高階思維應(yīng)用12基因組編輯技術(shù)思維探究情境CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)能對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯,其原理是由一條單鏈向?qū)NA(sgRNA)引導(dǎo)內(nèi)切核酸酶Cas9(一種蛋白質(zhì))到一個(gè)特定的基因位點(diǎn)進(jìn)行切割(如圖)。CRISPR復(fù)合體中的sgRNA的主要功能是與靶向基因(目的基因)上特定堿基序列互補(bǔ),從而定向引導(dǎo)Cas9蛋白與靶向基因結(jié)合,并在特定位點(diǎn)切割DNA。CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因生物,與傳統(tǒng)的基因工程相比,其明顯優(yōu)點(diǎn)是可將目的基因定點(diǎn)插入所需位點(diǎn),避免了因目的基因隨機(jī)插入宿主細(xì)胞DNA引起的生物安全性問題。CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在基因治療、基因水平進(jìn)行動(dòng)植物的育種、研究基因的功能等方面有廣闊的應(yīng)用前景。探究(1)利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)敲除一個(gè)長(zhǎng)度為1200bp的基因(R基因),在DNA水平上判斷基因敲除是否成功所采用的技術(shù)是,具體操作流程是_______________________________________。

(2)簡(jiǎn)述利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)敲除R基因,獲取基因敲除動(dòng)物的思路。_______________________________________。

