MUC13表達顯著增強胰腺腫瘤生長并降低異種移植小鼠模型中的存活率[13]。這些研究表明，黏蛋白在癌細胞增殖，遷移，侵襲和腫瘤生長中起關鍵作用。Endomucin(EMCN,MUC14)作為黏蛋白家族成員之一，是一種內皮唾液酸樣的I型糖蛋白。Liu發(fā)現(xiàn)，當內皮細胞被腫瘤條件培養(yǎng)基(TCM)或特異性血管生成因子如bFGF（堿性成纖維細胞生長因子）和TNFα（腫瘤壞死因子）刺激時，Endomucin表達增加，表明Endomucin可能在腫瘤血管生成中起作用[14]。同時，Endomucin可通過上調血管內皮生長因子（VEGF）來誘導血管形成，從而促進內皮細胞遷移，增殖[15]。這些研究表明，Endomucin可能與腫瘤的發(fā)生，轉移密切相關。但Endomucin在結腸癌中的表達情況以及對結腸癌增殖、轉移的影響尚不清楚。本研究擬利用結腸癌組織切片，通過免疫組織化學的方法檢測分析Endomucin蛋白在人體結腸癌組織的表達水平，并與臨床病理資料相結合，探討Endomucin蛋白的表達與腫瘤分化程度的關系。在結腸癌細胞系中通過上調或干擾Endomucin蛋白的表達來明確Endomucin對結腸癌細胞增殖和遷移能力的影響，為結腸癌的初期診斷、靶向治療以及預后評估提供新的理論依據。1實驗材料1.1病理組織與細胞人結腸癌HCT116細胞由本實驗室保存，結腸癌病人組織與結腸癌旁正常組織由成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化內科收集。1.2主要實驗儀器設備生物安全柜、微量分光光度計、垂直凝膠電泳槽、凝膠成像儀(721BR09246)、PCR基因擴增儀、酶標儀(iMark)購于BIO-RAD（美國）電轉儀、電泳儀(Mini-SubcellGT)購于六一電泳儀廠（北京）移液器(10μL，200μL，1mL)、CO2培養(yǎng)箱（ThermoBB15）、NanoDrop2000分光光度計均購自于ThermoScientific（美國）倒置熒光顯微鏡購于徠卡(MF53)超純水系統(tǒng)(ZYCGF-I-20L)購于優(yōu)普公司高速冷凍離心機(ThermoScientificMR23i)購于江蘇南京溫諾儀器設備有限公司細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)六孔板購于NEST生物公司4℃、-20℃冰箱購于海爾(BCD-263)-80℃冰箱thermo(903)1.3試劑配制(1)磷酸鹽緩沖液(PBS)：稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4)7.16g、氯化鈉(NaCl)16.00g磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.40g，氯化鉀(KCl)0.40g，充分溶解于1600mL去離子水中，然后滴加濃鹽酸(HCl)調節(jié)pH值至7.4，再加去離子水定容至2000mL。然后分裝于500mL血清瓶中，高溫高壓滅菌后，于4oC保存?zhèn)溆谩?2)PBS/Tween20(PBST)溶液的配置：向500mL的PBS中加入0.50mL的Tween-20，充分混勻后室溫保存?zhèn)溆谩?3)5%脫脂牛奶封閉液的配制：將2.00g脫脂奶粉溶解于40mLPBST中。現(xiàn)用現(xiàn)配。(4)檸檬酸鹽緩沖液：分別稱取Na3C6H5O7.2H2O試劑3.00g和檸檬酸試劑0.40g放進燒杯內，加入蒸餾水1000mL放置于磁力攪拌器上混合均勻，待完全溶解后倒入容量瓶室溫保存?zhèn)溆谩?5)10%SDS溶液：稱取SDS固體顆粒1.00g倒入15mL的離心管中，加入10mL的純水進行充分溶解，室溫保存。(6)濕轉電泳液緩沖液(pH=8.3)：分別稱取Trisbase試劑3.03g、甘氨酸試劑18.76g和SDS試劑1.00g將上述試劑放入燒杯中加入蒸餾水至1000mL充分溶解，室溫保存。(7)濕轉轉膜緩沖液(pH=8.3):分別稱取甘氨酸試劑14.40g和Trisbase試劑3.03g，加入400mL超純水溶解，再加入200mL的甲醇溶劑，用去離子水定容至1000mL混合均勻，常溫保存。