ICS65.020.20B38DB6110商洛市市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB6110/T008—2021前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4生產(chǎn)環(huán)境與設(shè)施 5萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌菌種的制備 6菌種質(zhì)量 7入庫 8標(biāo)志、包裝、運輸、貯藏 9生產(chǎn)檔案 附錄A培養(yǎng)基配方（規(guī)范性附錄） ⅡDB6110/T008—2021本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本文件由丹鳳縣永福工貿(mào)有限責(zé)任公司提出。本文件由商洛市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局歸口。本文件起草單位：丹鳳縣永福工貿(mào)有限責(zé)任公司、丹鳳縣良種天麻產(chǎn)業(yè)園、丹鳳縣農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中本文件主要起草人：張建民、梁富斌、王秋穎、楊丹軍、黃濤、慶立紅、王曉敏、梁育凡、王新悅。本文件由丹鳳縣永福工貿(mào)有限責(zé)任公司負(fù)責(zé)解釋。本文件首次發(fā)布。聯(lián)系方式如下：單位：丹鳳縣永福工貿(mào)有限責(zé)任公司電話址：丹鳳縣巒莊鎮(zhèn)河口村丹鳳縣良種天麻產(chǎn)業(yè)園郵編：726202DB6110/T008—20211天麻萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了天麻萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌菌種生產(chǎn)技術(shù)的術(shù)語和定義、生產(chǎn)環(huán)境與設(shè)施、萌發(fā)菌和蜜環(huán)菌菌種的制備、菌種質(zhì)量、入庫、標(biāo)志、包裝、運輸、貯藏以及生產(chǎn)檔案等技術(shù)要求。本文件適用于天麻萌發(fā)菌和蜜環(huán)菌菌種的生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB191包裝儲運圖示標(biāo)志GB4806.7食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸用塑料材料及制品GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T12728食用菌術(shù)語NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程NY/T2375食用菌生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范NY5099無公害食品食用菌栽培基質(zhì)安全技術(shù)要求3術(shù)語和定義GB/T12728界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件，為使用方便，以下重復(fù)列出了GB/T12728中的某些術(shù)語和定義。3.1天麻（GastrodiaelataBL.）天麻，又名赤箭、神草、鬼督郵、定風(fēng)草等。多年生蘭科草本異養(yǎng)植物，以干燥的塊莖入藥，藥材名稱天麻。3.2萌發(fā)菌（germinationfungi）為天麻種子提供營養(yǎng)的石斛小菇、紫其小菇等小菇屬真菌。為天麻提供營養(yǎng)物質(zhì)的傘菌目小皮傘科蜜環(huán)菌屬真菌。3.4母種（stockculture）經(jīng)各種方法選育出來的具有結(jié)實性的的菌絲體純培養(yǎng)物及其繼代培養(yǎng)物，也稱一級菌種、試管種。3.5原種（motherspawn）由母種移植、擴大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物，也稱二級菌種。DB6110/T008—202123.6栽培種（cultispawn）由原種移植、擴大培養(yǎng)而成用于栽培的菌絲體純培養(yǎng)物，栽培種只能用于栽培，不可再次擴大繁殖菌種，也稱三級菌種。3.7菌索（rhizomorph）真菌菌絲體集合而成的繩索狀結(jié)構(gòu)。3.8蒴果（capsule）呈倒卵形、卵形或紡錘形的天麻果實。4生產(chǎn)環(huán)境與設(shè)施4.1場地菌種生產(chǎn)車間應(yīng)建在空氣新鮮，無污染，交通便利的地方，水、電方便。4.2車間設(shè)置和布局應(yīng)設(shè)置原輔料倉庫、原料處理場地、洗滌室、配料室、滅菌室、預(yù)冷室、接種間、培養(yǎng)室、質(zhì)檢室、保藏室、貯藏庫等，布局科學(xué)合理。