微生物實驗報告

細(xì)菌的芽抱染色觀察實驗

劉欣怡201100140057

生命科學(xué)基地班

組別：周一下午三組

同組者：曹平平，周楠,

劉藝，劉希偉

實驗時間:2012年10月22號

一、實驗?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)并掌握芽抱染色法

2.了解芽洵桿菌的形態(tài)特征

3.鞏固顯微鏡操作技術(shù)及無菌操作技術(shù)

二、實驗器材

L菌種

枯草芽胞桿菌，梭狀芽胞桿菌。

2.溶液和試劑

5%孔雀綠水溶液，0.5%番紅水溶液。

3.儀器和其他用品

酒精燈，載玻片，雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和二甲苯)，顯微鏡、吸水紙、擦鏡紙：接

種環(huán)，載玻片夾子，無菌水等。

三、實驗原理

1.芽胞又叫內(nèi)牛袍子(endosopre),是某些細(xì)菌生長到一定階段在菌體內(nèi)形成

的休眠體，通常呈圓形或橢圓形。細(xì)菌能否形成芽把以及芽胞的形狀、芽抱在

芽狗囊內(nèi)的位置、芽布囊是否膨大等特征是鑒定細(xì)菌的依據(jù)之一。

2.芽抱菌體的特點：

a.芽抱的含水率低，38%?40%。

b.芽泡壁厚而致密，分三層：外層是芽胞外殼，為蛋白質(zhì)性質(zhì)。中層為

皮層，由肽聚糖構(gòu)成，含大量2,6-毗咤二陵酸。內(nèi)層為抱子壁，由肽聚糖

構(gòu)成，包圍芽抱細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)。芽抱萌發(fā)后抱子壁變?yōu)闋I養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞壁。

c.芽泡中的2,6-毗咤二瓶酸（簡稱DPA）含量高，為芽泡干重的5%?

15%0毗咤二竣酸以鈣鹽的形式存在，鈣含最高。在營養(yǎng)細(xì)胞和不產(chǎn)芽抱的

細(xì)菌體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)2,6-毗咤二竣酸。芽抱形成過程中，2,6-毗咤二竣酸隨

