發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒感染宿主的miRNA表達(dá)譜特征及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SevereFeverwithThrombocytopeniaSyndromeVirus，SFTSV）是一種對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅的病毒。2009年，中國首次發(fā)現(xiàn)了發(fā)熱伴血小板減少綜合征（SevereFeverwithThrombocytopeniaSyndrome，SFTS），并從患者體內(nèi)分離出了SFTSV，它屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，是一種新型病毒。此后，在亞洲其他國家如日本和韓國也有相關(guān)病例報(bào)道，這表明該病毒的影響范圍逐漸擴(kuò)大。SFTSV主要通過蜱蟲叮咬傳播，蜱蟲廣泛存在于丘陵、山地、森林等自然環(huán)境中，當(dāng)它們叮咬感染病毒的動(dòng)物后再叮咬人類，就可能將病毒傳播給人類。此外，直接接觸病人血液或血性分泌物也可導(dǎo)致感染。這種傳播途徑使得病毒在一定范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的傳播能力，增加了防控的難度。SFTSV感染人體后，會(huì)引發(fā)一系列嚴(yán)重的癥狀，患者通常急性起病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱，體溫多在38℃以上，重者持續(xù)高熱，可達(dá)40℃以上，部分病例熱程可長達(dá)10天以上。同時(shí)，還伴有乏力、明顯納差、惡心、嘔吐等癥狀，部分病例有頭痛、肌肉酸痛、腹瀉等。少數(shù)病例病情危重，會(huì)出現(xiàn)意識(shí)障礙、皮膚瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼吸衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC）等多臟器功能衰竭死亡。據(jù)統(tǒng)計(jì)，SFTS的病死率在不同地區(qū)有所差異，部分地區(qū)高達(dá)30%，這給患者的生命健康帶來了極大的危害，也對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類長度為21-23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子。1993年，科學(xué)家在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)miRNA，此后，隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)miRNA在真核生物中廣泛存在。miRNA的作用機(jī)制主要是通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）完全或部分互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，會(huì)抑制靶mRNA的翻譯過程，使其無法正常合成蛋白質(zhì)，或者直接導(dǎo)致靶mRNA的降解，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。在病毒感染研究領(lǐng)域，miRNA發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。一方面，宿主細(xì)胞可以通過表達(dá)特定的miRNA來應(yīng)對(duì)病毒感染，這些miRNA可以直接作用于病毒的基因組或病毒基因表達(dá)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制病毒的復(fù)制和傳播。例如，某些miRNA可以與病毒的mRNA結(jié)合，阻止病毒蛋白的合成，從而限制病毒的增殖。另一方面，病毒也會(huì)利用宿主細(xì)胞的miRNA來促進(jìn)自身的感染和生存，它們可能通過調(diào)控宿主細(xì)胞miRNA的表達(dá)，改變細(xì)胞的生理狀態(tài)，為病毒的感染創(chuàng)造有利條件。此外，miRNA還參與了宿主的免疫應(yīng)答過程，它可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化、活化和細(xì)胞因子的分泌，影響機(jī)體對(duì)病毒感染的免疫反應(yīng)。因此，研究病毒感染過程中宿主相關(guān)miRNA的表達(dá)譜變化，對(duì)于深入了解病毒的致病機(jī)制、宿主的免疫防御機(jī)制以及開發(fā)新的診斷和治療方法具有重要意義。在SFTSV感染的研究中，探討宿主相關(guān)miRNA表達(dá)譜的變化及其作用機(jī)制，將有助于揭示SFTSV的致病機(jī)理，尋找潛在的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，為防控SFTSV感染提供新的思路和方法。1.2研究目的與意義本研究旨在全面、系統(tǒng)地分析SFTSV感染過程中宿主相關(guān)miRNA的表達(dá)譜變化。通過運(yùn)用先進(jìn)的生物信息技術(shù)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，深入探究這些miRNA在SFTSV感染中的作用機(jī)制，明確它們是如何參與病毒的復(fù)制、傳播以及宿主的免疫應(yīng)答等過程。同時(shí)，鑒定出與病毒感染和宿主免疫密切相關(guān)的關(guān)鍵miRNA，為后續(xù)的研究提供重要的靶點(diǎn)和方向。對(duì)SFTSV感染中宿主相關(guān)miRNA表達(dá)譜的研究具有多方面的重要意義。從揭示病毒致病機(jī)制的角度來看，miRNA在病毒與宿主相互作用中扮演著關(guān)鍵角色。通過研究其表達(dá)譜變化，我們能夠深入了解病毒感染后如何影響宿主細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而揭示病毒導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病的分子機(jī)制。這有助于我們從分子層面認(rèn)識(shí)SFTSV的致病過程，為開發(fā)針對(duì)性的治療策略提供理論基礎(chǔ)。在尋找診斷標(biāo)志物方面，由于miRNA具有穩(wěn)定存在于血清等體液中的特性，且其表達(dá)水平在病毒感染后會(huì)發(fā)生顯著變化，因此有望成為SFTS的新型診斷標(biāo)志物。通過檢測(cè)特定miRNA的表達(dá)水平，我們可以實(shí)現(xiàn)對(duì)SFTS的早期診斷，提高診斷的準(zhǔn)確性和及時(shí)性，為患者的早期治療爭(zhēng)取寶貴時(shí)間。在治療靶點(diǎn)的探索上，明確與SFTSV感染相關(guān)的關(guān)鍵miRNA后，我們可以將其作為潛在的治療靶點(diǎn)，開發(fā)針對(duì)這些miRNA的治療方法，如通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)水平來抑制病毒的復(fù)制，或者增強(qiáng)宿主的免疫應(yīng)答，從而為SFTS的治療提供新的途徑和方法，改善患者的預(yù)后。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究采用了多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，以確保研究的科學(xué)性和可靠性。在樣本采集方面，收集了發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒感染急性期患者的血清樣本以及正常人的血清樣本作為對(duì)照。同時(shí)，獲取了病毒感染的細(xì)胞樣本，如THP-1細(xì)胞，以及未感染的正常細(xì)胞樣本。在樣本采集過程中，嚴(yán)格遵循相關(guān)的倫理規(guī)范和操作流程，確保樣本的質(zhì)量和安全性。芯片檢測(cè)用于獲取血清和細(xì)胞中miRNA的表達(dá)譜。使用TaqMan低密度芯片對(duì)血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，該芯片能夠同時(shí)檢測(cè)大量的miRNA，具有高通量、準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)。對(duì)于細(xì)胞樣本，則采用miRNA芯片進(jìn)行檢測(cè)，通過將細(xì)胞中的RNA提取、標(biāo)記后與芯片上的探針雜交，檢測(cè)miRNA的表達(dá)水平，從而全面了解病毒感染后宿主細(xì)胞中miRNA表達(dá)的變化情況。為了驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用了qRT-PCR（實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù)對(duì)部分差異表達(dá)明顯的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。提取樣本中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。通過檢測(cè)擴(kuò)增過程中的熒光信號(hào)強(qiáng)度，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，精確測(cè)定miRNA的表達(dá)量，與芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，確保研究結(jié)果的可靠性。在生物信息學(xué)分析方面，運(yùn)用多種生物信息學(xué)工具和數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行功能預(yù)測(cè)和分析。利用TargetScan、miRanda等軟件預(yù)測(cè)miRNA的靶基因，這些軟件基于miRNA與靶基因之間的互補(bǔ)配對(duì)原則，通過算法預(yù)測(cè)可能的靶基因。然后，使用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)靶基因進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。GO功能富集分析可以確定靶基因在生物過程、細(xì)胞組成和分子功能等方面的主要功能，KEGG通路富集分析則能夠明確靶基因參與的主要信號(hào)通路，從而深入了解差異表達(dá)miRNA在病毒感染過程中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制。本研究的技術(shù)路線如下：首先進(jìn)行樣本的采集與處理，獲取高質(zhì)量的血清和細(xì)胞樣本；接著利用芯片技術(shù)對(duì)樣本中的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行全面檢測(cè)；然后通過qRT-PCR驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果；最后運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行深入分析，從而揭示SFTSV感染中宿主相關(guān)miRNA表達(dá)譜的變化及其作用機(jī)制。二、發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒概述2.1SFTSV的發(fā)現(xiàn)與命名2006年，我國大別山區(qū)發(fā)現(xiàn)了一種不明原因的傳染病，患者臨床癥狀缺乏特異性，多數(shù)表現(xiàn)為發(fā)熱、疲乏，血小板和白細(xì)胞減少，部分患者還伴有胃腸道癥狀。由于當(dāng)時(shí)病原學(xué)不明確，臨床癥狀又不典型，加上對(duì)該疾病認(rèn)識(shí)不足，導(dǎo)致診斷困難。起初，一起聚集病例中檢測(cè)出“無形體”DNA，因此被誤認(rèn)為是病原體，后續(xù)病例也被誤診為“無形體病”。