題目：MuR5S4TR蛋白的純化條件探究目錄摘要 IV關鍵詞 IVAbstract IVKeywords IV1．前言 11.1癌癥 11.1.1癌癥和腫瘤 11.1.2癌癥出現(xiàn)的原因 11.1.3癌癥的高死亡率 11.1.4癌癥的治療 11.2TRAIL與腫瘤 21.2.1TRAIL的發(fā)現(xiàn) 21.2.2TRAIL蛋白 21.2.3TRAIL抗癌機制 22．儀器和材料 32.1儀器設備 32.2菌體 32.3耗材 42.4主要試劑配制方法 52.5SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳母液配制 52.6BCA溶液的配制 62.7匯研、博格隆、納微三家廠商的陽離子交換層析介質詳細信息對比： 73．方法 73.1層析柱裝柱 73.2掛柱實驗 83.2.1樣品預處理 83.2.2層析系統(tǒng)上樣 83.3雜蛋白洗脫條件探索 83.3.1樣品預處理 83.2.2層析系統(tǒng)上樣 93.4目的蛋白洗脫最佳條件探索 93.4.1樣品預處理 93.4.2層析系統(tǒng)上樣 93.5上樣條件的探索 103.5.1樣品預處理 103.5.2層析系統(tǒng)上樣 103.6SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 113.7BCA法測定蛋白濃度 114．結果 124.1匯研SPFocurose6FF純化實驗條件結果 124.1.1掛柱實驗 124.1.2雜蛋白洗脫條件分析 134.1.3目的蛋白洗脫條件優(yōu)化 144.1.4上樣條件分析 154.2博格隆SPBestaroseFF純化實驗條件結果 164.2.1掛柱實驗 164.2.2雜蛋白洗脫條件分析 174.2.3目的蛋白洗脫條件分析 184.2.4上樣條件分析 184.3納微SPPharmaroseFF純化實驗條件結果 194.3.1掛柱實驗 194.3.2雜蛋白洗脫條件分析 214.3.3目的蛋白洗脫條件優(yōu)化 214.3.4上樣條件分析 225．討論 236．結論 24參考文獻 24文獻綜述： 26致謝 30誠信聲明 31摘要目的：TRAIL的發(fā)現(xiàn)為腫瘤的治療帶來了新的曙光，本文研究的是采用三家廠商提供的陽離子交換介質探索TRAIL的重組蛋白MuR5S4TR的粗分離條件。方法：首先分別測試陽離子交換介質掛柱情況，再根據(jù)梯度洗脫的方式找到最佳的雜蛋白洗脫條件及目的蛋白的洗脫條件，最后通過改變不同鹽濃度的緩沖液進行篩選最佳上樣條件。結果：目的蛋白與三家廠商提供的陽離子交換介質均能穩(wěn)定掛柱結合，最終均得到理想的目的蛋白純化條件。關鍵詞TRAIL；純化；層析技術；陽離子交換介質ToexplorethepurificationconditionsofMuR5S4TRproteinAbstractTRAILdiscoverybringsnewdawnfortumortreatment.Inthisstudy,thecationicexchangemediumprovidedbythethreemanufacturerswasadoptedtoexploretheroughseparationconditionofTRAIL'srecombinantproteinMuR5S4TR.Methods:theconditionsofhangingcolumnincationicexchangemediumweretestedrespectivelyatfirst,andthentheoptimalconditionsofspuriousproteinelutionandtargetproteinelutionwerefoundaccordingtothegradientelutionmethod.Finally,theoptimalsampleloadingconditionswerescreenedbychangingbufferofdifferentsaltconcentrations.Theresultsshowedthatboththetargetproteinandcationicexchangemediumprovidedbythethreemanufacturerscouldbindstablyonthecolumn,andtheidealpurificationconditionsofthetargetproteinwerefinallyobtained.KeywordsTrail;purification;Tomographictechniques;Cationexchangemedium1．前言改為1.前言改為1.前言1.1癌癥癌癥已經成為危害人類身體健康的重大隱患之一，發(fā)表在《英國癌癥雜志》（BritishJournalofCancer）上的一項研究中，根據(jù)英國癌癥研究（CancerResearch）數(shù)據(jù)最新的預測顯示，在英國每兩人中可能有一人在某個階段患癌癥[1]。再看中國，據(jù)2018年癌癥數(shù)據(jù)報告，肺癌是我國患癌率、發(fā)病率最高的癌癥之一，已與發(fā)達國家水平持平，全國癌癥新發(fā)病例占全球四成[2]！1.1.1癌癥和腫瘤癌癥和腫瘤兩個詞經?；煊?，人們往往聽見腫瘤就以為是癌癥。確實在一定范圍內，這兩個詞是通用的，比如惡性腫瘤等于癌癥。癌癥指的是惡性腫瘤和血癌，腫瘤分為惡性腫瘤和良性腫瘤，良性腫瘤不屬于癌癥，血癌不屬于腫瘤[3]。1.1.2癌癥出現(xiàn)的原因導致癌癥最重要的因素是年齡。據(jù)2017年《中國腫瘤等級年報》數(shù)據(jù)顯示，全國每天約有1萬人確診癌癥，且40歲之后，發(fā)病率快速提升，到80歲達到高峰，患癌風險為36%[4]。癌癥的病變機理是基因突變，人體內大約有20000多個基因，而和癌癥相關的基因僅有100多個，基因突變發(fā)生在細胞分裂期間，細胞分裂又發(fā)生在細胞增殖和細胞修復階段，每一個細胞分裂都有可能發(fā)生基因突變，但多數(shù)基因突變都是無義突變，所以癌癥的發(fā)生仍然是小概率事件，但隨著年齡的增長，人體器官組織的修復的次數(shù)增加，細胞分裂次數(shù)達到極致，基因突變由量變引起質變。所以老年人更易患癌癥。這里并不考慮先天遺傳攜帶癌變基因和在懷孕期間導致的胎兒發(fā)生的突變，這是嬰幼兒患癌癥的主要因素[5][6]。1.1.3癌癥的高死亡率癌癥的高死亡率使得人們談癌色變，導致癌癥的高死亡率的原因制藥有兩個原因：1.惡性腫瘤易于發(fā)生轉移，由一個腫瘤變成多個腫瘤。