乳酸菌與植物內(nèi)生菌聯(lián)合發(fā)酵：解鎖黑棗多酚降血糖潛力的新鑰匙一、引言1.1研究背景1.1.1黑棗的營養(yǎng)與藥用價(jià)值黑棗，廣泛分布于中國北方地區(qū)，其性溫味甘，富含蛋白質(zhì)、糖類、有機(jī)酸、維生素B和維生素E，以及磷、鈣、鐵等微量元素，有著“營養(yǎng)倉庫”的美譽(yù)。在藥用價(jià)值方面，黑棗的表現(xiàn)十分出色。研究表明，黑棗中富含的膳食纖維，一方面能夠促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，另一方面能增加消化液的分泌，從而起到良好的潤腸通便作用，且還可發(fā)揮降低血脂、降低血糖的功效。黑棗中的鉀元素含量很高，而鈉含量相對(duì)較低，這對(duì)于控制血壓和保持心臟健康具有重要意義，鉀攝入人體后可促進(jìn)鈉的排出，同時(shí)軟化血管，達(dá)到降低血壓的效果。其含有的果膠具有很強(qiáng)的吸水性且難以消化，能有效阻止膽固醇與消化酶、膽汁酸及腸黏膜的接觸，束縛膽汁酸，阻斷膽固醇吸收，進(jìn)而起到降低膽固醇的功效。黑棗中豐富的鈣和鐵元素，對(duì)防治骨質(zhì)疏松和貧血有著重要作用。另外，黑棗富含的維生素C，能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成膠原蛋白，維持血管和皮膚的彈性，預(yù)防牙齦萎縮和減輕動(dòng)脈硬化，清除自由基，有效提升免疫力，還有預(yù)防癌癥的功效。值得一提的是，黑棗中含有的單寧，屬于植物多酚類，具有良好的抗菌抗病毒、清除自由基抗氧化、抗突變抗腫瘤以及降血脂降血糖的作用。1.1.2黑棗多酚在傳統(tǒng)加工中的問題在傳統(tǒng)的黑棗加工過程中，存在諸多導(dǎo)致黑棗多酚降解的因素。酶類物質(zhì)是其中之一，例如紅棗中含有的多酚氧化酶，在加工時(shí)會(huì)引發(fā)酶促褐變。這不僅會(huì)改變黑棗的色澤，還會(huì)使其中的多酚物質(zhì)在酶的催化作用下發(fā)生氧化分解等反應(yīng)，從而降低多酚含量。微生物的影響也不容小覷，在加工環(huán)境不夠嚴(yán)格時(shí)，外界微生物容易污染黑棗，這些微生物在生長繁殖過程中會(huì)消耗黑棗中的營養(yǎng)成分，包括多酚類物質(zhì)，導(dǎo)致其含量下降。溫度、濕度等環(huán)境因素也會(huì)對(duì)黑棗多酚產(chǎn)生影響，高溫可能加速多酚的氧化和分解，高濕度則可能促進(jìn)微生物生長，間接影響多酚含量。隨著人們對(duì)黑棗藥用價(jià)值認(rèn)識(shí)的加深以及對(duì)高品質(zhì)黑棗產(chǎn)品需求的增加，尋找一種新的黑棗多酚保護(hù)劑或新的黑棗多酚提取方法顯得尤為必要，這不僅有助于提高黑棗產(chǎn)品的質(zhì)量和附加值，還能更好地發(fā)揮黑棗的藥用功效。1.1.3乳酸菌與植物內(nèi)生菌的應(yīng)用現(xiàn)狀乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱，其在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛。在酸奶生產(chǎn)中，乳酸菌發(fā)酵牛奶中的乳糖產(chǎn)生乳酸，使牛奶中的蛋白質(zhì)凝固，形成酸奶獨(dú)特的質(zhì)地和風(fēng)味，同時(shí)還能產(chǎn)生多種維生素和酶類，提高酸奶的營養(yǎng)價(jià)值。在發(fā)酵泡菜制作中，乳酸菌將蔬菜中的糖類轉(zhuǎn)化為乳酸，抑制有害微生物生長，延長泡菜保質(zhì)期，賦予泡菜獨(dú)特的酸味和香氣。在釀酒工業(yè)中，乳酸菌參與蘋果酸-乳酸發(fā)酵，降低葡萄酒的酸度，改善口感和風(fēng)味。植物內(nèi)生菌是指那些寄居在植物內(nèi)部組織中、且宿主植物沒有表現(xiàn)出被感染的微生物。在植物保護(hù)方面，一些內(nèi)生細(xì)菌能夠控制植物的病原菌、昆蟲和線蟲，從而增強(qiáng)植物的抗病能力。有的內(nèi)生菌可以分泌植物生長激素、進(jìn)行固氮作用、溶磷作用、促進(jìn)鐵的吸收，改善宿主植物營養(yǎng)和增強(qiáng)抗逆能力。在土壤修復(fù)領(lǐng)域，生長在污染環(huán)境下植物體內(nèi)的內(nèi)生菌具有降解異生物和抗重金屬的能力，可強(qiáng)化宿主植物修復(fù)污染環(huán)境。1.2研究目的與意義1.2.1目的本研究旨在深入探究乳酸菌與植物內(nèi)生菌聯(lián)合發(fā)酵對(duì)黑棗多酚含量及其降血糖活性的影響。通過從常見的乳酸菌和植物內(nèi)生菌中篩選出適宜的菌種并進(jìn)行組合，確定聯(lián)合發(fā)酵的最佳條件，包括菌的種類、數(shù)量、比例以及發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH值等參數(shù)，考察不同處理?xiàng)l件下黑棗多酚的含量變化和降血糖活性差異。利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等先進(jìn)分析手段，鑒定并分析聯(lián)合發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物，明確其組成和結(jié)構(gòu)，從而揭示乳酸菌和植物內(nèi)生菌聯(lián)合發(fā)酵對(duì)黑棗多酚的保護(hù)機(jī)制以及對(duì)降血糖活性的提升機(jī)制，為黑棗多酚的保護(hù)和利用提供新的思路和方法。1.2.2意義在理論層面，本研究有助于豐富微生物發(fā)酵理論以及植物與微生物相互作用的研究。當(dāng)前，關(guān)于乳酸菌和植物內(nèi)生菌聯(lián)合發(fā)酵的研究尚處于發(fā)展階段，對(duì)其在特定底物（如黑棗）發(fā)酵過程中的作用機(jī)制了解有限。通過本研究，能夠深入揭示乳酸菌和植物內(nèi)生菌在黑棗多酚保護(hù)和降血糖活性提升方面的協(xié)同作用機(jī)制，為微生物發(fā)酵理論的發(fā)展提供新的理論依據(jù)，拓展植物與微生物相互作用的研究領(lǐng)域，使人們對(duì)微生物在食品加工和生物活性成分轉(zhuǎn)化中的作用有更全面、深入的認(rèn)識(shí)。在實(shí)際應(yīng)用方面，為黑棗多酚的保護(hù)和利用開辟新途徑。黑棗作為一種營養(yǎng)豐富的果實(shí)，其多酚具有多種生理活性，但在傳統(tǒng)加工中易降解。本研究若能找到合適的乳酸菌和植物內(nèi)生菌組合及發(fā)酵條件，實(shí)現(xiàn)對(duì)黑棗多酚的有效保護(hù)和活性提升，將為黑棗多酚的提取和應(yīng)用提供新的技術(shù)手段，有助于開發(fā)出更多高附加值的黑棗產(chǎn)品，如黑棗多酚提取物、黑棗功能性食品等。推動(dòng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，黑棗產(chǎn)業(yè)作為農(nóng)產(chǎn)品加工的一部分，其發(fā)展對(duì)于促進(jìn)農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收具有重要意義。本研究成果的應(yīng)用，可提高黑棗產(chǎn)品的質(zhì)量和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，帶動(dòng)黑棗種植、加工、銷售等相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，形成完整的產(chǎn)業(yè)鏈，促進(jìn)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展。同時(shí)，對(duì)于功能性食品產(chǎn)業(yè)而言，開發(fā)出具有降血糖活性的黑棗產(chǎn)品，滿足了市場(chǎng)對(duì)健康功能性食品的需求，推動(dòng)了功能性食品產(chǎn)業(yè)的創(chuàng)新發(fā)展。1.3研究內(nèi)容與技術(shù)路線1.3.1研究內(nèi)容適宜乳酸菌與植物內(nèi)生菌的篩選及組合：從常見的乳酸菌和植物內(nèi)生菌中篩選出適宜與黑棗進(jìn)行發(fā)酵的菌種。對(duì)于乳酸菌，選取如嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、植物乳桿菌等常見菌種，通過比較它們?cè)诤跅椞崛∫褐械纳L情況、產(chǎn)酸能力以及對(duì)黑棗多酚的耐受性，篩選出具有良好適應(yīng)性的乳酸菌菌株。對(duì)于植物內(nèi)生菌，從黑棗植株或其他相關(guān)植物中分離內(nèi)生菌，如通過表面消毒植物組織后進(jìn)行內(nèi)生菌的分離培養(yǎng)，然后對(duì)分離得到的內(nèi)生菌進(jìn)行鑒定和篩選，考察其與黑棗的共生能力以及對(duì)黑棗多酚的影響。對(duì)篩選出的乳酸菌和植物內(nèi)生菌進(jìn)行不同組合，設(shè)置多種組合實(shí)驗(yàn)組，用菌的數(shù)量和比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如乳酸菌與植物內(nèi)生菌的比例為1:1、1:2、2:1等不同組合，探究最佳的菌種組合方式。聯(lián)合發(fā)酵最佳條件的確定：制備黑棗水提液，將其作為發(fā)酵底物。進(jìn)行單獨(dú)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，分別用篩選出的乳酸菌和植物內(nèi)生菌對(duì)黑棗水提液進(jìn)行發(fā)酵，考察發(fā)酵時(shí)間（如12h、24h、36h等）、溫度（如30℃、35℃、40℃等）、pH值（如5.0、6.0、7.0等）等單因素對(duì)黑棗多酚含量和降血糖活性的影響。在單獨(dú)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察不同菌組合、菌的接種量（如1%、3%、5%等）、發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH值等多因素對(duì)黑棗多酚含量和降血糖活性的影響。通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等方法，確定聯(lián)合發(fā)酵的最佳條件，建立發(fā)酵條件與黑棗多酚含量和降血糖活性之間的數(shù)學(xué)模型，預(yù)測(cè)最佳發(fā)酵條件下的黑棗多酚含量和降血糖活性。代謝產(chǎn)物的鑒定與分析：利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）對(duì)聯(lián)合發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。首先，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，如離心、過濾等，去除雜質(zhì)和菌體，然后將處理后的發(fā)酵液注入LC-MS儀器中，通過液相色譜的分離作用，將代謝產(chǎn)物分離成不同的組分，再通過質(zhì)譜分析，獲得各組分的分子質(zhì)量、碎片離子等信息，從而鑒定出代謝產(chǎn)物的種類。結(jié)合核磁共振（NMR）等其他分析技術(shù)，進(jìn)一步確定代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，分析代謝產(chǎn)物的組成和含量變化，研究代謝產(chǎn)物與黑棗多酚含量和降血糖活性之間的關(guān)系，探討聯(lián)合發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物對(duì)黑棗多酚的保護(hù)作用和對(duì)降血糖活性的提升作用。聯(lián)合發(fā)酵機(jī)制及對(duì)黑棗多酚保護(hù)機(jī)制的探討：以黑棗多酚含量和降血糖活性為主要指標(biāo)，研究乳酸菌和植物內(nèi)生菌聯(lián)合發(fā)酵過程中，微生物之間的相互作用關(guān)系，如共生、競(jìng)爭(zhēng)等，探討聯(lián)合發(fā)酵的協(xié)同作用機(jī)制。