(8)TBST緩沖液配置：分別稱取2.42gTris、Nacl8.77g、Tween-200.50mL加入純水定容至1000mL，配置成(含0.05％Tween-20的TBS緩沖液)1.4主要試劑耗材CCK-8試劑盒購于biosharp生物科技公司（上海）；PrimeScript?RTMasterMix(PerfectRealTime)購于寶日醫(yī)生物技術公司（北京）；RPMI-1640培養(yǎng)基購于HyCloneLaboratories公司（美國）；青霉素和鏈霉素、胎牛血清（FBS）、胰酶均購于Gibco公司（美國）；1.0MTris-HCl、1.5MTris-HCl、RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、PMSF蛋白酶抑制劑購于碧云天生物科技公司（上海）；蛋白預染maker、Trizal試劑購于Thermo公司（美國）；PVDF膜、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購于Millipore公司；山羊抗兔IgG(H+L)二抗、辣根酶山羊抗兔購于proteintech技術有限公司（武漢）；SDS、30%丙烯酰胺、10%AP、TEMED、DMSO購于sigma公司；10%中性甲醛、無水乙醇、甘油、甲醇、購于科龍化工試劑廠（成都）；Endomucin一抗購于Abcam有限公司（英國）與Genetex有限公司（美國）；SABC試劑盒購于中杉金橋生物技術有限公司（北京）；Transwell小室購于康寧生物科技公司（美國）2實驗方法2.1免疫組織化學檢測2.1.1石蠟切片的制作：將從手術取下的結腸癌組織以及癌旁正常組織塊放入10%甲醛中固定24h。倒掉，流水沖洗組織塊24h。按照75%、85%、95%、100%的酒精濃度梯度依次脫水30min，再置于二甲苯中透明30min以除去組織塊上酒精。將組織塊置于含有已溶化的石蠟的溶蠟箱保溫。待石蠟完全浸入組織塊后進行包埋。隨即在切片機上切成厚度為5μm的石蠟切片，展片、粘片。將切片好的石蠟組織放入65℃烤箱中，烤干待用。2.1.2組織切片免疫組化將準備好的石蠟組織切片在60℃的烤箱中烘烤約2h，放入二甲苯缸浸泡3次，每次15min。脫蠟完成后將組織切片在濃度為100%、85%、75%酒精梯度中依次浸泡，每次5min。復水完成后用PBS漂洗，每次3min。隨即將切片放入3%H2O2溶液中室溫孵育15min，再用PBS漂洗3次，每次5min。將切片置于盛有檸檬酸鹽緩沖液的修復盒中，放入高壓鍋，煮沸15min進行抗原修復。取出冷卻至室溫。用PBS緩沖液洗3次，每次5min。滴加適量正常山羊血清工作液室溫孵育20min，傾去血清，勿洗。隨即滴加濃度為1:100的Endomucin抗體,同時滴加PBS作為空白對照，4℃冰箱過夜。次日PBS漂洗3次，每次3min。組織切片上滴加由生物素標記的山羊抗兔二抗，37℃孵箱中孵育18-20min；用PBS洗滌3次，每次5min。滴加HRP標記的鏈酶卵白素工作液于37℃孵箱中孵育20min。用PBS洗滌3次，每次5min。DAB顯色，蘇木素復染。75%酒精、85%酒精、100%酒精從低到高依次經過脫水，最后于二甲苯缸中透明10min，立即用中性樹膠封片。2.2實時熒光定量PCR檢測結腸癌組織及癌旁正常組織中Endomucin的mRNA表達2.2.1提取細胞及組織中的RNA收集細胞及組織樣品，腫瘤組織塊添加液氮研磨至粉狀。按每100mg組織和5×106個細胞的標準加入1mLTrizol，反復吹打以裂解細胞。將上述組織或細胞的Trizol裂解液轉入EP管中，室溫放置5min后加入0.2mL氯仿，用力震蕩混勻，室溫放置3min。待EP管中白色液體漂浮至上層后，以12000g，4℃低溫離心15min。離心后取上層水樣放置到新的EP管中，加入0.5mL異丙醇。室溫下放置10min后12000g，4℃離心10min。棄上清，加入1mL75%酒精進行洗滌，渦旋混合后7500g，4℃離心5min。棄上清，待干燥后加入30μLRNase-free溶解RNA，放入-80℃冰箱保存。2.2.2實時熒光定量PCR檢測去除基因組DNA反應：在無酶EP管內依次加入5×gDNAEraserBuffer12μL，gDNAEraser6μL，RNaseFreedH2O30μL。冰上混合后分裝至6個PCR反應管中，隨即加入2μLRNA。室溫反應30min后放入4℃冰箱內保存。逆轉錄cDNA反應：在無酶EP管內依次加入PrimeScripRTEnzymeMixI6μL，RTPrimerMix6μL，5×PrimeScriptBuffer2(forRealTime)24μL，RNaseFreedH2O24μL。冰上混合后分裝到步驟一反應后的PCR管中，設置PCR程序：37℃反應15min、85℃反應5s，結束，收取cDNA保存至-80℃冰箱，待用。cDNA擴增反應：Endomucin上游引物序列5'-ATTTGTTCTGGTGGGTTTGT-3'，下游引物序列5'-TGCAGGACTTTCTCCTTTTC-3'；GAPDH上游引物序列5'-CCCATCACCATCTTCCAGGA-3'，下游引物序列5'-CATCGCCCCACTTGATTTTG-3'以上引物均有生工生物工程公司設計合成（上海）。在無酶EP管內依次加入TBGreenPremixExTaqII(TliRNaseHPlus)75μL，PCRForwardPrimer(10uM)6μL，PCRReversePrimer(10uM)6μL，RNaseFreedH2O51μL，冰上混勻之后分裝到6個PCR反應管中，再于每管內加入2μLcDNA樣品。