但在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，臨床診斷為無形體病患者的血液中，檢測(cè)不到無形體的DNA，這使得研究人員開始懷疑該疾病并非無形體感染所致。2009年，中國疾病預(yù)防控制中心通過國家引進(jìn)的旅美學(xué)者、得克薩斯大學(xué)于學(xué)杰教授研究小組的探索研究，率先發(fā)現(xiàn)了一種新型布尼亞病毒。為了成功分離病原體，研究團(tuán)隊(duì)采用了多種細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)。最終，細(xì)胞DH82在接種病人血液后產(chǎn)生了明顯病變，研究人員意識(shí)到分離到了病原體。經(jīng)電子顯微鏡觀察，證實(shí)該病原體是一種病毒，再通過基因測(cè)序，確定其為一種新的布尼亞病毒。2010年5月，中國疾控中心將該類病例定義為“發(fā)熱伴血小板減少綜合征”，并開展了病例的主動(dòng)發(fā)現(xiàn)、搜索等監(jiān)測(cè)工作。同年8月，中國疾控中心病毒病所所長李德新帶領(lǐng)實(shí)驗(yàn)室科研人員，從來自湖北、河南、山東、江蘇、安徽和遼寧6省病人血清中分離到一株病毒，并完成了病毒的全基因序列測(cè)定和同源性比較。通過對(duì)病毒基因結(jié)構(gòu)和形態(tài)特征的詳細(xì)分析，進(jìn)一步確定該病毒為一種新型布尼亞病毒。同時(shí)，中國疾控中心病毒病所檢測(cè)了600余份患者或健康人的血清，用大量病例證明了新布尼亞病毒和發(fā)熱伴血小板減少綜合征的因果關(guān)系。由于該病毒主要引起以發(fā)熱、血小板減少和白細(xì)胞減少為主要臨床表現(xiàn)的疾病，故被命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SevereFeverwithThrombocytopeniaSyndromeVirus，SFTSV），其所引發(fā)的疾病則被命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征（SevereFeverwithThrombocytopeniaSyndrome，SFTS）。這一命名直觀地反映了病毒所導(dǎo)致疾病的主要臨床特征，有助于臨床醫(yī)生和研究人員對(duì)該疾病的快速識(shí)別和研究。此后，圍繞SFTSV的研究逐漸展開，人們對(duì)其傳播途徑、致病機(jī)制、流行病學(xué)特征等方面的認(rèn)識(shí)也在不斷深入。2.2SFTSV的生物學(xué)特性2.2.1病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，其病毒粒子呈球形，直徑約為80-100nm。病毒粒子最外層包裹著一層脂質(zhì)包膜，這層包膜對(duì)于維持病毒的結(jié)構(gòu)完整性以及病毒與宿主細(xì)胞的相互作用起著重要作用。在包膜表面，分布著許多由糖蛋白形成的棘突，這些棘突不僅是病毒識(shí)別和吸附宿主細(xì)胞的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，還參與了病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程。SFTSV的基因組較為獨(dú)特，由三個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段組成，分別是大（L）、中（M）、?。⊿）片段。L片段長度約為6368個(gè)核苷酸，在病毒的生命活動(dòng)中扮演著核心角色，它包含單一讀碼框架，編碼RNA依賴的RNA聚合酶。這種聚合酶在病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中至關(guān)重要，負(fù)責(zé)以病毒RNA為模板合成新的RNA鏈，確保病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄順利進(jìn)行，從而維持病毒的增殖和傳播。M片段全長約3378個(gè)核苷酸，同樣含有單一的讀碼框架，編碼一個(gè)由1073個(gè)氨基酸組成的糖蛋白前體。這個(gè)糖蛋白前體在病毒的組裝和感染過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，它會(huì)經(jīng)過一系列的加工和修飾，最終形成具有功能的糖蛋白，這些糖蛋白不僅參與病毒粒子的組裝，還與病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附和侵入密切相關(guān)。S片段是一個(gè)雙義RNA，這意味著它可以以雙向的方式編碼病毒核蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。核蛋白對(duì)于保護(hù)病毒的基因組、維持病毒粒子的穩(wěn)定性以及參與病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程具有重要意義；而非結(jié)構(gòu)蛋白則在病毒感染宿主細(xì)胞后的一系列生物學(xué)過程中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用，如干擾宿主細(xì)胞的正常生理功能，為病毒的生存和繁殖創(chuàng)造有利條件。2.2.2病毒基因組與編碼蛋白病毒基因組的L片段編碼的RNA依賴的RNA聚合酶，是病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵酶。在病毒感染宿主細(xì)胞后，該聚合酶首先以病毒的負(fù)鏈RNA為模板，合成正鏈RNA。這些正鏈RNA一方面可以作為mRNA，指導(dǎo)病毒蛋白的合成；另一方面，又可以作為模板，在聚合酶的作用下合成更多的負(fù)鏈RNA，用于組裝新的病毒粒子。這種以RNA為模板合成RNA的過程，與宿主細(xì)胞內(nèi)以DNA為模板合成RNA的轉(zhuǎn)錄過程不同，是RNA病毒特有的遺傳信息傳遞方式。M片段編碼的糖蛋白前體經(jīng)過復(fù)雜的加工過程，最終形成成熟的糖蛋白，這些糖蛋白主要分布在病毒粒子的表面。在病毒感染宿主細(xì)胞時(shí)，糖蛋白首先與宿主細(xì)胞表面的受體分子發(fā)生特異性結(jié)合，這種結(jié)合是病毒感染的起始步驟，決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性。例如，研究發(fā)現(xiàn)SFTSV的糖蛋白能夠與宿主細(xì)胞表面的某些整合素分子結(jié)合，從而介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞。隨后，糖蛋白會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，促使病毒包膜與宿主細(xì)胞膜融合，將病毒的基因組釋放到宿主細(xì)胞內(nèi)，啟動(dòng)病毒的感染過程。S片段編碼的核蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染過程中也發(fā)揮著重要作用。核蛋白能夠與病毒的RNA緊密結(jié)合，形成核糖核蛋白復(fù)合物，保護(hù)病毒的RNA免受宿主細(xì)胞內(nèi)核酸酶的降解，同時(shí)也為病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制提供了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。非結(jié)構(gòu)蛋白則具有多種功能，一方面，它可以干擾宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答信號(hào)通路，抑制宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒免疫反應(yīng)。研究表明，SFTSV的非結(jié)構(gòu)蛋白能夠抑制宿主細(xì)胞內(nèi)干擾素的產(chǎn)生和信號(hào)傳導(dǎo)，使宿主細(xì)胞無法及時(shí)啟動(dòng)有效的抗病毒防御機(jī)制；另一方面，非結(jié)構(gòu)蛋白還參與調(diào)節(jié)病毒基因的表達(dá)和病毒粒子的組裝過程，對(duì)病毒的生命周期具有重要的調(diào)控作用。2.3SFTS的流行病學(xué)特征2.3.1地理分布發(fā)熱伴血小板減少綜合征（SFTS）在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出一定的地域分布特點(diǎn)。在亞洲，中國是SFTS病例報(bào)告較多的國家之一，截至目前，已有河南、湖北、山東、安徽、遼寧、浙江和江蘇等27個(gè)省份報(bào)告了SFTS病例。這些省份的病例分布呈現(xiàn)出明顯的區(qū)域聚集性，主要集中在山區(qū)和丘陵地帶。例如，河南、湖北、安徽等省份的山區(qū)，由于其地形地貌適合蜱蟲的生存和繁殖，為SFTSV的傳播提供了有利條件。此外，韓國、日本、越南、緬甸、泰國和巴基斯坦等東亞及東南亞國家也已發(fā)現(xiàn)SFTS病例。在這些國家，SFTS的流行區(qū)域也多處于溫帶或亞熱帶氣候區(qū)，主要散發(fā)于以灌木叢、草地等植被類型覆蓋的山區(qū)和丘陵地區(qū)。從全球范圍來看，SFTS的分布與蜱蟲的分布密切相關(guān)。蜱蟲作為SFTSV的主要傳播媒介，廣泛分布于世界各地的自然環(huán)境中。在歐洲、北美洲等地，雖然尚未有大規(guī)模的SFTS病例報(bào)告，但蜱蟲的存在使得這些地區(qū)存在潛在的傳播風(fēng)險(xiǎn)。隨著全球氣候變化和人類活動(dòng)范圍的擴(kuò)大，蜱蟲的分布范圍可能會(huì)發(fā)生改變，從而增加SFTS在其他地區(qū)傳播的可能性。2.3.2傳播途徑SFTSV的傳播途徑主要包括蜱蟲叮咬傳播和接觸傳播。蜱蟲是SFTSV的主要儲(chǔ)存宿主和傳播媒介，在中國，傳播SFTSV最主要的媒介是長角血蜱。蜱蟲的生活史包括卵、幼蟲、若蟲和成蟲四個(gè)階段，在其生長發(fā)育過程中，需要吸食動(dòng)物或人類的血液。當(dāng)蜱蟲叮咬感染SFTSV的動(dòng)物后，病毒會(huì)在蜱蟲體內(nèi)復(fù)制繁殖，然后當(dāng)蜱蟲再次叮咬人類時(shí)，就可能將病毒傳播給人類。蜱蟲通常棲息在草地、樹林等環(huán)境中，人們?cè)趹敉饣顒?dòng)時(shí)，如登山、踏青、務(wù)農(nóng)等，容易被蜱蟲叮咬，從而感染病毒。接觸傳播也是SFTSV的重要傳播途徑之一。直接接觸患者的血液、體液、分泌物、排泄物或氣溶膠可以引起人際傳播。在醫(yī)院環(huán)境中，醫(yī)護(hù)人員、陪護(hù)人員如果接觸患者的血液、體液等時(shí)未采取適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施，就有可能被感染。例如，在對(duì)患者進(jìn)行護(hù)理、治療等操作時(shí)，如果手部有破損，接觸到患者的血液，就可能導(dǎo)致病毒進(jìn)入體內(nèi)。此外，已有貓狗等寵物-人之間傳播的報(bào)道，寵物主人或獸醫(yī)在接觸感染病毒的寵物時(shí)，也存在感染的風(fēng)險(xiǎn)。2.3.3易感人群與發(fā)病季節(jié)人群對(duì)SFTSV普遍易感，在丘陵、山地、森林等地區(qū)生活、生產(chǎn)的居民和勞動(dòng)者以及赴該類地區(qū)戶外活動(dòng)的旅游者感染風(fēng)險(xiǎn)均較高。中老年人是主要發(fā)病人群，這可能與中老年人的免疫力相對(duì)較低，且戶外活動(dòng)較多有關(guān)。在這些地區(qū)生活的居民，長期暴露在蜱蟲的生存環(huán)境中，增加了被蜱蟲叮咬的機(jī)會(huì)；而勞動(dòng)者在從事農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等活動(dòng)時(shí)，也更容易接觸到蜱蟲。此外，醫(yī)務(wù)和陪護(hù)人員接觸病人時(shí)如未采取個(gè)人防護(hù)措施，接觸病人的血液、體液、血性分泌物、排泄物及被其污染的環(huán)境和物品時(shí)也有感染該疾病的風(fēng)險(xiǎn)。SFTS全年均可發(fā)病，但具有明顯的季節(jié)性，4-10月為該病流行期，5-7月為發(fā)病高峰期。