ICS71.100.70CCSY42IT/SPMA008-2023前言 12規(guī)范性引用文件 13術語和定義 14原理 15儀器和設備 26主要試劑及耗材 27試驗方法 28結果計算 69試驗有效性判定 610結果報告 611結果相關性解讀 7附錄A（資料性）溶液制備 8附錄B（資料性）肥大細胞脫顆粒狀態(tài)圖片示例 9T/SPMA008-2023本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由上海市預防醫(yī)學會提出并歸口。本文件起草單位：上海市疾病預防控制中心、廣東博溪生物科技有限公司、德之馨香精香料（南通）有限公司、浙江養(yǎng)生堂天然藥物研究所有限公司、云南貝泰妮生物科技集團股份有限公司、片仔癀（上海）生物科技研發(fā)有限公司、時垠(上海)生物科技有限公司、北京鑫金證國際技術服務有限公司、常州諳美生物科技有限公司、東阿阿膠股份有限公司、上海海關技術中心、南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院、上海家化聯(lián)合股份有限公司、上海嘉亨日用化學品有限公司、上海測譜檢測技術有限公司、上海其然生物科技有限公司、上海永熙信息科技有限公司。本文件首期承諾執(zhí)行單位：上海市疾病預防控制中心、廣東博溪生物科技有限公司、德之馨香精香料（南通）有限公司、浙江養(yǎng)生堂天然藥物研究所有限公司、云南貝泰妮生物科技集團股份有限公司、片仔癀（上海）生物科技研發(fā)有限公司、時垠(上海)生物科技有限公司、北京鑫金證國際技術服務有限公司、常州諳美生物科技有限公司、東阿阿膠股份有限公司、上海海關技術中心、南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院、上海家化聯(lián)合股份有限公司、上海嘉亨日用化學品有限公司、上海測譜檢測技術有限公司、上海其然生物科技有限公司、上海永熙信息科技有限公司。本文件主要起草人：陶功華、崔文廣、陳田、應夢超、盧永波、勞樹權、王莎莎、王飛飛、謝阿貴、廖峰、許春暉、錢陳、洪新宇、李竹、周利紅、李瀟、王銀娟、任君宇、張正方、李晶晶、黃燕紅、魏春花、袁登峰、常懷龍、李小林、田守生、葉理、張坤、曹平、魯楠、袁旻嘉、喻竟。本文件為首次制定。1T/SPMA008-2023化妝品舒緩功效測試方法基于體外肥大細胞的脫顆粒抑制率及組胺釋放量檢測本文件規(guī)定了小鼠肥大細胞細胞系P815脫顆粒抑制率檢測和體外鼠源腹腔肥大細胞組胺含量檢測的方法。本文件適用于化妝品舒緩功效的測試評價。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1肥大細胞mastcell產生于骨髓造血干細胞，隨血流遷移到特定的組織中，并在特定環(huán)境下進行局部增殖并分化成熟。3.2肥大細胞脫顆粒mastcelldegranulation肥大細胞的一種功能狀態(tài)，是超敏反應發(fā)生的基礎。3.3組胺histamine強效的炎性介質，是動植物體內的一種生物胺，其主要由肥大細胞和嗜堿性粒細胞分泌。4原理具有舒緩功效的化妝品有助于改善皮膚刺激等狀態(tài)。皮膚刺激狀態(tài)的發(fā)生主要涉及皮膚屏障-神經血管-免疫炎癥的生理過程，通過舒緩皮膚炎癥反應可以改善皮膚刺激等問題。肥大細胞是一種重要的免疫細胞，非免疫性刺激（如C48/80、黃蜂毒素、神經肽P物質等），可以觸發(fā)肥大細胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯等生物活性介質。這些炎癥介質作用在皮膚上會引起平滑肌收縮和微血管通透性升高，造成組織損傷和變態(tài)反應。通過抑制肥大細胞脫顆粒和釋放組胺等炎性介質，可以起到改善皮膚刺激狀態(tài)，達到舒緩的功效。2T/SPMA008-2023使用非免疫性刺激物C48/80誘導肥大細胞，觸發(fā)細胞脫顆粒現象，采用計數法測定脫顆粒細胞數量，計算受試物的脫顆粒抑制率，通過與陰性對照組的比較，評價受試物的舒緩功效。使用神經肽P物質（substanceP,SP）刺激腹腔肥大細胞促使其細胞脫顆粒并釋放大量組胺，收集細胞培養(yǎng)上清，采用競爭性酶免疫分析法檢測受試物作用細胞后對組胺釋放量的抑制作用，評價受試物的舒緩功效。5儀器和設備5.1分析天平：精度0.1mg。5.2CO2培養(yǎng)箱：37℃,飽和濕度、5%CO2/空氣。5.3倒置顯微鏡。5.4離心機。