從酶學(xué)角度分析，研究聯(lián)合發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶類，如多酚氧化酶、過氧化物酶等，對(duì)黑棗多酚的影響，探討酶促反應(yīng)在黑棗多酚保護(hù)中的作用機(jī)制。從微生物代謝產(chǎn)物角度分析，研究代謝產(chǎn)物如有機(jī)酸、多糖、酶等對(duì)黑棗多酚的保護(hù)作用機(jī)制，如有機(jī)酸調(diào)節(jié)發(fā)酵環(huán)境pH值，影響多酚的穩(wěn)定性；多糖與多酚形成復(fù)合物，提高多酚的抗氧化性等。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證聯(lián)合發(fā)酵對(duì)黑棗多酚降血糖活性的提升作用，探討其作用機(jī)制，如對(duì)胰島素敏感性的影響、對(duì)糖代謝相關(guān)酶活性的影響等。1.3.2技術(shù)路線技術(shù)路線如圖1-1所示：原料準(zhǔn)備：采集新鮮黑棗，進(jìn)行清洗、去核等預(yù)處理，然后制備黑棗水提液，測(cè)定其初始的多酚含量和降血糖活性。菌種篩選：從常見乳酸菌和植物內(nèi)生菌中篩選適宜菌種，分別進(jìn)行乳酸菌和植物內(nèi)生菌的分離、培養(yǎng)、鑒定，然后進(jìn)行單菌在黑棗水提液中的適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)，篩選出生長良好、對(duì)黑棗多酚影響較小的乳酸菌和植物內(nèi)生菌菌株。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：進(jìn)行單獨(dú)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察單因素對(duì)黑棗多酚含量和降血糖活性的影響；在此基礎(chǔ)上進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，用多因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察不同條件對(duì)黑棗多酚含量和降血糖活性的影響，通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定最佳發(fā)酵條件。成分分析：在最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行處理，利用LC-MS等技術(shù)鑒定代謝產(chǎn)物，分析代謝產(chǎn)物的組成和結(jié)構(gòu)。機(jī)制研究：從微生物相互作用、酶學(xué)、代謝產(chǎn)物等角度探討聯(lián)合發(fā)酵機(jī)制和對(duì)黑棗多酚的保護(hù)機(jī)制，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證聯(lián)合發(fā)酵對(duì)黑棗多酚降血糖活性的提升作用及機(jī)制。結(jié)果分析與討論：對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，總結(jié)乳酸菌與植物內(nèi)生菌聯(lián)合發(fā)酵對(duì)黑棗多酚含量及其降血糖活性的影響，探討研究結(jié)果的意義和應(yīng)用前景。[此處插入技術(shù)路線圖，圖名為“圖1-1技術(shù)路線圖”，圖中清晰展示從原料準(zhǔn)備到結(jié)果分析與討論的整個(gè)流程，各步驟之間用箭頭連接，標(biāo)注關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)操作和分析方法][此處插入技術(shù)路線圖，圖名為“圖1-1技術(shù)路線圖”，圖中清晰展示從原料準(zhǔn)備到結(jié)果分析與討論的整個(gè)流程，各步驟之間用箭頭連接，標(biāo)注關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)操作和分析方法]二、微生物發(fā)酵黑棗菌株的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化2.1材料與設(shè)備2.1.1實(shí)驗(yàn)材料黑棗：選用產(chǎn)自[具體產(chǎn)地]的新鮮黑棗，在[具體時(shí)間]采摘，確保果實(shí)成熟度高、無病蟲害、無機(jī)械損傷。采摘后，將黑棗置于陰涼通風(fēng)處暫存，并盡快運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。乳酸菌菌種：嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）購自[菌種保藏中心名稱1]，編號(hào)為[具體編號(hào)1]；雙歧桿菌（Bifidobacterium）購自[菌種保藏中心名稱2]，編號(hào)為[具體編號(hào)2]；植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）由本實(shí)驗(yàn)室自行分離保存，分離自[具體來源，如某發(fā)酵蔬菜]，經(jīng)16SrRNA基因測(cè)序鑒定正確。植物內(nèi)生菌菌種：從健康的黑棗植株莖部、葉片中分離植物內(nèi)生菌。具體方法為：采集新鮮的黑棗植株樣本，用流水沖洗表面雜質(zhì)，再依次用75%乙醇浸泡消毒[具體時(shí)間1]，1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒[具體時(shí)間2]，無菌水沖洗[具體次數(shù)]次。將消毒后的組織剪成小塊，接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于細(xì)菌分離）和PDA培養(yǎng)基（用于真菌分離）上，在[具體溫度]下培養(yǎng)[具體時(shí)間]。挑取形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，得到多株植物內(nèi)生菌菌株。通過形態(tài)觀察、生理生化特性測(cè)定以及16SrRNA基因測(cè)序（細(xì)菌）或ITS基因測(cè)序（真菌）進(jìn)行鑒定，篩選出具有潛在應(yīng)用價(jià)值的植物內(nèi)生菌菌株，如菌株[具體菌株編號(hào)1]、[具體菌株編號(hào)2]等。培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基用于乳酸菌的培養(yǎng)，配方為：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、吐溫801mL、檸檬酸氫二銨2g、磷酸氫二鉀2g、乙酸鈉5g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，pH值調(diào)至6.2-6.6。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于植物內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)，配方為：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，pH值調(diào)至7.2-7.4。PDA培養(yǎng)基用于植物內(nèi)生真菌的培養(yǎng)，配方為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，自然pH。黑棗水提液培養(yǎng)基：將黑棗洗凈、去核后，按料液比1:10（g/mL）加入蒸餾水，在[具體溫度]下浸提[具體時(shí)間]，過濾取上清液，即為黑棗水提液。向黑棗水提液中加入[具體量]的瓊脂，加熱溶解后分裝，121℃滅菌20min，用于微生物在黑棗水提液中的適應(yīng)性培養(yǎng)和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。其他材料：無水乙醇、次氯酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸、濃硝酸、甲醇、乙腈等均為分析純?cè)噭徸訹試劑公司名稱]；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)制備；無菌水，將蒸餾水121℃滅菌20min后備用；無菌移液管（1mL、0.1mL）、無菌培養(yǎng)皿、無菌試管、三角瓶等玻璃器皿，均經(jīng)121℃滅菌20min后備用。2.1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱：型號(hào)為[具體型號(hào)1]，購自[設(shè)備公司名稱1]。用于乳酸菌和植物內(nèi)生菌的培養(yǎng)，可提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境，溫度范圍為20-60℃，精度可達(dá)±0.1℃。在培養(yǎng)過程中，將接種后的培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中，根據(jù)不同菌種的生長特性設(shè)置相應(yīng)的培養(yǎng)溫度和時(shí)間，如乳酸菌一般在37℃培養(yǎng)24-48h，植物內(nèi)生菌在28℃培養(yǎng)3-5天。離心機(jī)：型號(hào)為[具體型號(hào)2]，購自[設(shè)備公司名稱2]，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)[具體轉(zhuǎn)速]r/min。在實(shí)驗(yàn)中，用于發(fā)酵液的離心分離，以去除菌體和雜質(zhì)，獲取上清液用于后續(xù)分析。例如，在測(cè)定黑棗多酚含量和降血糖活性時(shí)，將發(fā)酵液在[具體轉(zhuǎn)速]r/min下離心[具體時(shí)間]，使菌體沉淀，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。PCR儀：型號(hào)為[具體型號(hào)3]，購自[設(shè)備公司名稱3]。用于微生物的分子生物學(xué)鑒定，通過擴(kuò)增微生物的特定基因片段，如乳酸菌的16SrRNA基因、植物內(nèi)生菌的16SrRNA基因（細(xì)菌）或ITS基因（真菌），并進(jìn)行測(cè)序分析，以確定菌種的種類。在操作時(shí)，根據(jù)不同基因的擴(kuò)增需求，設(shè)置合適的PCR反應(yīng)體系和程序，包括變性、退火、延伸等步驟的溫度和時(shí)間。高效液相色譜儀（HPLC）：型號(hào)為[具體型號(hào)4]，購自[設(shè)備公司名稱4]，配備紫外檢測(cè)器。用于黑棗多酚含量的測(cè)定，利用HPLC的分離能力，將黑棗中的多酚類物質(zhì)分離成不同的組分，再通過紫外檢測(cè)器檢測(cè)各組分的含量。在實(shí)驗(yàn)前，需對(duì)HPLC進(jìn)行調(diào)試和校準(zhǔn)，選擇合適的色譜柱（如C18柱）、流動(dòng)相（如甲醇-水-磷酸體系）以及檢測(cè)波長（根據(jù)不同多酚類物質(zhì)的特征吸收波長確定）。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）：型號(hào)為[具體型號(hào)5]，購自[設(shè)備公司名稱5]。用于聯(lián)合發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物的鑒定，先通過液相色譜將發(fā)酵液中的代謝產(chǎn)物分離，再通過質(zhì)譜分析獲得各組分的分子質(zhì)量、碎片離子等信息，從而鑒定代謝產(chǎn)物的種類和結(jié)構(gòu)。在使用LC-MS時(shí)，需對(duì)儀器參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，如離子源參數(shù)（如電噴霧電壓、離子源溫度等）、質(zhì)譜掃描范圍等，以提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。酶標(biāo)儀：型號(hào)為[具體型號(hào)6]，購自[設(shè)備公司名稱6]。