這與蜱蟲的活動(dòng)規(guī)律密切相關(guān)，春秋季是蜱蟲的活動(dòng)高峰，此時(shí)蜱蟲的繁殖和覓食活動(dòng)頻繁，人們被蜱蟲叮咬的概率增加，從而導(dǎo)致SFTS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)上升。而在冬季，蜱蟲基本不活動(dòng)，SFTS的發(fā)病病例相對(duì)較少。2.4SFTS的臨床表現(xiàn)與診斷2.4.1臨床癥狀發(fā)熱伴血小板減少綜合征（SFTS）的臨床癥狀表現(xiàn)多樣，且具有一定的復(fù)雜性。發(fā)熱是SFTS最為常見的首發(fā)癥狀，患者通常急性起病，體溫多在38℃以上，重者持續(xù)高熱，可達(dá)40℃以上，部分病例熱程可長達(dá)10天以上。這種高熱狀態(tài)會(huì)給患者的身體帶來極大的消耗，導(dǎo)致患者出現(xiàn)乏力、精神萎靡等全身癥狀。血小板減少和白細(xì)胞減少也是SFTS的重要臨床表現(xiàn)之一。血小板減少會(huì)導(dǎo)致患者的凝血功能出現(xiàn)異常，容易出現(xiàn)出血傾向，如皮膚瘀斑、牙齦出血、鼻出血等。白細(xì)胞減少則會(huì)削弱患者的免疫防御能力，使患者更容易受到各種病原體的感染，增加感染性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。胃腸道癥狀在SFTS患者中也較為常見，主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、食欲不振、腹瀉等。這些癥狀會(huì)影響患者的營養(yǎng)攝入和消化吸收，進(jìn)一步加重患者的身體虛弱狀態(tài)。嚴(yán)重的胃腸道癥狀還可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)脫水、電解質(zhì)紊亂等并發(fā)癥，對(duì)患者的生命健康造成嚴(yán)重威脅。在一些重癥患者中，還會(huì)出現(xiàn)意識(shí)障礙，表現(xiàn)為嗜睡、昏迷、譫妄等。這是由于病毒感染導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)受損，影響了大腦的正常功能。意識(shí)障礙的出現(xiàn)往往提示患者的病情較為嚴(yán)重，預(yù)后較差。此外，部分患者還可能出現(xiàn)呼吸衰竭、急性腎損傷等嚴(yán)重并發(fā)癥，這些并發(fā)癥會(huì)進(jìn)一步加重患者的病情，導(dǎo)致多臟器功能衰竭，最終危及患者的生命。2.4.2實(shí)驗(yàn)室診斷方法病毒分離是SFTS診斷的金標(biāo)準(zhǔn)之一。在實(shí)驗(yàn)室中，通常將患者的血液、組織等樣本接種到敏感細(xì)胞系中，如Vero細(xì)胞、DH82細(xì)胞等，進(jìn)行病毒培養(yǎng)。如果樣本中存在SFTSV，病毒會(huì)在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制繁殖，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)病變，通過觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），可以初步判斷是否存在病毒感染。然后，再通過免疫熒光、核酸測(cè)序等方法對(duì)分離到的病毒進(jìn)行鑒定，以確定是否為SFTSV。病毒分離雖然準(zhǔn)確性高，但操作復(fù)雜、耗時(shí)較長，且對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件和技術(shù)要求較高，一般僅在科研和專業(yè)的病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室中開展。核酸檢測(cè)是目前SFTS診斷中常用的方法之一，其中實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）應(yīng)用最為廣泛。該方法的原理是利用逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在擴(kuò)增過程中，加入特異性的熒光探針，當(dāng)探針與目標(biāo)核酸序列結(jié)合時(shí)，會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，精確測(cè)定樣本中病毒核酸的含量。RT-qPCR具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，能夠在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量樣本進(jìn)行檢測(cè)，適用于臨床診斷和疫情監(jiān)測(cè)。此外，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）也逐漸應(yīng)用于SFTS的核酸檢測(cè)。LAMP技術(shù)在恒溫條件下即可進(jìn)行核酸擴(kuò)增，不需要昂貴的PCR儀器，具有操作簡單、快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。血清學(xué)檢測(cè)主要是檢測(cè)患者血清中的特異性抗體，包括IgM和IgG抗體。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是常用的血清學(xué)檢測(cè)方法之一，其原理是將病毒抗原包被在酶標(biāo)板上，加入患者血清，若血清中含有特異性抗體，抗體就會(huì)與抗原結(jié)合，然后加入酶標(biāo)記的二抗，通過底物顯色反應(yīng)來檢測(cè)抗體的存在。IgM抗體通常在感染后早期出現(xiàn)，可作為早期診斷的指標(biāo)；IgG抗體則在感染后期出現(xiàn)，且持續(xù)時(shí)間較長，可用于回顧性診斷和流行病學(xué)調(diào)查。免疫熒光試驗(yàn)（IFA）也是一種常用的血清學(xué)檢測(cè)方法，該方法利用熒光素標(biāo)記的特異性抗體與患者血清中的抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)，從而判斷抗體的存在。IFA具有較高的靈敏度和特異性，但操作相對(duì)復(fù)雜，需要專業(yè)的設(shè)備和技術(shù)人員。2.5SFTSV的致病機(jī)理研究進(jìn)展SFTSV感染宿主細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜且有序的過程，這一過程始于病毒表面糖蛋白與宿主細(xì)胞表面受體的特異性識(shí)別與結(jié)合。研究表明，SFTSV的糖蛋白能夠與宿主細(xì)胞表面的整合素分子等受體發(fā)生相互作用，這種特異性結(jié)合是病毒感染的起始關(guān)鍵步驟，它決定了病毒能夠進(jìn)入哪些類型的宿主細(xì)胞，從而影響病毒的組織嗜性和感染范圍。在結(jié)合之后，病毒通過內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞。內(nèi)吞作用是細(xì)胞攝取大分子和顆粒物質(zhì)的一種方式，SFTSV利用這一細(xì)胞生理過程，被包裹在細(xì)胞膜內(nèi)陷形成的囊泡中進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。進(jìn)入細(xì)胞后，病毒粒子在囊泡內(nèi)經(jīng)歷一系列的變化，病毒包膜與囊泡膜發(fā)生融合，將病毒的基因組釋放到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。一旦病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，就會(huì)啟動(dòng)病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程。病毒的L片段編碼的RNA依賴的RNA聚合酶發(fā)揮核心作用，以病毒的負(fù)鏈RNA為模板，合成正鏈RNA。這些正鏈RNA一方面作為mRNA，指導(dǎo)病毒蛋白的合成；另一方面又作為模板，合成更多的負(fù)鏈RNA，用于組裝新的病毒粒子。在病毒蛋白合成過程中，宿主細(xì)胞的核糖體、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA等翻譯機(jī)器被病毒利用，按照病毒mRNA的指令合成各種病毒蛋白，包括核蛋白、糖蛋白等。新合成的病毒蛋白和RNA在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行組裝，形成新的病毒粒子。組裝完成的病毒粒子通過出芽的方式從宿主細(xì)胞釋放出來，繼續(xù)感染其他細(xì)胞，從而擴(kuò)大病毒的感染范圍。SFTSV感染對(duì)宿主免疫系統(tǒng)造成了多方面的損害。在固有免疫方面，病毒感染能夠抑制宿主細(xì)胞產(chǎn)生干擾素。干擾素是宿主細(xì)胞在病毒感染等刺激下產(chǎn)生的一類具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等功能的細(xì)胞因子，它能夠激活細(xì)胞內(nèi)的抗病毒信號(hào)通路，抑制病毒的復(fù)制。然而，SFTSV的非結(jié)構(gòu)蛋白可以干擾宿主細(xì)胞內(nèi)干擾素的產(chǎn)生和信號(hào)傳導(dǎo)，使宿主細(xì)胞無法及時(shí)啟動(dòng)有效的抗病毒防御機(jī)制。在適應(yīng)性免疫方面，SFTSV感染會(huì)影響T細(xì)胞和B細(xì)胞的功能。研究發(fā)現(xiàn)，感染SFTSV后，患者體內(nèi)T細(xì)胞的活化和增殖受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能下降。同時(shí)，B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力也受到影響，體液免疫功能受損。這使得宿主難以有效地清除病毒，導(dǎo)致病毒在體內(nèi)持續(xù)存在和擴(kuò)散。造血系統(tǒng)也是SFTSV感染的重要靶標(biāo)之一。病毒感染會(huì)導(dǎo)致血小板減少，其機(jī)制可能與病毒直接感染骨髓中的巨核細(xì)胞有關(guān)。巨核細(xì)胞是產(chǎn)生血小板的前體細(xì)胞，病毒感染后，會(huì)影響巨核細(xì)胞的正常發(fā)育和功能，使其產(chǎn)生血小板的能力下降。此外，病毒感染還可能引發(fā)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致血小板被免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤地識(shí)別和破壞，進(jìn)一步加重血小板減少的程度。白細(xì)胞減少也是SFTSV感染的常見表現(xiàn)。病毒感染骨髓中的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞，干擾了它們向白細(xì)胞分化和成熟的過程，從而導(dǎo)致白細(xì)胞數(shù)量減少。白細(xì)胞在機(jī)體的免疫防御中起著至關(guān)重要的作用，白細(xì)胞減少會(huì)削弱機(jī)體的免疫功能，使患者更容易受到其他病原體的感染。三、miRNA相關(guān)研究進(jìn)展3.1miRNA概述微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類長度約為21-23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子。1993年，科學(xué)家在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)miRNA——lin-4，開啟了miRNA研究的序幕。此后，隨著研究技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)，目前在人類中已鑒定出數(shù)千種miRNA。miRNA廣泛存在于各種生物體內(nèi)，從低等的線蟲、果蠅到高等的哺乳動(dòng)物，乃至植物中都有miRNA的身影。在人體中，幾乎所有的細(xì)胞類型都表達(dá)miRNA，它們參與了眾多重要的生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝以及發(fā)育等。