(19)國家知識產權局(10)申請公布號CN120154621A(71)申請人中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院地址510000廣東省廣州市沿江西路107號(72)發(fā)明人張梓宇周一鳴莊鴻鎧周睿商昌珍陳亞進(74)專利代理機構北京一枝筆知識產權代理事務所(普通合伙)11791專利代理師王絹(54)發(fā)明名稱JX06協(xié)同侖伐替尼在制備治療肝癌藥物中的應用本發(fā)明涉及腫瘤治療技術領域，特別是涉及JXO6協(xié)同侖伐替尼在制備治療肝癌藥物中的應用。JXO6作為一種新型丙酮酸脫氫酶激酶1特異性抑制劑，可以協(xié)同酪氨酸激酶抑制劑侖伐替尼體內外抑制肝細胞癌：在細胞實驗中聯(lián)合JX06可以降低侖伐替尼的半數(shù)抑制濃度(IC50)、在動物實驗中聯(lián)合用藥可以更好地抑制皮下移植瘤的21.JX06協(xié)同侖伐替尼在制備治療肝癌藥物中的應用。2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，當所述JXO6協(xié)同侖伐替尼用于體外實驗時，所述JX06與侖伐替尼的摩爾比為1:2;當所述JXO6協(xié)同侖伐替尼用于體內實驗時，所述JX06與侖伐替尼的摩爾比為2:1。式如式I所示：8,分子式如式II所示：◎5.一種治療肝癌的藥物，其特征在于，所述藥6.根據(jù)權利要求5所述的藥物，其特征在于，當所述JX06協(xié)同侖伐替尼用于體外實驗時，所述JX06與侖伐替尼的摩爾比為1:2;當所述JX06協(xié)同侖伐替尼用于體內實驗時，所述JX06與侖伐替尼的摩爾比為2:1。3JX06協(xié)同侖伐替尼在制備治療肝癌藥物中的應用技術領域[0001]本發(fā)明涉及腫瘤治療技術領域，特別是涉及JX06協(xié)同侖伐替尼在制備治療肝癌藥物中的應用。背景技術[0002]腫瘤天然耐藥或獲得性耐藥是臨床治療的難點與痛點之一，通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶家族逆轉腫瘤耐藥或者協(xié)同用藥增強療效的應用在部分癌種中已有報道：在非小細胞肺癌中，靶向丙酮酸脫氫酶激酶1(pyruvatedehydrogenasekinase1,PDK1)可以克服EGFRC797S突變驅動的奧希替尼耐藥；在多形性膠質母細胞瘤中，靶向PDK1可以通過抑制Warburg效應增強抗EGFR藥物的療效。與此同時，肝細胞癌(以下簡稱肝癌)治療的臨床實踐中也同樣面臨一線酪氨酸激酶抑制劑侖伐替尼耐藥的問題，此類藥物在抗血管生成的同時會誘導HIF1a上調，HIF1α介導上調OCT4和SOX2增強腫瘤干性進而促進侖伐替尼耐藥是部分患者出現(xiàn)耐藥的潛在分子機制之一。[0003]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了JXO6協(xié)同侖伐替尼在制備治療肝癌藥物中的應用，在肝癌中新型PDK1特異性抑制劑JXO6的有效性并不十分明確，因此本發(fā)明驗證了JX06聯(lián)合侖伐替尼在體內外協(xié)同抑制肝癌的有效性與安全性，尋找逆轉患者耐藥、改善療效的可能策略。[0004]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：[0005]本發(fā)明提供了JX06協(xié)同侖伐替尼在制備治療肝癌藥物中的應用。[0006]優(yōu)選的，當所述JXO6協(xié)同侖伐替尼用于體外實驗時，所述JX06與侖伐替尼的摩爾比為1:2;[0007]當所述JX06協(xié)同侖伐替尼用于體內實驗時，所述JX06與侖伐替尼的摩爾比為2:1。4[0012]本發(fā)明還提供了一種治療肝癌的藥物，所述藥物包括JX06和侖伐替尼。[0013]優(yōu)選的，當所述JX06協(xié)同侖伐替尼用于體外實驗時，所述JX06與侖伐替尼的摩爾比為1:2;[0014]當所述JX06協(xié)同侖伐替尼用于體內實驗時，所述JX06與侖伐替尼的摩爾比為2:1。