2.腫瘤常常出現(xiàn)在重要器官上或附近，導致器官衰竭，進而導致功能衰竭，威脅病人生命。3.癌癥的出現(xiàn)是由基因突變導致，同一種癌癥可能由不同的基因突變產生。進而出現(xiàn)不同的癥狀，這直接導致癌癥難以及時找到藥物對癥治療，當前藥物研發(fā)的抗癌藥物只能根據(jù)一種或幾種的基因突變進行，這也就導致了抗癌藥只對少部分病人有效。4.癌癥具有突變抗藥性。癌細胞長期在抗癌藥物環(huán)境中可能產生耐藥性[7]。1.1.4癌癥的治療癌細胞是病人體內的一部分，是由正常細胞基因突變而來，仍屬于人體細胞，所以在治療癌癥時由于藥物的特異識別能力不夠，導致在殺傷癌細胞時，同樣對正常細胞具有殺傷效果[8]。比如傳統(tǒng)的化療藥物具有對快速生長能力的細胞殺傷效果，而人體內有很多細胞生長速度都比較快，比如頭皮下的毛囊細胞，化療藥物在殺傷癌癥細胞的同時因識別能力不夠，將毛囊細胞也進行殺傷，最終導致病人頭發(fā)掉光的副作用以及更嚴重的副作用。這也使得醫(yī)生在給病人治療權衡利弊時左右兩難。癌癥的治療歷經了三次變革，第一次是細胞毒性化療藥物的出現(xiàn)，現(xiàn)在的絕大數(shù)化療藥物都屬于這類，如芪膠升白膠囊聯(lián)合粒細胞集落刺激因子治療癌癥[9]。第二次是靶向藥物的出現(xiàn)，但是它的局限性很大，僅對部分病人有效，且研發(fā)時間和成本較高。如精準醫(yī)療對肺癌治療，精準醫(yī)療有靶向驅動突變的制劑、靶向參與信號通路相關基因的治療以及利用microRNAs(miRNA)作為潛在的治療藥物及診斷標志物[10]。第三次是腫瘤免疫療法的成功，該法是通過激活并增強自身免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤，并且對多種腫瘤有效，最著名的就是CAR-T療法，據(jù)2016年12月29日發(fā)表在NEJM雜志上題為“RegressionofGlioblastomaafterChimericAntigenReceptorT-CellTherapy”的研究報道了一項CAR-T研究突破進展，一名患致命腦瘤的患者在接受了CAR-T療法后腫瘤顯著縮小，且有一段時間，腫瘤完全消失[11]。1.2TRAIL與腫瘤近年來，研究如何促進腫瘤細胞的凋亡為腫瘤的治療提供了新的途徑，腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand,TRAIL)的發(fā)現(xiàn)為腫瘤的凋亡療法開辟了新的道路[12]。1.2.1TRAIL的發(fā)現(xiàn)早在1995年，由Wiley等人通過在EST(expressedsequencetag)數(shù)據(jù)庫中搜索TNF家族成員保守區(qū)序列，確定了一個新的TNF家族蛋白—腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體TRAIL的編碼cDNA序列[13]，1996年Pitti等人獨立的從EST數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)并分離出281個氨基酸組成的分子量為32.5KD的蛋白質，將其命名為凋亡素2配體（Apo2ligand,Apo2L）,后來研究證明Apo2L和TRAIL為同一種蛋白，因此習慣上將其稱為Apo2l/TRAIL[14]。1.2.2TRAIL蛋白TRAIL蛋白是一種=2\*ROMANII型跨膜蛋白，位于細胞膜外C末端（141~281位氨基酸）保守性強，其中第230位半胱氨酸（C230）對于維持TRAIL的結構和生物活性具有重要意義[15]。近期研究發(fā)現(xiàn)，第101~281位氨基酸具有抗腫瘤活性，第114~281位氨基酸為可溶性片段，使開發(fā)小分子TRAIL成為可能。在體內蛋白酶可將TRAIL胞外區(qū)水解成TRAIL單體，3個TRAIL單體通過C230螯合一個鋅離子形成有活性的TRAIL三聚體。若C230突變，則不能形成三聚體，TRAIL與受體的結合能力下降200倍，凋亡誘導能力也將大打折扣[16]。1.2.3TRAIL抗癌機制TRAIL主要的抗癌機制仍未完全研究透徹，但最新研究報道指出，TRAIL主要通過與死亡受體4（DR4）和死亡受體5（DR5）蛋白結合，同時激活一系列支隊癌癥細胞凋亡的途徑，從而實現(xiàn)控制腫瘤細胞產生凋亡反應。研究還發(fā)現(xiàn)與TRAIL結合的DR4和DR5是腫瘤細胞中特異性表達的，正常細胞中幾乎沒有，使得TRAIL能夠靶向性的針對腫瘤細胞，而對正常細胞無毒副作用[17][18]。2．儀器和材料改為2.儀器和材料改為2.儀器和材料2.1儀器設備表2-1儀器設備設備名型號生產廠家電子天平YP502N上海精密科學儀器有限公司電子天平PL203METTLERTOLEDO電泳儀DYCP-31DN北京市六一儀器廠電泳儀電源DYY-8C北京市六一儀器廠水平搖床WD-9405B北京市六一儀器廠低溫冷凍離心機5430Reppendorf實驗室pH計FE20METTLERTOLEDO電導率儀FE38METTLERTOLEDO自動純化系統(tǒng)?KTApurifier10GEhealthcare層析柱XK16/20GEhealthcare凝膠圖像處理系統(tǒng)Tanon-1600上海天能科技有限公司恒溫磁力攪拌器SH21-2上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司自動壓力蒸汽滅菌器GI54DWS致微（廈門）儀器有限公司漩渦混合器QL-901海門市其林貝爾儀器制造有限公司低溫冷凍離心機5403eppendorf低溫冷卻液循環(huán)泵DLSK-10/20蘇州科泰實驗設備有限公司ATS高壓均質機AH-PILOTPLUSATSEngineeringlimited優(yōu)普系列超純水器UPR-I-40L四川優(yōu)普超純科技有限公司2.2菌體本實驗所用的細菌為大腸桿菌BL21(DE3)經過發(fā)酵所得。