疫苗菌毒種培育工作業(yè)指導(dǎo)書(shū)文件名稱：疫苗菌毒種培育工作業(yè)指導(dǎo)書(shū)編制部門：綜合辦公室編制時(shí)間：2025年類別：兩級(jí)管理標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：審核人：版本記錄：第一版批準(zhǔn)人：一、總則

1.適用范圍：本作業(yè)指導(dǎo)書(shū)適用于疫苗菌毒種培育工作的全過(guò)程，包括菌毒種篩選、擴(kuò)增、純化、鑒定、保存等環(huán)節(jié)。

2.目的：規(guī)范疫苗菌毒種培育工作流程，確保菌毒種的質(zhì)量和安全性，提高疫苗研發(fā)和生產(chǎn)效率。

3.依據(jù)：本指導(dǎo)書(shū)依據(jù)《疫苗生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》、《生物安全實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》等相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)制定。

二、操作前的準(zhǔn)備

1.勞動(dòng)防護(hù)用品穿戴：

-穿戴無(wú)菌操作服，確保無(wú)破損。

-配戴醫(yī)用口罩、護(hù)目鏡和帽子，防止飛沫感染。

-手部消毒，穿戴無(wú)菌手套，必要時(shí)佩戴雙層手套。

-工作人員進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前需進(jìn)行體溫檢測(cè)和健康狀態(tài)確認(rèn)。

2.技術(shù)準(zhǔn)備：

-審閱相關(guān)技術(shù)文件和操作規(guī)程，確保操作人員對(duì)菌毒種培育流程有充分了解。

-參與培訓(xùn)，掌握無(wú)菌操作技術(shù)、顯微鏡觀察技術(shù)等基本技能。

3.設(shè)備檢查：

-檢查超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、PCR儀等設(shè)備是否正常運(yùn)行，并調(diào)整至最佳工作狀態(tài)。

-確認(rèn)生物安全柜、滅菌器等設(shè)備的消毒記錄，確保設(shè)備消毒合格。

4.物料準(zhǔn)備：

-準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、試劑、耗材等，檢查其有效期和合格證明。

-確認(rèn)無(wú)菌操作室內(nèi)的空氣潔凈度，保持室內(nèi)環(huán)境清潔。

-預(yù)熱PCR儀、電泳儀等設(shè)備，確保實(shí)驗(yàn)設(shè)備在操作前已達(dá)到所需溫度。

三、操作的先后順序與方式

1.作業(yè)具體步驟：

-首先進(jìn)行菌種篩選，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的菌種。

-接著進(jìn)行菌種擴(kuò)增，使用培養(yǎng)基和適宜的溫度、pH值進(jìn)行培養(yǎng)。

-然后進(jìn)行純化，通過(guò)離心、過(guò)濾等方法去除雜質(zhì)。

-進(jìn)行菌種鑒定，使用PCR、基因測(cè)序等方法確認(rèn)菌種身份。

-最后進(jìn)行菌種保存，采用冷凍保存或凍干保存等方法。

2.關(guān)鍵操作要求：

-無(wú)菌操作是關(guān)鍵，所有操作應(yīng)在超凈工作臺(tái)或生物安全柜中進(jìn)行。

-控制溫度、pH值等培養(yǎng)條件，確保菌種生長(zhǎng)環(huán)境適宜。

-使用精確的量具，避免因量取不準(zhǔn)確導(dǎo)致的誤差。

3.特殊工序處理方法：

-對(duì)于需要特殊培養(yǎng)條件的菌種，調(diào)整培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)參數(shù)。

-對(duì)于需要特殊處理的菌種，如芽孢、病毒等，采用相應(yīng)的滅活或處理方法。

4.常見(jiàn)操作偏差的糾正措施：

-若觀察到菌落生長(zhǎng)異常，檢查培養(yǎng)基、溫度、pH值等因素，進(jìn)行調(diào)整。

-若出現(xiàn)污染，立即停止操作，對(duì)操作區(qū)域進(jìn)行消毒，重新開(kāi)始。

-若菌種鑒定結(jié)果不符，重新進(jìn)行鑒定或檢查操作流程中的每一步。

四、操作過(guò)程中設(shè)備及工具的狀態(tài)要求

1.正常運(yùn)行狀態(tài)特征：

-超凈工作臺(tái)應(yīng)保持無(wú)塵、無(wú)污染，運(yùn)行平穩(wěn)，風(fēng)速和壓力梯度符合要求。

-離心機(jī)運(yùn)行時(shí)應(yīng)平穩(wěn)，無(wú)異常噪音，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)平衡，離心力穩(wěn)定。