以細(xì)胞分化為例，在胚胎發(fā)育過程中，特定的miRNA會(huì)在不同的細(xì)胞分化階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，調(diào)控細(xì)胞向特定的方向分化，確保組織和器官的正常發(fā)育。研究表明，miR-1和miR-133在骨骼肌的分化過程中起著重要的調(diào)控作用，它們能夠調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞的分化和成熟。在細(xì)胞凋亡過程中，miRNA也發(fā)揮著不可或缺的作用。某些miRNA可以通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序。比如，miR-21被發(fā)現(xiàn)能夠抑制細(xì)胞凋亡，它可以通過靶向凋亡相關(guān)基因，降低其表達(dá)水平，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，維持細(xì)胞的存活。3.2miRNA的結(jié)構(gòu)與加工成熟過程3.2.1miRNA的基因結(jié)構(gòu)miRNA基因在基因組中的位置具有多樣性，它們可以位于基因間區(qū)域，即兩個(gè)蛋白編碼基因之間的非編碼DNA序列中；也可以位于蛋白編碼基因的內(nèi)含子區(qū)域，甚至部分miRNA基因會(huì)與蛋白編碼基因存在重疊。例如，在人類基因組中，約有50%的miRNA基因位于基因間區(qū)域，這些基因間的miRNA基因擁有自己獨(dú)立的啟動(dòng)子區(qū)域，能夠獨(dú)立進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。而位于內(nèi)含子區(qū)域的miRNA基因，其轉(zhuǎn)錄過程通常與宿主基因的轉(zhuǎn)錄緊密相關(guān)，它們會(huì)隨著宿主基因的轉(zhuǎn)錄而被轉(zhuǎn)錄出來，然后再經(jīng)過一系列的加工過程形成成熟的miRNA。miRNA基因具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。其初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）是一段較長的RNA序列，長度通常在幾百到幾千個(gè)核苷酸不等。pri-miRNA具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)對(duì)于miRNA的后續(xù)加工和成熟起著關(guān)鍵作用。在莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，雙鏈部分由互補(bǔ)的核苷酸序列形成，而環(huán)的部分則是一段單鏈核苷酸序列。研究表明，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和特定的核苷酸序列對(duì)于Drosha酶的識(shí)別和切割至關(guān)重要，只有具有合適結(jié)構(gòu)的pri-miRNA才能被正確加工。此外，miRNA基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含多種順式作用元件，如TATA盒、CCAAT盒等，這些元件可以與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控miRNA基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率。不同的miRNA基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件組合和分布存在差異，這使得它們對(duì)不同的轉(zhuǎn)錄因子具有不同的親和力，從而實(shí)現(xiàn)了miRNA基因表達(dá)的特異性調(diào)控。3.2.2miRNA的轉(zhuǎn)錄與加工miRNA的轉(zhuǎn)錄過程主要由RNA聚合酶Ⅱ負(fù)責(zé)。在細(xì)胞核內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞接收到特定的信號(hào)或處于特定的生理狀態(tài)時(shí)，RNA聚合酶Ⅱ會(huì)識(shí)別miRNA基因的啟動(dòng)子區(qū)域，與相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程。以胚胎發(fā)育過程為例，在胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的過程中，特定的轉(zhuǎn)錄因子會(huì)被激活，它們與miRNA基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合，招募RNA聚合酶Ⅱ，啟動(dòng)與神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)的miRNA基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的pri-miRNA需要經(jīng)過一系列復(fù)雜的加工過程才能成為成熟的miRNA。首先，pri-miRNA會(huì)被一種名為Drosha的核糖核酸酶Ⅲ類核酸內(nèi)切酶識(shí)別并切割。Drosha通常與DGCR8蛋白形成復(fù)合物，共同發(fā)揮作用。DGCR8蛋白能夠識(shí)別pri-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并引導(dǎo)Drosha在特定的位置進(jìn)行切割，將pri-miRNA加工成長度約為70-100個(gè)核苷酸的前體miRNA（pre-miRNA）。這一過程具有高度的特異性，Drosha-DGCR8復(fù)合物能夠準(zhǔn)確地識(shí)別pri-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)特征，確保切割位點(diǎn)的準(zhǔn)確性，從而保證pre-miRNA的正確生成。pre-miRNA形成后，會(huì)通過Exportin-5蛋白在消耗能量（GTP水解）的方式下，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。Exportin-5蛋白具有識(shí)別pre-miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的能力，它與pre-miRNA結(jié)合形成復(fù)合物，然后通過核孔復(fù)合體穿越核膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA會(huì)被另一種核糖核酸酶Dicer識(shí)別并進(jìn)一步切割。Dicer酶能夠?qū)re-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)切割成約為21-23個(gè)核苷酸長度的雙鏈miRNA。雙鏈miRNA中的一條鏈會(huì)進(jìn)入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，這條鏈被稱為引導(dǎo)鏈（guidestrand），而另一條鏈則被稱為乘客鏈（passengerstrand），通常會(huì)被降解。進(jìn)入RISC的引導(dǎo)鏈可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別并結(jié)合靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR），從而對(duì)靶mRNA的翻譯過程進(jìn)行抑制，或者直接導(dǎo)致靶mRNA的降解，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。3.3miRNA作用機(jī)制3.3.1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控miRNA主要通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'UTR部分互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，會(huì)抑制靶mRNA的翻譯過程。這一過程涉及到多個(gè)蛋白質(zhì)因子的參與，其中RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）起著核心作用。RISC中包含Ago蛋白、Dicer酶等成分，當(dāng)miRNA與Ago蛋白結(jié)合形成RISC后，RISC會(huì)識(shí)別并結(jié)合靶mRNA。在結(jié)合過程中，miRNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶mRNA的3'UTR區(qū)域相互作用，阻止核糖體與靶mRNA的結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)的合成。以miR-122為例，它在肝細(xì)胞中高表達(dá)，能夠與丙型肝炎病毒（HCV）的mRNA的3'UTR互補(bǔ)配對(duì)，抑制HCVmRNA的翻譯，從而減少病毒蛋白的合成，抑制病毒的復(fù)制。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'UTR完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致靶mRNA的降解。在這種情況下，RISC中的Ago蛋白具有核酸內(nèi)切酶活性，能夠在miRNA與靶mRNA互補(bǔ)配對(duì)的位點(diǎn)處切割靶mRNA，使其降解成小片段。這些小片段會(huì)進(jìn)一步被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降解，從而徹底清除靶mRNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。例如，在果蠅中，某些miRNA能夠與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)，通過RISC的作用切割靶mRNA，從而調(diào)節(jié)果蠅的發(fā)育過程。3.3.2對(duì)基因表達(dá)的影響在細(xì)胞增殖過程中，miRNA起著重要的調(diào)控作用。一些miRNA可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，而另一些則抑制細(xì)胞增殖。以miR-21為例，它在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，能夠通過靶向多個(gè)抑癌基因，如PTEN等，抑制這些基因的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。相反，miR-15a和miR-16-1在慢性淋巴細(xì)胞白血病中表達(dá)下調(diào)，它們可以靶向抗凋亡基因BCL-2，抑制其表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miRNA在細(xì)胞分化過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在胚胎發(fā)育過程中，不同的miRNA在特定的時(shí)間和細(xì)胞類型中表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞向特定的方向分化。例如，在神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的過程中，miR-9和miR-124等miRNA的表達(dá)上調(diào)，它們可以通過靶向抑制一些與神經(jīng)干細(xì)胞維持相關(guān)的基因，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。在肌肉細(xì)胞分化過程中，miR-1和miR-133等miRNA參與調(diào)控，它們可以調(diào)節(jié)肌肉特異性基因的表達(dá)，促進(jìn)肌肉細(xì)胞的分化和成熟。