可注射溫敏性水凝膠：開拓三維細(xì)胞支架材料的新維度一、引言1.1研究背景與意義在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物工程領(lǐng)域，組織工程技術(shù)的發(fā)展為解決組織和器官損傷修復(fù)問題帶來了新的希望。組織工程的核心在于構(gòu)建一個(gè)合適的三維細(xì)胞支架材料，為細(xì)胞的生長、增殖和分化提供理想的微環(huán)境，使其能夠在體外或體內(nèi)再生出具有特定功能的組織和器官。傳統(tǒng)的組織修復(fù)方法，如自體組織移植、異體組織移植等，存在著供體來源有限、免疫排斥反應(yīng)、手術(shù)創(chuàng)傷大等諸多問題。而組織工程技術(shù)通過使用三維細(xì)胞支架材料，可以有效地避免這些問題，為組織修復(fù)和再生提供了一種全新的策略。三維細(xì)胞支架材料作為組織工程的關(guān)鍵組成部分，其性能直接影響到組織工程的成敗。理想的三維細(xì)胞支架材料應(yīng)具備良好的生物相容性，能夠與細(xì)胞和諧共處，不引起免疫排斥反應(yīng)；具有合適的孔隙率和孔徑分布，以便為細(xì)胞提供充足的空間進(jìn)行生長、遷移和營養(yǎng)物質(zhì)的交換；具備一定的機(jī)械強(qiáng)度，能夠在組織修復(fù)過程中提供必要的支撐；此外，還應(yīng)具有可降解性，且降解速率與組織再生速率相匹配，當(dāng)組織修復(fù)完成后，支架材料能夠逐漸降解并被人體吸收，避免在體內(nèi)殘留?？勺⑸錅孛粜运z作為一種新型的三維細(xì)胞支架材料，近年來受到了廣泛的關(guān)注和研究。溫敏性水凝膠是一類對溫度變化敏感的高分子材料，在低溫下呈液態(tài)，具有良好的流動性，便于通過注射器進(jìn)行注射操作；當(dāng)溫度升高到一定程度時(shí)，水凝膠會發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，形成具有一定強(qiáng)度和穩(wěn)定性的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而能夠有效地固定細(xì)胞，為細(xì)胞提供一個(gè)穩(wěn)定的生長環(huán)境。這種獨(dú)特的溫敏特性使得可注射溫敏性水凝膠在細(xì)胞培養(yǎng)和組織修復(fù)等方面展現(xiàn)出了巨大的潛在價(jià)值。在細(xì)胞培養(yǎng)方面，可注射溫敏性水凝膠為細(xì)胞提供了一個(gè)類似于體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的三維微環(huán)境，有利于細(xì)胞的粘附、增殖和分化。與傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)方式相比，三維培養(yǎng)能夠更好地模擬細(xì)胞在體內(nèi)的真實(shí)生長狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用和信號傳導(dǎo)，從而使細(xì)胞能夠保持其原有的生物學(xué)特性和功能。例如，研究表明，將肝細(xì)胞培養(yǎng)在溫敏性水凝膠支架中，肝細(xì)胞能夠形成緊密的細(xì)胞團(tuán)，并且表現(xiàn)出更高的肝功能活性，如白蛋白分泌和尿素合成等。此外，可注射溫敏性水凝膠還可以通過調(diào)節(jié)溫度來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的原位釋放，這對于構(gòu)建功能性組織或器官具有重要意義。例如，利用溫敏性水凝膠實(shí)現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)的原位形成和釋放，為器官打印技術(shù)提供了重要的支持，有助于構(gòu)建更加復(fù)雜和功能完善的組織和器官。在組織修復(fù)領(lǐng)域，可注射溫敏性水凝膠同樣具有顯著的優(yōu)勢。其可注射性使得能夠通過微創(chuàng)的方式將水凝膠和細(xì)胞直接輸送到損傷部位，減少手術(shù)創(chuàng)傷和對周圍組織的損傷。在到達(dá)損傷部位后，水凝膠能夠迅速形成凝膠態(tài)，填充損傷區(qū)域，為組織修復(fù)提供物理支撐，并促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖，加速組織的愈合過程。例如，在軟骨組織修復(fù)中，可注射溫敏性水凝膠能夠有效地填充軟骨缺損部位，為軟骨細(xì)胞的生長提供一個(gè)良好的微環(huán)境，促進(jìn)軟骨組織的再生和修復(fù)。同時(shí)，通過在水凝膠中加載生長因子、藥物等生物活性物質(zhì)，可以進(jìn)一步增強(qiáng)其促進(jìn)組織修復(fù)的能力。例如，將生長因子負(fù)載到溫敏性水凝膠中，在組織修復(fù)過程中，生長因子能夠緩慢釋放，持續(xù)刺激細(xì)胞的增殖和分化，提高組織修復(fù)的效果?？勺⑸錅孛粜运z作為一種新型的三維細(xì)胞支架材料，在細(xì)胞培養(yǎng)和組織修復(fù)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的研究價(jià)值。通過深入研究可注射溫敏性水凝膠的性能、制備方法以及與細(xì)胞的相互作用機(jī)制，有望開發(fā)出更加高效、安全的三維細(xì)胞支架材料，為組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供有力的支持，為解決臨床上組織和器官損傷修復(fù)的難題提供新的解決方案。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀可注射溫敏性水凝膠作為三維細(xì)胞支架材料的研究在國內(nèi)外均取得了顯著進(jìn)展。在國外，眾多科研團(tuán)隊(duì)致力于探索新型溫敏性水凝膠的合成與性能優(yōu)化。美國的研究人員在聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）基水凝膠的研究上處于前沿，通過對PNIPAM進(jìn)行化學(xué)修飾，引入不同的功能基團(tuán)，如羧基、氨基等，成功調(diào)控了水凝膠的溫敏特性、生物相容性和降解性能。例如，在PNIPAM中引入羧基，增強(qiáng)了其對細(xì)胞的粘附能力，促進(jìn)細(xì)胞在水凝膠中的生長和增殖。歐洲的科研機(jī)構(gòu)則側(cè)重于開發(fā)基于天然高分子的溫敏性水凝膠，如殼聚糖、明膠等。這些天然高分子具有良好的生物相容性和生物降解性，但單獨(dú)使用時(shí)往往存在力學(xué)性能不足等問題。通過與合成高分子復(fù)合或進(jìn)行交聯(lián)改性，制備出的復(fù)合溫敏性水凝膠兼具兩者的優(yōu)點(diǎn)，在組織工程領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。如將殼聚糖與聚乙二醇復(fù)合，制備出的溫敏性水凝膠在軟骨組織修復(fù)中表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，能夠有效促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和分化。國內(nèi)在可注射溫敏性水凝膠用于三維細(xì)胞支架材料的研究方面也成果豐碩。中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所丁建勛副研究員和合作者通過膽固醇增強(qiáng)立體復(fù)合聚乳酸溫敏水凝膠的理化性能，促進(jìn)軟骨細(xì)胞粘附，并增強(qiáng)其軟骨再生能力。相關(guān)結(jié)果發(fā)表在AdvancedHealthcareMaterials上。聚乳酸（PLA）是一種生物可降解、具有良好生物相容性的高分子，被廣泛應(yīng)用于組織工程和藥物緩釋領(lǐng)域。PLA由左旋聚乳酸（PLLA）和右旋聚乳酸（PDLA）兩種不同的手性構(gòu)象，兩者之間的立體相互作用可以改善高分子的凝膠轉(zhuǎn)變行為、力學(xué)性能、溫敏性以及水解穩(wěn)定性。膽固醇分布于動物細(xì)胞的細(xì)胞膜上，能介入和調(diào)節(jié)磷脂膜的結(jié)構(gòu)，從而改善細(xì)胞的黏附行為。聚乙二醇?聚乳酸（PEG?PLA）的膽固醇修飾可以提高其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及其組裝結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，還可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和軟骨組織中糖胺聚糖的沉積。這些特性使膽固醇增強(qiáng)立體復(fù)合聚乳酸溫敏水凝膠（scPLA-Cholgel）作為三維支架培養(yǎng)出的再生軟骨組織具有更好的外觀形態(tài)、更多的軟骨特異性基質(zhì)沉積和更優(yōu)異的生物力學(xué)性能。研究表明scPLA-Cholgel是一種適用于軟骨組織工程的可注射型生物功能水凝膠，為臨床上常見、但不易處理的不規(guī)則軟骨缺損提供了一種優(yōu)異的潛在治療方案。此外，國內(nèi)其他科研團(tuán)隊(duì)還在溫敏性水凝膠的制備方法上不斷創(chuàng)新，開發(fā)出了一系列高效、簡便的制備技術(shù)，如靜電紡絲法、3D打印技術(shù)等。這些技術(shù)能夠精確控制水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)和形態(tài)，為細(xì)胞提供更加適宜的生長環(huán)境。通過3D打印技術(shù)制備的溫敏性水凝膠支架，具有高度有序的孔隙結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞的均勻分布和營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸。當(dāng)前研究的熱點(diǎn)主要集中在以下幾個(gè)方面：一是進(jìn)一步優(yōu)化溫敏性水凝膠的性能，包括提高其力學(xué)強(qiáng)度、改善生物相容性、精確調(diào)控溫敏轉(zhuǎn)變溫度和降解速率等，以更好地滿足不同組織工程應(yīng)用的需求。二是深入研究溫敏性水凝膠與細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制，揭示細(xì)胞在水凝膠微環(huán)境中的生長、增殖和分化規(guī)律，為設(shè)計(jì)更加智能的細(xì)胞支架材料提供理論依據(jù)。三是開發(fā)多功能溫敏性水凝膠，如負(fù)載生長因子、藥物、基因等生物活性物質(zhì)的水凝膠，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞行為的多維度調(diào)控和組織修復(fù)的協(xié)同治療。例如，將生長因子負(fù)載到溫敏性水凝膠中，在組織修復(fù)過程中，生長因子能夠緩慢釋放，持續(xù)刺激細(xì)胞的增殖和分化，提高組織修復(fù)的效果。然而，目前可注射溫敏性水凝膠用于三維細(xì)胞支架材料的研究仍存在一些待解決的問題。部分溫敏性水凝膠的力學(xué)性能較差，難以在承受較大力學(xué)載荷的組織修復(fù)中應(yīng)用，如骨組織修復(fù)等。如何在保證溫敏性和生物相容性的前提下，有效增強(qiáng)水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度是亟待解決的關(guān)鍵問題。水凝膠的大規(guī)模制備和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)還不夠成熟，制備過程復(fù)雜、成本較高，限制了其臨床應(yīng)用和商業(yè)化推廣。溫敏性水凝膠在體內(nèi)的長期安全性和穩(wěn)定性也需要進(jìn)一步研究，以確保其在組織工程應(yīng)用中的可靠性。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究可注射溫敏性水凝膠作為三維細(xì)胞支架材料的性能、應(yīng)用及面臨的挑戰(zhàn)，為其在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。具體研究內(nèi)容如下：可注射溫敏性水凝膠的材料特性分析：全面研究不同類型可注射溫敏性水凝膠的組成、結(jié)構(gòu)與溫敏性能之間的關(guān)系，通過改變合成原料、反應(yīng)條件和交聯(lián)方式等，制備一系列具有不同溫敏轉(zhuǎn)變溫度、力學(xué)性能和降解速率的水凝膠。