菌批號201805252.3耗材表2-2耗材試劑名稱生產廠家NaCl廣東光華科技股分有限公司Na2HPO4.12H2O廣東光華科技股分有限公司NaH2PO4.2H2O廣東光華科技股分有限公司(NH4)2SO4廣東光華科技股分有限公司NaOH廣東光華科技股分有限公司Tris-BaseANGUSAcrylamideAMERSCOBis-AcrylamideSIG-ALD，BiodeeAmmoniumpersulfateSIG-ALD，BiodeeSDSSIG-ALD，BiodeeTEMEDSIG-ALD，BiodeeGlycineAMERSCOCoomassieBrilliantBlueR-250AMERSCOBromphenolBlueSIG-ALD，BiodeeUnstainedProteinMolecularWeightMarkerThermoScientific冰乙酸廣東光華科技股份有限公司無水乙酸鈉天津博迪華工股份有限公司BCA二鈉鹽SIGMA酒石酸鈉廣東光華科技股分有限公司無水乙醇廣東光華科技股分有限公司碳酸氫鈉廣東光華科技股分有限公司五水合硫酸銅廣東光華科技股分有限公司2.4主要試劑配制方法（濃度主要指溶液中的NaCl的濃度）表2-3主要試劑配制方法NaCl（g）Na2HPO4.12H2O（g）NaH2PO4.2H2O（g）RO水定容（V/ml）0M破菌液0905000.3M破菌液8.8905000.6M破菌液17.6905000MSP平衡緩沖液07.20.85000.3MSP平衡緩沖液8.87.20.85000.6MSP平衡緩沖液17.67.20.85000.7MSP雜蛋白洗脫液20.57.20.85000.8MSP雜蛋白洗脫液23.47.20.85001.2MSP目的蛋白洗脫液35.17.90.55001.4MSP目的蛋白洗脫液417.90.55001.6MSP目的蛋白洗脫液46.87.90.55001.8MSP目的蛋白洗脫液52.67.90.5500用天平準確稱量各組分，再用RO水進行定容。試劑都是現(xiàn)配先用；0.5MNaOH溶液：稱量NaOH10g用RO水定容至500ml；20%乙醇溶液：量取無水乙醇100ml用RO水定容至500ml柱保存液：稱量無水乙酸鈉8.4g，量取無水乙醇100ml，用RO水定容至500ml。2.5SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳母液配制1.聚丙烯酰胺溶液（PA）：濃度30%，稱取30g丙烯酰胺和0.8g雙丙烯酰胺，溶解，定容于100ml，4℃保存。（操作時注意身體保護，配制后所有容器應用大量水沖洗）。2.4×分離膠緩沖液(pH8.8)：稱取Tris90.885g，SDS2g，溶解，定容至500ml，使用鹽酸調節(jié)pH至8.8，終濃度為1.5MTris-HCl，0.4%SDS。3.4×濃縮膠Buffer：稱取Tris15.143g，SDS1g，溶解，定容至250ml，使用鹽酸調節(jié)pH至6.8，終濃度為0.5MTris-HCl，0.4%SDS。 4.過硫酸銨（APS）：配制成10%（W/V）溶液。5.TEMED：使用原液。6.5′電泳緩沖液(pH8.3)：Tris15.1g，甘氨酸94g，10%SDS10ml（5.0g）加ddH2O溶解,定容至1000ml。7.考馬斯亮蘭染色液：考馬斯亮蘭R-2501g，乙醇250ml，冰醋酸80ml，ddH2O定容至1000ml。8.脫色液：乙醇250ml，冰醋酸80ml，ddH2O定容至1000ml。9.2×SDSLoadingBuffer：量取0.5MTris-HCl(pH6.8)5ml，SDS1g，溴酚藍50mg，甘油5ml，β-巰基乙醇1.25ml，定容至25ml，分裝后保存于-20℃。10.分離膠與濃縮膠的配方15%分離膠配方組分 H2O1ml+PA1.95ml+4×分離膠Buffer1ml+APS40μl+TEMED3μl；總共4ml4%濃縮膠配方H2O1.2ml+PA0.27ml+4×濃縮膠Buffer0.5ml+APS 20μl+TEMED3μl；總共2ml2.6BCA溶液的配制A液：1%BCA二鈉鹽，0.4%NaOH，0.16%酒石酸鈉，2%無水碳酸鈉，0.9%碳酸氫鈉，RO水定容100ml。B液：4%CuSO4,RO水定容100ml。2.7匯研、博格隆、納微三家廠商的陽離子交換層析介質詳細信息對比：表1-1三種陽離子交換介質對比介質匯研SPFocurose6FF博格隆SPBestaroseFastFlow納微SPPharmaroseFF基質高度交聯(lián)6%的瓊脂糖高度交聯(lián)6%瓊脂糖交聯(lián)6%瓊脂糖粒徑范圍45-165μm\\平均粒徑90μm90μm80μm介質類型強陽離子交換強陽離子交換強陽離子交換帶電基團-CH2CH2CH2SO3--CH2CH2CH2SO3--(CH2)3SO3-離子/蛋白載量180-250μmol

H+/ml

介質180-250μmolH+/ml介質>80mg/溶菌酶pH穩(wěn)定性4-13（工作）4-13(工作)4-13(工作)操作壓力≤0.3MPa≤0.3MPa≤0.3MPa最大流速700cm/h400cm/h>600cm/h化學穩(wěn)定性常用緩沖液、1.0M氫氧化鈉、8.0M尿素、6.0M鹽酸胍、70%乙醇避免使用氧化劑、陽離子去污劑、陽離子緩沖液在所有的常用水溶性緩沖液中穩(wěn)定：8M尿素，6M鹽酸胍，70%乙醇，1MNaOH，1M乙酸。所有常用水溶性緩沖液中穩(wěn)定貯存溶液0.2MNaAc，20%乙醇0.2MNaAc，20%乙醇0.2MNaAc，20%乙醇貯存溫度4-30℃4-30℃4-30℃3．方法改為3.方法改為3.方法本次實驗的順序是先對各公司的離子層析介質進行裝柱，然后制作樣品依次探索目的蛋白的掛柱情況，在能掛柱的情況下，先利用梯度洗脫的方法摸索該目的蛋白在介質上的雜蛋白洗脫條件，然后摸索目的蛋白的洗脫條件，再探索最佳的上樣條件，將收集回收的樣品利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行定性分析及BCA法對回收蛋白的含量測定。3.1層析柱裝柱層析柱（XK16/20）用RO水進行清洗，清洗后在柱內裝一定體積的水進行檢漏，若漏水檢查各個接口處是否旋緊，旋緊后將層析柱連接在純化系統(tǒng)上進行壓力檢查，如果壓力過大，可能是層析柱內濾片沒裝好，拆卸后重裝，直到壓力正常，層析柱檢查完畢。取需實驗的陽離子層析介質先搖勻，再緩緩加入，先靜止20min，待其自然沉降后，將層析柱的上部分接頭裝回柱內，（注意不要產生氣泡，若有氣泡，可緩緩的移動接頭除去氣泡）；再將層析柱連接在純化系統(tǒng)上，先用低流速如1ml/min對其進行壓縮，在保證壓力低于1.0Bar的條件下，增加流速。當層析介質壓縮到難以壓縮的時候，將上部接頭緩緩下移，直到剛剛接觸到層析介質。再用流速為5ml/min的流速繼續(xù)沖洗一會，（裝柱過程要時刻注意壓力的變化，若壓力過高，可適當進行反沖，或者重新裝柱）最后充滿柱保存液放入4℃冰箱進行保存待用。