【解析】(1)檢測(cè)對(duì)應(yīng)個(gè)體是否含有相應(yīng)基因應(yīng)采用PCR技術(shù),具體操作流程與基因工程中目的基因的檢測(cè)相同。(2)要想利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)敲除R基因,可以設(shè)計(jì)兩個(gè)基因表達(dá)載體,分別產(chǎn)生能與R基因兩端相結(jié)合的sgRNA1與sgRNA2,且將Cas9基因構(gòu)建在含有sgRNA編碼序列的表達(dá)載體上,通過(guò)基因工程即可在受體細(xì)胞中產(chǎn)生Cas9內(nèi)切酶與sgRNA1與sgRNA2,從而實(shí)現(xiàn)R基因的敲除。答案:(1)PCR技術(shù)提取R基因敲除個(gè)體的DNA分子,根據(jù)R基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否分離出R基因(2)依據(jù)R基因兩端的堿基序列設(shè)計(jì)兩個(gè)sgRNA編碼序列,將其與Cas9基因一起構(gòu)建在表達(dá)載體上,將基因表達(dá)載體導(dǎo)入目標(biāo)動(dòng)物的受精卵,通過(guò)早期胚胎培養(yǎng)和胚胎移植獲得敲除R基因動(dòng)物思維源點(diǎn)CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)1.系統(tǒng)簡(jiǎn)介:(1)當(dāng)細(xì)菌受到噬菌體的侵染時(shí),它的某段DNA序列被內(nèi)切核酸酶剪切后釋放到細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)菌將其作為新的“間隔序列”整合到CRISPR的間隔序列區(qū)域,從而使細(xì)菌“記住”這種外源基因。(2)當(dāng)再次遇到該外源基因時(shí),則在隨后轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的crRNA,crRNA可以引導(dǎo)Cas9內(nèi)切核酸酶找到并切斷噬菌體釋放的噬菌體DNA,從而阻止噬菌體在細(xì)菌體內(nèi)繁殖,以達(dá)到保護(hù)自身的目的。2.系統(tǒng)應(yīng)用:(1)定點(diǎn)編輯基因:可以設(shè)計(jì)一個(gè)表達(dá)載體,載體在細(xì)胞內(nèi)要完成兩件事:一是轉(zhuǎn)錄出一段與待編輯的目標(biāo)DNA片段的特定區(qū)域互補(bǔ)的向?qū)NA(sgRNA),這里的sgRNA相當(dāng)于細(xì)菌體內(nèi)的crRNA;二是表達(dá)出Cas9內(nèi)切核酸酶,它在sgRNA的引導(dǎo)下,找到要編輯的目標(biāo)DNA序列并將其切斷。之后,細(xì)胞內(nèi)天然的DNA修復(fù)過(guò)程被激活,就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的精確編輯。(2)敲除基因:可以設(shè)計(jì)兩個(gè)表達(dá)載體,在細(xì)胞中分別表達(dá)出能與待敲除基因兩端相結(jié)合的sgRNA1、sgRNA2與Cas9內(nèi)切核酸酶,Cas9內(nèi)切核酸酶會(huì)在sgRNA1和sgRNA2的帶領(lǐng)下完成兩次切割,實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的敲除。3.脫靶問題:利用CRISRP/Cas9基因組編輯技術(shù)對(duì)基因組編輯時(shí),可能出現(xiàn)非特異性切割,稱為“脫靶”,為了避免這種現(xiàn)象,可以適當(dāng)增加sgRNA的長(zhǎng)度,設(shè)計(jì)出特異性較強(qiáng)的sgRNA。遷移應(yīng)用1.(多選)(2024·揚(yáng)州模擬)基因組編輯CRISPR/Cas9系統(tǒng)由Cas9蛋白和人工設(shè)計(jì)的向?qū)NA構(gòu)成,在向?qū)NA引導(dǎo)下,Cas9蛋白與靶序列結(jié)合并將DNA雙鏈切斷,從而完成對(duì)目的基因的編輯。下列相關(guān)敘述正確的是()A.Cas9蛋白的功能是準(zhǔn)確識(shí)別DNA特定序列并進(jìn)行切割B.可設(shè)計(jì)向?qū)NA與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域互補(bǔ),從而促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄C.向?qū)NA的序列越短,越容易導(dǎo)致編輯對(duì)象出錯(cuò)而造成“脫靶”D.向?qū)NA的雙鏈區(qū)域的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與目標(biāo)基因的雙鏈區(qū)域不同【解析】選C、D。在向?qū)NA引導(dǎo)下,Cas9蛋白與靶序列結(jié)合并將DNA雙鏈切斷,可見Cas9蛋白不能準(zhǔn)確識(shí)別DNA特定序列,A錯(cuò)誤;可設(shè)計(jì)向?qū)NA與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域互補(bǔ),導(dǎo)致RNA聚合酶不能和啟動(dòng)子結(jié)合,從而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程,B錯(cuò)誤;由于非基因編輯對(duì)象也可能含有與向?qū)NA配對(duì)的堿基序列,故向?qū)NA的序列越短,越容易導(dǎo)致編輯對(duì)象出錯(cuò)而造成“脫靶”,C正確;向?qū)NA的雙鏈區(qū)域的堿基互補(bǔ)配對(duì)為A-U、G-C,目標(biāo)基因的雙鏈的堿基互補(bǔ)配對(duì)為A-T、G-C,D正確。2.(2024·珠海三模)載脂蛋白E(APOE)是由APOE基因編碼的一種經(jīng)典的脂質(zhì)結(jié)合蛋白,介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。干細(xì)胞衰老是機(jī)體衰老的關(guān)鍵表征及驅(qū)動(dòng)力。揭示APOE的人類干細(xì)胞衰老調(diào)控作用,有助于理解人類衰老及相關(guān)疾病的驅(qū)動(dòng)機(jī)制,為上述過(guò)程的干預(yù)提供靶點(diǎn)及候選藥物。(1)為研究APOE的作用,研究人員需敲除APOE基因。方法一:可使用最新基因編輯工具CRISPR/Cas9,它是由Cas9蛋白和sgRNA構(gòu)成的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體,其中的負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合特定DNA序列,引導(dǎo)Cas9蛋白切開鍵,對(duì)目的基因進(jìn)行編輯,敲除APOE基因。

方法二:應(yīng)用基因工程的原理,將新霉素抗性基因即Neo基因插入APOE基因內(nèi)部,利用同源重組技術(shù)制備APOE基因敲除小鼠。①插入Neo基因除了可以破壞APOE基因,還具有的作用最可能是_______________________________________。

②將APOE基因敲除細(xì)胞經(jīng)克隆培養(yǎng)后,采用顯微注射法將其導(dǎo)入正常小鼠的早期胚胎中,再移植到代孕小鼠體內(nèi)可獲得嵌合體APOE基因敲除小鼠。將嵌合體小鼠與野生型小鼠雜交后(假設(shè)子代足夠多)不一定能獲得基因敲除小鼠,原因是_______________________________________。