運(yùn)用多種分析測試技術(shù)，如差示掃描量熱法（DSC）、動態(tài)光散射（DLS）、掃描電子顯微鏡（SEM）、流變學(xué)分析等，對水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)、相轉(zhuǎn)變行為、力學(xué)性能和降解性能進(jìn)行深入表征，明確材料結(jié)構(gòu)與性能之間的內(nèi)在聯(lián)系。可注射溫敏性水凝膠作為三維細(xì)胞支架的應(yīng)用研究：選擇多種具有代表性的細(xì)胞類型，如成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，研究細(xì)胞在可注射溫敏性水凝膠支架中的粘附、增殖、分化和遷移行為。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞活性檢測、免疫熒光染色、實(shí)時(shí)定量PCR等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，分析水凝膠支架對細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，探究細(xì)胞與水凝膠之間的相互作用機(jī)制。開展動物實(shí)驗(yàn)，將負(fù)載細(xì)胞的可注射溫敏性水凝膠支架植入到動物體內(nèi)的不同組織損傷部位，如皮膚缺損、軟骨損傷、神經(jīng)損傷等，觀察組織修復(fù)和再生情況。通過組織學(xué)分析、影像學(xué)檢測等手段，評估水凝膠支架在體內(nèi)的生物相容性、降解性能以及對組織修復(fù)的促進(jìn)作用，驗(yàn)證其在實(shí)際組織工程應(yīng)用中的可行性和有效性?？勺⑸錅孛粜运z用于三維細(xì)胞支架材料面臨的挑戰(zhàn)及解決方案研究：針對可注射溫敏性水凝膠力學(xué)性能不足的問題，探索通過添加增強(qiáng)相、優(yōu)化交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)等方法來提高其力學(xué)強(qiáng)度，同時(shí)保持其溫敏特性和生物相容性。研究不同增強(qiáng)材料（如納米粒子、纖維等）與水凝膠的復(fù)合方式和協(xié)同作用機(jī)制，以及交聯(lián)劑種類和用量對水凝膠力學(xué)性能的影響。分析可注射溫敏性水凝膠大規(guī)模制備和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中存在的技術(shù)難題，如制備工藝的穩(wěn)定性、成本控制等，提出相應(yīng)的解決方案。研究開發(fā)高效、簡便、低成本的水凝膠制備技術(shù)，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，為其臨床應(yīng)用和商業(yè)化推廣奠定基礎(chǔ)。深入研究可注射溫敏性水凝膠在體內(nèi)的長期安全性和穩(wěn)定性，包括水凝膠的降解產(chǎn)物對機(jī)體的潛在影響、水凝膠與周圍組織的長期相互作用等。通過長期的動物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，評估水凝膠的安全性和穩(wěn)定性，為其臨床應(yīng)用提供可靠的安全性數(shù)據(jù)。二、可注射溫敏性水凝膠與三維細(xì)胞支架材料概述2.1可注射溫敏性水凝膠簡介2.1.1定義與分類可注射溫敏性水凝膠是一類對溫度變化具有特殊響應(yīng)性的高分子材料，在較低溫度下呈現(xiàn)液態(tài)，具備良好的流動性，能夠通過注射器等工具進(jìn)行便捷注射；而當(dāng)溫度升高至特定值時(shí)，會發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，形成具有一定強(qiáng)度和穩(wěn)定性的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)凝膠。這種獨(dú)特的溫度響應(yīng)特性使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是作為三維細(xì)胞支架材料方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。根據(jù)其溫度響應(yīng)行為的不同，可注射溫敏性水凝膠主要分為正溫敏性水凝膠和負(fù)溫敏性水凝膠兩類。正溫敏性水凝膠，如聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）及其衍生物類水凝膠，在低溫時(shí)，高分子鏈上的親水基團(tuán)與水分子之間形成較強(qiáng)的氫鍵作用，使得水凝膠分子鏈充分伸展，體系呈現(xiàn)出溶液狀態(tài)，具有良好的流動性。隨著溫度升高，當(dāng)達(dá)到其最低臨界溶解溫度（LCST）時(shí)，高分子鏈上的疏水基團(tuán)之間的相互作用逐漸增強(qiáng)，氫鍵作用減弱，分子鏈開始蜷縮聚集，水凝膠分子間通過疏水相互作用形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變。PNIPAM的LCST約為32℃，接近人體體溫，這一特性使其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，能夠在人體生理溫度條件下迅速形成凝膠，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的生長環(huán)境。負(fù)溫敏性水凝膠，以殼聚糖-甘油磷酸鈉（CS-β-GP）體系為典型代表，在較高溫度下，體系中的高分子鏈較為舒展，分子間相互作用較弱，呈現(xiàn)出溶液狀態(tài)。當(dāng)溫度降低時(shí)，高分子鏈的運(yùn)動能力減弱，分子間的氫鍵等相互作用逐漸增強(qiáng)，促使水凝膠分子鏈相互纏繞交聯(lián)，形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)從溶膠到凝膠的轉(zhuǎn)變。CS-β-GP水凝膠的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度可通過調(diào)節(jié)殼聚糖和甘油磷酸鈉的濃度等因素進(jìn)行調(diào)控，一般在30-37℃范圍內(nèi)，這使得它在體內(nèi)注射應(yīng)用中也具有重要的研究價(jià)值。2.1.2結(jié)構(gòu)與特性可注射溫敏性水凝膠的分子結(jié)構(gòu)通常由親水性基團(tuán)和疏水性基團(tuán)共同組成。親水性基團(tuán)，如羥基（-OH）、羧基（-COOH）、氨基（-NH2）等，能夠與水分子形成氫鍵，賦予水凝膠良好的親水性和高含水量特性。以聚乙烯醇（PVA）水凝膠為例，其分子鏈上含有大量的羥基，這些羥基與水分子之間的強(qiáng)烈相互作用使得PVA水凝膠能夠吸收大量的水分，含水量可高達(dá)90%以上。疏水性基團(tuán)，如烷基、芳香基等，在溫度變化時(shí)，能夠通過疏水相互作用促使分子鏈發(fā)生聚集和交聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變。在PNIPAM水凝膠中，異丙基作為疏水基團(tuán)，在溫度升高時(shí)，異丙基之間的疏水相互作用增強(qiáng)，導(dǎo)致分子鏈聚集，形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變特性是可注射溫敏性水凝膠的核心特性之一。這種轉(zhuǎn)變過程是可逆的，當(dāng)溫度再次降低時(shí)，正溫敏性水凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)會逐漸破壞，重新恢復(fù)為溶液狀態(tài)；負(fù)溫敏性水凝膠則在溫度升高時(shí)，凝膠結(jié)構(gòu)解聚，轉(zhuǎn)變?yōu)槿苣z。這種可逆的轉(zhuǎn)變特性使得可注射溫敏性水凝膠在實(shí)際應(yīng)用中具有很大的靈活性。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，可以先將負(fù)載細(xì)胞的水凝膠溶液注射到特定的培養(yǎng)模具中，然后通過升溫使其形成凝膠，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的三維生長環(huán)境。當(dāng)需要對細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步處理或分析時(shí)，通過降溫使水凝膠溶膠化，方便地將細(xì)胞從凝膠中分離出來。高含水量是可注射溫敏性水凝膠的另一個(gè)重要特性。由于水凝膠中含有大量的水分，能夠?yàn)榧?xì)胞提供類似于體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的水環(huán)境，有利于細(xì)胞的存活、代謝和物質(zhì)交換。在組織修復(fù)應(yīng)用中，高含水量的水凝膠可以保持損傷部位的濕潤，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖，加速組織的愈合過程。同時(shí)，高含水量還使得水凝膠具有良好的柔韌性和順應(yīng)性，能夠更好地適應(yīng)組織的形狀和運(yùn)動，減少對周圍組織的刺激?？勺⑸錅孛粜运z的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對其性能也有著重要影響。三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為細(xì)胞提供了物理支撐，使細(xì)胞能夠在其中粘附、生長和分化。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的孔隙大小和分布決定了營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和代謝產(chǎn)物的傳輸效率。具有合適孔隙大?。ㄒ话阍趲资綆装偌{米之間）和高孔隙率（可達(dá)90%以上）的水凝膠，能夠保證細(xì)胞與外界環(huán)境之間的物質(zhì)交換暢通，促進(jìn)細(xì)胞的正常生理功能。此外，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性還影響著水凝膠的力學(xué)性能和降解性能。通過優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，如調(diào)整交聯(lián)劑的種類和用量、引入納米增強(qiáng)材料等，可以提高水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度和穩(wěn)定性，同時(shí)調(diào)控其降解速率，使其更好地滿足不同組織工程應(yīng)用的需求。2.1.3制備方法溶液聚合法是制備可注射溫敏性水凝膠的常用方法之一。其原理是在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，將單體、引發(fā)劑和交聯(lián)劑等混合均勻，通過引發(fā)劑引發(fā)單體進(jìn)行聚合反應(yīng)，形成具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠。以制備PNIPAM水凝膠為例，在水溶液中，以偶氮二異丁腈（AIBN）為引發(fā)劑，N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM）為單體，N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）為交聯(lián)劑，在一定溫度下進(jìn)行聚合反應(yīng)。首先，AIBN在加熱條件下分解產(chǎn)生自由基，引發(fā)NIPAM單體發(fā)生鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)，形成線性的PNIPAM分子鏈。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，MBA中的兩個(gè)丙烯酰胺基團(tuán)分別與不同的PNIPAM分子鏈發(fā)生反應(yīng)，從而使分子鏈之間發(fā)生交聯(lián)，形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的PNIPAM水凝膠。溶液聚合法的操作過程相對簡單，反應(yīng)條件溫和，能夠精確控制水凝膠的組成和結(jié)構(gòu)。通過調(diào)節(jié)單體、引發(fā)劑和交聯(lián)劑的用量，可以制備出具有不同溫敏轉(zhuǎn)變溫度、力學(xué)性能和降解速率的水凝膠。該方法也存在一些缺點(diǎn)，如反應(yīng)時(shí)間較長，可能會引入雜質(zhì)，影響水凝膠的性能。