3.2掛柱實驗掛柱實驗條件為無鹽（NaCl）和0.6M鹽濃度進行3.2.1樣品預處理稱取冷凍菌液124g（大腸桿菌凈含量50g），加入無鹽破菌液至體積250ml，放置在磁力攪拌器上解凍混勻20min，混勻后的菌液用50ml離心管進行分裝，在4℃、7830r/mind的條件下離心20min,收集沉淀（此步驟是除去原溶液中的鹽離子）。沉淀加入無鹽破菌液定容至220ml進行重懸，重懸好的菌液在壓力為840Bar，溫度為4°的條件下用高壓均質機進行破菌均質，重復均質3次后回收料液，最后用少量無鹽破菌液沖洗均質機并收集洗脫液。最后料液體積在250ml左右。將料液均分為兩份，其中一份加入NaCl調節(jié)料液電導至58ms/cm即與0.6MSP平衡液的電導一致。再分別用50ml離心管進行分裝，做好標記，在4℃、7830r/mind的條件下離心45min,分別收集上清液。3.2.2層析系統(tǒng)上樣A1、A2管道插入SP平衡緩沖液里，B管道插入1.2MSP目的蛋白洗脫液里，先沖洗各管道，再將層析柱接入層析系統(tǒng)，將A1管道插入料液中選擇上樣程序進行上樣。1、平衡：使用平衡緩沖液平衡柱子。2、上樣：根據(jù)料液的體積設置好上樣體積，自動上樣。3、清洗：使用SP平衡緩沖液洗滌柱子以除去殘留的未結合蛋白。4、目的蛋白洗脫：使用SP目的蛋白緩沖液洗脫。5、NaOH清洗：使用0.5MNaOH溶液清洗柱子。6、再平衡：使用平衡緩沖液再平衡柱子。兩個料液分開上樣。分別收集樣品1ml：料液、穿透液、目的蛋白洗脫液、NaOH洗脫液用于電泳定性分析3.3雜蛋白洗脫條件探索3.3.1樣品預處理稱取冷凍菌液62g（大腸桿菌凈含量25g），加入無鹽破菌液至體積125ml，放置在磁力攪拌器上解凍混勻20min，混勻后的菌液用50ml離心管進行分裝，在4℃、7830r/mind的條件下離心20min,收集沉淀（此步驟是除去原溶液中的鹽離子）。沉淀加入無鹽破菌液定容至100ml進行重懸，重懸好的菌液在壓力為840Bar，溫度為4°的條件下用高壓均質機進行破菌均質，重復均質3次后回收料液，最后用少量無鹽破菌液沖洗均質機并收集洗脫液。最后料液體積在125ml左右。再分別用50ml離心管進行分裝，在4℃、7830r/mind的條件下離心45min,收集上清液。3.2.2層析系統(tǒng)上樣A1、A2管道插入無鹽SP平衡緩沖液里，B管道插入1.2MSP雜蛋白洗脫液里，A6管道插入0.8MSP目的蛋白洗脫液里。先沖洗各管道，再將層析柱接入層析系統(tǒng)，將A1管道插入料液中手動上樣。1、平衡：使用平衡緩沖液平衡柱子。2、上樣：平衡后將入口切換至A1開始上樣。3、清洗：上樣完成后使用SP平衡緩沖液洗滌柱子以除去殘留的未結合蛋白。4、雜蛋白洗脫：雜蛋白洗脫液梯度洗脫，梯度為0.3M~0.8M，階梯變量為0.1M5、目的蛋白洗脫：使用目的蛋白洗脫液進行洗脫6、NaOH清洗：使用0.5MNaOH溶液清洗柱子。7、再平衡：使用平衡緩沖液再平衡柱子。收集樣品1ml：料液、穿透液、雜蛋白洗脫液（0.3M~0.8M）、目的蛋白洗脫液、NaOH洗脫液用于電泳定性分析3.4目的蛋白洗脫最佳條件探索3.4.1樣品預處理稱取冷凍菌液124g（大腸桿菌凈含量50g），加入無鹽破菌液至體積250ml，放置在磁力攪拌器上解凍混勻20min，混勻后的菌液用50ml離心管進行分裝，在4℃、7830r/mind的條件下離心20min,收集沉淀（此步驟是除去原溶液中的鹽離子）。沉淀加入無鹽破菌液定容至220ml進行重懸，重懸好的菌液在壓力為840Bar，溫度為4°的條件下用高壓均質機進行破菌均質，重復均質3次后回收料液，最后用少量無鹽破菌液沖洗均質機并回收洗脫液。最后料液體積在250ml左右。再用50ml離心管進行分裝，在4℃、7830r/mind的條件下離心45min,收集上清液。收集到的上清平均分成三份3.4.2層析系統(tǒng)上樣本次實驗要進行三次上樣，第一次上樣目的蛋白洗脫液鹽濃度為1.4M，第二次目的蛋白洗脫液鹽濃度為1.6M，第三次目的蛋白鹽濃度為1.8M；其余條件都一樣0MSP平衡緩沖液，根據(jù)上一次雜蛋白洗脫實驗得到的洗脫條件選擇合適的雜蛋白洗脫液的鹽濃度。A1、A2管道插入SP平衡緩沖液里，B管道插入SP目的蛋白洗脫液里，A6管道插入SP雜蛋白洗脫液里先沖洗各管道，再將層析柱接入層析系統(tǒng)，將A1管道插入料液中選擇上樣程序進行上樣。1、平衡：使用平衡緩沖液平衡柱子。2、上樣：根據(jù)料液的體積設置好上樣體積，自動上樣。3、清洗：使用SP平衡緩沖液洗滌柱子以除去殘留的未結合蛋白。4、雜蛋白洗脫：使用SP雜蛋白緩沖液洗脫。5、目的蛋白洗脫：使用目的蛋白洗脫液進行洗脫6、NaOH清洗：使用0.5MNaOH溶液清洗柱子。7、再平衡：使用平衡緩沖液再平衡柱子。收集樣品1ml：料液、穿透液、雜蛋白洗脫液、目的蛋白洗脫液（1.4M、1.6M、1.8M）、NaOH洗脫液用于電泳定性分析3.5上樣條件的探索3.5.1樣品預處理稱取冷凍菌液124g（大腸桿菌凈含量50g），加入無鹽破菌液至體積250ml，放置在磁力攪拌器上解凍混勻20min，混勻后的菌液用50ml離心管進行分裝，在4℃、7830r/mind的條件下離心20min,收集沉淀（此步驟是除去原溶液中的鹽離子）。沉淀加入無鹽破菌液定容至220ml進行重懸，重懸好的菌液在壓力為840Bar，溫度為4°的條件下用高壓均質機進行破菌均質，重復均質3次后回收料液，最后用少量0M破菌液沖洗均質機并回收洗脫液。最后料液體積在250ml左右。收集到的料液平均分成三份，并分別標記0、0.3、0.6；取標記為0.3的料液用NaCl調節(jié)電導至33ms/cm,與0.3MSP平衡緩沖液的電導一致，取標記為0.6的料液調節(jié)電導至58ms/cm。再分別用50ml離心管進行分裝，在4℃、7830r/mind的條件下離心45min,分別收集上清液。3.5.2層析系統(tǒng)上樣本次實驗要進行三次上樣，第一次上樣SP平衡緩沖液鹽濃度為無鹽，第二次SP平衡緩沖液鹽濃度為0.3M，第三次SP平衡緩沖液鹽濃度為0.6M；其余條件都一樣0MSP平衡緩沖液，根據(jù)上一次雜蛋白洗脫實驗何目的蛋白洗脫實驗得到的洗脫條件選擇合適的雜蛋白洗脫液的鹽濃度及目的蛋白洗脫液的鹽濃度。A1、A2管道插入SP平衡緩沖液里，B管道插入SP目的蛋白洗脫液里，A6管道插入SP雜蛋白洗脫液里先沖洗各管道，再將層析柱接入層析系統(tǒng)，將A1管道插入料液中選擇上樣程序進行上樣。1、平衡：使用平衡緩沖液平衡柱子。2、上樣：根據(jù)料液的體積設置好上樣體積，自動上樣。3、清洗：使用SP平衡緩沖液洗滌柱子以除去殘留的未結合蛋白。4、雜蛋白洗脫：使用SP雜蛋白緩沖液洗脫。5、目的蛋白洗脫：使用目的蛋白洗脫液進行洗脫，并在合適的UV值開始收集目的蛋白。6、NaOH清洗：使用0.5MNaOH溶液清洗柱子。