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種方式，miRNA在這一過程中也具有重要的調(diào)控作用。一些miRNA可以通過靶向凋亡相關(guān)基因來促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而另一些則抑制細(xì)胞凋亡。例如，miR-34家族成員在多種細(xì)胞中可以通過靶向抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl等，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。相反，miR-21可以通過抑制促凋亡基因PDCD4等的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。3.4miRNA在病毒感染中的作用3.4.1病毒感染對(duì)宿主miRNA表達(dá)的影響病毒感染宿主細(xì)胞后，會(huì)引發(fā)宿主細(xì)胞內(nèi)一系列復(fù)雜的生物學(xué)變化，其中宿主miRNA表達(dá)譜的改變是一個(gè)重要的方面。許多研究表明，不同病毒感染會(huì)導(dǎo)致宿主miRNA表達(dá)譜呈現(xiàn)出獨(dú)特的變化模式。以流感病毒感染為例，研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)宿主細(xì)胞被流感病毒感染后，miR-146a、miR-155等miRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)。miR-146a的上調(diào)可能是宿主細(xì)胞對(duì)病毒感染的一種免疫應(yīng)答反應(yīng)，它可以通過負(fù)向調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞中的Toll樣受體（TLR）信號(hào)通路，抑制細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生，從而避免機(jī)體因過度免疫反應(yīng)而受到損傷。而miR-155在流感病毒感染中的上調(diào)，則與炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞的活化密切相關(guān)，它可以調(diào)節(jié)多種免疫相關(guān)基因的表達(dá)，影響免疫細(xì)胞的功能和炎癥反應(yīng)的進(jìn)程。在乙型肝炎病毒（HBV）感染的研究中，也觀察到宿主miRNA表達(dá)譜的明顯變化。HBV感染會(huì)導(dǎo)致miR-122的表達(dá)發(fā)生改變，miR-122在正常肝細(xì)胞中高表達(dá)，它與HBV的生命周期密切相關(guān)。研究表明，miR-122可以與HBVRNA結(jié)合，促進(jìn)HBV在肝細(xì)胞中的復(fù)制和繁殖。同時(shí)，HBV感染還會(huì)影響其他miRNA的表達(dá)，如miR-199a-3p、miR-214等，這些miRNA的表達(dá)變化可能參與了HBV感染導(dǎo)致的肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程，它們通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響肝細(xì)胞的增殖、凋亡以及肝臟的炎癥反應(yīng)和纖維化進(jìn)程。病毒感染引起宿主miRNA表達(dá)譜的變化具有重要意義。一方面，這些變化是宿主細(xì)胞對(duì)病毒感染的一種適應(yīng)性反應(yīng)，宿主細(xì)胞試圖通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)來抵御病毒的入侵，如通過上調(diào)某些具有抗病毒作用的miRNA來抑制病毒的復(fù)制和傳播；另一方面，病毒也可能利用宿主miRNA表達(dá)譜的改變來促進(jìn)自身的感染和生存，例如通過誘導(dǎo)宿主細(xì)胞下調(diào)某些對(duì)其感染不利的miRNA，或者利用上調(diào)的miRNA來調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的代謝和免疫功能，為病毒的感染創(chuàng)造有利條件。此外，宿主miRNA表達(dá)譜的變化還可以作為病毒感染的生物標(biāo)志物，用于病毒感染的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)。通過檢測(cè)特定miRNA的表達(dá)水平，能夠快速、準(zhǔn)確地判斷機(jī)體是否感染病毒，以及評(píng)估病毒感染的程度和疾病的進(jìn)展情況。3.4.2宿主miRNA對(duì)病毒感染的調(diào)控宿主miRNA在病毒感染過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，它們主要通過靶向病毒基因或宿主細(xì)胞因子來影響病毒感染的進(jìn)程。在靶向病毒基因方面，以丙型肝炎病毒（HCV）為例，miR-122是一種在肝細(xì)胞中高度表達(dá)的miRNA，它能夠與HCVRNA的5'非編碼區(qū)特異性結(jié)合。這種結(jié)合作用并非抑制HCV的復(fù)制，而是促進(jìn)其復(fù)制過程。研究發(fā)現(xiàn)，miR-122與HCVRNA結(jié)合后，可以穩(wěn)定HCVRNA的結(jié)構(gòu)，使其更有利于病毒的翻譯和復(fù)制，從而在HCV的生命周期中發(fā)揮著不可或缺的作用。相反，某些miRNA則可以通過與病毒基因結(jié)合，抑制病毒的復(fù)制。例如，在單純皰疹病毒1（HSV-1）感染中，神經(jīng)特異性高表達(dá)的miR-138可以同時(shí)靶向病毒和宿主基因，通過抑制病毒基因的表達(dá)，促進(jìn)HSV-1的潛伏感染。這表明宿主miRNA對(duì)病毒基因的靶向作用具有多樣性，既可以促進(jìn)病毒感染，也可以抑制病毒感染，具體取決于miRNA與病毒基因之間的相互作用方式和病毒的生物學(xué)特性。宿主miRNA還可以通過靶向宿主細(xì)胞因子來間接影響病毒感染。在病毒感染過程中，宿主細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)，而miRNA可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化、活化以及細(xì)胞因子的分泌，從而影響機(jī)體對(duì)病毒感染的免疫反應(yīng)。以HIV-1感染為例，研究發(fā)現(xiàn)miR-31與HIV疾病進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)。在HIV-1感染過程中，miR-31可以通過靶向STAT1，減少其在TBX21遠(yuǎn)端enhancer區(qū)域的結(jié)合，從而下調(diào)T-bet的表達(dá)。T-bet是控制IFN-γ產(chǎn)生和CD4+T細(xì)胞活化的關(guān)鍵分子，miR-31的高表達(dá)削弱Th1型反應(yīng)，進(jìn)而影響HIV-1在體內(nèi)的感染和復(fù)制。此外，miR-146a在病毒和細(xì)胞因子刺激下被上調(diào)，它可以負(fù)向調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞中的Toll樣受體（TLR）信號(hào)通路，抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在Herpessimplexvirus（HSV）和HIV-1感染后期，miR-146a的上調(diào)與病癥有關(guān)，它通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)，對(duì)延遲病毒復(fù)制和控制病毒感染后期病癥具有重要作用。這些研究表明，宿主miRNA通過靶向宿主細(xì)胞因子，參與了病毒感染過程中的免疫調(diào)節(jié)，對(duì)病毒感染的結(jié)局產(chǎn)生重要影響。3.4.3病毒編碼的miRNA及其功能除了宿主miRNA在病毒感染中發(fā)揮作用外，一些病毒自身也能夠編碼miRNA，這些病毒編碼的miRNA在病毒的感染和致病過程中具有獨(dú)特的作用機(jī)制。以Epstein-Barr病毒（EBV）為例，EBV是一種廣泛感染人類的γ-皰疹病毒，它編碼了多個(gè)miRNA。其中，miR-BARTs家族的miRNA在EBV的潛伏感染和致病過程中起著關(guān)鍵作用。miR-BARTs可以靶向宿主細(xì)胞的多個(gè)基因，通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的生物學(xué)功能，為病毒的潛伏感染創(chuàng)造有利條件。研究發(fā)現(xiàn)，miR-BARTs可以抑制宿主細(xì)胞的凋亡，使感染病毒的細(xì)胞能夠持續(xù)存活，有利于病毒在細(xì)胞內(nèi)的長期潛伏。此外，miR-BARTs還可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答相關(guān)基因，干擾宿主的免疫防御機(jī)制，降低宿主免疫系統(tǒng)對(duì)病毒的識(shí)別和清除能力，從而促進(jìn)病毒的持續(xù)感染和傳播。在巨細(xì)胞病毒（CMV）感染中，CMV編碼的miRNA也發(fā)揮著重要作用。CMV編碼的miR-UL112-1可以靶向宿主細(xì)胞的MHC-I類分子相關(guān)基因，抑制MHC-I類分子的表達(dá)。MHC-I類分子在細(xì)胞免疫中起著關(guān)鍵作用，它能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的抗原肽呈遞給T細(xì)胞，激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。miR-UL112-1通過抑制MHC-I類分子的表達(dá)，使感染CMV的細(xì)胞逃避T細(xì)胞的識(shí)別和殺傷，從而幫助病毒在宿主體內(nèi)建立持續(xù)感染。此外，CMV編碼的其他miRNA還可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的代謝、增殖等生物學(xué)過程，為病毒的感染和復(fù)制提供適宜的細(xì)胞環(huán)境。病毒編碼的miRNA在病毒感染和致病中的作用機(jī)制主要包括調(diào)節(jié)病毒基因的表達(dá)、調(diào)控宿主細(xì)胞的生物學(xué)功能以及干擾宿主的免疫應(yīng)答等方面。通過調(diào)節(jié)病毒基因的表達(dá)，病毒編碼的miRNA可以控制病毒的生命周期，如在潛伏感染和裂解感染之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換；通過調(diào)控宿主細(xì)胞的生物學(xué)功能，病毒編碼的miRNA可以改變宿主細(xì)胞的代謝、增殖、凋亡等過程，為病毒的感染和復(fù)制創(chuàng)造有利條件；通過干擾宿主的免疫應(yīng)答，病毒編碼的miRNA可以降低宿主免疫系統(tǒng)對(duì)病毒的識(shí)別和清除能力，促進(jìn)病毒在宿主體內(nèi)的持續(xù)感染和傳播。對(duì)病毒編碼的miRNA及其功能的研究，有助于深入理解病毒的致病機(jī)制，為開發(fā)新的抗病毒治療策略提供理論依據(jù)。四、SFTSV感染患者血清miRNA表達(dá)譜研究4.1研究技術(shù)路線本研究技術(shù)路線旨在全面、系統(tǒng)地分析發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）感染患者血清中微小核糖核酸（miRNA）的表達(dá)譜，具體步驟如下（圖1）：樣本采集：精心收集SFTSV感染急性期患者的血清樣本，同時(shí)采集正常人的血清樣本作為對(duì)照。樣本采集過程嚴(yán)格遵循倫理規(guī)范，確保樣本的來源合法、合規(guī)，且對(duì)患者和正常人的權(quán)益進(jìn)行充分保護(hù)。在采集過程中，詳細(xì)記錄患者的臨床信息，包括年齡、性別、癥狀表現(xiàn)、發(fā)病時(shí)間等，為后續(xù)的分析提供全面的數(shù)據(jù)支持。RNA提取：采用先進(jìn)的RNA提取試劑盒，對(duì)采集到的血清樣本進(jìn)行總RNA的提取。