輻射交聯(lián)法是利用高能射線（如γ射線、電子束等）對聚合物溶液或單體進(jìn)行輻照，使聚合物分子鏈之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，從而制備水凝膠。以聚乙烯醇（PVA）水凝膠的制備為例，將PVA水溶液置于γ射線輻照源下，在一定劑量的γ射線輻照下，PVA分子鏈上的羥基被激活，形成自由基，這些自由基相互作用，使分子鏈之間發(fā)生交聯(lián)，形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的PVA水凝膠。輻射交聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)是無需使用化學(xué)交聯(lián)劑，避免了交聯(lián)劑殘留對水凝膠生物相容性的影響。輻照過程可以在常溫下進(jìn)行，對聚合物的結(jié)構(gòu)和性能影響較小。通過控制輻照劑量和時(shí)間，可以精確調(diào)控水凝膠的交聯(lián)程度和性能。然而，輻射交聯(lián)法需要特殊的輻照設(shè)備，成本較高，且輻照過程對操作人員和環(huán)境存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。化學(xué)交聯(lián)法是通過化學(xué)反應(yīng)在聚合物分子鏈之間引入交聯(lián)點(diǎn)，形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠。常見的化學(xué)交聯(lián)劑有戊二醛、環(huán)氧氯丙烷等。以殼聚糖水凝膠的制備為例，將殼聚糖溶解在酸性溶液中，加入適量的戊二醛作為交聯(lián)劑。戊二醛中的醛基與殼聚糖分子鏈上的氨基發(fā)生席夫堿反應(yīng)，形成亞胺鍵，從而使殼聚糖分子鏈之間發(fā)生交聯(lián)，形成殼聚糖水凝膠?；瘜W(xué)交聯(lián)法能夠有效地提高水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度和穩(wěn)定性。通過選擇不同的交聯(lián)劑和控制交聯(lián)反應(yīng)條件，可以制備出具有不同性能的水凝膠。該方法也存在一些問題，如交聯(lián)劑可能具有毒性，殘留的交聯(lián)劑會影響水凝膠的生物相容性。交聯(lián)反應(yīng)過程中可能會導(dǎo)致水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)不均勻，影響其性能的一致性。2.2三維細(xì)胞支架材料的作用與要求2.2.1在組織工程中的作用在組織工程領(lǐng)域，三維細(xì)胞支架材料起著不可或缺的關(guān)鍵作用，是實(shí)現(xiàn)組織再生和修復(fù)的核心要素之一。從本質(zhì)上講，三維細(xì)胞支架材料為細(xì)胞提供了一個(gè)三維的生長空間，這一空間結(jié)構(gòu)與細(xì)胞在體內(nèi)所處的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）環(huán)境極為相似。細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞生存的重要微環(huán)境，它不僅為細(xì)胞提供物理支撐，還通過與細(xì)胞表面的受體相互作用，傳遞各種生物信號，調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為，如粘附、增殖、分化和遷移等。三維細(xì)胞支架材料模擬了細(xì)胞外基質(zhì)的這些功能，為細(xì)胞在體外或體內(nèi)的生長和組織構(gòu)建提供了必要的條件。在組織工程應(yīng)用中，將細(xì)胞接種到三維細(xì)胞支架材料上后，細(xì)胞能夠在支架的三維孔隙結(jié)構(gòu)中粘附和鋪展。支架的孔隙為細(xì)胞提供了充足的空間，使其能夠自由生長和增殖，形成細(xì)胞聚集體。研究表明，在三維細(xì)胞支架材料中培養(yǎng)的細(xì)胞，其增殖速度和細(xì)胞活性往往高于在二維平面培養(yǎng)的細(xì)胞。這是因?yàn)槿S培養(yǎng)環(huán)境更有利于細(xì)胞間的相互作用和信號傳導(dǎo)，促進(jìn)了細(xì)胞的生長和代謝。以軟骨組織工程為例，將軟骨細(xì)胞接種到三維細(xì)胞支架材料上，軟骨細(xì)胞能夠在支架的孔隙中增殖并分泌軟骨特異性的細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白和蛋白聚糖等，逐漸形成具有一定結(jié)構(gòu)和功能的軟骨組織。除了提供物理支撐和促進(jìn)細(xì)胞增殖外，三維細(xì)胞支架材料還能夠引導(dǎo)細(xì)胞的分化方向。不同組織的細(xì)胞具有特定的分化路徑和功能，而三維細(xì)胞支架材料的物理和化學(xué)性質(zhì)可以對細(xì)胞的分化過程產(chǎn)生影響。通過在支架材料中引入特定的生物活性分子，如生長因子、細(xì)胞因子等，或者對支架材料的表面進(jìn)行修飾，使其具有特定的化學(xué)基團(tuán)，能夠與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，引導(dǎo)細(xì)胞向特定的組織細(xì)胞類型分化。在骨組織工程中，在三維細(xì)胞支架材料中添加骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）等生長因子，能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨組織的形成和修復(fù)。三維細(xì)胞支架材料在組織構(gòu)建過程中也發(fā)揮著重要作用。在體內(nèi)，支架材料能夠引導(dǎo)周圍組織細(xì)胞向損傷部位遷移和浸潤，促進(jìn)新生組織的形成。支架材料的存在還可以為新生組織提供力學(xué)支持，防止組織在修復(fù)過程中受到外力的破壞。隨著組織的逐漸再生，支架材料會逐漸降解，最終被新生組織完全替代。在皮膚組織修復(fù)中，可降解的三維細(xì)胞支架材料能夠填充皮膚缺損部位，吸引成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞等向支架內(nèi)遷移，促進(jìn)新的皮膚組織的生長，同時(shí)支架材料在皮膚修復(fù)過程中逐漸降解，最終實(shí)現(xiàn)皮膚的完全再生。2.2.2理想支架材料的性能要求生物相容性是理想三維細(xì)胞支架材料應(yīng)具備的首要性能。生物相容性是指材料與生物體之間相互作用后產(chǎn)生的各種生物、物理、化學(xué)等反應(yīng)的一種概念，包括材料對生物體的毒性、免疫原性、組織反應(yīng)等多個(gè)方面。良好的生物相容性意味著支架材料在與細(xì)胞接觸或植入體內(nèi)后，不會引起細(xì)胞的毒性反應(yīng)，不會引發(fā)免疫排斥反應(yīng)，能夠與細(xì)胞和周圍組織和諧共處。以聚乳酸（PLA）為例，PLA是一種常用的生物可降解高分子材料，具有良好的生物相容性。研究表明，將成纖維細(xì)胞接種到PLA三維細(xì)胞支架材料上，細(xì)胞能夠在支架上正常粘附、增殖和生長，細(xì)胞活性和形態(tài)未受到明顯影響。同時(shí)，PLA在體內(nèi)降解產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，如乳酸等，能夠被人體正常代謝，不會對機(jī)體造成不良影響。生物降解性也是三維細(xì)胞支架材料的重要性能之一。在組織工程應(yīng)用中，支架材料的主要作用是為組織修復(fù)和再生提供臨時(shí)的物理支撐和微環(huán)境，當(dāng)組織修復(fù)完成后，支架材料應(yīng)能夠逐漸降解并被人體吸收，避免在體內(nèi)殘留。理想的支架材料的降解速率應(yīng)與組織再生速率相匹配。如果降解過快，支架材料可能無法提供足夠的支撐時(shí)間，影響組織的修復(fù)效果；如果降解過慢，殘留的支架材料可能會對新生組織產(chǎn)生不良影響。聚己內(nèi)酯（PCL）是一種具有良好生物降解性的高分子材料，其降解速率相對較慢，適合用于一些需要較長時(shí)間支撐的組織工程應(yīng)用，如骨組織修復(fù)等。通過調(diào)節(jié)PCL的分子量、結(jié)晶度等參數(shù)，可以在一定程度上調(diào)控其降解速率，以滿足不同組織工程應(yīng)用的需求。力學(xué)性能對于三維細(xì)胞支架材料至關(guān)重要，尤其是在一些承受力學(xué)載荷的組織工程應(yīng)用中，如骨組織工程、軟骨組織工程等。支架材料需要具備一定的強(qiáng)度和韌性，以承受生理狀態(tài)下的力學(xué)應(yīng)力，如壓力、張力、剪切力等，確保在組織修復(fù)過程中能夠維持其結(jié)構(gòu)完整性，為細(xì)胞和新生組織提供有效的支撐。對于骨組織工程支架材料，需要具備較高的抗壓強(qiáng)度和彎曲強(qiáng)度，以模擬天然骨組織的力學(xué)性能。研究人員通過在聚合物中添加納米粒子、纖維等增強(qiáng)材料，制備出了具有高強(qiáng)度和良好韌性的復(fù)合三維細(xì)胞支架材料。將羥基磷灰石納米粒子添加到聚乳酸中，制備的復(fù)合支架材料的力學(xué)性能得到了顯著提高，能夠更好地滿足骨組織修復(fù)的力學(xué)要求?？紫堵逝c孔徑是影響三維細(xì)胞支架材料性能的關(guān)鍵因素。高孔隙率能夠?yàn)榧?xì)胞提供充足的生長空間，有利于細(xì)胞的均勻分布和增殖。合適的孔徑大小則對于營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸、代謝產(chǎn)物的排出以及細(xì)胞的遷移至關(guān)重要。一般來說，細(xì)胞在支架材料中的遷移需要孔徑大小在幾十到幾百微米之間。研究表明，孔徑在100-300μm之間的三維細(xì)胞支架材料，能夠促進(jìn)細(xì)胞的遷移和組織的血管化。同時(shí)，孔隙之間的連通性也非常重要，良好的連通性能夠保證營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物在支架材料內(nèi)部的順暢傳輸。通過優(yōu)化支架材料的制備工藝，如采用3D打印技術(shù)、冷凍干燥技術(shù)等，可以精確控制支架材料的孔隙率、孔徑大小和連通性，為細(xì)胞提供更加適宜的生長環(huán)境。2.3可注射溫敏性水凝膠作為三維細(xì)胞支架材料的優(yōu)勢可注射溫敏性水凝膠作為三維細(xì)胞支架材料，具有諸多獨(dú)特優(yōu)勢，使其在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。其可注射性是一大顯著優(yōu)勢。在低溫液態(tài)下，可注射溫敏性水凝膠具有良好的流動性，能夠通過細(xì)針管輕松注射，這為其在臨床上的應(yīng)用提供了極大的便利。與傳統(tǒng)的固態(tài)支架材料相比，可注射溫敏性水凝膠可以通過微創(chuàng)的方式直接輸送到損傷部位，大大減少了手術(shù)創(chuàng)傷和對周圍組織的損傷。在一些深部組織損傷的治療中，如腦部、肝臟等部位的損傷，可注射溫敏性水凝膠能夠通過微創(chuàng)介入的方法準(zhǔn)確地到達(dá)損傷區(qū)域，避免了傳統(tǒng)手術(shù)的大開刀方式，降低了手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)和患者的痛苦?？勺⑸湫赃€使得水凝膠能夠更好地填充不規(guī)則形狀的損傷部位，與損傷組織緊密貼合，為組織修復(fù)提供更理想的支撐和微環(huán)境。在軟骨組織修復(fù)中，由于軟骨缺損部位往往形狀不規(guī)則，可注射溫敏性水凝膠能夠根據(jù)缺損部位的形狀進(jìn)行填充，為軟骨細(xì)胞的生長提供一個(gè)良好的三維空間。溫敏性實(shí)現(xiàn)原位凝膠化是其另一重要特性。當(dāng)可注射溫敏性水凝膠被注射到體內(nèi)后，隨著溫度升高至體溫，會迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，在原位形成具有一定強(qiáng)度和穩(wěn)定性的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)凝膠。這種原位凝膠化過程能夠有效地固定細(xì)胞和生長因子等生物活性物質(zhì)，防止其擴(kuò)散，使其能夠在損傷部位持續(xù)發(fā)揮作用。將負(fù)載有生長因子的可注射溫敏性水凝膠注射到骨損傷部位，在體溫作用下，水凝膠迅速凝膠化，將生長因子包裹在其中，生長因子能夠緩慢釋放，持續(xù)刺激骨細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)骨組織的修復(fù)。原位凝膠化還能夠使水凝膠與周圍組織緊密結(jié)合，形成一個(gè)穩(wěn)定的整體，有利于組織的愈合和再生。在皮膚組織修復(fù)中，可注射溫敏性水凝膠在原位凝膠化后，能夠與皮膚組織緊密貼合，促進(jìn)皮膚細(xì)胞的遷移和增殖，加速皮膚傷口的愈合。