用于黑棗降血糖活性的初步測(cè)定，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等方法，檢測(cè)發(fā)酵前后黑棗提取物對(duì)相關(guān)酶（如α-葡萄糖苷酶、淀粉酶等）活性的影響，以評(píng)估其降血糖活性。在實(shí)驗(yàn)中，按照ELISA試劑盒的操作說明，將樣品和試劑加入酶標(biāo)板中，在酶標(biāo)儀上測(cè)定特定波長下的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中相關(guān)物質(zhì)的含量或酶活性的變化。電子天平：型號(hào)為[具體型號(hào)7]，購自[設(shè)備公司名稱7]，精度為0.0001g。用于實(shí)驗(yàn)中各種試劑和材料的精確稱量，如培養(yǎng)基成分的稱量、黑棗的稱量等。在使用電子天平前，需進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)零，確保稱量結(jié)果的準(zhǔn)確性。pH計(jì)：型號(hào)為[具體型號(hào)8]，購自[設(shè)備公司名稱8]。用于培養(yǎng)基和發(fā)酵液pH值的測(cè)定和調(diào)節(jié)，在配制培養(yǎng)基時(shí)，用pH計(jì)測(cè)量培養(yǎng)基的pH值，并根據(jù)要求用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)至合適的pH范圍。在發(fā)酵過程中，定期用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH值，觀察其變化情況。高壓蒸汽滅菌器：型號(hào)為[具體型號(hào)9]，購自[設(shè)備公司名稱9]。用于培養(yǎng)基、玻璃器皿等的滅菌處理，通過高溫高壓（121℃，103kPa）的蒸汽殺滅微生物，保證實(shí)驗(yàn)的無菌環(huán)境。在使用高壓蒸汽滅菌器時(shí)，需按照操作規(guī)程進(jìn)行操作，注意滅菌時(shí)間、壓力和裝載量等參數(shù)的控制。超凈工作臺(tái)：型號(hào)為[具體型號(hào)10]，購自[設(shè)備公司名稱10]。為微生物實(shí)驗(yàn)提供無菌操作環(huán)境，在進(jìn)行菌種接種、培養(yǎng)基分裝等操作時(shí)，將實(shí)驗(yàn)器材和樣品置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，開啟風(fēng)機(jī)和紫外燈，進(jìn)行空氣凈化和表面消毒，防止雜菌污染。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1微生物的分離與培養(yǎng)乳酸菌的分離與培養(yǎng)：取10g新鮮的泡菜樣品，放入裝有90mL無菌生理鹽水并帶有玻璃珠的三角瓶中，在搖床上以180r/min的轉(zhuǎn)速振蕩30min，使樣品中的乳酸菌充分分散。采用10倍梯度稀釋法，將樣品稀釋成10?1-10??不同濃度的稀釋液。分別吸取0.1mL不同稀釋度的菌液，用無菌涂布棒均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次。將平板倒置，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察平板上的菌落形態(tài)，挑選出具有乳酸菌典型菌落特征（如圓形、邊緣整齊、表面濕潤光滑、灰白色、凸起等）的單菌落。將挑選出的單菌落用接種環(huán)挑取，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃、180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，進(jìn)行活化。活化后的菌液可用于后續(xù)的鑒定和實(shí)驗(yàn)。植物內(nèi)生菌的分離與培養(yǎng)：采集健康的黑棗植株莖部和葉片，用流水沖洗表面雜質(zhì)，去除表面的灰塵和污垢。將清洗后的植物組織剪成小段，放入75%乙醇中浸泡消毒30s，迅速殺死表面的大部分微生物。接著，將組織段放入1%次氯酸鈉溶液中浸泡消毒5min，進(jìn)一步殺滅殘留的微生物。用無菌水沖洗組織段5次，每次浸泡1-2min，以去除殘留的消毒劑。將消毒后的組織段剪成0.5cm×0.5cm的小塊，接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于細(xì)菌分離）和PDA培養(yǎng)基（用于真菌分離）上，每個(gè)平板接種5-6塊組織塊。將接種后的平板倒置，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。每天觀察平板上組織塊周圍的菌落生長情況，挑取形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。純化培養(yǎng)采用平板劃線法，將單菌落接種到新的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基或PDA培養(yǎng)基平板上，連續(xù)劃線3-4次，使菌落分散開。將劃線后的平板倒置，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天，直至得到單個(gè)的純菌落。將純化后的植物內(nèi)生菌接種到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，在28℃、150r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，制備菌懸液，用于后續(xù)的鑒定和實(shí)驗(yàn)。2.2.2微生物種類的鑒定形態(tài)學(xué)觀察：對(duì)于乳酸菌，將活化后的乳酸菌菌液進(jìn)行涂片，自然干燥后，進(jìn)行革蘭氏染色。在顯微鏡下觀察乳酸菌的細(xì)胞形態(tài)，如桿狀或球狀，以及排列方式，如單個(gè)、成對(duì)或成鏈狀。同時(shí)，觀察菌落形態(tài)，包括菌落的大小、形狀、顏色、表面特征（光滑或粗糙）、邊緣特征（整齊或不整齊）等。對(duì)于植物內(nèi)生菌，將分離得到的內(nèi)生菌在相應(yīng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，觀察菌落形態(tài)，如細(xì)菌菌落的大小、顏色、透明度、濕潤度等，真菌菌落的質(zhì)地（絨毛狀、絮狀等）、顏色、大小等。對(duì)于真菌，還可制作玻片標(biāo)本，在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、有無隔膜、孢子形態(tài)和著生方式等特征。生理生化實(shí)驗(yàn)：對(duì)于乳酸菌，進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，取少量乳酸菌菌液滴加3%過氧化氫溶液，觀察是否產(chǎn)生氣泡，乳酸菌一般為過氧化氫酶陰性，不產(chǎn)生氣泡。進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，將乳酸菌接種到含有不同糖類（如葡萄糖、乳糖、蔗糖等）的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)基顏色變化，判斷乳酸菌對(duì)不同糖類的發(fā)酵能力。進(jìn)行明膠液化實(shí)驗(yàn)，將乳酸菌接種到明膠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后觀察明膠是否液化，以確定乳酸菌是否產(chǎn)生明膠酶。對(duì)于植物內(nèi)生菌，細(xì)菌進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)，用無菌棉簽蘸取菌液，涂抹在氧化酶試劑上，觀察是否變色，判斷細(xì)菌是否具有氧化酶。進(jìn)行吲哚實(shí)驗(yàn)，將內(nèi)生細(xì)菌接種到蛋白胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后加入吲哚試劑，觀察是否出現(xiàn)紅色環(huán)，判斷細(xì)菌是否能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚。真菌進(jìn)行淀粉水解實(shí)驗(yàn)，將真菌接種到淀粉培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后滴加碘液，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，判斷真菌是否能產(chǎn)生淀粉酶水解淀粉。分子生物學(xué)技術(shù)：提取乳酸菌和植物內(nèi)生菌的基因組DNA，使用細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）擴(kuò)增乳酸菌和植物內(nèi)生細(xì)菌的16SrRNA基因；對(duì)于植物內(nèi)生真菌，使用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）擴(kuò)增ITS基因。PCR反應(yīng)體系（25μL）：10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，ddH?O17.3μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切下目的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收純化。將回收的PCR產(chǎn)物送往測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，與已知菌種的序列進(jìn)行相似性分析，根據(jù)相似性結(jié)果確定微生物的種類。2.2.3黑棗發(fā)酵菌株的篩選單獨(dú)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：將篩選出的乳酸菌和植物內(nèi)生菌分別進(jìn)行單獨(dú)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。制備黑棗水提液，將黑棗洗凈、去核后，按料液比1:10（g/mL）加入蒸餾水，在80℃下浸提2h，過濾取上清液，即為黑棗水提液。向黑棗水提液中添加2%的葡萄糖和0.5%的酵母膏，調(diào)節(jié)pH值至6.5，分裝到三角瓶中，121℃滅菌20min。將活化后的乳酸菌和植物內(nèi)生菌分別以3%的接種量接種到滅菌后的黑棗水提液中，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將接種后的三角瓶置于恒溫?fù)u床中，乳酸菌在37℃、180r/min的條件下發(fā)酵48h，植物內(nèi)生菌在28℃、150r/min的條件下發(fā)酵72h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在8000r/min的條件下離心10min，取上清液用于多酚含量和降血糖活性的測(cè)定。初步組合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：根據(jù)單獨(dú)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇多酚含量較高和降血糖活性較好的乳酸菌和植物內(nèi)生菌進(jìn)行初步組合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。設(shè)置不同的菌種組合，如乳酸菌A與植物內(nèi)生菌B、乳酸菌C與植物內(nèi)生菌D等，以及不同的接種比例，如乳酸菌：植物內(nèi)生菌=1:1、1:2、2:1等。將篩選出的乳酸菌和植物內(nèi)生菌按不同組合和比例接種到黑棗水提液中，接種總量為3%，每個(gè)組合設(shè)置3個(gè)重復(fù)。發(fā)酵條件同單獨(dú)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心處理，取上清液測(cè)定多酚含量和降血糖活性。以多酚含量和降血糖活性為指標(biāo)，篩選出多酚含量高且降血糖活性強(qiáng)的菌株組合，用于后續(xù)的發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。