設置PCR擴增程序：95℃預變性30s，95℃變性10s，60℃退火30s，總共40次循環(huán)。反應完成后記錄各組CT值，根據比較CT值方法計算mRNA相對表達量。2.3細胞培養(yǎng)將結腸癌細胞HT-29,HCT116,LoVo,SW620,SW480從液氮罐中取出置于37℃的水浴鍋中熔化，1000rpm，3min離心后接種于含10%FBS，1640培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)皿中，在5%CO2飽和濕度，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進行常規(guī)性消化和細胞傳代。2.4構建穩(wěn)定高表達與低表達Endomucin的HCT116細胞株待細胞長至對數(shù)期且細胞狀態(tài)良好時用胰酶消化后按每孔8×104個細胞接種到六孔板中，次日，從-80℃冰箱中取出Endomucin高表達病毒，低表達病毒和空白對照病毒在冰上熔化，取出六孔板做好標記，查閱資料得知HCT116的感染復數(shù)為30，配置含3種病毒的培養(yǎng)基，以換液的形式加入六孔板中。置于5%CO2飽和濕度的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10h，換取新鮮培養(yǎng)基。第三天時消化六孔板中細胞轉移至細胞培養(yǎng)皿中，按10μg/mL的濃度在培養(yǎng)皿中加入嘌呤霉素篩選病毒轉染成功的細胞，直至細胞熒光率約為100%2.5Westernblot與RT-PCR檢測轉染后HCT116細胞Endomucin蛋白和mRNA的表達(1)總蛋白的提?。簩CT116細胞分別傳代于兩個培養(yǎng)皿孔板中，每個板鋪1×106個的細胞，等細胞密度約90%時將細胞置于冰上，除去培養(yǎng)液，用PBS漂洗細胞兩次，盡量棄凈PBS。每皿細胞滴加200uLRIPA裂解液后置冰上裂解15min左右，接著用細胞刮反復刮細胞，待裂解液變得渾濁，繼續(xù)置冰上繼續(xù)裂解15min。最后，在4oC下通過12000rmp/min離心15min后將上清液中的細胞裂解產物分別收集至標記好的1.5mLEP管中，置于-80oC保存?zhèn)溆谩?2)蛋白濃度的測定：按照碧云天生物技術有限公司（上海）提供的試劑說明書制定制作標準蛋白濃度曲線。將蛋白樣品用1×PBS稀釋20倍，取96孔板每個樣品每孔加入稀釋的待測蛋白樣品20uL，每個待測樣品作三個副孔，每孔加入200uLBCA工作液，然后靜置37℃，30min后用酶標儀測定562nm波長處的吸光度，據公式算出蛋白樣品的濃度，確定最終上樣體積。(3)SDS凝膠電泳：配置濃度為10%分離膠，5%濃縮膠，配方如下表2-1灌入玻板后，立即插入梳子。待膠凝固后加入蛋白樣品。濃縮膠恒壓90V電泳30min，當?shù)鞍譓arker電泳進入分離膠，分離出條帶后，轉換至恒壓120V，當溴酚藍電泳至分離膠2/3處，即停止電泳，關閉電泳儀。表2-SEQ表格\*ARABIC1SDS凝膠配方試劑10%分離膠5%的濃縮膠ddH2O4.0mL2.1mL1.5MTris-HCl(PH8.8)2.5mL——1MTris-HCl(PH6.8)——0.4mL30%Acr/Bis3.3mL0.5mL10%SDS100μL30μL10%APS100μL30μLTEMED4.0μL4.0μL(4)轉膜：電泳完成，取出凝膠，切除濃縮膠。取與分離膠大小相同的PVDF膜，在甲醇中浸泡1min，轉至轉膜緩沖液中浸泡，電轉盒負極在下，依次放上3塊濾紙，凝膠，PVDF膜，3塊濾紙。合上電轉盒，加上足量的轉膜緩沖液，于冰上恒流250mA轉膜90min。(5)封閉與孵育抗體：轉膜完成后將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2h。根據檢測的目的條帶蛋白分子量不同，在Marker指示的相應位置分別剪下條帶，并將條帶放入相應的一抗（兔抗Endomucin1:1000；鼠抗β-actin1:5000），使始終浸沒在抗體溶液中，搖床上振蕩4oC孵育過夜。次日用PBST于搖床洗膜3次，每次10min。二抗孵育：加入HRP標記的二抗，在搖床上37oC振蕩孵育2h。用PBST洗滌3次，每次10min。(6)ECL化學發(fā)光顯色：分別取等體積試劑中的A液、B液進行混合。將PVDF膜輕輕接觸濾紙吸干液體，轉印有蛋白質的一面朝上，將辣根過氧化物酶化學發(fā)光液均勻涂在PVDF膜上。用Bio-Rad化學發(fā)光凝膠成像儀采集圖像、保存、分析。