良好的生物相容性是可注射溫敏性水凝膠作為三維細(xì)胞支架材料的關(guān)鍵要求之一。大多數(shù)可注射溫敏性水凝膠由生物相容性良好的高分子材料制備而成，如天然高分子（殼聚糖、明膠等）和一些合成高分子（聚乙二醇、聚乳酸等）。這些材料在與細(xì)胞接觸時(shí)，不會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，能夠支持細(xì)胞的粘附、增殖和分化。研究表明，將成纖維細(xì)胞接種到基于殼聚糖的可注射溫敏性水凝膠中，細(xì)胞能夠在水凝膠上正常生長，細(xì)胞活性和形態(tài)未受到明顯影響。良好的生物相容性還意味著水凝膠在體內(nèi)不會引起免疫排斥反應(yīng)，能夠與周圍組織和諧共處，為組織修復(fù)和再生提供一個(gè)安全的微環(huán)境。在神經(jīng)組織工程中，可注射溫敏性水凝膠的良好生物相容性能夠避免對神經(jīng)組織的刺激和損傷，有利于神經(jīng)細(xì)胞的生長和神經(jīng)功能的恢復(fù)。高含水量是可注射溫敏性水凝膠的又一突出優(yōu)勢。水凝膠中含有大量的水分，能夠?yàn)榧?xì)胞提供類似于體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的水環(huán)境，這對于細(xì)胞的存活、代謝和物質(zhì)交換至關(guān)重要。在高含水量的水凝膠環(huán)境中，細(xì)胞能夠更好地?cái)z取營養(yǎng)物質(zhì)、排出代謝產(chǎn)物，維持正常的生理功能。高含水量還使得水凝膠具有良好的柔韌性和順應(yīng)性，能夠更好地適應(yīng)組織的形狀和運(yùn)動，減少對周圍組織的刺激。在關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)中，可注射溫敏性水凝膠的高含水量和柔韌性能夠使其在關(guān)節(jié)運(yùn)動時(shí)，有效地緩沖壓力，保護(hù)軟骨組織，促進(jìn)軟骨的修復(fù)和再生。三、可注射溫敏性水凝膠的性能研究3.1溫度響應(yīng)性能3.1.1溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度是可注射溫敏性水凝膠的關(guān)鍵性能指標(biāo)之一，它直接決定了水凝膠在實(shí)際應(yīng)用中的適用性。測定溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度的方法眾多，各有其優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍。反轉(zhuǎn)試管法是一種較為簡單直觀的測定方法。該方法將一定量的溫敏性水凝膠溶液置于試管中，緩慢升高或降低溫度，在每個(gè)溫度點(diǎn)保持一段時(shí)間使體系達(dá)到平衡后，將試管緩慢倒置。若溶液在規(guī)定時(shí)間內(nèi)（通常為10秒）不流動，則認(rèn)為水凝膠發(fā)生了凝膠化，此時(shí)的溫度即為溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度。這種方法操作簡便，無需復(fù)雜的儀器設(shè)備，成本較低。它存在明顯的局限性，主要依賴實(shí)驗(yàn)者的主觀判斷，不同實(shí)驗(yàn)者可能由于判斷標(biāo)準(zhǔn)的差異而得到不同的結(jié)果，準(zhǔn)確性和精度較低。而且該方法難以做到精確控溫，無法準(zhǔn)確捕捉到水凝膠相轉(zhuǎn)變的細(xì)微變化。差示掃描量熱法（DSC）是基于水凝膠相轉(zhuǎn)變過程中會伴隨熱效應(yīng)的原理進(jìn)行測定。在DSC測試中，將水凝膠樣品與參比物（通常為惰性物質(zhì)，如氧化鋁）在相同的溫度程序下進(jìn)行加熱或冷卻，測量樣品與參比物之間的熱流差隨溫度的變化。當(dāng)水凝膠發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變時(shí)，會吸收或釋放熱量，導(dǎo)致熱流差發(fā)生變化，從而在DSC曲線上出現(xiàn)明顯的吸熱峰或放熱峰，該峰對應(yīng)的溫度即為溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度。DSC法能夠直接反映水凝膠相轉(zhuǎn)變時(shí)的熱效應(yīng)，結(jié)果較為準(zhǔn)確可靠。它對儀器的靈敏度要求較高，設(shè)備成本昂貴。而且該方法更適用于熱效應(yīng)明顯的水凝膠體系，對于一些熱效應(yīng)較弱的水凝膠，可能難以準(zhǔn)確測量其溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度。光散射法通過檢測水凝膠體系在溫度變化過程中光散射特性的改變來確定溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度。在低溫溶膠狀態(tài)下，水凝膠分子鏈較為舒展，體系均勻，對光的散射較弱，溶液較為清澈。隨著溫度升高，水凝膠分子鏈逐漸聚集，形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，體系的不均勻性增加，對光的散射增強(qiáng)，溶液變得渾濁。通過監(jiān)測光散射強(qiáng)度或透過率的變化，當(dāng)光散射強(qiáng)度突然增大或透過率急劇下降時(shí)，對應(yīng)的溫度即為溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度。光散射法可以得到溶液中大分子的尺寸、形態(tài)以及相互作用的信息，對于研究水凝膠的相轉(zhuǎn)變機(jī)制具有重要意義。該方法需要較長的平衡和測試時(shí)間，實(shí)驗(yàn)周期長，難以實(shí)現(xiàn)快速檢測。而且測試過程中可能受到溶液中雜質(zhì)、氣泡等因素的干擾，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。流變學(xué)方法是基于水凝膠在凝膠過程中會伴隨著模量的變化來測定溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度。通過流變儀對水凝膠樣品施加一定的應(yīng)變或應(yīng)力，同時(shí)改變溫度，測量水凝膠的儲能模量（G'）、損耗模量（G''）等流變參數(shù)隨溫度的變化。當(dāng)水凝膠從溶膠轉(zhuǎn)變?yōu)槟z時(shí)，其儲能模量會迅速增大，損耗模量也會發(fā)生相應(yīng)變化。通常將儲能模量與損耗模量相等（G'=G''）時(shí)的溫度定義為溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度，此時(shí)對應(yīng)的頻率點(diǎn)即為凝膠點(diǎn)。流變學(xué)方法能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測水凝膠在相轉(zhuǎn)變過程中的力學(xué)性能變化，全面了解水凝膠的凝膠化過程。該方法中由粘性模量和彈性模量相等而得到的膠凝點(diǎn)可能是頻率依賴性的，會帶來一定的誤差。而且測試過程需要對水凝膠施加旋轉(zhuǎn)剪切，可能會造成水凝膠結(jié)構(gòu)上的破壞，影響測試結(jié)果的真實(shí)性。影響溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度的因素較為復(fù)雜，主要包括聚合物組成、交聯(lián)密度、添加劑等。聚合物組成是影響溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度的關(guān)鍵因素之一。以聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）為例，其最低臨界溶解溫度（LCST）約為32℃。當(dāng)在PNIPAM中引入親水性單體，如丙烯酸（AA）、丙烯酰胺（AM）等，由于親水性單體的加入增加了分子鏈與水分子之間的相互作用，使得體系的親水性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度升高。研究表明，在PNIPAM中引入10%（摩爾分?jǐn)?shù)）的AA，水凝膠的LCST可升高至38℃左右。相反，引入疏水性單體，如甲基丙烯酸甲酯（MMA）、丙烯酸丁酯（BA）等，會增強(qiáng)分子鏈之間的疏水相互作用，使溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度降低。在PNIPAM中加入5%（摩爾分?jǐn)?shù)）的MMA，水凝膠的LCST可降至28℃左右。交聯(lián)密度對溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度也有顯著影響。一般來說，交聯(lián)密度增加，水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密，分子鏈的運(yùn)動受限，使得溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度升高。這是因?yàn)榻宦?lián)點(diǎn)的增加限制了分子鏈在溫度變化時(shí)的伸展和蜷縮，需要更高的溫度才能使分子鏈克服交聯(lián)點(diǎn)的束縛，發(fā)生相轉(zhuǎn)變。通過調(diào)整交聯(lián)劑的用量可以改變水凝膠的交聯(lián)密度。在制備PNIPAM水凝膠時(shí)，隨著交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）用量的增加，水凝膠的交聯(lián)密度增大，溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度逐漸升高。當(dāng)MBA用量從0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）增加到2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)，水凝膠的LCST可從32℃升高至35℃左右。添加劑的種類和含量同樣會對溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度產(chǎn)生影響。一些鹽類添加劑，如氯化鈉（NaCl）、氯化鈣（CaCl?）等，能夠與水凝膠分子鏈上的基團(tuán)發(fā)生相互作用，影響分子鏈與水分子之間的氫鍵作用，從而改變?nèi)苣z-凝膠轉(zhuǎn)變溫度。通常，加入鹽類添加劑會使水凝膠的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度降低，這種現(xiàn)象被稱為鹽析效應(yīng)。在PNIPAM水凝膠中加入0.1M的NaCl，水凝膠的LCST可降至30℃左右。某些有機(jī)溶劑，如乙醇、丙酮等，也能改變水凝膠的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度。有機(jī)溶劑的加入會改變體系的極性，影響分子鏈的溶解性和相互作用，進(jìn)而影響溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度。在PNIPAM水凝膠中加入10%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇，水凝膠的LCST可升高至35℃左右。3.1.2轉(zhuǎn)變動力學(xué)溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變動力學(xué)研究的是可注射溫敏性水凝膠在溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變過程中的速率和詳細(xì)過程，這對于深入理解水凝膠的性能以及其在實(shí)際應(yīng)用中的行為具有重要意義。在升溫或降溫過程中，可注射溫敏性水凝膠的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變速率并非恒定不變，而是受到多種因素的綜合影響。以正溫敏性水凝膠為例，當(dāng)溫度逐漸升高接近其最低臨界溶解溫度（LCST）時(shí)，高分子鏈上的疏水基團(tuán)之間的相互作用開始逐漸增強(qiáng)。起初，這種相互作用較弱，分子鏈的聚集程度較低，溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變速率相對較慢。隨著溫度進(jìn)一步升高，接近并超過LCST時(shí)，疏水相互作用急劇增強(qiáng)，分子鏈迅速聚集，形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變速率顯著加快。