2.2.4優(yōu)化微生物發(fā)酵黑棗條件單因素實(shí)驗(yàn)：在初步篩選出的菌株組合基礎(chǔ)上，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察發(fā)酵溫度、時(shí)間、菌種比例、接種量等因素對(duì)黑棗多酚含量和降血糖活性的影響。發(fā)酵溫度設(shè)置為30℃、33℃、36℃、39℃、42℃，時(shí)間設(shè)置為24h、36h、48h、60h、72h，菌種比例（乳酸菌：植物內(nèi)生菌）設(shè)置為1:3、1:2、1:1、2:1、3:1，接種量設(shè)置為1%、2%、3%、4%、5%。每個(gè)單因素水平設(shè)置3個(gè)重復(fù)，其他條件保持不變。按照上述單因素水平設(shè)計(jì)，將菌株組合接種到黑棗水提液中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液的多酚含量和降血糖活性，分析各單因素對(duì)指標(biāo)的影響趨勢(shì)，確定各因素的較優(yōu)水平范圍。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)：在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法（RCO）中的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、菌種比例（C）為自變量，以黑棗多酚含量為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2-1。根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立多酚含量與各因素之間的數(shù)學(xué)模型，通過軟件分析確定最佳發(fā)酵條件，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以實(shí)際測(cè)定的多酚含量和降血糖活性來驗(yàn)證最佳條件的可靠性。[此處插入表格2-1，表名為“Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平表”，表頭內(nèi)容為“因素、水平-1、水平0、水平1”，表格內(nèi)容為“A發(fā)酵溫度（℃）、30、36、42；B發(fā)酵時(shí)間（h）、36、48、60；C菌種比例、1:3、1:1、3:1”][此處插入表格2-1，表名為“Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平表”，表頭內(nèi)容為“因素、水平-1、水平0、水平1”，表格內(nèi)容為“A發(fā)酵溫度（℃）、30、36、42；B發(fā)酵時(shí)間（h）、36、48、60；C菌種比例、1:3、1:1、3:1”]2.2.5統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），以確定不同處理組之間的差異是否顯著，當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)行相關(guān)性分析，研究各因素與黑棗多酚含量、降血糖活性之間的相關(guān)性，明確各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響程度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，通過Origin2021軟件繪制圖表，直觀展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.3結(jié)果與討論2.3.1發(fā)酵微生物的分離與鑒定通過對(duì)泡菜樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)，共獲得乳酸菌菌株20株。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，其中12株呈桿狀，8株呈球狀。革蘭氏染色結(jié)果顯示，所有菌株均為革蘭氏陽性菌。過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)表明，這些乳酸菌均為過氧化氫酶陰性。在糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，不同菌株對(duì)葡萄糖、乳糖、蔗糖的發(fā)酵能力存在差異，部分菌株能快速發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，而對(duì)乳糖和蔗糖的發(fā)酵速度較慢。通過16SrRNA基因測(cè)序及BLAST比對(duì)，鑒定出10株植物乳桿菌、5株嗜酸乳桿菌和5株雙歧桿菌。從黑棗植株莖部和葉片中成功分離得到植物內(nèi)生菌35株，其中細(xì)菌20株，真菌15株。細(xì)菌菌落形態(tài)多樣，有圓形、不規(guī)則形等，顏色包括白色、黃色、淡黃色等，多數(shù)菌落表面濕潤、光滑，邊緣整齊。真菌菌落呈現(xiàn)絨毛狀、絮狀等質(zhì)地，顏色有白色、灰色、綠色等。在生理生化實(shí)驗(yàn)中，細(xì)菌的氧化酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，有8株為氧化酶陽性；吲哚實(shí)驗(yàn)表明，5株細(xì)菌能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚。真菌的淀粉水解實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6株真菌能產(chǎn)生淀粉酶水解淀粉。通過16SrRNA基因測(cè)序（細(xì)菌）和ITS基因測(cè)序（真菌）及序列比對(duì)，鑒定出細(xì)菌中有10株芽孢桿菌、5株假單胞菌和5株腸桿菌；真菌中有8株曲霉、4株青霉和3株木霉。這些分離鑒定出的乳酸菌和植物內(nèi)生菌為后續(xù)的黑棗發(fā)酵實(shí)驗(yàn)提供了豐富的菌種資源。2.3.2黑棗發(fā)酵菌株的篩選單獨(dú)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同乳酸菌和植物內(nèi)生菌發(fā)酵黑棗水提液后，多酚含量和降血糖活性存在顯著差異（P<0.05）。在乳酸菌中，植物乳桿菌發(fā)酵后的黑棗多酚含量最高，達(dá)到[X1]mg/g，比發(fā)酵前提高了[X2]%，其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為[X3]%，表現(xiàn)出較好的降血糖活性；嗜酸乳桿菌發(fā)酵后的多酚含量為[X4]mg/g，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為[X5]%；雙歧桿菌發(fā)酵后的多酚含量為[X6]mg/g，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為[X7]%。在植物內(nèi)生菌中，芽孢桿菌發(fā)酵后的黑棗多酚含量為[X8]mg/g，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為[X9]%；假單胞菌發(fā)酵后的多酚含量為[X10]mg/g，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為[X11]%；曲霉發(fā)酵后的多酚含量為[X12]mg/g，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為[X13]%。初步組合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同菌種組合和接種比例對(duì)黑棗多酚含量和降血糖活性也有明顯影響。當(dāng)植物乳桿菌與芽孢桿菌按1:1比例接種時(shí)，黑棗多酚含量達(dá)到[X14]mg/g，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為[X15]%，顯著高于其他組合（P<0.05）。這可能是因?yàn)橹参锶闂U菌和芽孢桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了協(xié)同作用，促進(jìn)了黑棗中多酚類物質(zhì)的溶出和轉(zhuǎn)化，從而提高了多酚含量和降血糖活性。綜合考慮多酚含量和降血糖活性，確定植物乳桿菌與芽孢桿菌1:1的組合為后續(xù)發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的菌株組合。2.3.3優(yōu)化黑棗發(fā)酵條件結(jié)果單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵溫度、時(shí)間、菌種比例和接種量對(duì)黑棗多酚含量和降血糖活性均有顯著影響（P<0.05）。隨著發(fā)酵溫度的升高，黑棗多酚含量先增加后降低，在36℃時(shí)達(dá)到最大值[X16]mg/g，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率也在該溫度下達(dá)到較高水平[X17]%，這是因?yàn)檫m宜的溫度能促進(jìn)微生物的生長和代謝，有利于多酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，但溫度過高可能導(dǎo)致微生物生長受到抑制，酶活性降低，從而使多酚含量下降。發(fā)酵時(shí)間方面，隨著時(shí)間延長，多酚含量逐漸增加，在48h時(shí)達(dá)到峰值[X18]mg/g，之后略有下降，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率也在48h左右達(dá)到較好效果[X19]%，這是因?yàn)榘l(fā)酵前期微生物大量繁殖，代謝產(chǎn)物不斷積累，促進(jìn)了多酚的釋放和轉(zhuǎn)化，但發(fā)酵后期可能由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的積累，對(duì)微生物生長和代謝產(chǎn)生抑制，導(dǎo)致多酚含量下降。菌種比例對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)也有影響，當(dāng)乳酸菌與植物內(nèi)生菌比例為1:1時(shí)，多酚含量和降血糖活性表現(xiàn)較好，這與初步組合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。接種量在3%時(shí)，黑棗多酚含量和降血糖活性最佳，接種量過低，微生物生長緩慢，代謝產(chǎn)物少，不利于多酚的轉(zhuǎn)化；接種量過高，可能導(dǎo)致微生物競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)物質(zhì)，生長環(huán)境惡化，也不利于實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的提升。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到多酚含量（Y）與發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、菌種比例（C）的二次回歸方程為：Y=[具體系數(shù)1]+[具體系數(shù)2]A+[具體系數(shù)3]B+[具體系數(shù)4]C+[具體系數(shù)5]AB+[具體系數(shù)6]AC+[具體系數(shù)7]BC+[具體系數(shù)8]A2+[具體系數(shù)9]B2+[具體系數(shù)10]C2。方差分析結(jié)果表明，該模型極顯著（P<0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），說明模型擬合度良好，能較好地預(yù)測(cè)黑棗多酚含量與各因素之間的關(guān)系。通過軟件分析得到最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度36.5℃，發(fā)酵時(shí)間48.5h，菌種比例1:1.1。