4.3建筑要求車間內(nèi)地面應(yīng)平整且經(jīng)硬化處理，便于清洗消毒和機械作業(yè)，且不易沾染雜菌孢子。4.4設(shè)施要求4.4.1滅菌室應(yīng)配備高壓或常壓滅菌設(shè)備，水電安全方便，通風(fēng)良好。4.4.2預(yù)冷室應(yīng)配備降溫、空氣凈化設(shè)備。4.4.3接種間為封閉式房間，設(shè)作業(yè)通道，更衣室、緩沖間、風(fēng)淋室、無菌室等，室內(nèi)平整光滑，配有紫外燈和臭氧等消毒設(shè)施。4.4.4培養(yǎng)室應(yīng)配備控溫、控濕和新風(fēng)系統(tǒng)設(shè)施。4.4.5保藏室配備冰箱或冰柜，用于保藏母種和原種。4.4.6貯藏庫應(yīng)配備制冷降溫設(shè)備，通風(fēng)良好，避光涼爽，用于貯藏栽培種。DB6110/T008—202135萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌菌種的制備5.1采集分離材料5.1.1萌發(fā)菌種菌每年5月～6月，在有野生天麻分布的山林下，收集枯枝落葉，與天麻蒴果拌勻后覆土，兩個月后取萌發(fā)的原球莖作為分離材料；或在野外采集的原球莖中將侵入原球莖的萌發(fā)菌分離出來，獲取萌發(fā)菌種5.1.2蜜環(huán)菌種菌蜜環(huán)菌種菌分離材料主要有蜜環(huán)菌菌索、帶菌索的天麻塊莖、蜜環(huán)菌子實體和孢子等。5.1.2.1蜜環(huán)菌菌索在夏秋季節(jié)雨晴之后，采集枯樹枝或枯樹樁上白色生長點及紅色幼嫩的蜜環(huán)菌菌索作為分離材料；或者將有蜜環(huán)菌菌絲的枯樹枝、枯樹樁帶回室內(nèi)培養(yǎng)，待其長出蜜環(huán)菌菌索后，將幼嫩菌索作為分離材料。5.1.2.2帶菌索的天麻塊莖在天麻采收季節(jié)，挑選健康的、帶菌索的白麻、母麻或營養(yǎng)繁殖莖作為分離材料。5.1.2.3蜜環(huán)菌子實體在天麻種植區(qū)域或野生蜜環(huán)菌生長的地方，采取發(fā)育正常、無病蟲害、尚未開傘的子實體作為分離材料。5.1.2.4孢子收集子實體成熟后散出的孢子作為分離材料。5.2母種的制備5.2.1PDA培養(yǎng)基配方配方應(yīng)符合附錄A.1的規(guī)定。5.2.2萌發(fā)菌母種的制備選取健壯的原球莖，清除泥土，用自來水沖洗干凈，然后用無菌水沖洗數(shù)次后，置于經(jīng)滅菌處理的培養(yǎng)皿中，用0.1%氯化汞溶液浸泡3min～5min，用滅菌小剪刀將原球莖剪成2段～3段，在鏈霉素液中蘸一下，接入PDA平面培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)5d～10d，待發(fā)出菌絲后，挑取菌絲接入PDA平板培養(yǎng)基，如此反復(fù)幾次，即可得到純化的母種。5.2.3蜜環(huán)菌母種的制備5.2.3.1菌索制備法切取部份蜜環(huán)菌菌索組織，用無菌水沖洗2次～3次，放入0.1%氯化汞溶液中浸泡0.5min～1min，再次用無菌水沖洗2次～3次，洗去殘存的藥液，在鏈霉素液中蘸一下，用無菌濾紙吸干表面附著水后，接入PDA培養(yǎng)基中，在25℃培養(yǎng)3d～4d，可發(fā)現(xiàn)接種點處開始發(fā)出少許絨狀白色菌絲，繼續(xù)培養(yǎng)至接種點DB6110/T008—20214處剛產(chǎn)生菌索分枝時，立即用接種鏟截取其中生長旺盛且幼嫩的菌索部分，接入PDA培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)，菌索長滿培養(yǎng)基后即為純化的母種。5.2.3.2帶菌索的天麻塊莖制備法清除帶菌索的天麻塊莖表面泥土，用無菌水沖洗2次～3次，在0.1%氯化汞溶液中浸泡1min～1.5min，再次用無菌水沖洗2次～3次，將帶有蜜環(huán)菌菌索的天麻塊莖剪成1cm的小段或小塊，在鏈霉素液中浸泡片刻，用無菌濾紙吸干表面附著水后，同菌索制備法進行培養(yǎng)和分離獲得純化后的母種。5.2.3.3子實體制備法清除蜜環(huán)菌子實體表面泥土，切除菌柄基部，用75%酒精擦拭表面2次～3次，將子實體撕開，在菌蓋和菌柄交界處或菌褶處挑取小塊組織接入PDA培養(yǎng)基中，在25℃培養(yǎng)5d～7d，在接種處剛產(chǎn)生菌索分枝時，同菌索制備法進行培養(yǎng)和分離獲得純化后的母種。5.2.3.4孢子制備法開傘的子實體截去菌柄的下半部，用75%的酒精擦拭表面2次～3次，然后菌褶向下插在孢子收集裝置的支架上，將支架置于無菌培養(yǎng)皿中，蓋上鐘罩，收集孢子。待孢子落于皿內(nèi)后，用無菌水制成孢子懸液接種于PDA培養(yǎng)基，在25℃培養(yǎng)3d～d天，在接種點處開始發(fā)出少許絨狀白色菌絲后，同菌索制備法進行培養(yǎng)和分離獲得純化后的母種。