2.6CCK-8檢測Endomucin對細胞增殖能力的影響在細胞處于對數(shù)生長期時，用胰酶將細胞消化下來，細胞計數(shù)，將細胞濃度調整至5×104個/mL；根據合適的鋪板細胞數(shù)，每孔約100μL細胞懸液接種至96孔板，設置4個復孔；在5%CO2飽和濕度，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設置相應的時間觀察點，24h、48h、72h、96h；在各自對應的觀察時間節(jié)點，配置10%濃度的CCK-8溶液的1640培養(yǎng)基，通過換液的方式加入96孔板中。將96孔板放入37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育2h；用多功能酶標儀檢測各組細胞波長在450nm下的吸光度。2.7Transwell小室實驗法檢測Endomucin對結腸癌細胞遷移能力的影響在24孔板中加入700μL含有30%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，將Transwell小室放入孔中，上室加入200μL用培養(yǎng)基原液配制的細胞懸液（濃度為5×105個/mL），在5%CO2飽和濕度，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時后取出，棄去液體后以4%的多聚甲醛固定液固定30min，0.5%結晶紫染色20min，最后反復用PBS洗去上室的結晶紫，同時用棉簽輕柔擦拭上室中的細胞；于Nikon倒置顯微鏡下，拍攝下室細胞（100倍下分別取5個視野拍照計數(shù)，取平均值，每組設3個平行樣本，取均數(shù)。將穿過小室膜下表面的的細胞數(shù)確定為遷移指標，穿過膜的細胞個數(shù)越多代表細胞的遷移能力越強，使用ImageProsPlus軟件計數(shù)所拍攝圖片內細胞數(shù)目,并做統(tǒng)計分析。）2.8統(tǒng)計學分析統(tǒng)計學分析采用SPSS16.0軟件完成。所有實驗數(shù)據均通過3次獨立重復實驗平均值±SD獲得。兩組之間的數(shù)據分析采用不配對student'st檢驗進行方差分析。以p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。3結果3.1結腸癌組織中Endomucin蛋白的表達與臨床病理特征的關系免疫組織化學染色結果顯示，Endomucin蛋白的表達主要位于結腸癌組織細胞的細胞質與細胞膜上，Endomucin的陽性表達呈現(xiàn)棕黃色，黃色和棕色。按腫瘤細胞染色陽性比例評分的評估標準：0分（染色陽性比例≤5%），1分（染色陽性比例為6%～25%），2分（染色陽性比例為26%～50%），3分（染色陽性比例>51%）；按腫瘤細胞染色強度評分的評估標準：0分（未染色），1分（輕度染色，黃色），2分（中度染色，棕黃色），3分（重度染色，棕色）。按免疫反應積分法（腫瘤細胞染色陽性比例分值×腫瘤細胞染色強度分值）進行評分，免疫反應積分≥6分判定為Endomuci蛋白表達呈陽性，≤4判定為Endomucin蛋白表達呈陰性。根據上述評分標準得出Endomucin在癌旁正常組織中呈現(xiàn)弱陽性或陰性表達，而在結腸癌組織中呈現(xiàn)陽性或強陽性表達，見圖3-1。同時腫瘤分化程度不同，Endomucin的陽性率也不同，腫瘤分化程度低的結腸癌組織的陽性率高于分化程度高的結腸癌組織，見圖3-2。圖3-1.Endomucin在癌旁正常組織和結腸癌組織中的表達Figure3-1.ExpressionofEndomucininNormalcolontissueandcoloncancer圖3-2.Endomucin在不同分化程度的結腸癌組織中的表達G1:高分化G2:中分化G3:低分化Figure3-2.EndomucinexpressionincoloncancertissuesofdifferentdegreesofdifferentiationG1:highdifferentiationG2:moderatedifferentiationG3:poordifferentiation統(tǒng)計98例結腸癌患者的結腸癌組織中Endomucin的表達與腫瘤TNM分期的關聯(lián)數(shù)據，從結腸癌患者的性別，年齡，腫瘤分化程度、TNM的不同分期以及淋巴結等特征與Endomucin表達結合分析，Endomucin蛋白的高低表達與腫瘤浸潤深度(p=0.001)、淋巴結轉移(p=0.002)及TNM分期(p=0.004)密切相關(p<0.05),但是Endomucin蛋白的表達與患者的年齡(p=0.382)、性別(p=0.319)、腫瘤組織塊大小(p=0.475)及遠處轉移(p=0.142)均無關,見表3-1。表3-1.