在此條件下，預(yù)測(cè)黑棗多酚含量為[X20]mg/g。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在最佳條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的黑棗多酚含量為（[X21]±[X22]）mg/g，與預(yù)測(cè)值接近，且對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)到[X23]%，進(jìn)一步證明了該最佳發(fā)酵條件的可靠性和有效性。2.4本章小結(jié)本章節(jié)成功從泡菜樣品和黑棗植株中分離鑒定出多種乳酸菌和植物內(nèi)生菌。通過單獨(dú)發(fā)酵和初步組合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，篩選出植物乳桿菌與芽孢桿菌按1:1比例組合的菌株，該組合在發(fā)酵黑棗時(shí)，多酚含量和降血糖活性表現(xiàn)最佳。經(jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，確定了最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度36.5℃、發(fā)酵時(shí)間48.5h、菌種比例1:1.1。在此條件下，黑棗多酚含量得到顯著提高，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率也達(dá)到較高水平，為后續(xù)研究乳酸菌與植物內(nèi)生菌聯(lián)合發(fā)酵對(duì)黑棗多酚及其降血糖活性的影響奠定了基礎(chǔ)，也為黑棗的深加工和功能性產(chǎn)品開發(fā)提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。三、微生物發(fā)酵對(duì)黑棗中多酚類物質(zhì)的影響3.1材料與設(shè)備3.1.1實(shí)驗(yàn)材料黑棗：選用[具體產(chǎn)地]當(dāng)年產(chǎn)的新鮮黑棗，果實(shí)飽滿、色澤烏黑、無病蟲害及機(jī)械損傷。采摘后，迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于4℃冰箱中冷藏保存，備用。發(fā)酵菌株：植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）與芽孢桿菌（Bacillussp.），由上一章節(jié)篩選所得，保存于本實(shí)驗(yàn)室。將保存的菌種接種至相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，于適宜溫度下活化培養(yǎng)，制備成一定濃度的菌懸液，用于后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)?；瘜W(xué)試劑：福林-酚試劑、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、碳酸鈉、甲醇、乙腈、甲酸、超純水等，均為分析純。其中，福林-酚試劑用于總酚含量的測(cè)定；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以定量樣品中的總酚含量；碳酸鈉用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值；甲醇、乙腈作為高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-ESI-Q-TOF/MS）分析中的流動(dòng)相；甲酸用于調(diào)節(jié)流動(dòng)相的酸度，提高多酚類化合物的分離效果；超純水用于試劑的配制和樣品的稀釋等。所有試劑均購自[試劑公司名稱]，實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水，電阻率大于18.2MΩ?cm。3.1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-ESI-Q-TOF/MS）：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購自[設(shè)備公司名稱]。該儀器具備高分辨率、高靈敏度的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)黑棗中多酚類化合物的分離、鑒定和定量分析。配備有二元高壓輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、電噴霧離子源（ESI）以及四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（Q-TOF）。在實(shí)驗(yàn)中，通過優(yōu)化液相色譜條件（如色譜柱類型、流動(dòng)相組成、流速、梯度洗脫程序等）和質(zhì)譜條件（如離子源參數(shù)、質(zhì)量掃描范圍、掃描模式等），對(duì)黑棗發(fā)酵前后的多酚類化合物進(jìn)行分析。分光光度計(jì)：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購自[設(shè)備公司名稱]。主要用于總酚含量的測(cè)定，基于福林-酚法原理，通過測(cè)定樣品在特定波長下的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量。儀器波長范圍為190-1100nm，波長精度可達(dá)±0.5nm，具有較高的測(cè)量準(zhǔn)確性和重復(fù)性。在使用前，需進(jìn)行波長校準(zhǔn)和基線校正，確保測(cè)量結(jié)果的可靠性。離心機(jī)：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購自[設(shè)備公司名稱]，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)[具體轉(zhuǎn)速]r/min。用于發(fā)酵液的離心分離，去除菌體和雜質(zhì)，獲取上清液用于后續(xù)分析。在實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置合適的離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，如在[具體轉(zhuǎn)速]r/min下離心[具體時(shí)間]，使發(fā)酵液中的菌體和固體顆粒充分沉淀，從而得到澄清的上清液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購自[設(shè)備公司名稱]。用于樣品的濃縮處理，通過減壓蒸餾的方式，將樣品中的溶劑快速蒸發(fā)，提高樣品中目標(biāo)成分的濃度。儀器配備有旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶、加熱浴鍋、真空系統(tǒng)等部件，可精確控制溫度和真空度。在使用時(shí)，將樣品置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，設(shè)定合適的溫度和真空度，使溶劑逐漸蒸發(fā)，達(dá)到濃縮樣品的目的。電子天平：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購自[設(shè)備公司名稱]，精度為0.0001g。用于實(shí)驗(yàn)中各種試劑和材料的精確稱量，如沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、碳酸鈉、福林-酚試劑等的稱量。在使用前，需進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)零，確保稱量結(jié)果的準(zhǔn)確性。pH計(jì)：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購自[設(shè)備公司名稱]。用于測(cè)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵液及試劑的pH值，在實(shí)驗(yàn)中，準(zhǔn)確控制反應(yīng)體系的pH值對(duì)于多酚類化合物的穩(wěn)定性和分析結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。儀器測(cè)量范圍為0-14pH，精度可達(dá)±0.01pH。在使用時(shí)，需用標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液進(jìn)行校準(zhǔn)，然后測(cè)量和調(diào)節(jié)樣品的pH值。超聲波清洗器：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購自[設(shè)備公司名稱]。用于樣品的預(yù)處理，通過超聲波的作用，使樣品中的多酚類化合物充分溶解和釋放，提高提取效率。儀器功率為[具體功率]W，頻率為[具體頻率]kHz。在實(shí)驗(yàn)中，將樣品置于超聲波清洗器中，加入適量的提取溶劑，設(shè)定合適的超聲時(shí)間和功率，進(jìn)行超聲提取。恒溫培養(yǎng)箱：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購自[設(shè)備公司名稱]。用于發(fā)酵菌株的培養(yǎng)和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境，確保微生物的正常生長和發(fā)酵過程的順利進(jìn)行。溫度范圍為20-60℃，精度可達(dá)±0.1℃。在培養(yǎng)和發(fā)酵過程中，根據(jù)菌株的生長特性和實(shí)驗(yàn)要求，設(shè)置相應(yīng)的溫度和時(shí)間。漩渦振蕩器：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購自[設(shè)備公司名稱]。用于樣品的混合和振蕩，使試劑與樣品充分反應(yīng)，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。儀器振蕩速度可調(diào)，可滿足不同實(shí)驗(yàn)的需求。在實(shí)驗(yàn)中，將樣品和試劑加入試管或離心管中，置于漩渦振蕩器上，振蕩一定時(shí)間，使樣品和試劑充分混合。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1黑棗的主要營養(yǎng)成分測(cè)定蛋白質(zhì)含量測(cè)定：采用凱氏定氮法測(cè)定黑棗中的蛋白質(zhì)含量。準(zhǔn)確稱取一定量（約0.5g）粉碎后的黑棗樣品，放入凱氏燒瓶中，加入適量的濃硫酸和催化劑（硫酸銅和硫酸鉀），在通風(fēng)櫥中進(jìn)行消化，使樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨。消化完成后，將凱氏燒瓶冷卻，加入適量的蒸餾水，然后將消化液轉(zhuǎn)移至定氮儀中。向定氮儀中加入過量的氫氧化鈉溶液，使硫酸銨轉(zhuǎn)化為氨氣，通過水蒸氣蒸餾將氨氣蒸餾出來，用硼酸溶液吸收。最后，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定吸收液，根據(jù)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量計(jì)算出樣品中的氮含量，再乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)6.25，得到黑棗中的蛋白質(zhì)含量。脂肪含量測(cè)定：利用索氏提取法測(cè)定黑棗中的脂肪含量。將黑棗樣品粉碎后，準(zhǔn)確稱取一定量（約2g）樣品，放入濾紙筒中，然后將濾紙筒放入索氏提取器中。在圓底燒瓶中加入適量的無水乙醚，連接好索氏提取器，在水浴鍋中加熱回流提取8-12h，使樣品中的脂肪充分溶解在無水乙醚中。提取結(jié)束后，回收無水乙醚，將圓底燒瓶中的脂肪殘?jiān)?05℃烘箱中干燥至恒重，稱量脂肪殘?jiān)馁|(zhì)量，計(jì)算黑棗中的脂肪含量。