7、再平衡：使用平衡緩沖液再平衡柱子。收集每次上樣的各樣品1ml：料液、穿透液、雜蛋白洗脫液、目的蛋白洗脫液、NaOH洗脫液用于電泳定性分析，收集到的三份目的蛋白洗脫液用BCA法測定蛋白濃度。3.6SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳操作步驟：1、組裝玻璃制膠板。2、配制分離膠?；靹蚝蠊嗳氩ＡО彘g，以水封閉，注意使液面水平。3、分離膠聚合后，將分離膠上的水倒去,加入濃縮膠混合液,立即將梳子插入玻璃板間，完全聚合需15-30min。4、樣品處理：將樣品加入等量的2×Loadingbuffer,在漩渦混合器上混合。5、取處理后的樣品及Marker加入樣品孔中。6、在電泳槽中加入1′電泳緩沖液，連接電源，負極在上，正極在下。電壓200V,電泳至溴酚蘭行至電泳槽下端停止（約需45min）。7、染色：將膠小心從玻璃板中取出，切除濃縮膠，再使用考馬斯亮蘭染色液，在脫色搖床上染色30min。8、脫色：將膠從染色液中取出，加入脫色液，在脫色搖床上脫去底色，多次更換脫色直至蛋白帶清晰。9、凝膠圖像處理系統(tǒng)：將脫色后的分離膠放入凝膠圖像處理系統(tǒng)進行圖像分析和記錄保存。3.7BCA法測定蛋白濃度1、配制BCA液：計算BCA液的用量，按A液：B液=50:1進行配制（現(xiàn)配現(xiàn)用，每次多配制5ml。）2、標準曲線的制備:取96孔酶標板，按下表加入試劑表3-1BCA法測定蛋白濃度編號（ul）12345678dH2O2019181612840標準蛋白01248121620BCA液2002002002002002002002003、待測樣品處理：根據(jù)收集的uv峰值和收樣體積，估計樣品溶液濃度的大致范圍，然后將預估濃度稀釋至0.5mg/ml。點樣=稀釋后的樣品20ul+BCA液200ul以上所有加樣孔做三個復孔。4、加樣完成后放入37℃孵箱進行孵育30min,再在570nm處進行比色測定。5、計算：根據(jù)標準曲線算出稀釋后的樣品濃度；樣品蛋白含量=稀釋后的樣品濃度×稀釋倍數(shù)×收樣體積。4．結果改為4.結果改為4.結果4.1匯研SPFocurose6FF純化實驗條件結果4.1.1掛柱實驗圖4-1匯研無鹽條件掛柱實驗陰影面積依次為：上樣峰、目的蛋白洗脫峰、NaOH洗脫峰圖4-2匯研0.6M鹽濃度條件掛柱實驗陰影面積依次為：上樣峰、目的蛋白洗脫峰、NaOH洗脫峰圖4-3匯研掛柱實驗電泳結果泳道順序：無鹽料液，穿透，目的蛋白洗脫，NaOH洗脫；0.6M鹽濃度料液，穿透，目的蛋白洗脫，NaOH洗脫；Marker從實驗結果圖來看，無論是否有無鹽離子，都有洗脫峰的出現(xiàn)，經過凝膠電泳對樣品進行分析，也能觀察到目的蛋白條帶。證明目的蛋白可以與該介質進行結合。可以進行后續(xù)實驗。4.1.2雜蛋白洗脫條件分析圖4-4匯研雜蛋白洗脫條件箭頭所指為梯度洗脫液的鹽濃度順序：0.3M-0.8M從純化圖我們可以明顯看到當鹽濃度為0.3M時，峰值較大，隨著鹽濃度的增加，也有比較明顯的洗脫峰，但鹽濃度為0.8M時，就沒有UV峰出現(xiàn)，UV值開始緩慢增大。并且長時間的使用0.8M鹽濃度進行清洗，導致后面的目的蛋白洗脫峰明顯變小。而目的蛋白洗脫峰值的大小與收集的目的蛋白的含量成正比例關系。因此猜測在鹽濃度為0.8M時，目的蛋白已經開始被洗脫出來了。所以選擇0.7M鹽濃度為雜蛋白的洗脫鹽濃度。并根據(jù)此經驗，修改后面進行雜蛋白洗脫實驗時，直接用0.3M鹽濃度進行上樣，0.4M開始進行雜蛋白梯度洗脫。并且從凝膠電泳的結果圖可以發(fā)現(xiàn)，NaOH泳道中有很濃的目的蛋白條帶。因此需要進行目的蛋白洗脫條件的優(yōu)化4.1.3目的蛋白洗脫條件優(yōu)化圖4-51.4M鹽濃度目的蛋白洗脫條件箭頭指示為目的蛋白洗脫峰圖4-61.6M鹽濃度目的蛋白洗脫條件箭頭指示為目的蛋白洗脫峰從純化圖的結果，可以發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的增加，目的蛋白的UV峰值在增大，而NaOH的峰值在明顯變小。洗脫時間變短，洗脫體積減小。在之前的試驗里并沒有這種情況，所以推測為鹽濃度過高，導致雜蛋白也已經開始被洗脫。因1.4M和1.6M的峰值數(shù)據(jù)差距不大，但洗脫時間1.4M的比1.6M的長，即洗脫時拖尾情況比較明顯，故可選擇1.6M進行目的蛋白洗脫。4.1.4上樣條件的分析圖4-8無鹽，0.3M,0.6M上樣條件結果藍色：無鹽；紅色：0.3M；紫色：0.6M圖4-9匯研最終純化結果對比從純化圖，我們能看到隨著鹽濃度的增加，雜蛋白的洗脫峰值逐漸減小；無鹽時，目的蛋白的UV峰值最小，0.3M時目的蛋白的UV峰值最大，0.6M次之。NaOH的峰值變化不大。最后根據(jù)BCA法對收集到的目的蛋白樣品液進行濃度測定。結果顯示0M時收集到的蛋白含量最少，0.3M和0.6M回收到的蛋白含量差距不大。故可以選擇0.3M或者0.6M鹽濃度進行上樣。小結：經過一系列的實驗最終匯研SPFocurose6FF的純化實驗條件為0.3M鹽離子或者0.6M鹽離子濃度進行上樣，0.7M鹽濃度進行雜蛋白洗脫，1.6M鹽濃度進行目的的蛋白洗脫。由于現(xiàn)工藝的上樣鹽濃度為0.6M，且菌液保存濃度也為0.6M，故可使用0.6M鹽濃度進行上樣，而目的蛋白洗脫液的鹽濃度，由于1.4M和1.6M洗脫結果差距不明顯，但1.4M的洗脫時間比1.6M的長，即洗脫時拖尾情況比較明顯，故選擇1.6M進行目的蛋白洗脫。4.2博格隆SPBestaroseFF純化實驗條件結果4.2.1掛柱實驗圖4-10博格隆無鹽條件掛柱實驗陰影面積依次為：上樣峰、目的蛋白洗脫峰、NaOH洗脫峰圖4-11博格隆0.6M鹽濃度條件掛柱實驗陰影面積依次為：上樣峰、目的蛋白洗脫峰、NaOH洗脫峰圖4-12博格隆掛柱實驗電泳結果泳道順序：無鹽料液，穿透，目的蛋白洗脫，NaOH洗脫；0.6M鹽濃度料液，穿透（點樣失誤，樣品沒有完全點進泳道），穿透（重新點樣）、目的蛋白洗脫，NaOH洗脫；Marker從純化圖可以發(fā)現(xiàn)，無論是否有鹽，都有明顯的洗脫峰出現(xiàn)，是否如箭頭所示?若是，則用括號說明。另一共有10條泳道，但說明中只有9種成分?且經過凝膠電泳分析，具有濃的目的蛋白條帶（如箭頭所示）。證明目的蛋白能與該介質結合?？山浶泻罄m(xù)實驗。是否如箭頭所示?若是，則用括號說明。另一共有10條泳道，但說明中只有9種成分?4.2.2雜蛋白洗脫條件分析圖4-13博格隆雜蛋白洗脫條件箭頭所指為梯度洗脫液鹽濃度順序：0.4M-0.8M這次實驗結合了匯研雜蛋白洗脫實驗的結果，直接用0.3M鹽濃度進行上樣，梯度洗脫鹽濃度從0.4M~0.8M。