即合成，芽泡就具有耐熱性，芽的萌發(fā)形成營養(yǎng)細(xì)胞時，2,6-毗咤二竣酸

就消失，耐熱性就喪失。

d.含有耐熱性酶，

芽抱由于有以上四個特點，使得芽抱對不良環(huán)境如高溫、低溫、干燥、

光線和化學(xué)藥物有很強的抵抗力。細(xì)菌的營養(yǎng)細(xì)胞在70?80℃時10分鐘就

死亡，而芽泡在120?140℃還能生存幾小時，營養(yǎng)細(xì)胞在5%苯酚溶液中很

快就死亡，芽抱卻能存活15天，芽他的大多數(shù)酶處于不活動狀態(tài)，代謝活

力極低，所以，芽抱是抵抗外界不良環(huán)境的休眠體。

3.芽胞染色法是利用細(xì)菌的芽抱和菌體對染料的親和力不同的原理，用不同染

料進行著色，使芽泡和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。芽抱壁厚、透性低，著

色、脫色均較困難，因此，當(dāng)先用弱堿性染料，如孔雀綠或堿性品紅在加熱條

件下進行染色時，此染料不僅可進入菌體，而且也可進入芽狗，進入菌體的染

料可經(jīng)水洗脫色，而進入芽孩的染料則難以透出，若再用復(fù)染液（如番紅液）

或襯托溶液（如黑色素溶液）處理，則菌體和芽泡易于區(qū)分。

4、芽抱有的長在中央或近中央，圓形或橢圓形，芽抱的大小，位置，在分類鑒

定上有一定的意義，它僅僅是芽洵細(xì)菌生活史的一個環(huán)節(jié)。芽抱可作為培養(yǎng)基

滅菌徹底與否的檢驗依據(jù)、在桿菌中能形成芽胞的種類較多，在球菌和螺旋菌

中只有少數(shù)菌種可形成芽抱。

5.產(chǎn)生芽胞的幾個屬：

芽劑桿菌屬（Bacillus）、梭狀芽泡桿菌屬（Clostridium）、芽劑八疊球菌屬

（Sporosarcina）,

四、實驗內(nèi)容

根據(jù)實驗提供的兩種細(xì)菌，即枯草芽抱桿菌和梭狀芽泡桿菌，然選一種或者兩

者都選，進行制片，進而染色觀察細(xì)菌芽抱的形態(tài)特征。若選擇兩種菌，可以再

制作在同一個載玻片上。

五、實驗步驟

1、涂片

取一塊洗凈并自然晾干的載玻片，分別滴兩小滴蒸儲水于載玻片靠近中央

處；用接種環(huán)無菌操作，先將接種環(huán)在酒精燈上燒2遍，從酒精燈旁用稍

冷卻的接種環(huán)從枯草芽抱桿菌牛肉膏蛋白陳瓊脂斜面或梭狀芽抱桿菌牛肉

膏蛋白陳瓊脂斜面挑取適量菌苔（接觸一或兩下），在載玻片上的兩滴蒸

儲水中分別涂抹（接觸三到四下），使菌懸液在載玻片上形成均勻薄膜或

觀察到小水滴有些渾濁。記錄兩者相對位置，不要弄混。并且還耍記清載

玻片真反面，可以做標(biāo)記。

2.干燥固定

可以有酒精燈進行加熱干燥，用夾子夾住載玻片在火焰上過1到2遍就放到

手背上試一下玻片溫度，一不燙手為原則，一直重復(fù)操作直至液滴完全干燥固

定。

3、染色

向干燥固定好的片子上加數(shù)滴孔雀綠染液，使菌完全被覆蓋，用木夾夾住載玻

片一端，在微火上加熱（可以在酒精燈上過幾下，稍停一下再在酒精燈上過幾下

根據(jù)染液冒蒸汽的實際情況自行判斷做法）至染料稍冒蒸汽并開始計時，維持

5mino加熱過程中及時補充染液。切勿讓涂片干涸。

4.冷卻后水洗

染色結(jié)束后，待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗載玻片背面；直至流出的水無

色為止。

5、復(fù)染

水洗好后，用番紅水覆蓋菌，染色2mino

6.水洗干燥

復(fù)染結(jié)束后，用緩流水洗載玻片背面，直至流出的水無色為止。然后自然風(fēng)干C

7、鏡檢

將制好的玻片放在顯微鏡下，先低倍鏡，再高倍鏡，最后滴加香柏油用油鏡觀

察芽泡形態(tài)，并記錄。

8、實驗結(jié)束

實驗結(jié)束后，整理實驗臺，儀器歸位，電器拉下電源，擦凈染液。

六、實驗結(jié)果及記錄照片

1.芽抱染色觀察結(jié)果：

顯微鏡視野中，芽胞呈現(xiàn)綠色，菌體呈現(xiàn)淡淡的紅色或者無色透明（番紅水

復(fù)染不成功），亦或者視野中僅有幾個番紅水復(fù)染上了紅色的菌。

枯草芽抱桿菌芽抱呈橢圓到柱狀，位于菌體中央或末端，菌體基本無大變化；梭

狀芽抱桿菌芽胞呈圓形，比菌體粗，位于菌體頂端，使細(xì)菌呈鼓槌狀。

綜合來看，視野中，能看到有的菌中間有較亮且染為綠色的部分，即為芽范。有

的芽抱在菌的中間出現(xiàn)，即中生芽抱；有的芽抱在菌的末端出現(xiàn)，即端生芽抱;