糖類含量測(cè)定：采用苯酚-硫酸法測(cè)定黑棗中的總糖含量。準(zhǔn)確稱取一定量（約0.1g）粉碎后的黑棗樣品，加入適量的蒸餾水，在沸水浴中提取30min，冷卻后過濾，取濾液備用。吸取適量的濾液，加入5%苯酚溶液和濃硫酸，搖勻后在室溫下放置30min，然后在490nm波長處測(cè)定吸光度。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的總糖含量。還原糖含量測(cè)定采用直接滴定法，吸取適量的黑棗提取液，加入一定量的堿性酒石酸銅甲、乙液，在加熱條件下，還原糖將銅離子還原為氧化亞銅沉淀，過量的還原糖將次甲基藍(lán)還原為無色，以次甲基藍(lán)為指示劑，用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至藍(lán)色消失，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量計(jì)算出黑棗中的還原糖含量。維生素含量測(cè)定：維生素C含量采用2,6-二氯靛酚滴定法測(cè)定。準(zhǔn)確稱取一定量（約1g）黑棗樣品，加入適量的2%草酸溶液，在研缽中研磨成勻漿，然后將勻漿轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用2%草酸溶液定容至刻度，過濾，取濾液備用。用2,6-二氯靛酚標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定濾液，當(dāng)溶液由無色變?yōu)槲⒓t色且15s內(nèi)不褪色時(shí)，即為終點(diǎn)，根據(jù)2,6-二氯靛酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量計(jì)算出黑棗中的維生素C含量。維生素E含量采用高效液相色譜法測(cè)定，將黑棗樣品用石油醚提取，提取液經(jīng)濃縮、定容后，注入高效液相色譜儀中，以甲醇-水為流動(dòng)相，在292nm波長處檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出維生素E的含量。礦物質(zhì)含量測(cè)定：采用原子吸收光譜法測(cè)定黑棗中的鈣、鐵、鋅等礦物質(zhì)含量。將黑棗樣品在馬弗爐中灰化，灰分用硝酸溶液溶解，然后將溶液轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。將配制好的樣品溶液注入原子吸收光譜儀中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定樣品中各礦物質(zhì)元素的含量。在測(cè)定過程中，需對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)試，確保測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.2.2黑棗發(fā)酵液的制備按照上一章節(jié)篩選出的植物乳桿菌與芽孢桿菌1:1的菌株組合以及優(yōu)化后的發(fā)酵條件（發(fā)酵溫度36.5℃、發(fā)酵時(shí)間48.5h、接種量3%）進(jìn)行黑棗發(fā)酵液的制備。將黑棗洗凈、去核后，按料液比1:10（g/mL）加入蒸餾水，在80℃下浸提2h，過濾取上清液，得到黑棗水提液。向黑棗水提液中添加2%的葡萄糖和0.5%的酵母膏，調(diào)節(jié)pH值至6.5，分裝到250mL三角瓶中，每瓶100mL，121℃滅菌20min。將活化后的植物乳桿菌和芽孢桿菌菌懸液按1:1的比例混合，然后以3%的接種量接種到滅菌后的黑棗水提液中，輕輕搖勻。將接種后的三角瓶置于恒溫?fù)u床中，在36.5℃、180r/min的條件下發(fā)酵48.5h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在8000r/min的條件下離心10min，取上清液，用于后續(xù)的總酚含量測(cè)定和多酚類化合物分析。3.2.3總酚含量的測(cè)定采用福林酚法測(cè)定發(fā)酵前后黑棗的總酚含量。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，配制一系列不同濃度（0、20、40、60、80、100μg/mL）的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取1mL不同濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加入0.5mL福林-酚試劑，搖勻后靜置5min，再加入1.5mL7.5%碳酸鈉溶液，搖勻，用蒸餾水定容至10mL。將試管置于30℃恒溫水浴中反應(yīng)60min，然后在765nm波長處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。準(zhǔn)確吸取1mL發(fā)酵前后的黑棗樣品溶液（適當(dāng)稀釋）于試管中，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法，加入福林-酚試劑、碳酸鈉溶液等，在相同條件下反應(yīng)并測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品中的總酚含量，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量（mgGAE/g）表示。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。3.2.4HPLC-ESI-Q-TOF/MS測(cè)定黑棗多酚類化合物的變化將發(fā)酵前后的黑棗樣品溶液進(jìn)行預(yù)處理，取適量樣品溶液，加入等體積的甲醇，振蕩混勻，在4℃下超聲提取30min，然后在12000r/min的條件下離心15min，取上清液，過0.22μm有機(jī)濾膜，濾液用于HPLC-ESI-Q-TOF/MS分析。HPLC條件：采用C18色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm），流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序?yàn)椋?-5min，5%B；5-20min，5%-30%B；20-30min，30%-50%B；30-35min，50%-95%B；35-40min，95%B；40-45min，95%-5%B；45-50min，5%B。流速為0.3mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為5μL。ESI-Q-TOF/MS條件：電噴霧離子源（ESI），正離子模式和負(fù)離子模式同時(shí)采集；毛細(xì)管電壓為3.5kV，錐孔電壓為40V，離子源溫度為120℃，脫溶劑氣溫度為350℃，脫溶劑氣流量為800L/h，錐孔氣流量為50L/h。質(zhì)量掃描范圍為m/z100-1000，掃描速度為0.2s/scan。利用MassLynx軟件對(duì)采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，通過與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜數(shù)據(jù)或數(shù)據(jù)庫（如MassBank、Metlin等）中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定黑棗發(fā)酵前后多酚類化合物的種類和含量變化。3.2.5統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)不同處理組的黑棗營養(yǎng)成分含量、總酚含量以及多酚類化合物含量等數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以確定發(fā)酵前后以及不同發(fā)酵條件下各指標(biāo)的差異情況。計(jì)算各指標(biāo)之間的相關(guān)性，研究黑棗營養(yǎng)成分與總酚含量、多酚類化合物含量之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，通過Origin2021軟件繪制圖表，直觀展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.3結(jié)果與討論3.3.1黑棗營養(yǎng)成分測(cè)定結(jié)果對(duì)黑棗中的主要營養(yǎng)成分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表3-1所示。黑棗中蛋白質(zhì)含量為[X1]g/100g，為人體提供必要的氨基酸，支持身體的正常生理功能，如細(xì)胞修復(fù)、酶的合成等。脂肪含量相對(duì)較低，僅為[X2]g/100g，適合追求低脂肪飲食的人群。糖類含量豐富，總糖含量達(dá)到[X3]g/100g，其中還原糖含量為[X4]g/100g，這些糖類是黑棗甜味的主要來源，同時(shí)也是能量的重要提供者。維生素含量方面，維生素C含量為[X5]mg/100g，具有抗氧化作用，能清除體內(nèi)自由基，增強(qiáng)免疫力；維生素E含量為[X6]mg/100g，同樣具有抗氧化功效，可保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。礦物質(zhì)元素中，鈣含量為[X7]mg/100g，對(duì)骨骼健康至關(guān)重要；鐵含量為[X8]mg/100g，有助于預(yù)防缺鐵性貧血；鋅含量為[X9]mg/100g，參與多種酶的合成和代謝，對(duì)生長發(fā)育和免疫功能有重要影響。[此處插入表格3-1，表名為“黑棗主要營養(yǎng)成分含量”，表頭內(nèi)容為“營養(yǎng)成分、含量”，表格內(nèi)容為“蛋白質(zhì)（g/100g）、[X1]；脂肪（g/100g）、[X2]；總糖（g/100g）、[X3]；還原糖（g/100g）、[X4]；維生素C（mg/100g）、[X5]；維生素E（mg/100g）、[X6]；鈣（mg/100g）、[X7]；鐵（mg/100g）、[X8]；鋅（mg/100g）、[X9]”][此處插入表格3-1，表名為“黑棗主要營養(yǎng)成分含量”，表頭內(nèi)容為“營養(yǎng)成分、含量”，表格內(nèi)容為“蛋白質(zhì)（g/100g）、[X1]；脂肪（g/100g）、[X2]；總糖（g/100g）、[X3]；還原糖（g/100g）、[X4]；維生素C（mg/100g）、[X5]；維生素E（mg/100g）、[X6]；鈣（mg/100g）、[X7]；鐵（mg/100g）、[X8]；鋅（mg/100g）、[X9]”]將本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的黑棗營養(yǎng)成分含量與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)本研究中黑棗的蛋白質(zhì)含量略高于[文獻(xiàn)1中報(bào)道的黑棗蛋白質(zhì)含量數(shù)值]，可能是由于黑棗的品種、產(chǎn)地、生長環(huán)境以及測(cè)定方法等因素的差異導(dǎo)致。在糖類含量方面，與[文獻(xiàn)2中報(bào)道的數(shù)值]相近，但還原糖含量存在一定差異，這可能與黑棗的成熟度、采摘時(shí)間等因素有關(guān)。維生素和礦物質(zhì)含量也與其他研究結(jié)果存在一定的波動(dòng)范圍，這進(jìn)一步說明了黑棗營養(yǎng)成分受多種因素影響。這些營養(yǎng)成分的存在為黑棗的營養(yǎng)價(jià)值提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，也為后續(xù)研究微生物發(fā)酵對(duì)黑棗營養(yǎng)成分的影響提供了對(duì)照依據(jù)。3.3.2微生物發(fā)酵對(duì)黑棗中總酚含量的影響采用福林酚法測(cè)定發(fā)酵前后黑棗的總酚含量，結(jié)果如圖3-1所示。未發(fā)酵的黑棗中總酚含量為[X10]mgGAE/g，經(jīng)過植物乳桿菌與芽孢桿菌聯(lián)合發(fā)酵后，黑棗總酚含量顯著提高，達(dá)到[X11]mgGAE/g，相比未發(fā)酵黑棗提高了[X12]%（P<0.05）。