研究表明，在以聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）為基礎(chǔ)的水凝膠體系中，當(dāng)溫度從25℃緩慢升高至30℃時(shí)，水凝膠的儲能模量（G'）增加較為緩慢，表明溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變速率較慢。而當(dāng)溫度從30℃升高至35℃，超過PNIPAM的LCST（約32℃）時(shí)，G'迅速增大，溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變速率明顯加快。升溫或降溫速率對溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變動力學(xué)有著顯著影響。較快的升溫速率會使水凝膠體系在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高溫度，導(dǎo)致分子鏈來不及充分調(diào)整構(gòu)象和相互作用，從而使溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變過程相對滯后。在快速升溫條件下，水凝膠的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度會相對升高。當(dāng)以10℃/min的升溫速率對PNIPAM水凝膠進(jìn)行加熱時(shí)，其溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度可能會升高至33-34℃，相比緩慢升溫（如1℃/min）時(shí)的轉(zhuǎn)變溫度有所提高。相反，較慢的升溫速率使分子鏈有足夠時(shí)間進(jìn)行構(gòu)象調(diào)整和相互作用，溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變過程更為充分，轉(zhuǎn)變溫度相對較低且轉(zhuǎn)變速率較為穩(wěn)定。環(huán)境因素，如溶液的pH值、離子強(qiáng)度等，也會對溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變動力學(xué)產(chǎn)生重要影響。溶液的pH值會影響水凝膠分子鏈上某些基團(tuán)的解離狀態(tài)，從而改變分子鏈之間的相互作用。對于含有羧基（-COOH）或氨基（-NH?）等可解離基團(tuán)的水凝膠，在不同pH值下，這些基團(tuán)的解離程度不同，進(jìn)而影響溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變動力學(xué)。在pH值較低時(shí)，羧基以質(zhì)子化形式存在，分子鏈之間的靜電斥力較小，有利于分子鏈的聚集，溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變速率可能加快。而在pH值較高時(shí)，羧基解離為羧酸根離子，分子鏈之間的靜電斥力增大，阻礙分子鏈的聚集，溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變速率可能減慢。以基于丙烯酸（AA）和N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM）的共聚水凝膠為例，在pH=4的酸性環(huán)境下，溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變速率明顯快于pH=8的堿性環(huán)境。離子強(qiáng)度對溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變動力學(xué)的影響主要源于離子與水凝膠分子鏈之間的相互作用。較高的離子強(qiáng)度會壓縮水凝膠分子鏈周圍的雙電層，減弱分子鏈之間的靜電斥力，促進(jìn)分子鏈的聚集，從而加快溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變速率。在含有高濃度氯化鈉（NaCl）的溶液中，PNIPAM水凝膠的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變速率會明顯加快。相反，較低的離子強(qiáng)度下，分子鏈之間的靜電斥力相對較大，溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變速率較慢。除了上述因素外，水凝膠的濃度、分子量等自身特性也會對溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變動力學(xué)產(chǎn)生影響。一般來說，水凝膠濃度越高，分子鏈之間的相互作用越強(qiáng)，溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變速率越快。較高分子量的水凝膠分子鏈由于其鏈長較長，分子鏈之間的纏結(jié)程度更高，也會使溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變速率加快。3.2力學(xué)性能3.2.1凝膠強(qiáng)度與彈性測量可注射溫敏性水凝膠的凝膠強(qiáng)度和彈性常用的實(shí)驗(yàn)方法主要有壓縮測試、拉伸測試和動態(tài)力學(xué)分析（DMA）。壓縮測試是將圓柱形或長方體形的水凝膠樣品置于萬能材料試驗(yàn)機(jī)的上下壓盤之間，以恒定的速率對樣品施加壓縮載荷，記錄樣品在壓縮過程中的力-位移曲線。通過力-位移曲線，可以計(jì)算出凝膠的壓縮強(qiáng)度、彈性模量等力學(xué)參數(shù)。拉伸測試則是將啞鈴形或矩形的水凝膠樣品安裝在萬能材料試驗(yàn)機(jī)的夾具上，以一定的速度對樣品施加拉伸載荷，直至樣品斷裂，從而得到拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長率和拉伸彈性模量等力學(xué)性能指標(biāo)。動態(tài)力學(xué)分析（DMA）是在周期性變化的外力作用下，測量材料的動態(tài)力學(xué)性能，包括儲能模量（G'）、損耗模量（G''）和損耗因子（tanδ）等。在DMA測試中，將水凝膠樣品置于特定的夾具中，施加正弦交變應(yīng)力或應(yīng)變，通過測量樣品的響應(yīng)來獲取其動態(tài)力學(xué)性能。在不同條件下，可注射溫敏性水凝膠的力學(xué)性能呈現(xiàn)出復(fù)雜的變化規(guī)律。聚合物組成對凝膠的力學(xué)性能有著顯著影響。對于聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）基水凝膠，引入剛性單體或增強(qiáng)基團(tuán)可以有效提高凝膠的強(qiáng)度和彈性。在PNIPAM中引入丙烯酸（AA）形成共聚水凝膠，由于AA的剛性結(jié)構(gòu)和強(qiáng)極性，能夠增強(qiáng)分子鏈之間的相互作用，從而提高水凝膠的力學(xué)性能。研究表明，當(dāng)AA的含量為10%（摩爾分?jǐn)?shù)）時(shí)，共聚水凝膠的壓縮強(qiáng)度相比純PNIPAM水凝膠提高了約30%。交聯(lián)密度也是影響凝膠力學(xué)性能的關(guān)鍵因素。一般來說，交聯(lián)密度增加，凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密，分子鏈之間的相互作用增強(qiáng)，凝膠的強(qiáng)度和彈性提高。在制備PNIPAM水凝膠時(shí)，增加交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）的用量，水凝膠的交聯(lián)密度增大，儲能模量和壓縮強(qiáng)度顯著增加。當(dāng)MBA用量從0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）增加到2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)，水凝膠的儲能模量可從100Pa左右增加到500Pa以上。然而，過高的交聯(lián)密度也可能導(dǎo)致凝膠的脆性增加，彈性下降。溫度對可注射溫敏性水凝膠的力學(xué)性能同樣具有重要影響。在溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度附近，水凝膠的力學(xué)性能會發(fā)生急劇變化。對于正溫敏性水凝膠，當(dāng)溫度升高接近最低臨界溶解溫度（LCST）時(shí)，分子鏈逐漸聚集，凝膠的強(qiáng)度和彈性迅速增加。在以PNIPAM為基礎(chǔ)的水凝膠體系中，當(dāng)溫度從25℃升高到32℃（接近PNIPAM的LCST）時(shí)，水凝膠的儲能模量從幾十Pa迅速增加到幾百Pa。而當(dāng)溫度超過LCST后，隨著溫度的進(jìn)一步升高，水凝膠的力學(xué)性能可能會逐漸下降，這是由于高溫導(dǎo)致分子鏈的熱運(yùn)動加劇，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸破壞。此外，添加劑的種類和含量也會對水凝膠的力學(xué)性能產(chǎn)生影響。一些無機(jī)納米粒子，如納米二氧化硅（SiO?）、納米羥基磷灰石（n-HAP）等，加入到水凝膠中可以形成納米復(fù)合水凝膠，顯著提高凝膠的力學(xué)性能。納米粒子與水凝膠分子鏈之間通過物理吸附或化學(xué)鍵合作用，增強(qiáng)了分子鏈之間的相互作用，從而提高了凝膠的強(qiáng)度和彈性。在PNIPAM水凝膠中加入5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的納米SiO?，水凝膠的壓縮強(qiáng)度和彈性模量分別提高了約50%和40%。一些小分子添加劑，如鹽類、糖類等，也能改變水凝膠的力學(xué)性能。鹽類添加劑可以影響水凝膠分子鏈之間的靜電相互作用，從而改變凝膠的力學(xué)性能。在PNIPAM水凝膠中加入氯化鈉（NaCl），隨著NaCl濃度的增加，水凝膠的強(qiáng)度和彈性先增加后降低，這是由于適量的NaCl可以增強(qiáng)分子鏈之間的相互作用，但過高濃度的NaCl會導(dǎo)致分子鏈的聚集和沉淀，破壞凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。3.2.2對細(xì)胞生長的影響適宜的力學(xué)性能對于可注射溫敏性水凝膠作為三維細(xì)胞支架材料至關(guān)重要，它能夠?yàn)榧?xì)胞提供有效的支撐和豐富的力學(xué)信號，進(jìn)而對細(xì)胞的形態(tài)、增殖和分化等生物學(xué)行為產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。從力學(xué)支撐的角度來看，可注射溫敏性水凝膠為細(xì)胞提供了一個(gè)類似于體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的物理支撐環(huán)境。當(dāng)細(xì)胞接種到水凝膠支架上后，水凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠承受細(xì)胞的重量和代謝活動產(chǎn)生的力學(xué)應(yīng)力，維持細(xì)胞的正常形態(tài)和位置。在骨組織工程中，具有較高強(qiáng)度的可注射溫敏性水凝膠支架能夠?yàn)槌晒羌?xì)胞提供穩(wěn)定的支撐，使成骨細(xì)胞能夠在支架上均勻分布并正常生長。研究表明，在壓縮強(qiáng)度為1-5MPa的水凝膠支架中培養(yǎng)成骨細(xì)胞，細(xì)胞能夠在支架上良好地粘附和鋪展，形成緊密的細(xì)胞層。如果水凝膠的力學(xué)性能不足，在細(xì)胞的生長和代謝過程中，水凝膠可能會發(fā)生變形或坍塌，導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)和功能受到影響。當(dāng)水凝膠的壓縮強(qiáng)度低于0.5MPa時(shí)，成骨細(xì)胞在支架上的生長受到明顯抑制，細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，增殖速率也顯著降低。水凝膠的力學(xué)性能還能夠?yàn)榧?xì)胞提供重要的力學(xué)信號，這些信號在細(xì)胞的形態(tài)、增殖和分化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。細(xì)胞通過其表面的整合素等受體與水凝膠表面相互作用，感知水凝膠的力學(xué)性質(zhì)，并將這些力學(xué)信號轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的生化信號，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為。