(2)研究表明,進(jìn)入干細(xì)胞細(xì)胞核的APOE蛋白可作用于細(xì)胞核骨架(與細(xì)胞骨架系統(tǒng)相類似)和異染色質(zhì)蛋白,誘導(dǎo)這些蛋白發(fā)生自噬性降解,影響異染色質(zhì)上的基因的表達(dá),促進(jìn)該種干細(xì)胞的衰老。請(qǐng)根據(jù)以上信息,在圖中添加箭頭和文字說(shuō)明完成模型構(gòu)建(APOE蛋白用▆表示)?！窘馕觥?1)CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由Cas9蛋白和sgRNA構(gòu)成的RNA—蛋白質(zhì)復(fù)合體。其中的sgRNA負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合特定DNA序列,引導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)目的基因進(jìn)行編輯。復(fù)合體中Cas9蛋白能發(fā)揮酶的作用,負(fù)責(zé)切開磷酸二酯鍵,執(zhí)行目的基因的編輯,實(shí)現(xiàn)對(duì)APOE基因的敲除。①根據(jù)題意,在APOE基因內(nèi)部插入Neo基因,可破壞APOE基因。此外,Neo基因是新霉素抗性基因,可作為標(biāo)記基因,便于篩選。②將APOE基因敲除細(xì)胞克隆培養(yǎng)后,采用顯微注射法將其導(dǎo)入正常小鼠的早期胚胎中,再移植到代孕小鼠體內(nèi)可獲得嵌合體APOE基因敲除小鼠。由于嵌合體小鼠的生殖器官中不一定含有基因敲除細(xì)胞,所以將嵌合體小鼠與野生型小鼠雜交后(假設(shè)子代足夠多)不一定能獲得基因敲除小鼠。(2)依題意,APOE蛋白進(jìn)入細(xì)胞核后,作用于細(xì)胞核骨架和異染色質(zhì)蛋白,誘導(dǎo)這些蛋白發(fā)生自噬性降解,影響異染色質(zhì)上的基因的表達(dá),促進(jìn)該種干細(xì)胞的衰老。結(jié)合圖中信息,完整模型如答案圖所示。答案:(1)sgRNA磷酸二酯①作為標(biāo)記基因,便于篩選②嵌合體小鼠的生殖器官中不一定含有基因敲除細(xì)胞(2)【加固訓(xùn)練】CRISPR/Cas9系統(tǒng)可對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯,其工作原理如圖1所示。該系統(tǒng)主要包含單鏈向?qū)NA和Cas9酶兩個(gè)部分,能特異性識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列,從而引導(dǎo)Cas9酶到相應(yīng)位置并剪切DNA,最終實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因序列的編輯。請(qǐng)回答下列問題:(1)圖1為CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用示意圖,該系統(tǒng)能精準(zhǔn)識(shí)別相關(guān)基因的原理是sgRNA與目標(biāo)DNA發(fā)生,Cas9酶可催化(化學(xué)鍵名稱)水解,剪切特定DNA片段。

(2)LMNA基因編碼的核纖層蛋白與維持細(xì)胞核正常形態(tài)有關(guān)?？蒲腥藛T利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)體外培養(yǎng)的HepG2(人源肺癌細(xì)胞)細(xì)胞株進(jìn)行基因編輯,獲得了LMNA基因敲除的穩(wěn)定細(xì)胞系。①體外培養(yǎng)HepG2時(shí)需要添加一定比例的O2和CO2,其中CO2的主要作用是;培養(yǎng)基除滅菌外還需要通過(guò)來(lái)保證無(wú)菌無(wú)毒環(huán)境。

②HepG2細(xì)胞中沒有編碼Cas9的基因,需將Cas9基因及sgRNA基因拼接形成拼接基因并與質(zhì)粒結(jié)合導(dǎo)入HepG2,用圖2中的質(zhì)粒以及含Cas9-sgRNA拼接基因的DNA片段構(gòu)建表達(dá)載體時(shí),應(yīng)選用進(jìn)行酶切。

③將構(gòu)建好的表達(dá)載體與用處理的細(xì)菌置于適宜反應(yīng)體系中培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)的細(xì)菌涂布于含的平板培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24h后挑取菌落,提取質(zhì)粒作為模板,選擇圖3中引物組合和,通過(guò)PCR和電泳技術(shù)鑒定是否重組成功。

④用鑒定重組成功的工程菌對(duì)HepG2進(jìn)行轉(zhuǎn)染,培養(yǎng)三天后收集HepG2,提取基因組,對(duì)其序列進(jìn)行檢測(cè),判斷Cas9-sgRNA拼接基因是否導(dǎo)入成功。若從細(xì)胞水平進(jìn)行檢測(cè),可以檢測(cè)HepG2數(shù)目增長(zhǎng)量或。