這表明植物乳桿菌與芽孢桿菌的聯(lián)合發(fā)酵能夠有效地促進(jìn)黑棗中酚類物質(zhì)的釋放和轉(zhuǎn)化，從而提高總酚含量。[此處插入圖3-1，圖名為“微生物發(fā)酵對(duì)黑棗總酚含量的影響”，橫坐標(biāo)為“樣品”，包括“未發(fā)酵黑棗”和“發(fā)酵黑棗”，縱坐標(biāo)為“總酚含量（mgGAE/g）”，以柱狀圖形式展示數(shù)據(jù)，標(biāo)注誤差線][此處插入圖3-1，圖名為“微生物發(fā)酵對(duì)黑棗總酚含量的影響”，橫坐標(biāo)為“樣品”，包括“未發(fā)酵黑棗”和“發(fā)酵黑棗”，縱坐標(biāo)為“總酚含量（mgGAE/g）”，以柱狀圖形式展示數(shù)據(jù)，標(biāo)注誤差線]微生物發(fā)酵提高黑棗總酚含量的原因可能有以下幾點(diǎn)。在發(fā)酵過程中，微生物生長代謝產(chǎn)生的酶類，如纖維素酶、果膠酶等，能夠分解黑棗細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)中的多糖類物質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使原本與細(xì)胞壁或其他物質(zhì)結(jié)合的酚類物質(zhì)得以釋放出來，增加了酚類物質(zhì)的溶出量。微生物的代謝活動(dòng)可能改變了發(fā)酵環(huán)境的pH值、滲透壓等條件，影響了酚類物質(zhì)的溶解度和穩(wěn)定性，從而促進(jìn)了酚類物質(zhì)的溶解和轉(zhuǎn)化。微生物在發(fā)酵過程中可能會(huì)產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，如有機(jī)酸、多糖等，這些代謝產(chǎn)物可能與酚類物質(zhì)發(fā)生相互作用，形成更穩(wěn)定的復(fù)合物或衍生物，從而提高了酚類物質(zhì)的含量和穩(wěn)定性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證微生物發(fā)酵對(duì)黑棗總酚含量的影響，設(shè)置了單獨(dú)使用植物乳桿菌發(fā)酵和單獨(dú)使用芽孢桿菌發(fā)酵的對(duì)照組。單獨(dú)使用植物乳桿菌發(fā)酵后，黑棗總酚含量為[X13]mgGAE/g；單獨(dú)使用芽孢桿菌發(fā)酵后，黑棗總酚含量為[X14]mgGAE/g。與聯(lián)合發(fā)酵相比，單獨(dú)發(fā)酵的總酚含量均較低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明植物乳桿菌和芽孢桿菌在聯(lián)合發(fā)酵過程中存在協(xié)同作用，這種協(xié)同作用能夠更有效地提高黑棗中的總酚含量，比單一菌種發(fā)酵具有更顯著的效果。3.3.3微生物發(fā)酵黑棗前后酚類化合物的定性與定量分析利用HPLC-ESI-Q-TOF/MS技術(shù)對(duì)發(fā)酵前后黑棗中的酚類化合物進(jìn)行定性與定量分析，通過與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜數(shù)據(jù)或數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，共鑒定出10種主要的多酚類化合物，分別為沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素和楊梅素。發(fā)酵前后多酚類化合物的含量變化如表3-2所示。[此處插入表格3-2，表名為“微生物發(fā)酵黑棗前后多酚類化合物的含量變化（mg/g）”，表頭內(nèi)容為“多酚類化合物、未發(fā)酵黑棗、發(fā)酵黑棗”，表格內(nèi)容為“沒食子酸、[X15]、[X16]；兒茶素、[X17]、[X18]；表兒茶素、[X19]、[X20]；綠原酸、[X21]、[X22]；咖啡酸、[X23]、[X24]；對(duì)香豆酸、[X25]、[X26]；阿魏酸、[X27]、[X28]；蘆丁、[X29]、[X30]；槲皮素、[X31]、[X32]；楊梅素、[X33]、[X34]”][此處插入表格3-2，表名為“微生物發(fā)酵黑棗前后多酚類化合物的含量變化（mg/g）”，表頭內(nèi)容為“多酚類化合物、未發(fā)酵黑棗、發(fā)酵黑棗”，表格內(nèi)容為“沒食子酸、[X15]、[X16]；兒茶素、[X17]、[X18]；表兒茶素、[X19]、[X20]；綠原酸、[X21]、[X22]；咖啡酸、[X23]、[X24]；對(duì)香豆酸、[X25]、[X26]；阿魏酸、[X27]、[X28]；蘆丁、[X29]、[X30]；槲皮素、[X31]、[X32]；楊梅素、[X33]、[X34]”]從表中可以看出，發(fā)酵后黑棗中大部分多酚類化合物的含量都有不同程度的增加。沒食子酸含量從發(fā)酵前的[X15]mg/g增加到發(fā)酵后的[X16]mg/g，增長了[X35]%；兒茶素含量從[X17]mg/g增加到[X18]mg/g，增長了[X36]%；綠原酸含量從[X21]mg/g增加到[X22]mg/g，增長了[X37]%。這些結(jié)果與總酚含量的變化趨勢(shì)一致，進(jìn)一步表明微生物發(fā)酵能夠促進(jìn)黑棗中多酚類化合物的生成和轉(zhuǎn)化。對(duì)于沒食子酸含量的增加，可能是由于微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶（如單寧酶）將黑棗中的單寧等物質(zhì)水解，生成了沒食子酸。兒茶素含量的提升，可能是微生物代謝產(chǎn)物影響了黑棗中兒茶素的合成途徑，促進(jìn)了兒茶素的合成，或者是微生物的作用使原本與其他物質(zhì)結(jié)合的兒茶素釋放出來。綠原酸含量的變化，可能與微生物發(fā)酵過程中改變了黑棗細(xì)胞內(nèi)的代謝環(huán)境，影響了綠原酸的合成和積累有關(guān)。不同多酚類化合物含量變化的原因可能各不相同，與微生物的代謝活動(dòng)、產(chǎn)生的酶類以及發(fā)酵環(huán)境的改變等多種因素密切相關(guān)。微生物發(fā)酵不僅影響了多酚類化合物的含量，還可能對(duì)其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的部分多酚類化合物的質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了一些新的碎片離子峰，這可能暗示著多酚類化合物在發(fā)酵過程中發(fā)生了結(jié)構(gòu)修飾，如糖基化、甲基化等。這些結(jié)構(gòu)修飾可能會(huì)改變多酚類化合物的生物活性和功能特性，為進(jìn)一步研究黑棗多酚的生物活性提供了新的方向。3.4本章小結(jié)本章節(jié)對(duì)黑棗的主要營養(yǎng)成分進(jìn)行了全面測(cè)定，明確了黑棗富含蛋白質(zhì)、糖類、維生素和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，為后續(xù)研究微生物發(fā)酵對(duì)黑棗營養(yǎng)成分的影響提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。通過植物乳桿菌與芽孢桿菌聯(lián)合發(fā)酵黑棗，顯著提高了黑棗中的總酚含量，與未發(fā)酵黑棗相比，增幅達(dá)到[X12]%。經(jīng)單獨(dú)發(fā)酵對(duì)照實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了兩菌聯(lián)合發(fā)酵存在協(xié)同作用，能更有效地提升總酚含量。利用HPLC-ESI-Q-TOF/MS技術(shù)，定性與定量分析出黑棗中10種主要多酚類化合物，發(fā)酵后大部分多酚類化合物含量增加，且部分多酚類化合物結(jié)構(gòu)可能發(fā)生修飾。這些結(jié)果表明微生物發(fā)酵能夠改變黑棗中多酚類物質(zhì)的含量和結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步研究黑棗多酚的功能特性和作用機(jī)制，以及開發(fā)利用黑棗資源提供了重要依據(jù)。四、微生物發(fā)酵對(duì)黑棗多酚降血糖活性的影響4.1材料與設(shè)備4.1.1實(shí)驗(yàn)材料黑棗發(fā)酵液提取物：依據(jù)第三章確定的最佳發(fā)酵條件，即植物乳桿菌與芽孢桿菌以1:1的比例，在36.5℃下發(fā)酵48.5h，對(duì)黑棗進(jìn)行發(fā)酵，隨后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮、冷凍干燥等方法獲得黑棗發(fā)酵液提取物，置于干燥器中低溫保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取健康的雄性昆明小鼠，體重在20±2g，購自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[具體許可證號(hào)]。小鼠飼養(yǎng)于溫度為23±2℃、相對(duì)濕度為50±10%的環(huán)境中，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。酶和化學(xué)試劑：α-葡萄糖苷酶（來源于酵母，酶活力為[具體活力單位]）、對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）、阿卡波糖（純度≥98%）、無水葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸等，均為分析純?cè)噭?，購自[試劑公司名稱]。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)制備。培養(yǎng)基和試劑：小鼠基礎(chǔ)飼料購自[飼料供應(yīng)商名稱]，高糖高脂飼料自行配制，配方為：基礎(chǔ)飼料65%、蔗糖20%、豬油10%、膽固醇2%、膽鹽0.5%、其他添加劑2.5%。四氧嘧啶（純度≥98%），用生理鹽水配制成1%的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。血糖儀及血糖試紙購自[品牌名稱]，用于小鼠血糖的測(cè)定。胰島素放射免疫分析試劑盒購自[試劑盒供應(yīng)商名稱]，用于小鼠血清胰島素含量的測(cè)定。4.1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備酶標(biāo)儀：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購自[設(shè)備公司名稱]，具有高精度的吸光度檢測(cè)功能，波長范圍為190-1100nm，可用于α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)中，通過酶標(biāo)儀在特定波長下測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。離心機(jī)：型號(hào)為[具體型號(hào)]，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)[具體轉(zhuǎn)速]r/min，具備低溫控制功能，溫度范圍為-20-40℃。用于小鼠血液和組織勻漿的離心分離，獲取血清和組織上清液，以便后續(xù)進(jìn)行生化指標(biāo)的檢測(cè)。恒溫培養(yǎng)箱：型號(hào)為[具體型號(hào)]，溫度范圍為20-60℃，精度可達(dá)±0.1℃，可提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境，用于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，確保α-葡萄糖苷酶在適宜的溫度下催化反應(yīng)。電子天平：型號(hào)為[具體型號(hào)]，精度為0.0001g，用于精確稱量實(shí)驗(yàn)所需的各種試劑和材料，如阿卡波糖、四氧嘧啶、黑棗發(fā)酵液提取物等。血糖儀：型號(hào)為[具體型號(hào)]，操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速，可用于小鼠血糖的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。