結合純化圖，可以發(fā)現(xiàn)，鹽濃度在0.4~0.7M時都有明顯的雜蛋白洗脫峰。當鹽濃度升到0.8M時，UV值一直緩慢增長。故推測當0.8M時，目的蛋白開始被洗脫下來。所以最終選擇雜蛋白洗脫條件為0.7M鹽濃度。4.2.3目的蛋白洗脫條件分析圖4-141.2M鹽濃度目的蛋白洗脫條件箭頭指示為目的蛋白洗脫峰從實驗結果來看，由于在目的蛋白洗脫時沒有出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象，因此，可以不對該條件再優(yōu)化。4.2.4上樣條件分析圖4-150M，0.3M,0.6M上樣條件結果藍色：0M;紅色：0.3M；綠色：0.6M圖4-16博格隆最終純化結果對比從純化圖可以發(fā)現(xiàn)，當鹽濃度為無鹽條件時，由于雜蛋白的競爭結果過大，導致后面進行目的蛋白洗脫時，回收的蛋白量大大減少。當鹽濃度為0.3時，UV吸收峰達到最大為1915.1mAu，且回收蛋白的量也是最多的為124.7mg。鹽濃度為0.6M時，回收蛋白量與0.3M時的差距不大。因此也可用于上樣條件。小結：博格隆陽離子交換介質的最后純化條件為上樣鹽濃度為0.3M或0.6M，雜蛋白洗脫鹽濃度為0.7M，目的蛋白洗脫的鹽濃度為1.2M。最佳組合為上樣條件0.3M，雜蛋白洗脫液0.7M，目的蛋白洗脫1.2M。4.3納微SPPharmaroseFF純化實驗條件結果4.3.1掛柱實驗圖4-17納微無鹽條件掛柱實驗陰影面積依次為：上樣峰、目的蛋白洗脫峰、NaOH洗脫峰圖4-18納微0.6M鹽濃度條件掛柱實驗陰影面積依次為：上樣峰、目的蛋白洗脫峰、NaOH洗脫峰圖4-19納微掛柱實驗電泳結果泳道順序：無鹽稀釋20倍后穿透液，目的蛋白洗脫，NaOH洗脫；0.6M稀釋20倍后穿透液，目的蛋白洗脫，NaOH洗脫；Marker從純化圖可以發(fā)現(xiàn)，無論是否有鹽，都有明顯的洗脫峰出現(xiàn)，且經過凝膠電泳分析，具有濃的目的蛋白條帶。證明目的蛋白能與該介質結合?？山浶泻罄m(xù)實驗。4.3.2雜蛋白洗脫條件分析圖4-20納微雜蛋白洗脫條件箭頭所指為梯度洗脫液鹽濃度順序：0.4M-0.8M從純化圖的結果可以發(fā)現(xiàn)，0.4M鹽濃度到0.7M鹽濃度時有明顯的洗脫峰，當鹽濃度為0.8M時，UV值開始緩慢增長，可以認定為目的蛋白被洗脫。所以雜蛋白洗脫條件為0.7M鹽濃度。4.3.3目的蛋白洗脫條件優(yōu)化圖4-211.4M鹽濃度目的蛋白洗脫條件箭頭指示為目的蛋白洗脫峰圖4-221.6M鹽濃度目的蛋白洗脫條件箭頭指示為目的蛋白洗脫峰從純化圖可以觀察到，隨著鹽濃度的增加，目的蛋白的UV峰值在增大，NaOH的UV峰值在減小，并且洗脫時間縮短，體積減小。4.3.4上樣條件分析圖4-23無鹽，0.3M,0.6M上樣條件結果藍色：無鹽;紅色：0.3M；綠色：0.6M圖4-24納微最終純化結果對比從結果可以看到，當上樣鹽濃度為無鹽條件時，洗脫峰值最小，且蛋白的回收量也相對較小，而鹽濃度為0.3M和0.6M時，數(shù)據(jù)差距不大，因此，0.3M和0.6M鹽濃度都可以作為目的蛋白的上樣條件。小結：納微SPPharmaroseFF的實驗完成，上樣的洗脫鹽濃度為0.3M和0.6M都可以去除大量的雜蛋白，使更多的目的蛋白與介質結合；雜蛋白洗脫液的鹽濃度控制為0.7M，目的蛋白的鹽濃度控制為1.4M或者1.6M。實驗的最佳組合為0.3M的上樣，0.7M的雜蛋白洗脫，和1.6M的目的蛋白洗脫。最終選擇，可以根據(jù)放大實驗后的結果進行調整。5．討論改為“5.討論”改為“5.討論”本研究證明了匯研、博格隆、納微三家廠商的陽離子交換介質都能與目的蛋白MuR5S4TR進行純化，且純化效果與國外GE廠家生產的SPSepharoseFF相比，性能差距不大，可以選擇一家替換GE的陽離子交換介質。從之前的實驗結果可以發(fā)現(xiàn)，當鹽離子濃度為無鹽條件時，雜蛋白對目的蛋白與介質的結合影響較大。當鹽離子濃度升至0.3M時，可以降低樣品中的大部分雜蛋白的競爭結合。但當鹽離子濃度超過0.3M時，鹽離子成為了新的競爭結合因素。但只要低于0.6M時，鹽離子的競爭力度不是特別明顯，但當鹽濃度提高到0.8M時，就可以阻止目的蛋白與介質進行結合。對雜蛋白洗脫條件探索的最好方法就是梯度洗脫，梯度洗脫可以清楚的看到線性分離混合樣品中各種成分；在目的蛋白洗脫條件優(yōu)化過程中，持續(xù)對樣品進行洗脫時，雖然增加鹽濃度可以加快洗脫速度以及減少收樣體積，增加目的蛋白的回收率。但當鹽濃度升高至1.8M時，與介質結合力較強的雜質也被洗脫出來，可能造成后續(xù)純化步驟的難度變大，且可能導致目的蛋白變性。所以在目的蛋白洗脫過程中，沒有出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象以及目的蛋白的大量殘留的情況，不建議提高目的蛋白洗脫鹽濃度條件。 上樣條件雜蛋白洗脫條件目的蛋白洗脫條件目的蛋白洗脫最大UV峰值最大回收蛋白的量匯研0.3M/0.6M0.7M1.6M1915.1mAu120.4mg博格隆0.3M/0.6M0.7M1.2M1820.5mAu124.7mg納微0.3M/0.6M0.7M1.4M/1.6M2109.8mAu131.8mg表5-1三種介質最終純化條件對比6．結論三種介質的純化條件相似，從數(shù)據(jù)上來看，回收蛋白量差距不大；但回收蛋白量最多的是納微公司的介質，且納微公司具有標準藥用級的GMP生產資料，是目前比較符合本公司發(fā)展要求的介質提供商。本實驗方法是在一系列實踐后所得，所以前期實驗的順序有差別，但不影響數(shù)據(jù)的真實性以及參考性。綜合分析前期的實驗方法和實驗步驟得出體會，實驗操作方法有待提高，實驗效率有待提高！參考文獻姬衛(wèi)國，《癌癥深度科普》，河南中醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院腫瘤科2017.05.26陳學兵，《2018年全國最新癌癥報告中國每年新發(fā)癌癥病例達429萬》，浙江大學醫(yī)學院康復研究中心，2018.10.01趙永剛.對比CT與X線胸片放射診斷的方法鑒別良性腫瘤與肺癌的效果[J].中國衛(wèi)生標準管理,2018,9(6):104-106.赫捷、陳萬青等，《Cancer?incidence?and?mortality?in?China?in?2013:?an?analysis?based?on?urbanization?level》，《中國癌癥研究》2017.02李治中，《可能是關于癌癥最好的深度科普》，2018吳引芳.