有的芽泡向外膨脹；有的芽泡不向外膨脹；有的芽也游離在菌體之外，估計是操

作中動作較大使得芽把脫落下來。

2、芽泡染色觀察記錄圖：

該圖為梭狀芽泡桿菌的觀察視野。從圖中可以看到第一次孔雀綠染色較好，但

是水洗脫色以及復(fù)染色有點失敗，大部分菌體沒能染上紅色，菌體大部分是綠

色或無色。該圖中能看到幾個染色較好的細(xì)菌，菌體為紅色，內(nèi)含綠色的芽狗,

為中生芽袍。

該圖為枯草芽抱桿菌的觀察視野。圖中可以看到染色較好的綠色芽泡，但是菌

體近乎都為無色的，說明水洗脫色較好但是復(fù)染色不成功。對于菌體沒能復(fù)染

上紅色，有兩大可能原因：一是番紅水濃度低，二是染色時間不夠。

3、全班內(nèi)搜尋好的實驗玻片，進一步觀察芽抱的形態(tài)特征

本實驗圖片從其他組獲得，觀察視野中可以看到一些復(fù)染色較好、呈紫紅色的菌

體，當(dāng)然還有一些菌體是綠色或者無色；芽孑包染色較好，被染成了綠色，但是游

離的芽泡很多，估計有較為嚴(yán)重的不當(dāng)操作致使很多芽泡從菌體中脫落下來。

4、資料查找圖：與自己的實驗結(jié)果進行對比，更進一步了解芽抱形態(tài)特征。

二一端生芽抱

離芽抱

七、實驗結(jié)果分析

L本實驗的觀察結(jié)果：

能較為清楚地觀察到芽泡的存在，而且能觀察到不同的芽抱著生方式。

觀察到不少的芽泡游離在菌體之外，估計和自己的操作有較大關(guān)系，分析此

現(xiàn)象發(fā)生的原因可能布?如下三種：a.由于芽劑較厚，耐壓力細(xì)胞體強，可能由

于在圖片時用力過大，將細(xì)胞體的細(xì)胞壁壓碎從而使的芽抱脫落出來；b.可能

是由于菌體培養(yǎng)時間過久，芽抱正處于復(fù)蘇階段，所以大多數(shù)芽抱都從菌體中

游離出來；c.可能在干燥固定和染色兩個步驟中，加熱的溫度太高使得芽抱從菌

體中裂出。

芽泡染色較好，均為綠色或淺綠色，但是外面的菌體基本上沒染上番紅水的

紅色，但是外面的菌體水洗脫色不錯，在觀察視野中成無色透明狀.

沒能復(fù)染上番紅水的紅色的原因可能有：番紅水是番紅染液的稀釋液，濃度

小不易使菌體染上色；番紅水復(fù)染的時間較短，不足老師要求的2min；水洗后

直接進行復(fù)染，或略了載玻片上的殘余水，沒有先用番紅水沖載玻片而是直接

覆蓋，使得染液濃度又降低。

2.綠色芽抱及紅色菌體的觀察現(xiàn)象分析：

由于芽池壁厚、透性低上不易著色，當(dāng)用番紅、結(jié)晶紫等進行單染色時：菌

體和芽泡囊著色，而芽抱囊內(nèi)的芽也不著色或僅顯很淡的顏色，游離的芽泡呈

淡紅或淡藍紫色的圈。但是用著色力強的染色劑孔雀綠，在加熱條件下染色，使

染料不僅進入菌體也可進入芽泡內(nèi)，菌體的染料經(jīng)水洗后被脫色，而芽抱一經(jīng)