-PCR儀顯示正常，溫度控制準(zhǔn)確，反應(yīng)曲線平滑，無(wú)異常波動(dòng)。

-生物安全柜應(yīng)保持適當(dāng)?shù)臍饬?，無(wú)泄漏，操作面板顯示正常。

-顯微鏡視野清晰，調(diào)焦順暢，無(wú)故障報(bào)警。

2.潛在異常跡象：

-超凈工作臺(tái)風(fēng)速不穩(wěn)定，壓力梯度異常，可能存在泄漏或過(guò)濾網(wǎng)堵塞。

-離心機(jī)運(yùn)行時(shí)出現(xiàn)震動(dòng)、噪音增大，可能是轉(zhuǎn)子不平衡或軸承損壞。

-PCR儀溫度控制不準(zhǔn)確，反應(yīng)曲線異常，可能是加熱元件故障或溫度控制系統(tǒng)故障。

-生物安全柜氣流異常，操作面板顯示異常，可能是氣流控制閥故障或電路問(wèn)題。

-顯微鏡視野模糊，調(diào)焦困難，可能是鏡頭污染或光學(xué)系統(tǒng)故障。

3.狀態(tài)維護(hù)的基本要求：

-定期檢查和維護(hù)設(shè)備，包括清潔、潤(rùn)滑、校準(zhǔn)等。

-定期更換過(guò)濾網(wǎng)、密封件等易損件。

-記錄設(shè)備運(yùn)行數(shù)據(jù)，如溫度、壓力、使用時(shí)間等，以便進(jìn)行趨勢(shì)分析和故障排查。

-對(duì)設(shè)備進(jìn)行定期消毒，確保無(wú)菌操作環(huán)境。

-培訓(xùn)操作人員正確使用和維護(hù)設(shè)備，避免人為損壞。

五、作業(yè)過(guò)程中的參數(shù)調(diào)試與質(zhì)量校驗(yàn)

1.關(guān)鍵參數(shù)調(diào)試方法：

-菌種培養(yǎng)過(guò)程中，根據(jù)菌種特性和生長(zhǎng)需求調(diào)整培養(yǎng)基成分、溫度、pH值和氧氣供應(yīng)。

-無(wú)菌操作時(shí)，確保超凈工作臺(tái)的風(fēng)速和壓力梯度符合規(guī)范，必要時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

-PCR擴(kuò)增過(guò)程中，優(yōu)化退火溫度、延伸溫度和時(shí)間，確保擴(kuò)增效率。

-顯微鏡觀察時(shí)，調(diào)整顯微鏡的焦距、光圈和亮度，獲得清晰的圖像。

2.質(zhì)量校驗(yàn)的頻次與標(biāo)準(zhǔn)：

-菌種培養(yǎng)過(guò)程，每24小時(shí)檢查菌落生長(zhǎng)情況，確保無(wú)污染。

-PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物大小和純度。

-顯微鏡觀察結(jié)果，每批樣品至少隨機(jī)檢查3個(gè)視野，確保觀察結(jié)果準(zhǔn)確。

-質(zhì)量校驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)參照相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

3.校驗(yàn)不合格的處理流程：

-發(fā)現(xiàn)菌落污染，立即停止操作，對(duì)污染區(qū)域進(jìn)行消毒，重新進(jìn)行無(wú)菌操作。

-PCR擴(kuò)增結(jié)果不合格，重新設(shè)計(jì)引物或調(diào)整PCR條件，重新擴(kuò)增。

-顯微鏡觀察結(jié)果異常，重新檢查顯微鏡狀態(tài)或更換樣本進(jìn)行觀察。

-所有不合格情況均需詳細(xì)記錄，分析原因，并采取改進(jìn)措施防止再次發(fā)生。

六、操作人員的作業(yè)站位與規(guī)范動(dòng)作

1.合理站位：

-操作人員應(yīng)站在超凈工作臺(tái)的前方，距離適當(dāng)，以便于操作而不妨礙空氣流動(dòng)。

-保持一定的距離，避免在操作過(guò)程中產(chǎn)生氣流干擾。

-確保操作臺(tái)面有足夠的空間，以便于放置實(shí)驗(yàn)器材和記錄本。

2.標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)作規(guī)范：

-操作時(shí)，手臂應(yīng)盡量靠近身體，以減少無(wú)菌操作區(qū)域外的暴露。

-使用手腕的力量進(jìn)行操作，避免使用肘部以上的力量，減少無(wú)菌區(qū)域的污染風(fēng)險(xiǎn)。

-操作物品時(shí)，應(yīng)使用專用的工具，如鑷子、移液器等，避免直接用手接觸。

3.避免誤操作的動(dòng)作禁忌：

-避免在操作過(guò)程中轉(zhuǎn)身或移動(dòng)腳步，以免造成氣流干擾。

-不要在無(wú)菌區(qū)域外觸摸操作臺(tái)面或自己，以防污染。

-使用移液器時(shí)，注意不要讓吸頭接觸容器內(nèi)壁或液體表面，以防止氣泡產(chǎn)生或液體飛濺。

-操作完畢后，不要在無(wú)菌區(qū)域外處理實(shí)驗(yàn)器材，應(yīng)立即將其放入消毒液或適當(dāng)?shù)娜萜髦小?/p>

-人機(jī)工程學(xué)應(yīng)用：

-調(diào)整操作臺(tái)高度，使操作人員的肘部與操作臺(tái)面平行，以減少腰部和頸部的壓力。

-確保操作人員的視線與操作臺(tái)面保持水平，減少頸部和眼睛的疲勞。

-定期休息，避免長(zhǎng)時(shí)間保持同一姿勢(shì)，以減少肌肉疲勞和損傷風(fēng)險(xiǎn)。

七、作業(yè)過(guò)程中的關(guān)鍵注意事項(xiàng)