5.2.4鑒定5.2.4.1萌發(fā)菌萌發(fā)實驗挑取萌發(fā)菌母種連同培養(yǎng)基少許，轉(zhuǎn)接在經(jīng)滅菌處理的闊葉樹樹葉上，25℃培養(yǎng)至菌絲長滿樹葉時，取長滿萌發(fā)菌的樹葉和天麻蒴果拌勻，放入組培瓶內(nèi)海綿上于22℃培養(yǎng)，期間加無菌水保持海綿濕潤。2個～3個月后，若有原球莖，證明該菌種即為萌發(fā)菌，即可對其擴繁。5.2.4.2蜜環(huán)菌伴栽試驗采取天麻常規(guī)種植的拌栽試驗對蜜環(huán)菌進行鑒定。5.3原種的制備5.3.1原種培養(yǎng)基配方萌發(fā)菌和蜜環(huán)菌原種培養(yǎng)基配方應(yīng)符合附錄A.2的規(guī)定。5.3.2萌發(fā)菌原種的制備將萌發(fā)菌原種培養(yǎng)基裝入菌種袋或瓶中，裝袋或瓶以容積的4/5為宜，高壓滅菌1.5h～2h或常壓滅菌8h～10h后，移入預(yù)冷室冷卻至室溫，接入萌發(fā)菌母種，25℃培養(yǎng)至菌絲長滿整個培養(yǎng)基后，所得菌種即為原種。5.3.3蜜環(huán)菌原種的制備將蜜環(huán)菌原種培養(yǎng)基裝入菌種袋或瓶中，同萌發(fā)菌原種的制備方法，25℃培養(yǎng)至菌索長滿整個培養(yǎng)基后，所得菌種即為原種。5.4栽培種的制備DB6110/T008—202155.4.1栽培種培養(yǎng)基配方萌發(fā)菌和蜜環(huán)菌栽培種培養(yǎng)基配方應(yīng)符合附錄A.3的規(guī)定。5.4.2萌發(fā)菌栽培種的制備將萌發(fā)菌母種接入PDA液體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)5d～7d后，將培養(yǎng)好的液體接入萌發(fā)菌栽培種培養(yǎng)基中，或?qū)⒚劝l(fā)菌母種直接接入萌發(fā)菌栽培種培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)至菌絲長滿整個培養(yǎng)基后，即得萌發(fā)菌栽培種。5.4.3蜜環(huán)菌栽培種的制備5.4.3.1蜜環(huán)菌枝條菌將直徑0.5cm～1.5cm的樹枝截成1.5cm～2.5cm的小段，在水中浸泡48h，使樹枝充分吸水后裝入瓶中，裝入量以瓶容積的4/5為宜，再加水至瓶口后封蓋，高溫滅菌后接入蜜環(huán)菌固體或經(jīng)活化培養(yǎng)的液體原種，25℃培養(yǎng)至菌索長滿所有培養(yǎng)基，即得蜜環(huán)菌栽培種。5.4.3.2蜜環(huán)菌固體干菌將蜜環(huán)菌栽培種培養(yǎng)基裝入菌種袋或瓶中，同萌發(fā)菌原種的制備方法，25℃培養(yǎng)至菌索長滿整個培養(yǎng)基后，即得蜜環(huán)菌栽培種。5.5菌種保藏5.5.1母種保藏萌發(fā)菌和蜜環(huán)菌保藏條件相同，于1℃~4℃下冰箱或冰柜中保藏。5.5.2原種和栽培種保藏萌發(fā)菌和蜜環(huán)菌保藏條件相同，4℃~6℃下保存在貯藏庫中。6菌種質(zhì)量6.1母種質(zhì)量萌發(fā)菌母種菌絲應(yīng)長滿斜面培養(yǎng)基，粗壯均勻，無雜菌和異味。蜜環(huán)菌母種菌索應(yīng)長滿斜面培養(yǎng)基，粗壯均勻，有鎖狀聯(lián)合，無雜菌和異味。6.2原種、栽培種質(zhì)量無雜菌，無害蟲，上下一體，袋（瓶）壁有少量水珠、無積水，菌塊完整、不萎縮、不散碎、有彈性、無異味。萌發(fā)菌原種和栽培種顏色潔白，蜜環(huán)菌原種和栽培種呈白色至棕紅色。制備好的菌種，經(jīng)檢驗合格后及時入庫。7.1記錄生產(chǎn)中各環(huán)節(jié)應(yīng)詳細(xì)記錄備案。DB6110/T008—20216各級菌種都應(yīng)留樣備查，母種留樣的數(shù)量應(yīng)為每個批號3支～5支，原種和栽培種每批次5瓶（袋）~7瓶（袋），于0℃~6℃下貯存至正常生產(chǎn)條件下該批菌種生產(chǎn)出天麻止。8標(biāo)志、包裝、運輸、貯藏8.1標(biāo)志原種和栽培種標(biāo)志內(nèi)容應(yīng)包含產(chǎn)品名稱、生產(chǎn)單位、生產(chǎn)許可證號、保質(zhì)期、保藏條件。8.2包裝包裝材料應(yīng)按GB4806.7規(guī)定的要求執(zhí)行。8.3運輸在0℃-15℃條件下運輸，不得與有毒有害物品混合運輸。9生產(chǎn)檔案建立生產(chǎn)檔案，保存不少于2年。DB6110/T008—20217（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基配方A.1PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml，pH自然。A.2原種培養(yǎng)基A.2.1萌發(fā)菌原種培養(yǎng)基青岡、板栗等闊葉樹的木屑77.5%、麩皮15%、玉米粉5%、葡萄