5.5調節(jié)移液槍：1000μL、200μL、50μL、10μL。5.6細胞計數儀。5.7酶標儀：配置450nm光片。5.8超凈工作臺。6主要試劑及耗材除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，與細胞培養(yǎng)相關試劑、耗材均需經過無菌處理。6.1細胞脫顆粒抑制率檢測選用小鼠肥大細胞瘤細胞P815（建議細胞株來源于美國典型物質保藏中心，ATCC組胺釋放量檢測選用小鼠原代分離所獲腹腔肥大細胞。如果培養(yǎng)條件能滿足細胞的特殊需要，其他肥大細胞也可用于本試驗，但應證明其等同性。6.2細胞培養(yǎng)涉及試劑及耗材高糖DMEM培養(yǎng)液、新生牛血清、細胞培養(yǎng)瓶、臺式液、KM小鼠、重組小鼠干細胞因子、重組小鼠IL-3、RPMI1640培養(yǎng)基、percoll細胞分離液、甲苯胺藍染色液。6.3檢測涉及試劑及耗材色甘酸鈉、compound48/80（C48/80）、細胞培養(yǎng)板（規(guī)格24孔）、P物質、組胺酶聯(lián)免疫試劑盒（內7試驗方法7.1脫顆粒抑制率檢測7.1.1細胞準備將冷凍保存的細胞培養(yǎng)物以一個合適的密度接種到培養(yǎng)液，并在檢測前至少傳代一次。細胞應以合適的密度接種到培養(yǎng)液中用于試驗，細胞接種密度應保證在接種12h后，融合度達到45%~60%。7.1.2受試物準備3T/SPMA008-20237.1.2.1除非有穩(wěn)定性數據證明儲備液可接受，否則受試物應在使用前新鮮配制并直接使用（見附錄A）。7.1.2.2水中溶解度受限的受試物應溶解在適當的溶劑中，溶劑體積應在所有培養(yǎng)物中保持一致，即在陰性對照和受試物中保持一致，且無細胞毒性。受試物濃度的選擇應避免出現沉淀和溶液呈現云霧狀。7.1.2.3建議使用二甲基亞砜（DMSO）和無水乙醇作為溶劑。在使用溶劑前，應依據受試物的特殊性質，評估受試物是否與溶劑發(fā)生反應。7.1.2.4可以使用渦旋混合/或超聲處理和/或加熱到適當溫度等方法輔助溶解，除非這些操作會影響到受試物的穩(wěn)定性。7.1.3試驗條件7.1.3.1受試物濃度應通過細胞毒性測試確定受試物的濃度范圍，選擇細胞活力≥90%的受試物濃度。7.1.3.2刺激條件Compound48/80作為外源非免疫性激活劑，可以激活肥大細胞發(fā)生脫顆?，F象。Compound48/80推薦暴露劑量為40μg/mL，具體暴露劑量可根據實驗室培養(yǎng)細胞特點及選用細胞系特性進行調整。與空白對照相比，細胞培養(yǎng)板內至少30%的細胞出現脫顆?，F象，說明刺激有效。7.1.3.3陽性對照每一次試驗都應同步設置陽性對照組。陽性劑推薦使用色甘酸鈉，暴露終濃度為1mg/mL。具體的暴露劑量可根據各實驗室培養(yǎng)細胞特性進行調整。陽性對照組一般要求脫顆粒抑制率≥20%。7.1.4試驗步驟7.1.4.1細胞消化、接種7.1.4.1.1將T75培養(yǎng)瓶中細胞懸液收集至離心管中，800r/min離心6min。7.1.4.1.2棄掉上清液，向離心管中加入5mL細胞培養(yǎng)液，彎頭吸管吹打混勻細胞，細胞計數儀進行計數。7.1.4.1.3用細胞培養(yǎng)液稀釋細胞至接種密度。細胞接種密度應保證在接種12h后細胞融合度達到40%~60%，建議接種密度為6.5×104~7.5×104cells/孔，可根據實驗室細胞特點進行調整。7.1.4.1.4接種結束后，放置于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、95%RH）中培養(yǎng)24h±2h。7.1.4.2誘導及受試物處理7.1.4.2.1使用移液器槍頭從培養(yǎng)液表面吸棄培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，受試物組加入含有受試物和Compound48/80的無血清高糖DMEM培養(yǎng)液，陰性對照組加入含有Compound48/80的無血清高糖DMEM培養(yǎng)液，陽性對照組加入含有陽性劑和Compound48/80的無血清高糖DMEM培養(yǎng)液，空白對照組加入無血清高糖DMEM培養(yǎng)液，每孔1mL。每組均應設立3個復孔。