嬰幼兒怎么會患癌癥[J].早期教育:教師版,1998(6):30-30.王微《癌癥誘因爭論不休科學家寄望早期發(fā)現(xiàn)》,2018蔣析文,劉悅,朱小亞,等.BRCA基因突變型乳腺癌研究進展[J].生物產業(yè)技術,2018(2).于紅，王維濤，嵇鈞安等，《芪膠升白膠囊聯(lián)合粒細胞集落刺激因子治療癌癥化療后骨髓抑制療效觀察》，現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2018.02.28張穎，胡艷平，馬中良《精準醫(yī)學下的非小細胞肺癌靶向藥物及診斷標志物的研究進展》，《轉化醫(yī)學雜志》2018年6月第7卷第3期《RegressionofGlioblastomaafterChimericAntigenReceptorT-CellTherapy》，nejm，2016.12.29WileySR,SchooleyK,SmolakPJ,etal.Identificationandcharacterizationofanewmemberofthetnffamilythatinducesapoptosis[J].Immunity,1995,3(6):673-682.PittiRM,MarstersSA,RuppertS,etal.Inductionofapoptosisbyapo-2ligand,anewmemberofthetumornecrosisfactorcytokinefamily[J].JournalofBiologicalChemistry,1996,271(22):12687-12690.AshkenaziA，PaiＲC，F(xiàn)ongS，etal．SafetyandantitumoractivityofrecombinantsolubleApo2ligand［J］．JClinInvest，1999，104(2):155－162BaaderE，ToloczkoA，F(xiàn)uchsU，etal．Tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand-mediatedproliferationofrumorcellswithreceptor-proximalapoptosisdefects［J］．CancerＲes，2005，65(17):7888－7895HolochPA，GriffithTS．TNF－relatedapoptosis-inducingligand(TＲAIL):anewpathtoanti-cancertherapies［J］．EurJPharmacol，2009，625(1－3):63－72．胡劉兵，《Hsp90抑制劑SNX-2112聯(lián)合TRAIL誘導宮頸癌細胞凋亡的機制研究》，暨南大學碩士學位論文，2018.06.27二氫青蒿素對TNF相關凋亡誘導配體抗肺癌細胞活性的影響及其機制研究[J].浙江中西醫(yī)結合雜志,2018(2):98-100.文獻綜述：近代蛋白質層析分離技術簡介摘要：蛋白質(酶)存在于所有生物體中，是一種非常重要的生物大分子。蛋白質是生物功能的執(zhí)行者，承擔著生物催化、物質運輸、防御、調節(jié)、記憶、識別等多種生理功能。蛋白質使用最廣泛的兩個領域是食品加工和醫(yī)療。蛋白質的每種性質都有不同的作用。在蛋白質的應用過程中，需要提取純蛋白質有機物，這關系到蛋白質的純化。這些蛋白質大多存在于較復雜的混合組分中，且本身的穩(wěn)定性較差，不易分離。本文主要所涉及到的內容為根據(jù)蛋白質性質的不同而采取不同層析分離純化技術。關鍵詞：蛋白質；分離；技術一、蛋白質分離與純化的一般原則蛋白質和多肽在組織和細胞中以多種復雜形式存在，為下游生物工程技術的發(fā)展提出了艱巨的任務。到目前為止，還沒有一種簡單和現(xiàn)成的方法來分離和純化目標蛋白。蛋白質和多肽產品的提取和純化的基本原理是將目標成分從復雜的多組分物質中分離出來，得到盡可能多的具有生物活性的蛋白質和多肽產品。提高了目標產物的純度和生物活性。為了避免目的蛋白和多肽的變性和降解，有必要明確目的蛋白的物理、化學和生物學特性，以便選擇合適的分離方法[1]。目標蛋白的提取與純化一般包括以下幾個步驟：一是目標蛋白的釋放，使目標蛋白盡可能保持自然構象狀態(tài)，并在溶解狀態(tài)下釋放出組織或細胞碎片。例如，動物組織可用電攪拌或勻漿處理，細菌和植物細胞可用超聲波、研磨、勻漿器、酶消化、低溫冷凍等方法破碎。然后，采用適當?shù)娜軇┹腿2]和離心過濾。之后進行初步純化，蛋白溶液選擇合適的純化方法將目標蛋白與雜質分離，在保持活性的前提下盡可能提高產品的濃度和質量。其次高純度純化，也稱為精細純化，主要采用離子交換、親和層析、疏水色譜等色譜技術，因為這些操作具有較高的選擇性，可以去除理化性質相近的雜質。最后是成品的加工，產品的使用和要求決定了最終的加工方法。最常用的操作是濃縮、結晶和冷凍干燥。結晶通常是必不可少的操作，通常是一個先進的分離和純化過程。純度越高，結晶度越高，重結晶是去除少量雜質的方法之一。由于變性后的蛋白質不結晶，也是判斷目標產物是否保持在自然狀態(tài)的間接手段。大多數(shù)產品還需要干燥，如冷凍干燥，這可以保持目標蛋白的自然活性。每一步的分離操作都需要注意產物的變性、蛋白酶的水解作用以及微生物污染等，在接近生理的溫和條件下操作，能確保最大活性下獲得最高純度的蛋白制品[3]。二、蛋白分離純化技術隨著基因工程和蛋白質工程的不斷發(fā)展，作為基因工程下游技術的蛋白質純化變得越來越重要。蛋白質純化技術是指利用蛋白質之間的異同點，利用蛋白質相似性去除非蛋白質，然后利用蛋白質差異去除雜蛋白。蛋白質分離純化技術屬于當前生物領域的核心應用技術，該技術的應用難度大，成本相對較高。為了保證分離質量，必須合理選擇最合適的工藝來完成整個分離過程。目前，蛋白質分離純化技術主要包括電泳、透析、層析等技術，這些技術在醫(yī)學領域也得到了廣泛的應用，為醫(yī)藥產業(yè)的發(fā)展做出了重要貢獻。下面介紹幾種在工業(yè)和實驗室中常用的蛋白質純化技術。2.1離子交換層析色譜法中，以離子交換層析應用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計在蛋白質的純化實驗中，利用離子交換色譜法進行純化實驗的占比達到75%[4]。離子交換色譜，是一種利用離子交換基質不溶性骨架（如GE的SPSepharoseFF的基質為交聯(lián)瓊脂糖）和離子交換基團（如硫丙基，強陽離子交換基團）與帶相反電荷的蛋白相結合的原理分離多混合物的分離方法。