【解析】(1)圖1為CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用示意圖,該系統(tǒng)能精準(zhǔn)識(shí)別相關(guān)基因的原理是堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,即sgRNA與目標(biāo)DNA發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì),同時(shí)Cas9蛋白可催化磷酸二酯鍵的水解,從而在特定的部位剪切特定DNA片段。(2)①培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí),CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液pH;由于細(xì)胞產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞具有毒害作用,所以培養(yǎng)基除滅菌外還需要定期更換培養(yǎng)液,同時(shí)可通過(guò)添加一定量的抗生素來(lái)保證無(wú)菌無(wú)毒環(huán)境。②用圖2中的質(zhì)粒以及含Cas9-sgRNA拼接基因的DNA片段構(gòu)建表達(dá)載體時(shí),應(yīng)選用EcoRⅠ進(jìn)行酶切,因?yàn)樵谫|(zhì)粒和目的基因的兩端均含有該酶的切割位點(diǎn),而BamHⅠ的酶切位點(diǎn)正好在標(biāo)記基因內(nèi),因此該酶不能選擇。③將構(gòu)建好的表達(dá)載體與用Ca2+(或CaCl2)處理的細(xì)菌(增加細(xì)菌的通透性,使其處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài))置于適宜反應(yīng)體系中培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)的細(xì)菌涂布于含嘌呤霉素的平板培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,凡是能正常生長(zhǎng)的菌落即為帶有目的基因的細(xì)菌,37℃培養(yǎng)24h后挑取菌落,提取質(zhì)粒作為模板,根據(jù)圖中目的基因兩側(cè)的堿基序列以及引物的堿基順序,結(jié)合堿基互補(bǔ)配對(duì)原則可選擇圖3中引物組合Ⅱ和Ⅲ進(jìn)行體外DNA復(fù)制,通過(guò)PCR和電泳技術(shù)鑒定是否重組成功。④用鑒定重組成功的工程菌對(duì)HepG2進(jìn)行轉(zhuǎn)染,培養(yǎng)三天后收集HepG2,提取基因組,由于DNA具有特異性,可對(duì)其堿基(或核苷酸)序列進(jìn)行檢測(cè),判斷Cas9-sgRNA拼接基因是否導(dǎo)入成功。若從細(xì)胞水平進(jìn)行檢測(cè),可以通過(guò)檢測(cè)HepG2數(shù)目增長(zhǎng)量或細(xì)胞核形態(tài)是否變化來(lái)判斷。答案:(1)堿基互補(bǔ)配對(duì)磷酸二酯鍵(2)①維持培養(yǎng)液pH定期更換培養(yǎng)液(或添加一定量的抗生素或無(wú)菌操作)②EcoRⅠ③Ca2+(或CaCl2)嘌呤霉素ⅡⅢ④堿基(或核苷酸)細(xì)胞核形態(tài)3.(2024·唐山一模)為研究組蛋白去乙?；?(HDAC8)基因的生物學(xué)功能,研究者以斑馬魚為研究對(duì)象,通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建HDAC8基因缺失的突變模型(如圖1所示)?；卮鹣铝袉栴}:(1)據(jù)圖1分析可知:CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可實(shí)現(xiàn)靶向切除HDAC8基因的原理是Cas9蛋白—sgRNA復(fù)合體中sgRNA識(shí)別并與目標(biāo)DNA中的靶點(diǎn)序列結(jié)合,其中sgRNA與靶點(diǎn)序列結(jié)合的堿基序列為;Cas9蛋白作用于目標(biāo)DNA的(填化學(xué)鍵)使雙鏈斷裂,實(shí)現(xiàn)對(duì)HDAC8基因敲除。

(2)sgRNA是由體外轉(zhuǎn)錄形成的,其基因的上游具有,該結(jié)構(gòu)的作用是。

(3)通過(guò)對(duì)野生型斑馬魚和實(shí)施HDAC8基因敲除的斑馬魚HDAC8進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖2所示(數(shù)字表示HDAC8氨基酸的數(shù)量)。研究人員認(rèn)為HDAC8基因敲除成功,理由是,功能喪失。出現(xiàn)圖2結(jié)果的原因可能是HDAC8基因轉(zhuǎn)錄的mRNA中提前出現(xiàn)。