[0016]JX06作為一種新型PDK1特異性抑制劑，可以協(xié)同一線酪氨酸激酶抑制劑侖伐替尼體內外抑制肝細胞癌，在細胞實驗中聯(lián)合JX06可以降低侖伐替尼的IC50,在動物實驗中聯(lián)合用藥可以更好地抑制皮下移植瘤的生長。附圖說明[0017]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹。[0018]圖1為JX06在人肝癌細胞系Huh7及SNU449細胞中的IC50;[0019]圖2為協(xié)同高低劑量JX06時，侖伐替尼在Huh7及SNU449細胞中的IC50(Ctrl:空白[0020]圖3為空白對照組、侖伐替尼組、JX06組及聯(lián)合用藥組Huh7與SNU449細胞的凋亡比例與定量分析；[0021]圖4為空白對照組、侖伐替尼組、JX06組及聯(lián)合用藥組3D腫瘤球的直徑變化(標尺[0022]圖5為空白對照組、侖伐替尼組、JX06組及聯(lián)合用藥組小鼠皮下瘤的大體照片(標尺=10mm)、皮下瘤重量與皮下瘤體積變化曲線；[0023]圖6為空白對照組、侖伐替尼組、JX06組及聯(lián)合用藥組小鼠皮下瘤Ki67免疫組化染色(低倍視野標尺=50μm,高倍視野標尺=25μm)。具體實施方式[0024]本發(fā)明提供了JX06協(xié)同侖伐替尼在制備治療肝癌藥物中的應用。在本發(fā)明中，當所述JX06協(xié)同侖伐替尼用于體外實驗時，所述JX06與侖伐替尼的摩爾比為1:2;當所述JX06協(xié)同侖伐替尼用于體內實驗時，所述JX06與侖伐替尼的摩爾比為2:1。本發(fā)明對所述JX06與侖伐替尼的來源沒有特殊限定，采用常規(guī)市售產品即可。在本發(fā)明中，所述JX06的CAS號為：CAS:729-46-4,分子式如式I所示：5o[0033]測量JX06IC50時JX06濃度梯度設置為0-0.312-0.625-1.25-2.5-[0035]測量SNU449的侖伐替尼IC50時濃度梯度設置為0-0.312-0.625-1.25-2.5-5-10-[0036]培養(yǎng)48h后將孔中的培養(yǎng)基更換為100μL含10%CCK-8的新鮮完全培養(yǎng)基，37℃避6用藥方案空白對照組(Ctrl)//[0043](3)藥物處理48h后將細胞消化至離心管中，于1000rpm條件下離心5min,PBS重懸后再次離心獲得細胞沉淀。[0044](4)使用配套的結合緩沖液400μL重懸對照組細胞，將其一分為二，一管作為空白管后續(xù)不加試劑，其余各組用200μL結合緩沖液重懸細胞沉淀。[0045](5)待測管中每管加入5μLAnnexinV-FITC試劑和5μL碘化丙啶(濃度為50μg/mL),輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育15～20min。[0046](6)孵育完畢后置于冰上后立即上機檢測，AnnexinV-FITC用FITC通道，PI優(yōu)先選擇PerCP/Cy5.5通道。[0047](7)Flowjo繪圖定量，統(tǒng)計組間差異。[0048]3、藥物處理3D腫瘤球[0049](1)使用極低吸附能力的U型96孔板進行3D腫瘤球培養(yǎng)，每孔加入1×10?個Huh7細胞，靜置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,鏡下觀察腫瘤成球。[0050](2)腫瘤成球后根據(jù)實驗方案加入含2μmol/L侖伐替尼或1μmol/LJXO6或2μmol/L侖伐替尼+1μmol/LJXO6的完全培養(yǎng)基進行換液操作，空白對照組僅加入等量完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后鏡下觀察拍照記錄腫瘤球直徑、形態(tài)。