結腸癌組織中Endomucin蛋白表達與臨床病理特征之間的關系臨床病理特征總例數(shù)NEndomucinlowhighp值年齡（age）0.382≤65583721>65402218性別(gender)0.319男623527女362412腫瘤大小(cm)0.475≤4.5563224>4.5422715腫瘤浸潤深度0.001T1~T225223T3~T4733736淋巴結轉移0.002N0期564115N1~N2期421824遠處轉移0.142M0期825230M1期1679TNM分期0.004Ⅰ期22202Ⅱ期332013Ⅲ期271215Ⅳ期1679注：本樣本采取兩獨立樣本t檢驗，各組中兩兩比較，符號相同者p＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義；符號不同者p＜0.05差異有統(tǒng)計學意義3.2EndomucinmRNA在結腸癌組織中的表達應用RT-PCR法對結腸癌組織和癌旁正常組織中Endomucin的mRNA水平進行檢測后比較得出，結腸癌組織中EndomucinmRNA的表達水平高于相應的癌旁正常組織，與結腸癌中和癌旁正常組織中Endomucin蛋白表達結果一致，見圖3-3。圖3-3.結腸癌中Endomucin的mRNA表達水平Figure3-3.mRNAexpressionlevelsofEndomucinincoloncancer;*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0013.3Endomucin在五種結腸癌細胞系中的表達通過Western-blotting和RT-PCR分別檢測Endomucin蛋白和mRNA在結腸癌五種細胞系的表達水平，結果如圖3-4所示，發(fā)現(xiàn)Endomucin蛋白和mRNA在HCT116中表達量較高，高于其它四組細胞。故選用HCT116進行慢病毒感染過表達Endomucin和低表達Endomucin，進行后續(xù)慢病毒感染實驗。CABCAB圖3-4.Endomucin在結腸癌細胞系中的表達情況A:通過Westernblotting驗證Endomucin蛋白在結腸癌細胞系中的表達；B：Endomucin蛋白在結腸癌細胞系中表達的灰度值分析；C：EndomucinmRNA在五種結腸癌系中的表達Figure3-4.ExpressionofEndomucinincoloncancercelllines

A:WesternblottingwasusedtoconfirmtheexpressionofEndomucinproteinincoloncancercelllines;B:GrayvalueanalysisofEndomucinproteinexpressionincoloncancercelllines;C:ExpressionofEndomucinmRNAinfivecoloncancerlines3.4成功構建高表達與低表達Endomucin結腸癌細胞株熒光顯微鏡下計數(shù)熒光細胞作為陽性細胞，使用ImageProsPlus軟件計數(shù)所拍攝圖片內細胞數(shù)目,隨機選取5-7個400倍視野，計算平均轉染率：轉染率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)*100%[13]，得出Endomucin高表達的轉染效率約為90%。實時熒光定量PCR結果顯示在Endomucin過表達組，細胞的Endomucin的mRNA表達水平顯著高于Endomucin陰性對照組，Western-Blot結果也顯示過表達組中Endomucin蛋白表達水平顯著高于陰性對照組（p<0.05）如圖3-4所示。同理，Endomucin低表達的轉染效率約為95%。與過表達組結果相反，在Endomucin低表達組，細胞的Endomucin的mRNA表達水平顯著低于Endomucin陰性對照組，Western-Blot結果也顯示高表達組中Endomucin蛋白表達水平顯著低于陰性對照組（p<0.05）如圖3-5所示。ABABCDCD圖3-5成功構建穩(wěn)定高表達Endomucin結腸癌細胞HCT116細胞株A：高表達Endomucin后細胞在白光和熒光下的對照;B：轉染后EndomucinmRNA表達水平的變化;C：轉染后Endomucin蛋白表達水平的變化;D：Endomucin蛋白表達水平的灰度值分析*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001Figure3-5SuccessfullyconstructedstableandhighlyexpressedEndomucincoloncancercelllineHCT116A:controlofcellsunderhighlightexpressionofEndomucinunderwhitelightandfluorescence;B:changeofexpressionlevelofEndomucinmRNAaftertransfection;C:changeofexpressionlevelofEndomucinproteinaftertransfection;D:GrayvalueanalysisofexpressionlevelofEndomucinprotein*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001ABABDCDC圖3-6成功構建穩(wěn)定低表達Endomucin結腸癌細胞HCT116細胞株A：低表達Endomucin后細胞在白光和熒光下的對照;B：轉染后EndomucinmRNA表達水平的變化;C：轉染后Endomucin蛋白表達水平的變化;D：Endomucin蛋白表達水平的灰度值分析*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001Figure3-6SuccessfullyconstructedstablelowexpressionofEndomucincoloncancercelllineHCT116A:controlofcellsunderlowlightexpressionofEndomucinunderwhitelightandfluorescence;B:changeofexpressionlevelofEndomucinmRNAaftertransfection;C:changeofexpressionlevelofEndomucinproteinaftertransfection;D:GrayvalueanalysisofexpressionlevelofEndomucinprotein*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0013.5低表達的Endomucin抑制結腸癌細胞的增殖為了驗證Endomucin在結腸癌細胞中的生物學效應，設計并構建了Endomucin的低表達慢病毒載體，感染高表達Endomucin蛋白的結腸癌細胞系HCT116，經過嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定遺傳的HCT116細胞株，獲得低表達Endomucin蛋白的結腸癌HCT116細胞之后，應用CCK-8對細胞增殖能力變化檢測，結果發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的不斷延長，低表達Endomucin組結腸癌細胞HCT116的增殖能力從第2天起開始比陰性對照組降低，到第四天時有統(tǒng)計學意義（p<0.05）,結果表明Endomuicn具有促進結腸癌細胞增殖的能力。如圖3-6圖3-7.低表達Endomucin抑制HCT116結腸癌細胞增殖Figure3-7.LowexpressionofEndomucininhibitsproliferationofHCT116coloncancercells3.6高表達和低表達Endomucin對結腸癌細胞遷移能力的影響細胞遷移是惡性腫瘤侵襲和轉移的關鍵步驟之一，因此本研究應用Transwell法研究轉染后細胞遷移能力的變化，結果如圖3-7所示，在高表達Endomucin組中，有更多的細胞穿過了Transwell膜，細胞的遷移能力得到了明顯的促進。相反在低表達Endomucin則表現(xiàn)出比陰性對照組更少的細胞，結腸癌細胞的遷移能力受到了明顯的抑制。BABA圖3-8.Endomucin對HCT116細胞遷移的影響A：高表達Endomucin后細胞遷移情況；B：低表達Endomucin后細胞遷移情況Figure3-8.EffectofEndomucinonmigrationofHCT116cells;

A:cellmigrationafterhighexpressionofEndomucin;B:cellmigrationafterlowexpressionofEndomucin4討論結腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居全部惡性腫瘤的第四位，且近20年來其發(fā)生率呈逐年上升的趨勢[16]。患者治療前結腸癌的轉移與治療后腫瘤的復發(fā)，是影響患者預后及治療效果的關鍵因素[17]。近年來，隨著分子生物學技術的不斷進步與發(fā)展，結腸癌的復發(fā)轉移相關的生物學模式與分子遺傳學特性逐步被發(fā)現(xiàn)和了解。因此，進一步尋找有關結腸癌復發(fā)、轉移生物標記物及敏感性和特異性是該病有效治療、提高生存率的關鍵點。黏蛋白作為糖蛋白家族成員之一，具有高度糖基化、高分子量兩個特點。通常情況下，在人類和動物的黏膜表面都有不同程度的表達[18]。迄今為止，根據其蛋白核心的不同可以至少可以分為20種,主要分為分泌型黏蛋白和跨膜黏蛋白[19]。