(4)將敲除成功的純合斑馬魚與野生型斑馬魚雜交,F1自由交配得F2。將F2不同類型的斑馬魚標(biāo)記后放歸到有捕食性天敵的野外水域中,一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)突變純合子數(shù)量明顯減少,而其他類型的數(shù)量幾乎沒變。請(qǐng)結(jié)合圖3解釋突變純合子數(shù)量變化的原因:_______________________________________。

【解析】(1)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的原理是Cas9蛋白—sgRNA復(fù)合體中sgRNA識(shí)別并與目標(biāo)DNA中的靶點(diǎn)序列結(jié)合,圖中靶點(diǎn)序列為3'-GTTAC-5',根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,sgRNA與靶點(diǎn)序列結(jié)合的堿基序列為5'-CAAUG-3';Cas9使目標(biāo)DNA斷裂,故作用的化學(xué)鍵為磷酸二酯鍵。(2)sgRNA是由體外轉(zhuǎn)錄形成的,其基因的上游具有啟動(dòng)子,啟動(dòng)子的功能是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位,驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。(3)分析圖2,基因敲除斑馬魚HDAC8蛋白長(zhǎng)度變短,故推測(cè)基因敲除成功。HDAC8蛋白長(zhǎng)度變短的原因可能是HDAC8基因轉(zhuǎn)錄的mRNA中終止密碼子提前出現(xiàn)。(4)將敲除成功的純合斑馬魚與野生型斑馬魚雜交,F1自由交配得F2。將F2不同類型的斑馬魚標(biāo)記后放歸到有捕食性天敵的野外水域中,一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)突變純合子數(shù)量明顯減少,而其他類型的數(shù)量幾乎沒變。結(jié)合圖3解釋突變純合子數(shù)量變化的原因:(HDAC8基因被敲除后,)突變純合子的運(yùn)動(dòng)能力(游動(dòng)速度、活動(dòng)性、運(yùn)動(dòng)距離)下降,更容易被天敵捕捉。答案:(1)5'-CAAUG-3'磷酸二酯鍵(2)啟動(dòng)子RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位,驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄(3)基因敲除斑馬魚HDAC8蛋白長(zhǎng)度變短終止密碼子(4)(HDAC8基因被敲除后,)突變純合子的運(yùn)動(dòng)能力(游動(dòng)速度、活動(dòng)性、運(yùn)動(dòng)距離)下降,更容易被天敵捕捉4.(2023·天津高考)構(gòu)建可利用纖維素產(chǎn)乙醇的轉(zhuǎn)基因釀酒酵母菌株是解決能源危機(jī)的手段之一,為此設(shè)計(jì)表達(dá)載體,思路如下。(1)外源基因的選擇:纖維素常見生物降解途徑如下。釀酒酵母通常無(wú)法吸收纖維素、寡糖和纖維二糖,應(yīng)向釀酒酵母轉(zhuǎn)入上圖中三種酶的基因,并使其表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞(填“內(nèi)”或“外”)發(fā)揮作用。

(2)外源基因的插入方法:同源重組是堿基序列基本相同的DNA區(qū)段通過(guò)配對(duì)、鏈斷裂和再連接而產(chǎn)生片段交換的過(guò)程。通過(guò)同源重組將外源基因插入染色體的特定位點(diǎn)可獲得遺傳穩(wěn)定的工程菌株,如甲圖所示。釀酒酵母基因組有多個(gè)AB短序列。為通過(guò)同源重組將外源基因插入A、B之間,在設(shè)計(jì)表達(dá)載體時(shí),可采用PCR技術(shù)在外源基因兩端分別引入A和B,獲得乙圖所示長(zhǎng)片段。PCR時(shí)應(yīng)選用的一對(duì)引物為(從P1~P6中選)。

(3)標(biāo)記基因的選擇:URA3是尿嘧啶合成關(guān)鍵酶基因,常被用作標(biāo)記基因。另外,URA3編碼的蛋白可將外源5-氟乳清酸轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì),導(dǎo)致細(xì)胞死亡。①為得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株1,需將酶Ⅰ基因同URA3一起插入U(xiǎn)RA3缺陷型釀酒酵母基因組A、B之間,并利用的培養(yǎng)基篩選存活菌株。

②在后續(xù)插入酶Ⅱ基因時(shí),為繼續(xù)利用URA3作為篩選標(biāo)記,需切除菌株1的URA3。為此設(shè)計(jì)表達(dá)載體時(shí),還應(yīng)向URA3兩端引入釀酒酵母基因組中不存在的同源區(qū)段C和C',并以下圖方式排列才能通過(guò)同源重組達(dá)到上述目的。