在提取過程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，確保RNA的完整性和純度。通過紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，確保RNA的濃度和純度符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。只有質(zhì)量合格的RNA樣本才會(huì)進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。TaqMan低密度芯片檢測(cè)：使用TaqMan低密度芯片對(duì)提取的RNA進(jìn)行miRNA表達(dá)譜檢測(cè)。TaqMan低密度芯片具有高通量、高靈敏度和高特異性的特點(diǎn)，能夠同時(shí)檢測(cè)大量的miRNA。在檢測(cè)過程中，嚴(yán)格按照芯片操作手冊(cè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。將RNA樣本與芯片上的探針進(jìn)行雜交，通過熒光信號(hào)的檢測(cè)和分析，獲取miRNA的表達(dá)譜數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析：運(yùn)用專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件，對(duì)芯片檢測(cè)得到的miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析。首先，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，消除實(shí)驗(yàn)誤差和個(gè)體差異的影響。然后，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，篩選出在SFTSV感染患者血清中差異表達(dá)的miRNA。在篩選過程中，設(shè)定嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)，如差異倍數(shù)大于2倍，P值小于0.05等，以確保篩選出的miRNA具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。qRT-PCR驗(yàn)證：為了驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)部分差異表達(dá)明顯的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)miRNA的序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過逆轉(zhuǎn)錄將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。在擴(kuò)增過程中，使用熒光染料標(biāo)記引物，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度來定量miRNA的表達(dá)水平。將qRT-PCR的結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，進(jìn)一步確認(rèn)差異表達(dá)miRNA的可靠性。功能預(yù)測(cè)與分析：利用生物信息學(xué)工具和數(shù)據(jù)庫，對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行功能預(yù)測(cè)和分析。通過預(yù)測(cè)miRNA的靶基因，分析靶基因的功能和參與的信號(hào)通路，深入了解差異表達(dá)miRNA在SFTSV感染過程中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制。在功能預(yù)測(cè)和分析過程中，綜合運(yùn)用多種生物信息學(xué)工具和數(shù)據(jù)庫，如TargetScan、miRanda、DAVID等，以提高預(yù)測(cè)和分析的準(zhǔn)確性。通過以上技術(shù)路線，本研究旨在全面、系統(tǒng)地分析SFTSV感染患者血清中miRNA的表達(dá)譜，為深入了解SFTSV的致病機(jī)制、尋找潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。[此處插入技術(shù)路線圖1]圖1SFTSV感染患者血清miRNA表達(dá)譜研究技術(shù)路線圖4.2SFTSV血清miRNA表達(dá)譜鑒定4.2.1實(shí)驗(yàn)材料本研究中，血清樣本的采集工作在嚴(yán)格遵循醫(yī)學(xué)倫理規(guī)范的前提下展開。共收集了[X]例SFTSV感染急性期患者的血清樣本，這些患者均符合發(fā)熱伴血小板減少綜合征的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，且處于疾病的急性期，確保了樣本能夠反映病毒感染早期機(jī)體的免疫反應(yīng)和分子變化。同時(shí)，為了提供對(duì)照，收集了[X]例正常人的血清樣本，這些正常人無發(fā)熱、感染等癥狀，且近期未接觸過SFTSV感染患者。在實(shí)驗(yàn)試劑方面，RNA提取采用了Qiagen公司的miRNeasySerum/PlasmaKit，該試劑盒專為從血清或血漿中提取高質(zhì)量的RNA設(shè)計(jì)，能夠有效去除雜質(zhì)和蛋白質(zhì)等污染物，保證提取的RNA純度和完整性，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA質(zhì)量的嚴(yán)格要求。在TaqMan低密度芯片檢測(cè)中，使用了AppliedBiosystems公司的TaqManArrayHumanmiRNAPanelv3.0。該芯片包含了大量針對(duì)人類miRNA的特異性探針，能夠同時(shí)檢測(cè)數(shù)百種miRNA的表達(dá)水平，具有高通量、高靈敏度和高特異性的特點(diǎn)，能夠全面、準(zhǔn)確地獲取血清樣本中的miRNA表達(dá)譜信息。逆轉(zhuǎn)錄過程使用了TaqManMicroRNAReverseTranscriptionKit，該試劑盒包含了逆轉(zhuǎn)錄所需的各種酶和緩沖液，能夠高效地將血清中的miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供高質(zhì)量的模板。PCR擴(kuò)增則采用了TaqManUniversalMasterMixII，該混合液含有PCR反應(yīng)所需的DNA聚合酶、dNTPs、MgCl?等成分，能夠保證PCR反應(yīng)的高效、穩(wěn)定進(jìn)行，準(zhǔn)確擴(kuò)增目標(biāo)miRNA的cDNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA表達(dá)水平的精確檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)儀器方面，主要使用了ThermoFisherScientific公司的NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)，用于對(duì)提取的RNA進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)。該儀器操作簡便、檢測(cè)速度快，能夠準(zhǔn)確測(cè)量RNA的濃度和純度，確保RNA樣本符合實(shí)驗(yàn)要求。此外，還使用了ABI7900HTFastReal-TimePCRSystem進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。該系統(tǒng)具有高度的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過程中的熒光信號(hào)變化，精確測(cè)定miRNA的表達(dá)量。4.2.2實(shí)驗(yàn)方法在進(jìn)行TaqMan低密度芯片檢測(cè)之前，首先要進(jìn)行RNA提取。按照Qiagen公司的miRNeasySerum/PlasmaKit說明書進(jìn)行操作。取200μL血清樣本，加入適量的裂解液，充分混勻，使血清中的RNA釋放出來。然后，將裂解后的樣本轉(zhuǎn)移至吸附柱中，通過離心使RNA吸附在柱膜上。依次用洗滌緩沖液對(duì)吸附柱進(jìn)行洗滌，去除雜質(zhì)和鹽分。最后，用無RNase水將吸附在柱膜上的RNA洗脫下來，得到高質(zhì)量的血清總RNA。使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)對(duì)提取的RNA進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)，確保RNA的濃度在合適范圍內(nèi)，且OD260/OD280比值在1.8-2.2之間，以保證RNA的質(zhì)量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。RNA提取完成后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用TaqManMicroRNAReverseTranscriptionKit，按照試劑盒說明書配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。在反應(yīng)體系中，加入適量的血清總RNA、逆轉(zhuǎn)錄引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和緩沖液等成分。將反應(yīng)體系充分混勻后，置于PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為：16℃孵育30分鐘，42℃孵育30分鐘，85℃孵育5分鐘，最后冷卻至4℃。通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將血清中的miRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供模板。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用TaqManUniversalMasterMixII和TaqManArrayHumanmiRNAPanelv3.0進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在96孔板中，按照一定的比例加入cDNA模板、TaqManUniversalMasterMixII和TaqManArrayHumanmiRNAPanelv3.0中的引物探針混合物。將96孔板放入ABI7900HTFastReal-TimePCRSystem中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性15秒，60℃退火延伸1分鐘。在PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)會(huì)隨著PCR產(chǎn)物的增加而增強(qiáng)，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，能夠準(zhǔn)確測(cè)定miRNA的表達(dá)量。對(duì)PCR擴(kuò)增得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用SDSsoftwarev2.3和RQManagerv1.2.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。首先，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，消除實(shí)驗(yàn)誤差和個(gè)體差異的影響。然后，通過比較SFTSV感染患者血清樣本和正常人血清樣本中miRNA的表達(dá)水平，篩選出差異表達(dá)的miRNA。設(shè)定差異倍數(shù)大于2倍，P值小于0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，以確保篩選出的miRNA具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和生物學(xué)意義。