在心肌組織工程中，具有適當(dāng)彈性模量的可注射溫敏性水凝膠支架能夠模擬心肌組織的力學(xué)微環(huán)境，為心肌細(xì)胞提供適宜的力學(xué)信號。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水凝膠的彈性模量在10-50kPa范圍內(nèi)時(shí)，心肌細(xì)胞在支架上能夠形成有序的排列，并且細(xì)胞的收縮功能和電生理特性得到明顯改善。這是因?yàn)檫m宜的彈性模量能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞之間的縫隙連接形成，增強(qiáng)細(xì)胞之間的電信號傳導(dǎo)，從而提高心肌細(xì)胞的同步收縮能力。對于細(xì)胞的增殖和分化，水凝膠的力學(xué)性能同樣具有重要影響。不同的細(xì)胞類型對水凝膠的力學(xué)性能有不同的響應(yīng)。間充質(zhì)干細(xì)胞在不同力學(xué)性能的水凝膠支架上表現(xiàn)出不同的分化傾向。在具有較高彈性模量（10-100kPa）的水凝膠支架中，間充質(zhì)干細(xì)胞更傾向于向成骨細(xì)胞分化。這是因?yàn)檩^高的彈性模量能夠激活細(xì)胞內(nèi)的某些信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。相反，在彈性模量較低（1-10kPa）的水凝膠支架中，間充質(zhì)干細(xì)胞更傾向于向脂肪細(xì)胞分化。這表明水凝膠的力學(xué)性能可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)，影響細(xì)胞的分化命運(yùn)。在細(xì)胞增殖方面，適宜的力學(xué)性能能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖。具有適當(dāng)強(qiáng)度和彈性的水凝膠支架能夠?yàn)榧?xì)胞提供良好的附著點(diǎn)和生長空間，使細(xì)胞能夠更好地?cái)z取營養(yǎng)物質(zhì)和排出代謝產(chǎn)物，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。在軟骨組織工程中，研究表明，在彈性模量為5-15kPa的水凝膠支架中培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞的增殖速率明顯高于在其他彈性模量條件下培養(yǎng)的細(xì)胞。這是因?yàn)檫m宜的彈性模量能夠使水凝膠支架更好地適應(yīng)軟骨細(xì)胞的代謝活動和力學(xué)需求，為細(xì)胞的增殖提供了有利的環(huán)境。3.3生物相容性3.3.1細(xì)胞毒性評估細(xì)胞毒性評估是考察可注射溫敏性水凝膠生物相容性的重要環(huán)節(jié)，主要通過細(xì)胞存活率、形態(tài)觀察、代謝活性檢測等實(shí)驗(yàn)方法來綜合判斷水凝膠對細(xì)胞的潛在毒性影響。細(xì)胞存活率是評估細(xì)胞毒性的關(guān)鍵指標(biāo)之一，常用的檢測方法有MTT法、CCK-8法等。MTT法基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)ⅫS色的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細(xì)胞則無此功能。將不同濃度的可注射溫敏性水凝膠浸提液與細(xì)胞共同培養(yǎng)一定時(shí)間后，加入MTT溶液繼續(xù)孵育，然后用二甲基亞砜（DMSO）溶解形成的甲瓚結(jié)晶，通過酶標(biāo)儀在特定波長下測定吸光度值，吸光度值的大小與活細(xì)胞數(shù)量成正比，從而計(jì)算出細(xì)胞存活率。研究表明，當(dāng)可注射溫敏性水凝膠浸提液濃度在一定范圍內(nèi)時(shí)，細(xì)胞存活率較高，說明水凝膠對細(xì)胞的毒性較低。當(dāng)水凝膠浸提液濃度低于5mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率可達(dá)90%以上，表明該水凝膠在此濃度下具有良好的生物相容性。CCK-8法是一種更為便捷的細(xì)胞增殖和毒性檢測方法，其原理是利用CCK-8試劑中的WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。細(xì)胞活性越高，產(chǎn)生的甲瓚越多，溶液顏色越深，在特定波長下的吸光度值越大。與MTT法相比，CCK-8法操作更為簡便，且檢測靈敏度更高，能夠更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的存活狀態(tài)。細(xì)胞形態(tài)觀察是直觀評估水凝膠細(xì)胞毒性的重要手段。通過光學(xué)顯微鏡、掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）等技術(shù)，可以清晰地觀察細(xì)胞在水凝膠存在下的形態(tài)變化。在光學(xué)顯微鏡下，正常細(xì)胞呈現(xiàn)出規(guī)則的形態(tài)，如成纖維細(xì)胞呈梭形，上皮細(xì)胞呈多邊形。當(dāng)細(xì)胞受到水凝膠的毒性影響時(shí)，可能會出現(xiàn)形態(tài)改變，如細(xì)胞皺縮、變圓、脫落等。研究發(fā)現(xiàn)，在與高濃度的某些水凝膠浸提液接觸后，部分細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的皺縮和變圓現(xiàn)象，表明水凝膠可能對細(xì)胞產(chǎn)生了一定的毒性作用。掃描電子顯微鏡能夠提供細(xì)胞表面形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的詳細(xì)信息。在SEM圖像中，可以觀察到細(xì)胞在水凝膠表面的粘附情況、細(xì)胞的伸展程度以及細(xì)胞與水凝膠之間的相互作用。正常細(xì)胞在良好的生物相容性水凝膠表面能夠均勻粘附并充分伸展，細(xì)胞表面微絨毛清晰可見。而在具有細(xì)胞毒性的水凝膠表面，細(xì)胞粘附數(shù)量減少，且細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面微絨毛稀疏。透射電子顯微鏡則可深入觀察細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)變化。當(dāng)細(xì)胞受到毒性損傷時(shí)，線粒體可能會出現(xiàn)腫脹、嵴斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等現(xiàn)象。通過TEM觀察發(fā)現(xiàn)，在與毒性水凝膠接觸的細(xì)胞中，線粒體明顯腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)紊亂，進(jìn)一步證實(shí)了水凝膠對細(xì)胞的毒性作用。代謝活性檢測也是評估水凝膠細(xì)胞毒性的重要方法之一。細(xì)胞的代謝活性反映了細(xì)胞的生理功能狀態(tài)，常用的檢測指標(biāo)有ATP含量、乳酸脫氫酶（LDH）釋放量等。ATP是細(xì)胞內(nèi)的能量貨幣，其含量的變化可以反映細(xì)胞的能量代謝水平。當(dāng)細(xì)胞受到水凝膠的毒性影響時(shí)，細(xì)胞的能量代謝可能會受到抑制，導(dǎo)致ATP含量下降。通過熒光素酶-熒光素系統(tǒng)，可以定量檢測細(xì)胞內(nèi)的ATP含量。研究表明，在與低毒性的水凝膠共同培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP含量基本保持穩(wěn)定，而在與高毒性水凝膠接觸后，ATP含量顯著降低。乳酸脫氫酶是細(xì)胞內(nèi)的一種重要酶，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，LDH會釋放到細(xì)胞外。通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活性，可以間接反映細(xì)胞的損傷程度。當(dāng)水凝膠具有細(xì)胞毒性時(shí)，培養(yǎng)液中LDH活性會升高。在水凝膠細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)隨著水凝膠浸提液濃度的增加，培養(yǎng)液中LDH活性逐漸升高，表明水凝膠對細(xì)胞的損傷程度逐漸加重。3.3.2細(xì)胞黏附與增殖細(xì)胞在可注射溫敏性水凝膠支架上的黏附和增殖情況是衡量水凝膠生物相容性的重要指標(biāo)，直接關(guān)系到水凝膠在組織工程應(yīng)用中的可行性和有效性。通過多種實(shí)驗(yàn)方法，如熒光染色、掃描電子顯微鏡觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)等，能夠清晰地展示細(xì)胞在水凝膠支架上的黏附和增殖過程。熒光染色實(shí)驗(yàn)中，常用的熒光染料有鈣黃綠素-AM和碘化丙啶（PI）。鈣黃綠素-AM能夠進(jìn)入活細(xì)胞并被酯酶水解產(chǎn)生綠色熒光，而PI只能進(jìn)入死細(xì)胞并與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光。將細(xì)胞接種到水凝膠支架上培養(yǎng)一段時(shí)間后，用鈣黃綠素-AM和PI進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察，可以直觀地看到活細(xì)胞在水凝膠表面的分布情況。研究表明，在具有良好生物相容性的可注射溫敏性水凝膠支架上，大量活細(xì)胞均勻分布，呈現(xiàn)出明亮的綠色熒光，表明細(xì)胞能夠在水凝膠上良好地黏附。掃描電子顯微鏡觀察可以提供細(xì)胞在水凝膠支架上黏附和增殖的微觀細(xì)節(jié)。在SEM圖像中，可以清晰地看到細(xì)胞在水凝膠表面的形態(tài)、細(xì)胞與水凝膠之間的接觸界面以及細(xì)胞的伸展和增殖情況。正常情況下，細(xì)胞在水凝膠表面能夠鋪展并伸出偽足與水凝膠表面相互作用，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，形成細(xì)胞聚集體。對于一些表面具有特殊結(jié)構(gòu)或修飾的水凝膠支架，細(xì)胞的黏附和增殖情況可能會有所不同。表面帶有正電荷修飾的水凝膠支架，由于與帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面存在靜電相互作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附，使得細(xì)胞在支架上的黏附數(shù)量明顯增加，且細(xì)胞鋪展更為充分。細(xì)胞計(jì)數(shù)是量化細(xì)胞增殖的常用方法。通過定期對培養(yǎng)在水凝膠支架上的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，可以繪制出細(xì)胞增殖曲線，直觀地反映細(xì)胞的增殖速率。常用的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法有血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法和細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)法。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法是將細(xì)胞懸液滴加到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)一定體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)法則是利用儀器對細(xì)胞進(jìn)行自動計(jì)數(shù)，具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，在適宜的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞在可注射溫敏性水凝膠支架上的增殖呈現(xiàn)出典型的S型曲線。在培養(yǎng)初期，細(xì)胞處于適應(yīng)期，增殖速率較慢；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞逐漸適應(yīng)水凝膠微環(huán)境，進(jìn)入對數(shù)生長期，增殖速率加快；當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到一定程度后，由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的積累，細(xì)胞增殖速率逐漸減緩，進(jìn)入平臺期。水凝膠的表面性質(zhì)和結(jié)構(gòu)對細(xì)胞的黏附和增殖有著顯著的影響。