由于黏蛋白在胞外的部分被大量寡糖復合物糖基化，因此黏蛋白通過形成一種胞外的選擇性空間屏障并且促進形成保護性細胞外粘蛋白凝膠來為脆弱的上皮細胞提供保護[20]。粘蛋白的異常過表達認為是輔助腫瘤細胞逃避免疫識別，并通過幫助細胞-細胞和細胞-基質接觸的分解來促進遷移和轉移而促進腫瘤發(fā)展。黏蛋白在臨床上作為腫瘤標志物已經在全世界得到科研人員的廣泛研究。因為其糖基化模式的改變，包括新型抗原的表達，在黏蛋白低聚糖側鏈產生腫瘤相關表位。因此，為了方便患者在癌癥早期就能進行診斷，減少患者生理上的痛苦和經濟上的負擔，黏蛋白的分析成為疾病發(fā)展和診斷的潛在指標和腫瘤免疫治療靶標。例如：在胰腺癌，乳腺癌，肺癌等許多腺癌中都檢測到黏蛋白的過度表達[21]。已經證實黏蛋白1（MUC1）在細胞表面與β-連環(huán)蛋白相互作用，MUC1阻斷GSK3B對β-連環(huán)蛋白的磷酸化依賴性降解，導致β-連環(huán)蛋白在細胞質中增加。從而促進了Vimentin和CDH2的表達，導致腫瘤EMT的發(fā)生[22]。.而MUC4通過干擾腫瘤細胞與細胞外基質蛋白的相互作用促進腫瘤細胞的增殖、侵襲與凋亡[23]。Endomucin作為一種新發(fā)現(xiàn)的黏蛋白，有研究表明，Endomucin可以被糖基化修飾成分子量在80-10KDa的兩種亞型[24]，其中90-100KDa的Endomucin-1被一組特定的糖基轉移酶好磺基轉移酶修飾后與L-選擇蛋白相互作用以介導細胞的粘附與運動，在淋巴細胞歸巢至中樞淋巴器官發(fā)揮重要的作用[23]。據報道，其在血管瘤和T細胞淋巴瘤等疾病中具有重要的作用，相比正常內皮組織，Endomucin在以上病變部位均表現(xiàn)出比正常組織中表達高。因此研究者們得出結論其可作為一種新型的內皮細胞標記物[25]。我們的研究發(fā)現(xiàn)Endomucin在結腸癌組織中的表達相比結直腸癌旁正常組織顯著上調，這表明Endomucin可能參與結腸癌腫瘤惡性轉化的進程。細胞實驗中，我們運用慢病毒轉染技術過表達了Endomucin，顯示Endomucin在過表達組中，結腸癌細胞HCT116顯示出了更具明顯的增殖和遷移表型。但其具體作用機制還需進一步的研究，尤其是Endomucin的下游靶標和其他轉錄因子相互之間的作用仍是人們下一步要探索的目標。通過以上實驗認為，Endomucin可望成為早期診斷結腸癌的分子標志物，也是一個潛在的腫瘤免疫治療靶標。5結論在免疫組織化學實驗中得出了Endomucin在結腸癌組織中相比正常結腸組織表達顯著上調，預示著Endomucin可能參與結腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。通過transwell遷移實驗和CCK-8細胞增殖實驗得出了Endomucin促進結腸癌細胞增殖和遷移從而參與了結直腸癌的發(fā)展進程。Endomucin有望成為結直腸癌診斷和預后評估的一個新的潛在標志物。參考文獻[1]SiegelR,DesantisC,JemalA.Colorectalcancerstatistics[J].CACancerJClin,2014,64(2):104-117.[2]TangJ,ChenX,etal.Metastasisassociatedincoloncancer1(MACC1)promotesgrowthandmetastasisprocessesofcoloncancercells[J].EuropeanReviewforMedicalandPharmacologicalSciences,2016,20:2825-2834[3]AldonaK，

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的正常乳腺上皮樣本(42.1%)[31]。3.2結腸癌腫瘤相關糖蛋白(TAG-72)在多種上皮惡性組織中異常表達。在56例胃癌患者和45例結直腸癌患者中，48％的患者檢測到血清中TAG-72抗原水平升高[32]。B72.3單克隆抗體(MAb)被鑒定為唾液酸-Tn的高分子量黏蛋白(腫瘤相關糖蛋白，TAG-72)攜帶的表位，并且它與正常組織的反應有限，但它與上皮癌反應較高。該抗體與全部人結腸直腸腺癌（過渡性黏膜）相鄰的黏膜標本和81％的鄰近結腸癌標本反應強烈。因此，TAG-72抗原的表達發(fā)生在結腸上皮細胞轉化過程中[33]。MUC13在結直腸癌中的表達增加與低分化腫瘤相關[34]，而MUC2表達與人類腫瘤的惰性行為相關[35]。MUC6具有100％的特異性來區(qū)分結腸無柄鋸齒狀腺瘤（N

=26;陽性染色）與增生性息肉(N