1.質(zhì)量控制：

-嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程，確保每一步操作準(zhǔn)確無(wú)誤。

-定期對(duì)菌毒種進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，如無(wú)菌性、純度、活力等。

-對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)記錄，以便于追蹤和分析。

-質(zhì)量問(wèn)題出現(xiàn)時(shí)，及時(shí)查找原因，采取措施糾正。

2.安全防護(hù)：

-操作過(guò)程中，佩戴必要的防護(hù)用品，如口罩、護(hù)目鏡、手套等。

-注意生物安全，防止菌毒種泄露或交叉污染。

-定期進(jìn)行生物安全培訓(xùn)，提高安全意識(shí)。

3.設(shè)備保護(hù)：

-使用前檢查設(shè)備狀態(tài)，確保設(shè)備正常運(yùn)行。

-避免設(shè)備過(guò)載或長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)工作，防止設(shè)備過(guò)熱。

-定期進(jìn)行設(shè)備維護(hù)和保養(yǎng)，延長(zhǎng)設(shè)備使用壽命。

4.環(huán)境維護(hù)：

-保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)清潔，定期消毒，防止污染。

-控制實(shí)驗(yàn)室溫度和濕度，確保菌毒種培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性。

-合理安排實(shí)驗(yàn)流程，避免高峰時(shí)段設(shè)備擁堵。

-節(jié)約使用實(shí)驗(yàn)材料，減少浪費(fèi)。

八、作業(yè)完成后的收尾工作

-現(xiàn)場(chǎng)清理：

-操作完成后，立即清理工作臺(tái)面，移除所有實(shí)驗(yàn)器材和廢棄物。

-使用消毒劑對(duì)操作區(qū)域進(jìn)行徹底消毒，確保無(wú)殘留。

-清理地面，避免液體或固體廢棄物遺漏。

-設(shè)備歸位：

-將所有使用過(guò)的設(shè)備放回原位，確保設(shè)備整潔有序。

-對(duì)設(shè)備進(jìn)行簡(jiǎn)單的清潔，如擦拭儀器表面。

-物料整理：

-分類整理剩余的實(shí)驗(yàn)材料，如培養(yǎng)基、試劑等，放回原儲(chǔ)存位置。

-檢查所有物料標(biāo)簽是否清晰，確保物料的正確標(biāo)識(shí)。

-作業(yè)記錄填寫(xiě)：

-詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程、結(jié)果和任何異常情況。

-確保記錄完整、準(zhǔn)確，便于后續(xù)查閱和分析。

-對(duì)記錄進(jìn)行歸檔，按照實(shí)驗(yàn)室規(guī)定進(jìn)行保存。

九、突發(fā)問(wèn)題的應(yīng)急處理

1.設(shè)備故障：

-立即停止操作，避免設(shè)備損壞加劇。

-檢查設(shè)備故障原因，如電源、線路、機(jī)械部件等。

-若無(wú)法自行修復(fù)，通知設(shè)備維護(hù)人員。

-記錄故障情況，包括時(shí)間、現(xiàn)象、初步判斷等。

-上報(bào)上級(jí)領(lǐng)導(dǎo)，根據(jù)情況決定是否暫停作業(yè)。

2.質(zhì)量異常：

-立即隔離異常樣品，避免進(jìn)一步污染。

-分析異常原因，如操作錯(cuò)誤、材料問(wèn)題等。

-重新進(jìn)行相關(guān)操作或更換材料，確保質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)。

-記錄異常情況，包括時(shí)間、原因、處理措施等。

-上報(bào)質(zhì)量管理部門，進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)查和處理。

3.安全隱患：

-立即采取必要措施，如隔離危險(xiǎn)區(qū)域、疏散人員等。

-確定安全隱患原因，如設(shè)備故障、操作失誤等。

-修復(fù)或消除安全隱患，防止類似事件再次發(fā)生。

-記錄事故情況，包括時(shí)間、原因、處理過(guò)程等。

-上報(bào)安全管理部門，進(jìn)行事故調(diào)查和預(yù)防措施制定。

十、附則

1.解釋權(quán)：

本作業(yè)指導(dǎo)書(shū)的解釋權(quán)歸實(shí)驗(yàn)室管理部門所有。

2.生效日期：

本作業(yè)指導(dǎo)書(shū)自發(fā)布之日起正式生效。

3.修訂流程：

如需對(duì)作業(yè)指導(dǎo)書(shū)進(jìn)行修訂，應(yīng)由