此后,需要將菌株1在的培養(yǎng)基上培養(yǎng),存活菌株即為URA3被成功切除的菌株1'。

(4)表達(dá)載體的構(gòu)建:綜上,將三種酶基因依次插入釀酒酵母基因組中,在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí),A、B、C、C'、URA3和酶基因應(yīng)采用下圖(填數(shù)字)的排布方式。

【解析】(1)據(jù)題意,釀酒酵母需利用纖維素作為生產(chǎn)乙醇的原料,但釀酒酵母菌株無(wú)法直接吸收利用纖維素等糖類,所以酶Ⅰ、酶Ⅱ和酶Ⅲ應(yīng)為胞外酶,在細(xì)胞外催化纖維素生物降解為葡萄糖后,再被釀酒酵母吸收利用。因此三種酶的基因表達(dá)產(chǎn)物應(yīng)在細(xì)胞外發(fā)揮作用。(2)同源重組需要在外源基因兩端分別引入A和B,可通過(guò)PCR方法實(shí)現(xiàn)三個(gè)片段的連接。引物對(duì)P3/P4只能擴(kuò)增外源基因,引物對(duì)中含P2或P5則不能有效擴(kuò)增。而引物P1(P6)同時(shí)包含A(B)和外源基因部分序列,可達(dá)到設(shè)計(jì)要求。故選用的一對(duì)引物為P1和P6。(3)①URA3作為標(biāo)記基因,其表達(dá)產(chǎn)物可以合成細(xì)胞代謝所必需的尿嘧啶,所以在篩選被轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞時(shí),需在培養(yǎng)基中去除尿嘧啶,無(wú)URA3(連同目的基因)的酵母細(xì)胞將無(wú)法存活,因此可篩選出含有目的基因及URA3的受體細(xì)胞。②如題圖所示,方式1中URA3兩側(cè)C、C'是反向同源序列,方式2中URA3兩側(cè)C、C'是同向同源序列。在發(fā)生同源重組時(shí),方式1只是導(dǎo)致URA3序列倒位,但不會(huì)切除URA3;而方式2將導(dǎo)致URA3以環(huán)狀小分子形式被切除,并在細(xì)胞分裂過(guò)程中因不能復(fù)制而丟失。所以選方式2。此后,菌株1'因不含URA3,可在含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的培養(yǎng)基上存活,而沒有成功切除URA3的菌株,會(huì)將5-氟乳清酸轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì),導(dǎo)致細(xì)胞死亡。(4)在明確了表達(dá)載體整體構(gòu)建思路后,最終的表達(dá)載體需要同時(shí)滿足兩個(gè)條件:一是需要將URA3標(biāo)記基因與目的基因(酶基因)一起插入釀酒酵母基因組A、B之間,所以A、B應(yīng)置于標(biāo)記基因與目的基因最外側(cè);二是需要利用C、C'片段切除URA3標(biāo)記基因,同時(shí)不能影響酶基因,所以C、C'應(yīng)緊鄰URA3兩側(cè)。同時(shí)滿足上述條件的只有圖4。答案:(1)外(2)P1和P6(3)①不含尿嘧啶②2含有5-氟乳清酸和尿嘧啶(4)45.(2024·邢臺(tái)模擬)Cre/lox重組酶系統(tǒng)是一種用于細(xì)胞DNA的特定位點(diǎn)上的特異性重組酶技術(shù),其特點(diǎn)在于可以對(duì)指定的特定細(xì)胞群進(jìn)行DNA修改。該技術(shù)使用Cre重組酶對(duì)loxP序列(由反向重復(fù)序列和間隔序列組成)的間隔序列進(jìn)行切割,機(jī)制如圖1所示。回答下列問題:(1)Cre酶切開的化學(xué)鍵為。Cre酶切開一個(gè)loxP序列后形成的黏性末端分別可表示為(標(biāo)出3'端或5'端)。

(2)科研人員利用Cre-lox重組技術(shù)研究小鼠(小鼠的基因型均為AA)基因A的功能。若欲通過(guò)受精卵改造小鼠,則要將受精卵的所有A基因兩側(cè)都加入同向loxP序列(即),至少需要向受精卵加入個(gè)loxP序列。在小鼠的部分細(xì)胞中,A基因會(huì)被Cre酶切下,切下的A基因片段由于自身含有