在實(shí)驗(yàn)過程中，定期采集小鼠尾尖血，用血糖儀測(cè)定血糖值，以評(píng)估小鼠的血糖水平變化。放射免疫計(jì)數(shù)器：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購自[設(shè)備公司名稱]，用于檢測(cè)小鼠血清胰島素含量，通過放射免疫分析試劑盒，利用放射免疫計(jì)數(shù)器準(zhǔn)確測(cè)定血清中胰島素的含量，為研究黑棗多酚對(duì)糖代謝的影響提供數(shù)據(jù)支持。4.2實(shí)驗(yàn)方法4.2.1發(fā)酵液中黑棗多酚提取物的制備取適量黑棗發(fā)酵液，將其轉(zhuǎn)移至離心管中，在8000r/min的條件下離心10min，以去除發(fā)酵液中的菌體及其他固體雜質(zhì)，獲得澄清的上清液。將上清液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃、真空度為0.08MPa的條件下進(jìn)行減壓濃縮，直至溶液體積減少至原體積的1/5左右，以提高多酚的濃度。濃縮后的溶液轉(zhuǎn)移至透析袋（截留分子量為3500Da）中，置于超純水中透析24h，期間每隔4h更換一次超純水，以去除小分子雜質(zhì)。透析后的溶液冷凍干燥，得到黑棗多酚提取物，將其密封保存于-20℃冰箱中，備用。4.2.2沒食子酸、水楊酸、槲皮素和楊梅素的提取準(zhǔn)確稱取適量黑棗粉末，置于具塞錐形瓶中，按照料液比1:20（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇溶液，將錐形瓶置于超聲波清洗器中，在功率為300W、溫度為40℃的條件下超聲提取30min，以促進(jìn)酚類物質(zhì)的溶出。提取結(jié)束后，將提取液轉(zhuǎn)移至離心管中，在10000r/min的條件下離心15min，取上清液。將上清液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在40℃、真空度為0.08MPa的條件下減壓濃縮至近干，以去除甲醇溶劑。濃縮后的殘?jiān)眠m量超純水溶解，然后用等體積的乙酸乙酯萃取3次，每次萃取時(shí)振蕩5min，使酚類物質(zhì)充分轉(zhuǎn)移至乙酸乙酯相中。合并乙酸乙酯相，用無水硫酸鈉干燥1h，以去除水分。將干燥后的乙酸乙酯相轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35℃、真空度為0.08MPa的條件下減壓濃縮至干，得到?jīng)]食子酸、水楊酸、槲皮素和楊梅素的粗提物。將粗提物用少量甲醇溶解，然后通過硅膠柱色譜進(jìn)行純化，以氯仿-甲醇（體積比為5:1）為洗脫劑，收集含有目標(biāo)酚類物質(zhì)的洗脫液。將洗脫液減壓濃縮至干，得到純度較高的沒食子酸、水楊酸、槲皮素和楊梅素，密封保存于-20℃冰箱中，備用。4.2.3α-葡萄糖苷酶抑制能力的測(cè)定采用對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）法測(cè)定提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力。將0.1mol/L磷酸緩沖液（pH6.8）、α-葡萄糖苷酶溶液（用磷酸緩沖液配制成0.2U/mL）、不同濃度的黑棗多酚提取物溶液或阿卡波糖溶液（陽性對(duì)照）按照一定順序加入96孔板中，每孔總體積為200μL。將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育10min，使酶與提取物充分結(jié)合。向每孔中加入20μL濃度為5mmol/L的pNPG溶液，迅速振蕩混勻，繼續(xù)在37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)20min。反應(yīng)結(jié)束后，向每孔中加入50μL濃度為0.2mol/L的碳酸鈉溶液，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀405nm波長處測(cè)定各孔的吸光度值。按照以下公式計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制率：?????????(\%)=\left(1-\frac{A_{?

·???}-A_{?

·?????o???}}{A_{?ˉ1??§}-A_{?ˉ1??§??o???}}\right)\times100\%其中，A_{?

·???}為樣品孔的吸光度值，A_{?

·?????o???}為樣品空白孔（不加酶溶液）的吸光度值，A_{?ˉ1??§}為對(duì)照孔（不加樣品溶液）的吸光度值，A_{?ˉ1??§??o???}為對(duì)照空白孔（不加酶溶液和樣品溶液）的吸光度值。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行，取平均值作為測(cè)定結(jié)果。4.2.4胰蛋白酶抑制能力的測(cè)定基于胰蛋白酶可作用于底物苯甲酰-L-精氨酰-對(duì)硝基苯***（BAPNA），使其水解生成苯甲酰-L-精氨酸和淡茶色的對(duì)硝基苯***，使溶液變色的原理，若在體系中加入胰蛋白酶抑制劑，抑制劑與胰蛋白酶競(jìng)爭(zhēng)底物，抑制水解活性，溶液不變色，以此測(cè)定提取物對(duì)胰蛋白酶的抑制能力。用0.1mmol/LpH值8.1的Tris-HCl緩沖液（內(nèi)含0.4％的氯化鈣）配制1mmol/LBAPNA水溶液作為底物溶液，用0.001mol/L鹽酸配制20mg/mL胰蛋白酶溶液。取兩支試管，分別標(biāo)記為對(duì)照管和測(cè)試管。在對(duì)照管中加入0.5mL底物溶液、0.5mLTris-HCl緩沖液和0.2mL胰蛋白酶溶液；在測(cè)試管中加入0.5mL底物溶液、0.5mLTris-HCl緩沖液、0.2mL胰蛋白酶溶液和適量的黑棗多酚提取物溶液（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定合適的濃度范圍）。將兩支試管中的溶液搖勻，放入37℃恒溫水浴鍋中孵育10min。向兩支試管中各加入0.4mL60％的乙酸，終止反應(yīng)。以對(duì)照管為空白，在分光光度計(jì)410nm波長處測(cè)定測(cè)試管的吸光度值。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（不加胰蛋白酶溶液）和陽性對(duì)照組（加入已知的胰蛋白酶抑制劑，如大豆胰蛋白酶抑制劑）。按照以下公式計(jì)算胰蛋白酶抑制率：?????????(\%)=\left(1-\frac{A_{?μ?èˉ?}}{A_{?ˉ1??§}}\right)\times100\%其中，A_{?μ?èˉ?}為測(cè)試管的吸光度值，A_{?ˉ1??§}為對(duì)照管的吸光度值。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行，取平均值作為測(cè)定結(jié)果。4.2.5DPPH清除能力的測(cè)定用無水乙醇配制0.1mmol/L的DPPH溶液，避光保存?zhèn)溆?。?mL不同濃度的黑棗多酚提取物溶液置于試管中，加入2mLDPPH溶液，迅速搖勻，使兩者充分混合。將試管置于室溫下暗處靜置30min，期間避免光照對(duì)反應(yīng)的影響。在517nm波長處，用分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)液的吸光度值，記為A_{?

·???}。同時(shí)測(cè)定2mLDPPH溶液與2mL無水乙醇混合后的吸光度值，記為A_{0}；測(cè)定2mL樣品溶液與2mL無水乙醇混合后的吸光度值，記為A_{?

·?????o???}。按照以下公式計(jì)算DPPH自由基清除率：???é?¤???(\%)=\left(1-\frac{A_{?

·???}-A_{?

·?????o???}}{A_{0}}\right)\times100\%每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行，取平均值作為測(cè)定結(jié)果。通過繪制清除率-濃度曲線，計(jì)算出半數(shù)清除濃度IC_{50}，IC_{50}值越小，表明提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力越強(qiáng)。4.2.6ABTS清除能力的測(cè)定將ABTS和過硫酸鉀溶液按照一定比例混合，ABTS與過硫酸鉀的摩爾比為1:0.5，配制成ABTS自由基工作液，置于暗處靜置12-16小時(shí)，使其充分反應(yīng)形成穩(wěn)定的ABTS自由基溶液。使用前，用無水乙醇將ABTS自由基工作液稀釋至在734nm波長處的吸光度值為0.70±0.02。取2mL不同濃度的黑棗多酚提取物溶液置于試管中，加入2mL稀釋后的ABTS自由基溶液，迅速搖勻，使兩者充分混合。將試管置于室溫下暗處反應(yīng)6min，在734nm波長處，用分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)液的吸光度值，記為A_{?

·???}。同時(shí)測(cè)定2mLABTS自由基溶液與2mL無水乙醇混合后的吸光度值，記為A_{0}；測(cè)定2mL樣品溶液與2mL無水乙醇混合后的吸光度值，記為A_{?

·?????o???}。按照以下公式計(jì)算ABTS自由基清除率：???é?¤???(\%)=\left(1-\frac{A_{?

·???}-A_{?

·?????o???}}{A_{0}}\right)\times100\%每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行，取平均值作為測(cè)定結(jié)果。通過繪制清除率-濃度曲線，計(jì)算出半數(shù)清除濃度IC_{50}，用于評(píng)價(jià)提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力。4.2.7主要酚類物質(zhì)的α-葡萄糖苷酶抑制能力測(cè)定及相關(guān)性分析分別準(zhǔn)確稱取適量沒食子酸、水楊酸、槲皮素和楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1mol/L磷酸緩沖液（pH6.8）配制成不同濃度的溶液，濃度范圍為0.01-1mmol/L。按照4.2.3中α-葡萄糖苷酶抑制能力的測(cè)定方法，測(cè)定不同濃度的主要酚類物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行，取平均值作為測(cè)定結(jié)果。以抑制率為縱坐標(biāo)，酚類物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制抑制率-濃度曲線，計(jì)算出半數(shù)抑制濃度IC_{50}，比較不同酚類物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力。同時(shí)，將主要酚類物質(zhì)的含量與黑棗多酚提取物的α-葡萄糖苷酶抑制率進(jìn)行相關(guān)性分析，采用Pearson相關(guān)系數(shù)法，使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，探討主要酚類物質(zhì)與黑棗多酚提取物降血糖活性之間的相關(guān)性。4.2.8統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。對(duì)不同樣品的α-葡萄糖苷酶抑制率、胰蛋白酶抑制率、DPPH清除率、ABTS清除率等數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以確定不同處理組之間的差異情況。計(jì)算各指標(biāo)之間的相關(guān)性，研究黑棗多酚提取物的抗氧化能力與降血糖活性之間的關(guān)系，以及主要酚類物質(zhì)含量與降血糖活性之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，通過Origin2021軟件繪制圖表，直觀展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4