=48;陰性染色)[36]。在MUC12表達的情況下，與匹配的正常結腸組織相比，在15個(40%)結腸直腸腫瘤樣本中有6個被下調或缺失，并且表達在6個結腸直腸癌中的任何一個中被下調或未被檢測到[37]。相反，在結腸直腸癌中，在低分化腫瘤中觀察到MUC13的最高表達。與黏液性腫瘤相比，腺癌中的染色強度高81%。同樣，在低分化和晚期腫瘤中觀察到高強度的細胞質染色[34]。3.3肺癌與其他類型的癌癥相似，肺鱗狀細胞癌中的MUC1過度表達與較差的存活率相關[38]。MUC4被視為一種腫瘤診斷的潛在黏蛋白，有研究人員檢測到肺癌組織中MUC4蛋白的表達以及mRNA水平，在該研究中包括29個腫瘤樣品，發(fā)現(xiàn)67％的MUC4蛋白表達陽性，72％的MUC4mRNA表達陽性[39]，這種表達不能與癌癥的臨床階段相關聯(lián)。然而，最近的一項研究表明，MUC4的表達卻與患者預后不良有關，結果顯示，腫瘤具有高MUC4水平的患者無疾病曲線顯著低于MUC4水平較低的患者[40]。盡管該研究中僅有13.5%的患者具有MUC4的高表達，但這些結果表明MUC4表達是肺腺癌預后不良的指標。與這些研究一致，MUC4在肺腺癌中的過表達被證明可用于區(qū)分肺腺癌和惡性間皮瘤。3.4胰腺癌MUC4作為胰腺癌診斷的生物標志物，它不是在正常胰腺或慢性胰腺炎表達，但它在人胰腺腫瘤[41-43]。MUC4早在癌前期胰腺上皮內瘤（PanIN）病變中表達，其表達隨疾病進展而增加[44]。同樣，胰液中mRNA(MUC1/MUC5AC)的定量評估是胰腺癌術前診斷的潛在候選基因[45]。有研究表明MUC4特異性抗體在癌癥患者外周血單核細胞（PBMCs）血清和MUC4轉錄物中的存在，將MUC4作為高風險個體以及已確定癌癥患者的腫瘤診斷生物標志物[46]。

3.5其它癌癥在對轉移性前列腺癌患者的靶向放射免疫療法的臨床研究中，識別MUC1的VNTR區(qū)域中的表位的BrE3抗體顯示與前列腺癌進展明顯的相關性，表明低糖基化的MUC1具有作為侵襲性前列腺癌的標志物的潛力[47]。在約40％的膀胱癌病例中，通過單克隆抗體4F1檢測到MUC2表達，而正常尿路上皮未顯示MUC2表達[48]。在肝外膽管癌中，MUC1/Df3是MUC1黏蛋白的各種糖型中最有用的預后指標[49]。最后，膽管癌中的MUC1表達與去分化，浸潤性生長模式和患??者存活相關，而異常的MUC1表達與膽管癌的進展相關[50]。4總結黏蛋白是黏液中最豐富的高分子量糖蛋白，其在多種生物功能中的具有重要作用，例如：細胞分化，細胞黏附，免疫應答和細胞信號傳導等。從腫瘤預后的觀點來看，它們的表達和糖基化的改變與惡性疾病的發(fā)展和進展有關。因此，對黏蛋白進一步的深入研究將在腫瘤的篩查、診斷和了解腫瘤發(fā)生和治療中發(fā)揮重要作用。參考文獻[1]HollingsworthMA,SwansonBJ.Mucinsincancer:protectionandcontrolofthecellsurface[J].NatRevCancer,2004,4(1):45-60[2]GottschalkA.In:TheChemistryandBiologyofSialicAcidsandRelatedSubstances[J].CambridgeUniversityPress;NewYork:1960.pp.1–11.[3]MontreuilJ,VliegenthartJFG,SchachterH.GlycoproteinsandDisease.Vol.Elsevier;Amsterdam:1995.[4]KufeDW.Mucinsincancer:function,prognosisandtherapy[J].NatRevCancer,2009,9(12):874-885[5]RachaganiS,TorresMP,MoniauxN,etal.Currentstatusofmucinsinthediagnosisandtherapyofcancer[J].Biofactors,2009,35(6):509-527[6]HattrupCL,GendlerSJ.Structureandfunctionofthecellsurface(tethered)mucins[J].AnnuRevPhysiol,2008,70:431-457[7]CullenPJ.Post-translationalregulationofsignalingmucins[J].CurrOpinStructBiol,2011,21(5):590-596[8]VanKlinkenBJ,VanderWalJW,etal.SulphationandsecretionofthepredominantsecretoryhumancolonicmucinMUC2inulcerativecolitis[J].BMJ,1999,44(3):387-393[9]StanleyP.Golgiglycosylation[J].ColdSpringHarbPerspectBiol.,2011,1;3(4)[10]KaurS,

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