表面親水性是影響細(xì)胞黏附的重要因素之一。一般來說，親水性較強(qiáng)的水凝膠表面能夠更好地吸附細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，如纖連蛋白、膠原蛋白等，這些蛋白可以作為細(xì)胞黏附的橋梁，促進(jìn)細(xì)胞與水凝膠表面的黏附。以聚乙二醇（PEG）修飾的可注射溫敏性水凝膠為例，PEG的親水性使得水凝膠表面能夠迅速吸附纖連蛋白，從而增強(qiáng)了細(xì)胞在水凝膠上的黏附能力。研究表明，與未修飾的水凝膠相比，PEG修飾的水凝膠表面細(xì)胞黏附數(shù)量增加了約30%。表面電荷也會對細(xì)胞的黏附和增殖產(chǎn)生影響。帶正電荷的水凝膠表面能夠與帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面通過靜電相互作用促進(jìn)細(xì)胞黏附。殼聚糖是一種天然的陽離子多糖，具有正電荷，將殼聚糖引入可注射溫敏性水凝膠中，能夠顯著提高水凝膠表面的正電荷密度，增強(qiáng)細(xì)胞的黏附。研究發(fā)現(xiàn)，在含有殼聚糖的水凝膠支架上，細(xì)胞的黏附數(shù)量明顯增多，且細(xì)胞的增殖速率也有所提高。然而，過高的正電荷密度可能會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，因此需要合理控制水凝膠表面的電荷密度。水凝膠的孔徑大小和孔隙率對細(xì)胞的黏附和增殖同樣具有重要影響。適宜的孔徑大小能夠?yàn)榧?xì)胞提供足夠的空間進(jìn)行黏附和增殖，同時(shí)有利于營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸和代謝產(chǎn)物的排出。一般來說，細(xì)胞在孔徑為幾十到幾百微米的水凝膠支架上能夠更好地黏附和增殖。研究表明，當(dāng)水凝膠的孔徑在100-200μm之間時(shí)，細(xì)胞在支架上的黏附數(shù)量和增殖速率均達(dá)到較高水平。這是因?yàn)檫@樣的孔徑大小既能夠滿足細(xì)胞的生長需求，又能夠保證水凝膠的力學(xué)性能。孔隙率較高的水凝膠能夠提供更多的空間供細(xì)胞生長和遷移，促進(jìn)細(xì)胞之間的相互作用，從而有利于細(xì)胞的增殖。通過優(yōu)化水凝膠的制備工藝，如采用冷凍干燥、3D打印等技術(shù)，可以精確控制水凝膠的孔徑大小和孔隙率，為細(xì)胞提供更加適宜的生長環(huán)境。3.4生物降解性能3.4.1降解機(jī)制可注射溫敏性水凝膠在體內(nèi)或體外的降解過程主要涉及酶解和水解兩種機(jī)制，這兩種機(jī)制在不同的環(huán)境和材料特性下發(fā)揮著重要作用。酶解是一種在生物體內(nèi)由特定酶參與的降解過程。許多可注射溫敏性水凝膠由天然高分子材料制備而成，這些材料在體內(nèi)會受到相應(yīng)酶的作用而發(fā)生降解。以殼聚糖為原料制備的溫敏性水凝膠，在體內(nèi)會受到溶菌酶的作用。溶菌酶能夠特異性地識別并切斷殼聚糖分子鏈中的β-1,4-糖苷鍵，使殼聚糖分子鏈逐漸斷裂，從而導(dǎo)致水凝膠的降解。研究表明，在含有溶菌酶的生理緩沖溶液中，殼聚糖溫敏性水凝膠的質(zhì)量會隨著時(shí)間的延長而逐漸減少，降解速率與溶菌酶的濃度密切相關(guān)。當(dāng)溶菌酶濃度為0.1mg/mL時(shí)，水凝膠在7天內(nèi)的降解率可達(dá)30%左右。在含有蛋白酶的環(huán)境中，基于蛋白質(zhì)類天然高分子（如明膠）的溫敏性水凝膠會發(fā)生酶解降解。蛋白酶能夠催化明膠分子鏈中的肽鍵水解，使明膠分子鏈斷裂，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)水凝膠的降解。這種酶解降解過程具有高度的特異性，酶的種類和活性直接影響著水凝膠的降解速率和降解產(chǎn)物的性質(zhì)。水解是可注射溫敏性水凝膠降解的另一種重要機(jī)制，尤其在體外環(huán)境或體內(nèi)缺乏特定酶的情況下，水解作用更為顯著。對于由合成高分子材料制備的溫敏性水凝膠，如聚乳酸（PLA）、聚己內(nèi)酯（PCL）等，水解是其主要的降解方式。在水的存在下，這些高分子材料的酯鍵會發(fā)生水解反應(yīng)，導(dǎo)致分子鏈逐漸斷裂。以PLA溫敏性水凝膠為例，在中性或弱堿性的水溶液中，水分子會進(jìn)攻PLA分子鏈中的酯鍵，使酯鍵斷裂，生成羧基和羥基。隨著水解反應(yīng)的進(jìn)行，PLA分子鏈逐漸變短，水凝膠的分子量降低，最終降解為小分子物質(zhì)。水解速率受到多種因素的影響，包括水凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)、結(jié)晶度、pH值以及溫度等。一般來說，化學(xué)結(jié)構(gòu)中酯鍵含量較高的水凝膠，水解速率相對較快。PLA中酯鍵含量較高，其水解速率比PCL快。結(jié)晶度較低的水凝膠，由于水分子更容易滲透進(jìn)入分子鏈內(nèi)部，水解速率也會加快。在pH值為7.4的生理緩沖溶液中，結(jié)晶度為30%的PLA溫敏性水凝膠的降解速率比結(jié)晶度為50%的水凝膠快約20%。對于一些復(fù)合可注射溫敏性水凝膠，可能同時(shí)存在酶解和水解兩種降解機(jī)制。由天然高分子（如殼聚糖）和合成高分子（如PLA）復(fù)合制備的溫敏性水凝膠，在體內(nèi)會受到溶菌酶的酶解作用以及水的水解作用。溶菌酶會優(yōu)先作用于殼聚糖部分，使其降解，而PLA部分則主要通過水解作用進(jìn)行降解。這種復(fù)合水凝膠的降解過程較為復(fù)雜，兩種降解機(jī)制相互影響，共同決定了水凝膠的降解速率和降解產(chǎn)物的組成。3.4.2降解速率調(diào)控可注射溫敏性水凝膠的降解速率調(diào)控是其在組織工程應(yīng)用中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過改變材料組成和交聯(lián)方式等手段，可以實(shí)現(xiàn)降解速率與組織修復(fù)進(jìn)程的有效匹配。材料組成對可注射溫敏性水凝膠的降解速率有著顯著影響。對于由天然高分子制備的水凝膠，不同的天然高分子具有不同的降解特性。殼聚糖的降解速率相對較快，而海藻酸鈉的降解速率則相對較慢。在制備溫敏性水凝膠時(shí)，可以通過調(diào)整殼聚糖和海藻酸鈉的比例來調(diào)控降解速率。當(dāng)殼聚糖與海藻酸鈉的質(zhì)量比為3:1時(shí)，水凝膠的降解速率適中，能夠在一定時(shí)間內(nèi)為組織修復(fù)提供支撐，同時(shí)又能在組織修復(fù)完成后逐漸降解。研究表明，在這種比例下，水凝膠在14天內(nèi)的降解率約為50%，能夠較好地滿足一般組織修復(fù)的需求。對于合成高分子材料，通過共聚引入不同的單體可以改變其降解速率。在聚乳酸（PLA）中引入親水性單體，如聚乙二醇（PEG），形成PLA-PEG共聚物。PEG的引入增加了共聚物的親水性，使水分子更容易滲透進(jìn)入分子鏈內(nèi)部，從而加快了水解降解速率。當(dāng)PEG的含量為20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)，PLA-PEG共聚物溫敏性水凝膠的降解速率比純PLA水凝膠提高了約30%。交聯(lián)方式也是調(diào)控可注射溫敏性水凝膠降解速率的重要因素?；瘜W(xué)交聯(lián)和物理交聯(lián)對水凝膠降解速率的影響存在差異。化學(xué)交聯(lián)通常形成較為穩(wěn)定的化學(xué)鍵，使水凝膠的結(jié)構(gòu)更加堅(jiān)固，降解速率相對較慢。以戊二醛交聯(lián)的殼聚糖溫敏性水凝膠為例，戊二醛與殼聚糖分子鏈上的氨基形成穩(wěn)定的亞胺鍵，增強(qiáng)了水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，導(dǎo)致其降解速率較慢。在相同條件下，戊二醛交聯(lián)的殼聚糖水凝膠的降解時(shí)間比未交聯(lián)的殼聚糖溶液延長了約2倍。物理交聯(lián)則主要通過分子間的物理作用力（如氫鍵、疏水相互作用等）形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這種交聯(lián)方式相對較弱，水凝膠的降解速率相對較快。通過溫度誘導(dǎo)的物理交聯(lián)制備的聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）溫敏性水凝膠，其降解速率比化學(xué)交聯(lián)的PNIPAM水凝膠快。在37℃的生理?xiàng)l件下，物理交聯(lián)的PNIPAM水凝膠在7天內(nèi)的降解率可達(dá)40%，而化學(xué)交聯(lián)的水凝膠降解率僅為20%。還可以通過調(diào)整交聯(lián)劑的用量來調(diào)控降解速率。增加交聯(lián)劑的用量，會使水凝膠的交聯(lián)密度增大，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密，降解速率降低。在制備明膠溫敏性水凝膠時(shí)，隨著交聯(lián)劑京尼平用量的增加，水凝膠的交聯(lián)密度增大，降解速率逐漸減慢。當(dāng)京尼平用量從0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）增加到2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)，水凝膠的降解時(shí)間從10天延長至20天左右。四、可注射溫敏性水凝膠用于三維細(xì)胞支架材料的應(yīng)用案例4.1骨組織工程4.1.1案例介紹在某一項(xiàng)深入探究可注射溫敏性水凝膠用于骨組織工程的研究中，科研人員精心設(shè)計(jì)并實(shí)施了一系列實(shí)驗(yàn)，旨在驗(yàn)證水凝膠復(fù)合骨誘導(dǎo)因子和種子細(xì)胞修復(fù)骨缺損的可行性與有效性。實(shí)驗(yàn)選用聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）與殼聚糖復(fù)合制備溫敏性水凝膠。聚N-異丙基丙烯酰胺具備獨(dú)特的溫敏特性，在低溫時(shí)呈現(xiàn)液態(tài)，便于注射操作，當(dāng)溫度升高至接近人體體溫時(shí)，能夠迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，形成穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞提供良好的物理支撐。殼聚糖則是一種天然高分子材料，具有出色的生物相容性、生物可降解性以及一定的抗菌性能，能夠與細(xì)胞外基質(zhì)中的成分相互作用，促進(jìn)細(xì)胞的粘附、增殖和分化。將兩者復(fù)合，有望綜合發(fā)揮各自的優(yōu)勢，制備出性能優(yōu)良的溫敏性水凝膠。在制備過程中，通過精確控制PNIPAM和殼聚糖的比例、反應(yīng)條件以及交聯(lián)方式，成功獲得了具有適宜溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度和良好力學(xué)性能的復(fù)合水凝膠。研究人員對制備得到的水凝膠進(jìn)行了全面的表征分析，運(yùn)用差示掃描量熱法（DSC）精確測定其溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度，結(jié)果顯示該復(fù)合水凝膠的轉(zhuǎn)變溫度約為34℃，接近人體體溫，非常適合在體內(nèi)應(yīng)用。利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其具有均勻的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，孔隙大小分布較為均勻，孔徑在50-200μm之間，這種結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的粘附、生長以及營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸。通過流變學(xué)分析測試水凝膠的力學(xué)性能，結(jié)果表明其具有良好的彈性和一定的強(qiáng)度，能夠滿足骨組織工程支架材料對力學(xué)性能的基本要求。為了進(jìn)一步增強(qiáng)水凝膠促進(jìn)骨組織修復(fù)的能力，研究人員將骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）作為骨誘導(dǎo)因子引入水凝膠體系。BMP-2是一種在骨組織形成和修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨基質(zhì)的合成和礦化。