染色便難以被水洗脫。當(dāng)用對比度大的復(fù)染色劑番紅染色后，芽抱仍保留初染劑

孔雀綠的綠色，而菌體和芽泡囊被染成復(fù)染色劑的顏色，使芽抱和菌體更易于

區(qū)分。

3.要保證本實驗獲得成功，必須要注意以下幾點

a.選用適當(dāng)菌齡的菌種，幼齡的尚未形成芽花，而老齡菌芽胞囊已破裂。

b.加熱染色時必須維持在染液微冒蒸汽的狀態(tài)，加熱沸騰會導(dǎo)致菌體或芽劑

囊破裂，如熱不夠則難以著色。

c.脫色必須等玻片冷卻后進行，否則驟然用冷水沖洗會導(dǎo)致玻片破裂。

八、實驗注意事項

1.加熱時使用載玻片夾子或試管夾，以免燙傷。

2.使用染料時一定要注意避免沾到衣物上。

3.載玻片一定要洗凈，自然晾干。

4.向載玻片上滴加兩滴蒸儲水時一定要注意水滴要小。

5.載玻片未干燥固定前，注意水平放置玻片，以防載玻片上的兩滴水滴混合以

至于制片失敗。

6、供芽羯染色用的菌種應(yīng)控制菌齡，使大部分芽抱仍保留在菌體上為宜。

7、制片的干燥固定操作中，注意加熱程度及載玻片溫度，以免加熱溫度太高使

得菌和芽胞裂開。

8、孔雀綠染色計時是從加熱覆蓋了染液的載玻片、看到有蒸汽冒出開始的八

9、孔雀綠染液染色過程中，需加熱，但是不要一直放在酒精燈火焰上加熱，以

防載玻片加熱斷裂，可以在火焰上多過幾下后移開稍稍冷卻。

10、孔雀綠染液染色加熱過程要及時補充染液，切勿讓涂片干涸。

11.補充染液，需要先將載玻片從酒精燈火焰上移開，等待稍稍冷卻后再向載

玻片上滴加孔雀綠染液，以防冷的染液遇到熱的載玻片使得載玻片斷裂。

12.本次實驗中，水洗均沖洗載玻片無菌面。

13.實驗中，圖片時要動作輕緩，以防因動作太大而使得芽狗從菌體上脫落下

來。

14、孔雀綠染液染色過程中，要注意不能持久加熱，會使得載玻片溫度很高,

溫度很高容易使得芽胞和菌體裂開。

15.孔雀綠染液加熱染色后，需要將載玻片冷卻一小段時間后再水洗，以防熱

的載玻片突然遇到冷的水流發(fā)生斷裂。

16.注意兩次染色的時間。

17、番紅水復(fù)染并水洗干凈后，一定要自然晾干載玻片。

18、鏡檢時，先低倍鏡，再高倍鏡，最后滴加香柏油換為油鏡。

19、實驗后洗干凈手再離開。

九、實驗思考題

1.用簡單染色法能否觀察到細(xì)菌的芽泡?說明原因。

答：不能。細(xì)菌的芽抱具有厚而致密的壁。透性低，不易著色，若用一般染色法

只能使菌體著色而芽也不著色（芽抱呈無色透明狀）。

2.為什么芽農(nóng)染色需要進行加熱？

答：芽也壁厚，透性低，不易著色。加熱條件下染色，染料可以進入菌體內(nèi)，

也可以進入芽狗。

3.用孔雀綠初染芽抱后，為什么必須等載玻片冷卻后再用水沖洗？

答：若玻片不冷卻就直接沖洗，會因為突然遇冷而炸裂。

4.細(xì)菌芽抱用孔雀綠染色并加熱時，為什么不能蒸干染液？

答：加熱染色都不能把染料蒸干,染料被蒸干后積聚在玻片以及菌體上，干擾

光線穿透影響鏡卜觀察菌體結(jié)構(gòu)情況。

5.若在視野中多看到游離的芽抱，而很少看到芽抱囊和營養(yǎng)細(xì)胞，試分析原因。

答：a.由于芽抱較厚，耐壓力細(xì)胞體強，可能由于在圖片時用力過大，將細(xì)

胞體的細(xì)胞壁壓碎從而使的芽胞脫落出來。

b.可能是由于菌體培養(yǎng)時間過久，芽泡正處于復(fù)蘇階段，所以大多數(shù)芽

抱都