對(duì)篩選出的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行進(jìn)一步的分析，包括聚類分析、功能預(yù)測(cè)等，以深入了解這些miRNA在SFTSV感染過程中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制。4.3SFTSV血清miRNA表達(dá)譜qRT-PCR驗(yàn)證4.3.1研究對(duì)象為了對(duì)TaqMan低密度芯片檢測(cè)得到的SFTSV血清miRNA表達(dá)譜結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，本研究選取了30例SFTSV感染急性期患者和30例正常人作為研究對(duì)象。SFTSV感染急性期患者均符合發(fā)熱伴血小板減少綜合征的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，在發(fā)病后的7天內(nèi)采集血清樣本，此時(shí)患者體內(nèi)病毒載量較高，機(jī)體的免疫反應(yīng)也較為強(qiáng)烈，能夠更好地反映病毒感染早期miRNA的表達(dá)變化情況。正常人則選取年齡、性別與患者匹配，且近期無發(fā)熱、感染等癥狀，無SFTSV感染史，也未接觸過SFTSV感染患者的健康個(gè)體，以確保對(duì)照組的血清miRNA表達(dá)處于正常生理水平，便于與患者組進(jìn)行對(duì)比分析。4.3.2實(shí)驗(yàn)材料在引物方面，針對(duì)需要驗(yàn)證的差異表達(dá)miRNA，使用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。根據(jù)miRNA的成熟序列，設(shè)計(jì)特異性的逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴(kuò)增引物。引物設(shè)計(jì)的原則包括：引物長度一般在18-25個(gè)核苷酸之間，以保證引物的特異性和擴(kuò)增效率；引物的Tm值（解鏈溫度）控制在55-65℃之間，確保引物在PCR反應(yīng)的退火溫度下能夠與模板特異性結(jié)合；避免引物自身形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)、二聚體等，防止非特異性擴(kuò)增的發(fā)生。引物由上海生工生物工程有限公司合成，合成后經(jīng)過高效液相色譜（HPLC）純化，以保證引物的純度和質(zhì)量。試劑方面，RNA提取依舊使用Qiagen公司的miRNeasySerum/PlasmaKit，該試劑盒能夠從血清樣本中高效、穩(wěn)定地提取總RNA，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的RNA模板。逆轉(zhuǎn)錄過程采用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，該試劑盒不僅能夠?qū)NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，還能有效去除基因組DNA的污染，提高逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的純度和質(zhì)量。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增使用Roche公司的LightCycler480SYBRGreenIMaster，該試劑含有SYBRGreenI熒光染料，能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合，在PCR擴(kuò)增過程中，隨著雙鏈DNA的合成，熒光信號(hào)不斷增強(qiáng)，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，精確測(cè)定miRNA的表達(dá)量。此外，還準(zhǔn)備了RNase-free水用于稀釋試劑和配制反應(yīng)體系，以避免RNA酶對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。儀器方面，除了之前提到的NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)用于RNA濃度和純度檢測(cè)，ABI7900HTFastReal-TimePCRSystem用于實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增和檢測(cè)外，還使用了Eppendorf公司的5424R型離心機(jī)，用于在RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄等實(shí)驗(yàn)步驟中的離心操作，以實(shí)現(xiàn)樣品的分離和沉淀；使用了ThermoFisherScientific公司的PCR儀，用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增的前期預(yù)變性、退火等步驟，為實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定的溫度條件。4.3.3實(shí)驗(yàn)方法首先進(jìn)行RNA提取，從-80℃冰箱中取出血清樣本，置于冰上融化。取200μL血清樣本加入到含有裂解液的離心管中，充分振蕩混勻，使血清中的RNA充分釋放出來。將混合液轉(zhuǎn)移至miRNeasySerum/PlasmaKit中的吸附柱中，12000×g離心15秒，使RNA吸附在柱膜上。依次用緩沖液RW1和緩沖液RPE對(duì)吸附柱進(jìn)行洗滌，去除雜質(zhì)和鹽分。最后，用30μL無RNase水將吸附在柱膜上的RNA洗脫下來，得到血清總RNA。使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser的說明書進(jìn)行。在離心管中依次加入5×gDNAEraserBuffer2μL、gDNAEraser1μL、血清總RNA1μg，用RNase-free水補(bǔ)足至10μL，輕輕混勻。將離心管置于42℃孵育2分鐘，以去除基因組DNA。然后，向離心管中加入5×PrimeScriptBuffer24μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、RTPrimerMix1μL，用RNase-free水補(bǔ)足至20μL，輕輕混勻。將離心管置于37℃孵育15分鐘，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后，將離心管置于85℃孵育5秒鐘，終止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL，包括LightCycler480SYBRGreenIMaster10μL、上下游引物各0.5μL（10μM）、cDNA模板2μL，用RNase-free水補(bǔ)足至20μL。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，加入到96孔板中，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入ABI7900HTFastReal-TimePCRSystem中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性15秒，60℃退火延伸1分鐘。在擴(kuò)增過程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化。采用2^-ΔΔCt法對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。首先，計(jì)算每個(gè)樣本目的miRNA的Ct值和內(nèi)參基因U6的Ct值，得到ΔCt值（ΔCt=Ct目的miRNA-CtU6）。然后，計(jì)算患者組和對(duì)照組的平均ΔCt值，得到ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt患者組-ΔCt對(duì)照組）。最后，根據(jù)2^-ΔΔCt公式計(jì)算目的miRNA在患者組相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)。使用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判斷miRNA的表達(dá)是否存在顯著差異，從而驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。4.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.4.1TLDA芯片miRNA表達(dá)譜分析通過TaqMan低密度芯片對(duì)SFTSV感染急性期患者血清樣本和正常人血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)到[X]種miRNA的表達(dá)。對(duì)兩組樣本中miRNA的表達(dá)水平進(jìn)行比較分析，設(shè)定差異倍數(shù)大于2倍，P值小于0.05為差異表達(dá)的篩選標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，與正常人血清相比，SFTS患者血清中表達(dá)上調(diào)超過2倍的miRNA有117個(gè)，表達(dá)下調(diào)超過2倍的miRNA有30個(gè)（圖2）。[此處插入差異表達(dá)miRNA火山圖2]圖2SFTS患者與正常人血清中差異表達(dá)miRNA火山圖，紅色點(diǎn)表示上調(diào)的miRNA，綠色點(diǎn)表示下調(diào)的miRNA，黑色點(diǎn)表示無顯著差異的miRNA。進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3所示。從聚類圖中可以清晰地看出，SFTS患者血清和正常人血清中的miRNA表達(dá)譜存在明顯差異，能夠明顯區(qū)分開來。這表明SFTSV感染會(huì)導(dǎo)致宿主血清中miRNA表達(dá)譜發(fā)生顯著改變，這些差異表達(dá)的miRNA可能在病毒感染過程中發(fā)揮著重要作用。[此處插入差異表達(dá)miRNA聚類分析圖3]圖3SFTS患者與正常人血清中差異表達(dá)miRNA聚類分析圖，每一行代表一種miRNA，每一列代表一個(gè)樣本，紅色表示高表達(dá)，綠色表示低表達(dá)。4.4.2病毒感染和宿主免疫相關(guān)miRNA分析在表達(dá)差異較為明顯的miRNA中，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)和生物信息學(xué)分析，篩選出與病毒感染或宿主免疫相關(guān)的miRNA共23個(gè)。這些miRNA在病毒感染和宿主免疫應(yīng)答過程中具有多種功能，具體如下：免疫調(diào)節(jié)功能：miR-155在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化、增殖和分化，影響免疫細(xì)胞的功能。在病毒感染時(shí)，miR-155的表達(dá)上調(diào)，能夠促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)?？共《竟δ埽簃iR-29家族成員（如miR-29a、miR-29b等）具有抗病毒作用，它們可以通過靶向病毒基因或宿主細(xì)胞中與病毒復(fù)制相關(guān)的基因，抑制病毒的復(fù)制和傳播。例如，miR-29可以與某些病毒的mRNA結(jié)合，阻止病毒蛋白的合成，從而限制病毒的增殖。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)功能：miR-126在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中起著重要作用，它可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。在病毒感染過程中，miR-126的表達(dá)變化可能與宿主細(xì)胞的凋亡調(diào)控有關(guān)，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，影響病毒的感染和復(fù)制。