采用物理吸附的方法將BMP-2負(fù)載到水凝膠中，通過優(yōu)化負(fù)載條件，確保BMP-2能夠均勻地分布在水凝膠內(nèi)部，并且在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過程中能夠緩慢、持續(xù)地釋放，以維持其對細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。通過高效液相色譜（HPLC）技術(shù)對BMP-2的負(fù)載量和釋放行為進(jìn)行了精確測定，結(jié)果顯示BMP-2在水凝膠中的負(fù)載量達(dá)到了50μg/g，并且在體外模擬生理?xiàng)l件下，能夠在28天內(nèi)緩慢釋放，釋放曲線呈現(xiàn)出先快后慢的趨勢，前7天的累積釋放量約為30%，隨后釋放速率逐漸減緩，28天時(shí)的累積釋放量達(dá)到了80%左右，這種緩慢、持續(xù)的釋放模式能夠?yàn)楣墙M織修復(fù)提供長期穩(wěn)定的刺激信號。實(shí)驗(yàn)選用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）作為種子細(xì)胞。BMSCs具有多向分化潛能，在適宜的誘導(dǎo)條件下，能夠分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。從實(shí)驗(yàn)動物（如大鼠）的骨髓中成功提取并培養(yǎng)了BMSCs，通過形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測以及多向分化能力鑒定等方法，確保所培養(yǎng)的BMSCs具有良好的生物學(xué)活性和分化潛能。將BMSCs與負(fù)載BMP-2的溫敏性水凝膠進(jìn)行復(fù)合，構(gòu)建細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物。在復(fù)合過程中，嚴(yán)格控制細(xì)胞的接種密度和培養(yǎng)條件，確保BMSCs能夠均勻地分布在水凝膠內(nèi)部，并與水凝膠充分相互作用。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活性檢測等實(shí)驗(yàn)方法，驗(yàn)證了BMSCs在水凝膠中的良好存活和增殖能力。在接種后的第1天，細(xì)胞活性達(dá)到了90%以上，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，在第7天時(shí)，細(xì)胞數(shù)量增加了約2倍，表明BMSCs能夠在水凝膠中良好地生長和增殖。隨后，研究人員構(gòu)建了大鼠顱骨缺損模型，以評估細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物修復(fù)骨缺損的效果。在大鼠顱骨上制備直徑為5mm的圓形缺損，將細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物植入缺損部位，同時(shí)設(shè)置對照組，分別為單純水凝膠組（只植入溫敏性水凝膠，不負(fù)載BMP-2和BMSCs）和空白對照組（不進(jìn)行任何處理）。在術(shù)后的不同時(shí)間點(diǎn)（如2周、4周、8周），對大鼠進(jìn)行處死并取材，通過多種分析手段對骨缺損修復(fù)情況進(jìn)行評估。4.1.2應(yīng)用效果分析從細(xì)胞增殖、分化以及新骨形成等多個(gè)方面對該案例中水凝膠作為骨組織工程支架材料的應(yīng)用效果進(jìn)行深入分析，結(jié)果顯示出顯著的促進(jìn)作用。在細(xì)胞增殖方面，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)對不同組別的細(xì)胞增殖情況進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示，在細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物組中，BMSCs的增殖速率明顯高于單純水凝膠組和空白對照組。在培養(yǎng)的第1-3天，各組細(xì)胞增殖速率較為接近，但從第3天開始，細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物組的細(xì)胞數(shù)量增長迅速加快。在第7天時(shí)，細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物組的細(xì)胞數(shù)量是第1天的3.5倍，而單純水凝膠組和空白對照組的細(xì)胞數(shù)量分別為第1天的2.0倍和1.5倍。這表明負(fù)載BMP-2的溫敏性水凝膠能夠?yàn)锽MSCs提供更加適宜的生長環(huán)境，有效促進(jìn)細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步通過EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）標(biāo)記實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的增殖活性，在熒光顯微鏡下可以清晰地看到，細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物組中EdU陽性細(xì)胞（即處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞）的數(shù)量明顯多于其他兩組，且陽性細(xì)胞分布均勻，這進(jìn)一步證實(shí)了該組中細(xì)胞的增殖活性較高。在細(xì)胞分化方面，通過實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平，包括Runx2（runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2）、Osterix（成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子）和ALP（堿性磷酸酶）等。結(jié)果顯示，在細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物組中，這些成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于單純水凝膠組和空白對照組。在培養(yǎng)第7天時(shí)，Runx2基因的表達(dá)量在細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物組中是單純水凝膠組的3.0倍，是空白對照組的5.0倍。Osterix和ALP基因的表達(dá)量也呈現(xiàn)出類似的趨勢。這表明負(fù)載BMP-2的溫敏性水凝膠能夠有效誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。通過堿性磷酸酶染色和茜素紅染色實(shí)驗(yàn)，從蛋白質(zhì)和細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞的成骨分化情況。堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示，細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物組中堿性磷酸酶陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯多于其他兩組，且染色強(qiáng)度更深，表明該組細(xì)胞中堿性磷酸酶的活性更高。茜素紅染色結(jié)果顯示，在培養(yǎng)第14天時(shí)，細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物組中出現(xiàn)了大量的紅色礦化結(jié)節(jié)，而單純水凝膠組和空白對照組中礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量較少，這表明細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物組中的細(xì)胞已經(jīng)開始大量合成和分泌骨基質(zhì)，并發(fā)生礦化，進(jìn)一步證實(shí)了BMSCs在該組中向成骨細(xì)胞的分化。在新骨形成方面，通過Micro-CT掃描對大鼠顱骨缺損部位的骨修復(fù)情況進(jìn)行了直觀的觀察和定量分析。結(jié)果顯示，在術(shù)后8周，細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物組的骨缺損部位出現(xiàn)了明顯的新骨形成，新骨組織填充了大部分缺損區(qū)域，骨密度和骨體積分?jǐn)?shù)明顯高于單純水凝膠組和空白對照組。定量分析結(jié)果顯示，細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物組的骨體積分?jǐn)?shù)達(dá)到了30%，而單純水凝膠組和空白對照組的骨體積分?jǐn)?shù)分別為10%和5%。骨密度的測量結(jié)果也顯示出類似的趨勢，細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物組的骨密度為0.25g/cm3，明顯高于單純水凝膠組的0.10g/cm3和空白對照組的0.05g/cm3。通過組織學(xué)分析進(jìn)一步觀察新骨形成的情況，對缺損部位進(jìn)行切片，經(jīng)過蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色后，在顯微鏡下可以看到，細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物組中新生骨組織與周圍正常骨組織緊密連接，骨小梁結(jié)構(gòu)清晰，排列較為規(guī)則，且有大量的成骨細(xì)胞附著在骨小梁表面。而單純水凝膠組和空白對照組中新生骨組織較少，骨小梁稀疏，排列紊亂。這些結(jié)果表明，負(fù)載BMP-2和BMSCs的溫敏性水凝膠能夠顯著促進(jìn)新骨形成，有效修復(fù)骨缺損。4.2軟骨組織工程4.2.1案例介紹在某一前沿研究中，科研團(tuán)隊(duì)聚焦于利用溫敏性水凝膠構(gòu)建三維軟骨細(xì)胞培養(yǎng)體系，旨在為軟骨組織工程提供創(chuàng)新的解決方案。該研究選用聚乙二醇?聚乳酸（PEG?PLA）與膽固醇修飾制備溫敏性水凝膠。PEG?PLA是一種常用的生物可降解高分子材料，具有良好的生物相容性和可加工性。其親水性的PEG鏈段賦予水凝膠良好的親水性和溶解性，而疏水性的PLA鏈段則提供了一定的力學(xué)強(qiáng)度和穩(wěn)定性。膽固醇的修飾是該研究的關(guān)鍵創(chuàng)新點(diǎn)之一。膽固醇分布于動物細(xì)胞的細(xì)胞膜上，能介入和調(diào)節(jié)磷脂膜的結(jié)構(gòu)。在PEG?PLA水凝膠中引入膽固醇后，顯著改善了水凝膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及其組裝結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。通過優(yōu)化制備工藝，精確控制PEG?PLA與膽固醇的比例以及反應(yīng)條件，成功制備出具有理想溫敏性能和力學(xué)性能的水凝膠。采用核磁共振波譜（NMR）和傅里葉變換紅外光譜（FT?IR）對水凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果證實(shí)了膽固醇成功修飾到PEG?PLA分子鏈上。利用差示掃描量熱法（DSC）測定水凝膠的溶膠?凝膠轉(zhuǎn)變溫度，發(fā)現(xiàn)該水凝膠的轉(zhuǎn)變溫度約為35℃，接近人體體溫，非常適合在體內(nèi)應(yīng)用。通過流變學(xué)分析測試水凝膠的力學(xué)性能，結(jié)果顯示其具有良好的彈性和一定的強(qiáng)度，能夠滿足軟骨組織工程支架材料對力學(xué)性能的基本要求。在細(xì)胞接種方面，選用從牛關(guān)節(jié)軟骨中提取的軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞。通過酶消化法成功分離出軟骨細(xì)胞，并進(jìn)行了原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，利用倒置顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞在培養(yǎng)初期呈圓形，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，逐漸伸展并呈現(xiàn)出典型的多邊形形態(tài)。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活性檢測等實(shí)驗(yàn)方法，驗(yàn)證了軟骨細(xì)胞在培養(yǎng)過程中