不溶性骨架一般為惰性基質，不與待分離組分發(fā)生反應[5]。根據(jù)蛋白質的等電點差異，在不同的PH的條件下，不同的蛋白的帶電狀態(tài)也不同，離子交換基質結合的交換基團可以結合與它相反電荷的蛋白，從而分離出部分雜蛋白；再根據(jù)不同蛋白之間的帶電量不同，與離子交換基團的結合能力也不同，通過改變流動相的離子強度或pH，可以將蛋白按照結合由弱到強的順序依次洗脫下來，進而達到分離效果。陰離子交換介質可以結合帶負電荷的蛋白，陽離子交換介質可以與帶正電荷的蛋白結合[6]。2.2凝膠排阻層析凝膠過濾層析又稱分子排阻層析、分子篩色譜等。是根據(jù)分子大小不同分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中的介質是大分子惰性聚合物，交聯(lián)葡聚糖是通過控制交聯(lián)劑和葡聚糖的比例獲得不同交聯(lián)度的聚合物結構。理論上，根據(jù)排斥極限，大分子不進入凝膠顆粒網，小分子在低層凝膠網中反復反向擴散，在流動相使不同大小的分子通過不同距離流動時，依次被洗脫。根據(jù)分離極限，一些成分被完全堵塞，而另一些成分則被完全滲透。一般情況下，大分子基團從色譜柱中分離出來，小分子隨后流出。凝膠排阻色譜法的優(yōu)點是分離操作不需要梯度混合泵，設備簡單，操作方便。通過已知組分的大小與保留時間的關系，可以確定未知組分的保留時間[7]。2.3疏水作用層析疏水相互作用色譜主要是基于蛋白質表面疏水性的不同而進行的。疏水相互作用色譜要求蛋白質分子表面的疏水區(qū)域被暴露，因此需要進行鹽析，如加入高濃度的鹽溶液。一次吸附可用于多種洗脫方法，包括線性或逐步降低緩沖液的離子強度，從而提高蛋白質的親水性。配體結構是決定疏水相互作用色譜選擇性的條件之一。最理想的色譜介質應根據(jù)目標蛋白的生化和理化性質來確定。如果介質的結合力太強，則很難洗脫，因此在探索條件時，應選擇具有介質結合力的介質。在整個過程中，根據(jù)疏水相互作用色譜和離子相互作用吸附和洗脫的不同特點，通常將其作為離子交換純化的下一步操作，使疏水相互作用色譜在高鹽下吸附蛋白質。不需要離子交換層析產物交換液(增加溶液鹽的濃度)，即對蛋白質進行純化，達到換液的目的，節(jié)省時間，減少蛋白質的損失。近年來，疏水相互作用色譜已廣泛應用于生化產品的分離純化，主要用于可互換酶的分離[8]。2.4親和層析親和層析的分離原理是蛋白質在層析介質上識別配體特異性，并通過生物親和作用可逆結合。例如，純化酶的配體可以是底物、可逆抑制劑、相應的競爭性抑制劑或變構因子，從而建立一種利用制備的固相抗體或抗原來純化相應抗原或抗體的高分辨率純化方法。為了更好地應用親和層析，有必要對目的蛋白的結構和生物學特性有一個清楚的了解，以便設計出最佳的分離方案。對于酶-配體復合物的可逆結合，最佳的分離條件應是最合適的。在純化蛋白質時，培養(yǎng)基上的單克隆抗體與待分離的目的蛋白結合能力強，需要更嚴格的洗脫條件。然而，這將使該蛋白失活并破壞單克隆抗體。同時，混合物中的蛋白酶也可能破壞抗體或與抗體非特異性結合。一些單克隆抗體在純化過程中也會與目標產物分離和混合，因此應將其從最終產物中去除。親和層析常用于純化過程的最后階段。此時，待分離的樣品體積減少了幾個單位，大部分雜質被除去，從而降低了親和層析的壓力。目前，該方法已被大規(guī)模地用于酶和抗體的分離純化，而在核酸、免疫球蛋白、膜受體、核酸、細胞器乃至完整細胞的純化中也得到了較小規(guī)模的應用[9]。2.5金屬偶聯(lián)層析金屬偶聯(lián)色譜主要是利用瓊脂糖環(huán)氧活化后和亞氨二醋酸鹽偶聯(lián)形成雙梭甲基氨瓊脂糖，過渡金屬如鎳、銅等固相結合形成穩(wěn)定的活性中心。這些金屬離子可以與配體配位。根據(jù)偶聯(lián)的不同過渡金屬與蛋白質上暴露的氨基酸殘基之間的相互作用，對氨基酸殘基進行了分離。金屬離子對色譜試劑的親和力要大于與分離物質的配位作用，否則吸附困難。洗脫劑可以通過降低離子強度、增加離子強度、在緩沖液中加入螯合劑等方法來實現(xiàn)。這種色譜技術在工業(yè)蛋白生產中還沒有得到廣泛的應用[10]。2.6氣相層析氣相色譜屬于分配色譜或吸附色譜，僅適用于揮發(fā)性和低揮發(fā)性化合物的分析和分離。固定相覆蓋一層高沸點液體，如硅油、高沸點石蠟和潤滑脂、惰性載體上的環(huán)氧聚合物(如研磨耐火磚)。外涂層的重量約為支架重量的20%。工作溫度范圍一般為室溫至200℃。專用色譜柱可達500℃。在流動相中，氦、氬或氮通常用作擴散氣體。氣相色譜分離的區(qū)域非常清晰，因為揮發(fā)性物質可以很快在兩相之間達到平衡，而且大大縮短了分析時間，通常從幾分鐘縮短到10分鐘以上。所述檢測記錄系統(tǒng)所繪制的峰值是對流出氣體的電阻變化的測定結果，因此可以測量到微克和納米顆粒的水平上的樣品大小。該方法具有快速、靈敏、痕量等優(yōu)點。氣相色譜法也可用于分離和制備樣品，但需要增加一個裝置，通過冷凍回收分離出的氣體11]。2.7等電聚焦層析等電聚焦色譜采用不同的兩性分子pI在穩(wěn)定的、連續(xù)的和線性的梯度條件下純化蛋白質。該方法主要用于蛋白質等兩性物質的分離，特別是當其它色譜方法不能達到很好的分辨率時，這種方法更適用于蛋白質等兩性物質的分離。它要求蛋白質在離子交換器或凝膠中以連續(xù)穩(wěn)定的梯度進行分離。該方法主要用于蛋白質等兩性物質的分離，特別是在其它色譜分離不到的情況下。大多數(shù)填料是以交聯(lián)瓊脂糖為載體。目前，它主要用于分離微生物酶、粗卵蛋白、水溶性蛋白等，但由于洗脫劑和介質價格昂貴，限制了其大規(guī)模應用，僅適用于高附加值產品的純化[12]。2.8高效液相層析(又名高壓液相色譜)20世紀70年代發(fā)展起來的一種新的色譜分析方法。其特點是采用高壓輸液泵，最大壓力可達5000psi(相當于34個標準大氣壓)。均勻的不銹鋼柱內填充直徑約為3-10微米的超細支撐。一種常見的載體是在玻璃珠上涂上1-2微米的二氧化硅，然后與硫酰氯反應生成Si-Cl，進一步連接疏水性烷基，如Si-C18H37，或陽離子交換基團-Si(CH2)n=C6H4SO3H，或陰離子交換基團Si(CH2)nNH2。這種支撐體能夠承受高壓，并且具有穩(wěn)定的化學性質。HPLC具有不同的載體類型，可用于吸附色譜、離子交換色譜和凝膠過濾色譜。該分析方法的微量定量可達10g級。可以純化上克的樣品。展層時間短，一般需幾分鐘到10余分鐘。其分析速度和準確度與氣相色譜法相當。HPLC適用于非揮發(fā)性和極性物質的分析和分離。然而，氣相色譜法僅適用于揮發(fā)性物質，兩者相輔相成，是目前最理想的色譜