[0051]4、小鼠皮下瘤藥物干預[0052](1)提前擴繁足夠數(shù)量的Huh7細胞，消化計數(shù)后使用基質膠與PBS重懸稀釋細胞沉[0053](2)使用巴氏管將細胞懸液徹底混勻，按每只BALB/c-nude小鼠200μL(含5×10?個細胞)基質膠懸液注射于右頸后皮下，注意進針深度，可見皮下形成明顯皮丘。[0054](3)待皮下瘤體積接近100-150mm3時，將荷瘤的BALB/c-nude小鼠隨機分為4組，每組6只，分別為空白對照組/侖伐替尼組/JX06組/聯(lián)合用藥組，測量基線皮下瘤直徑；實驗所用藥物現(xiàn)配現(xiàn)用：[0055]侖伐替尼灌胃體系制備：侖伐替尼粉末溶解于5%DMSO中，使用0.5%羧甲基纖維素鈉將侖伐替尼母液稀釋至lμg/μL;[0056]JX06腹腔注射體系制備：JX06粉末溶解于5%DMSO中，使用40%PEG300、5%Tween80、生理鹽水將JX06母液稀釋至2μg/μL;[0057]根據(jù)實驗分組給予以下干預：[0058]空白對照組：與處理組等量的藥物溶劑灌胃、腹腔注射；[0059]侖伐替尼組：10mg/kg侖伐替尼灌胃；[0061]聯(lián)合用藥組：10mg/kg侖伐替尼灌胃+20mg/kgJXO6腹腔注射；[0062]隔天給藥共3周，每4天測量皮下瘤的長徑和短徑，按公式V=(L×W2)/2計算皮下7[0063](4)3周后處死小鼠，暴露皮下瘤位置排列整齊拍攝大體照片；小心剝離皮下瘤后按照相同的順序排列整齊后拍照，測量瘤重后將皮下瘤以4%多聚甲醛固定后送石蠟固定切片，免疫組化染色定量反映細胞增殖能力的Ki67。[0065]體外實驗(細胞實驗):[0066]JX06可以抑制肝癌細胞生長，在Huh7細胞中IC50為0.51μmol/L,在SNU449細胞中[0067]Huh7細胞系對侖伐替尼處理是天然敏感的，而SNU449細胞系相對而言則是天然耐藥的，通過藥物聯(lián)合處理發(fā)現(xiàn)JX06可以降低侖伐替尼在這兩株細胞系的IC50:[0068]Huh7細胞中侖伐替尼單藥的IC50為2.34μmol/L,加入0.25μmol/LJX06后侖伐替尼的IC50為1.6lμmol/L,降低31.2%;加入0.5μmol/LJXO6后侖伐替尼的IC50降至1.13μmol/L,降低51.7%。[0069]SNU449細胞中侖伐替尼單藥的IC50為55.37μmol/L,加入1μmol/LJX06后侖伐替尼的IC50為10.06μmol/L,降低81.8%;加入2μmol/LJXO6后侖伐替尼的IC50為4.17μmol/L,降低92.5%(圖2)。[0070]流式細胞術檢測肝癌細胞凋亡發(fā)現(xiàn)：[0071]2μmol/L侖伐替尼處理Huh7細胞48h后凋亡比例為9.38%,而聯(lián)合使用2μmol/L侖伐替尼與1μmol/LJXO6后凋亡細胞比例為30.36%;[0072]4μmol/L侖伐替尼處理SNU449細胞48h后凋亡比例僅為4.31%,聯(lián)合使用4μmol/L侖伐替尼與2μmol/LJX06后凋亡細胞比例升高至20.21%。[0073]可見聯(lián)合用藥組對肝癌的殺傷明顯強于侖伐替尼單藥組(圖3)。[0074]與上述結果一致，聯(lián)合用藥對于3D培養(yǎng)的腫瘤球也比單藥組有更強的生長抑制[0075]體內實驗(動物實驗):[0076]通過BALB/c-nude小鼠皮下荷瘤后給予藥物干預的方式驗證JXO6協(xié)同侖伐替尼在體內抑制肝癌的療效。結果與體外實驗一致，聯(lián)合用藥可以更好抑制皮下瘤的生長(圖5),免疫組織化學染色提示JX06與侖伐替尼聯(lián)合組Ki67表達最低(圖6)。[0077]盡管上述實施例對本發(fā)明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部實施例，人們還可以根據(jù)本實施例在不經(jīng)創(chuàng)造性前提下獲得其他實施例，這些實施例都屬于本發(fā)明保護范圍。81/2頁1/2頁10O●●o一