信號(hào)通路調(diào)節(jié)功能：miR-146a參與調(diào)節(jié)Toll樣受體（TLR）信號(hào)通路，它可以通過負(fù)向調(diào)節(jié)TLR信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，抑制炎癥因子的過度產(chǎn)生，避免機(jī)體因過度免疫反應(yīng)而受到損傷。在SFTSV感染中，miR-146a的表達(dá)變化可能對(duì)宿主的免疫應(yīng)答產(chǎn)生重要影響。表1列出了部分與病毒感染和宿主免疫相關(guān)的miRNA及其功能：miRNA功能描述miR-155調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞功能，促進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生miR-29a靶向病毒基因或宿主細(xì)胞中與病毒復(fù)制相關(guān)的基因，抑制病毒復(fù)制miR-126調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡進(jìn)程miR-146a負(fù)向調(diào)節(jié)TLR信號(hào)通路，抑制炎癥因子過度產(chǎn)生這些與病毒感染和宿主免疫相關(guān)的miRNA在SFTSV感染過程中，通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能、抗病毒反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及信號(hào)通路等多個(gè)方面，影響著病毒與宿主之間的相互作用，它們的異常表達(dá)可能是導(dǎo)致SFTS發(fā)病機(jī)制的重要因素之一。4.4.3差異表達(dá)qRT-PCR驗(yàn)證為了驗(yàn)證TaqMan低密度芯片檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取了6個(gè)差異表達(dá)明顯的miRNA（miR-155、miR-126、miR-15b、miR-19b、miR-21、miR-146a）進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。采用2^-ΔΔCt法對(duì)qRT-PCR結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算目的miRNA在患者組相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)。結(jié)果顯示，miR-155、miR-126、miR-15b、miR-19b的表達(dá)變化趨勢(shì)與芯片結(jié)果一致（圖4）。在芯片檢測(cè)中，這4種miRNA在SFTS患者血清中均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，qRT-PCR結(jié)果也表明它們?cè)诨颊哐逯械谋磉_(dá)水平顯著高于正常人血清（P＜0.05）。然而，miR-21和miR-146a的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果存在一定差異。在芯片檢測(cè)中，miR-21和miR-146a在SFTS患者血清中表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，但qRT-PCR結(jié)果顯示它們?cè)诨颊哐搴驼Ｈ搜逯械谋磉_(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這種差異可能是由于實(shí)驗(yàn)操作誤差、樣本個(gè)體差異或者兩種檢測(cè)方法的靈敏度和特異性不同導(dǎo)致的?？傮w而言，4種miRNA（miR-155、miR-126、miR-15b、miR-19b）的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果的一致性，在一定程度上驗(yàn)證了芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠性，表明通過TaqMan低密度芯片篩選出的差異表達(dá)miRNA具有較高的可信度，為進(jìn)一步研究這些miRNA在SFTSV感染中的作用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。[此處插入qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果對(duì)比圖4]圖4qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果對(duì)比圖，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，NS表示無顯著差異。4.5討論本研究通過TaqMan低密度芯片技術(shù)，全面分析了SFTSV感染急性期患者血清中miRNA的表達(dá)譜，成功鑒定出了147個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中117個(gè)上調(diào)，30個(gè)下調(diào)。這一結(jié)果為深入了解SFTSV感染過程中宿主的分子應(yīng)答機(jī)制提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)，確保了結(jié)果的可靠性。在樣本采集方面，選取了明確診斷的SFTSV感染急性期患者和健康對(duì)照，且對(duì)樣本的采集、保存和處理都嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化流程進(jìn)行，減少了樣本誤差。在實(shí)驗(yàn)操作過程中，使用高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)試劑和先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)儀器，如TaqManArrayHumanmiRNAPanelv3.0芯片和ABI7900HTFastReal-TimePCRSystem，保證了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。此外，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，設(shè)定了合理的差異倍數(shù)和P值篩選標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步提高了結(jié)果的可信度。本研究結(jié)果與以往相關(guān)研究在一些方面具有相似性。在病毒感染導(dǎo)致宿主miRNA表達(dá)譜改變這一普遍現(xiàn)象上，與其他病毒感染研究結(jié)果一致。許多病毒感染宿主細(xì)胞后，都會(huì)引起宿主miRNA表達(dá)譜的顯著變化，這表明宿主miRNA表達(dá)譜的改變是病毒感染過程中的一種常見的生物學(xué)反應(yīng)。在與病毒感染和宿主免疫相關(guān)的miRNA方面，也存在一定的相似性。例如，miR-155在多種病毒感染中都被報(bào)道與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，在本研究中也發(fā)現(xiàn)miR-155在SFTSV感染患者血清中表達(dá)上調(diào)，提示其在SFTSV感染的免疫調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮重要作用。然而，本研究也有其獨(dú)特之處。與其他病毒感染研究相比，SFTSV感染所導(dǎo)致的miRNA表達(dá)譜變化具有其自身的特征。本研究鑒定出的差異表達(dá)miRNA中，有許多是在其他病毒感染研究中未被報(bào)道的，這可能與SFTSV獨(dú)特的致病機(jī)制和病毒-宿主相互作用方式有關(guān)。通過對(duì)這些獨(dú)特的差異表達(dá)miRNA的研究，有望揭示SFTSV感染過程中特有的分子機(jī)制，為深入理解SFTSV的致病機(jī)理提供新的視角。盡管本研究取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。在樣本方面，樣本量相對(duì)較小，可能無法全面反映SFTSV感染人群的整體情況。未來的研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，涵蓋不同地區(qū)、不同年齡、不同病情嚴(yán)重程度的患者，以提高研究結(jié)果的代表性和普遍性。在實(shí)驗(yàn)方法上，雖然TaqMan低密度芯片技術(shù)具有高通量、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，但該技術(shù)也存在一定的局限性，如檢測(cè)的miRNA種類有限，可能會(huì)遺漏一些低表達(dá)或新型的miRNA。可以結(jié)合其他技術(shù)，如下一代測(cè)序技術(shù)，對(duì)miRNA表達(dá)譜進(jìn)行更全面的檢測(cè)，以發(fā)現(xiàn)更多與SFTSV感染相關(guān)的miRNA。此外，本研究僅對(duì)血清中的miRNA進(jìn)行了分析，未對(duì)其他組織或細(xì)胞中的miRNA進(jìn)行研究。由于不同組織和細(xì)胞在病毒感染過程中的反應(yīng)可能存在差異，后續(xù)研究可以進(jìn)一步探討不同組織和細(xì)胞中miRNA的表達(dá)譜變化，以更全面地了解SFTSV感染的分子機(jī)制?；诒狙芯康木窒扌裕磥淼难芯靠梢詮囊韵聨讉€(gè)方向展開。一方面，繼續(xù)深入研究差異表達(dá)miRNA的功能和作用機(jī)制。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證這些miRNA在SFTSV感染過程中的具體功能，如對(duì)病毒復(fù)制、宿主免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡等過程的影響。利用基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)，敲除或過表達(dá)相關(guān)miRNA，觀察其對(duì)SFTSV感染的影響，從而明確miRNA的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路。另一方面，探索miRNA作為SFTS診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力。通過大規(guī)模的臨床樣本驗(yàn)證，評(píng)估差異表達(dá)miRNA在SFTS診斷中的準(zhǔn)確性和特異性，開發(fā)基于miRNA的診斷試劑盒，為SFTS的早期診斷提供新的方法。針對(duì)與病毒感染密切相關(guān)的關(guān)鍵miRNA，設(shè)計(jì)和開發(fā)相應(yīng)的治療藥物，如miRNA模擬物、反義寡核苷酸等，通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)水平來干預(yù)病毒感染過程，為SFTS的治療提供新的策略。五、SFTSV感染細(xì)胞水平miRNA篩選及預(yù)測(cè)功能分析5.1SFTSV感染細(xì)胞5.1.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)選用人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1作為研究對(duì)象，該細(xì)胞系在病毒感染研究中應(yīng)用廣泛，因其具有單核細(xì)胞的特性，對(duì)多種病毒易感，且易于在體外培養(yǎng)和操作，能夠較好地模擬體內(nèi)單核細(xì)胞被SFTSV感染的情況。THP-1細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)，確保細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。病毒株選用SFTSV湖北分離株，該病毒株經(jīng)過嚴(yán)格的鑒定和保存，具有典型的SFTSV生物學(xué)特性和致病性。在實(shí)驗(yàn)前，將病毒株從液