4T/SPMA008-20237.1.4.2.2受試物處理完畢后，將細胞培養(yǎng)板放置于培養(yǎng)箱中（37℃、5%CO2、95%RH每隔10min觀察一次陰性對照組細胞的脫顆粒狀態(tài)，與空白對照相比，30%~60%范圍內的細胞出現脫顆粒現象時，將細胞培養(yǎng)板放置在0℃冰水浴中靜置10min，終止C48/80的誘導刺激。7.1.4.3拍照終止反應后對肥大細胞進行拍照，每組在40倍物鏡下從中央向一個方向上，選擇融合度相似的3個區(qū)域，每個區(qū)域拍攝1張照片（見附錄B）。7.1.4.4脫顆粒細胞數統(tǒng)計用圖像分析軟件或人工計數方式分別統(tǒng)計各組40倍物鏡下拍攝的3張照片中脫顆粒細胞與所有細胞的數量。細胞形態(tài)學辨別分以下兩種特征：未脫顆粒細胞形態(tài)為細胞膜光滑、完整、明亮，胞質均勻、幾乎無顆粒；脫顆粒細胞形態(tài)為細胞膜粗糙、不規(guī)則，細胞質內顆粒光曲折率低，胞質或細胞膜周圍可見胞吐顆粒，即脫顆粒現象。7.2組胺釋放量檢測7.2.1細胞準備7.2.1.1小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇腹部消毒，腹腔注入5mL預冷無Ca2+Tyrode液，按摩腹部5min。7.2.1.2沿腹白線切開腹腔，用5mL無菌注射器吸取腹腔沖洗液至50mL無菌帶蓋塑料離心管中，于4℃、1500r/min離心4min。7.2.1.3棄上清液，加10mL無Ca2+Tyrode液。7.2.1.4配制30%:80%的percoll梯度分離液，比例為1:1，30%與80%的percoll各加10mL，按濃度從高到低加入10mL離心管中。7.2.1.5將“7.2.1.3”中收集的細胞懸液緩慢加入30%:80%Percoll梯度分離液的離心管上層，三者7.2.1.6于4℃、4000r/min離心5min，收集界面細胞，用無Ca2+Tyrode液洗滌2次，4℃、1000r/min離心10min。7.2.1.7顯微鏡下計數，使用無Ca2+Tyrode液調整細胞密度至5×106~6×106cells/mL。臺盼藍染色檢測細胞活力，甲苯胺藍染色檢測細胞純度。7.2.2細胞鑒定7.2.2.1細胞活性鑒定7.2.2.1.1肥大細胞正常結構呈圓形或卵圓形，取細胞懸液20μL，加20μL臺盼藍染液，充分混勻染色2min，然后加樣于細胞計數板加樣槽內，分別進行細胞計數和細胞活力的測定。7.2.2.1.2細胞活力（活細胞率）=活細胞數活細胞數+死細胞數）×100%。7.2.2.2細胞特性鑒定5T/SPMA008-20237.2.2.2.1取細胞懸液20μL，加20μL甲苯胺藍染液，充分混勻染色2min，然后加樣于細胞計數板加樣槽內，進行肥大細胞純度的檢測，肥大細胞被染成紅-紫色，其他細胞被染成藍色。7.2.2.2.2計算公式為：肥大細胞純度=肥大細胞數肥大細胞數+非肥大細胞數）×100％。7.2.3受試物準備7.2.3.1受試物應在使用前新鮮配制并直接使用。7.2.3.2水中溶解度受限的受試物應當溶解在適當的溶劑中，溶劑體積應當在所有培養(yǎng)物中保持一致，即在陰性對照組和所有試驗組保持一致，并且無細胞毒性。受試物濃度的選擇應避免出現沉淀或溶液呈現云霧狀。7.2.3.3建議使用二甲基亞砜（DMSO）和乙醇作為溶劑。在使用溶劑前，應依據受試物的特殊性質，評估受試物是否與溶劑發(fā)生反應。7.2.3.4在不影響受試物穩(wěn)定性的條件下，可使用渦旋混合/或超聲處理和/或加熱到適當溫度等方法輔助溶解。7.2.4試驗條件7.2.4.1受試物濃度應當通過細胞毒性測試確定受試物的濃度范圍。建議選用來源相同、同一代次的細胞開展細胞毒性測試，以確保試驗的一致性。例如選擇細胞活力≥90%，且細胞形態(tài)與對照組無明顯差異的濃度。7.2.4.2試驗分組實驗需設置空白對照組、陰性對照組、陽性對照組和受試物組，每組均設立3個復孔。7.2.4.3陽性對照每一次試驗都應同步設置陽性對照。陽性劑推薦使用氯化鈣或二氫燕麥?；彴被郊姿酓（見附錄A），暴露終濃度分別為1μg/mL和500μg/mL。具體的暴露濃度可根據各實驗室培養(yǎng)細胞特性進行調整。陽性對照組一般要求組胺抑制率≥25%。7.2.5試驗步驟7.2.5.1細胞培養(yǎng)及受試物前處理將分離所獲的細胞用培養(yǎng)液重懸至細胞密度為5×106~6×106cells/mL，各取100μL細胞懸液加入細胞培養(yǎng)板中，于37℃孵育4h。對于陽性對照組和試驗組需提前加入特定濃度陽性標準品和樣品于37℃培養(yǎng)4h。培養(yǎng)液為含10%胎牛血清(v/v)、50U/ml青霉素、50mg/ml鏈霉素、2mMl-谷氨酰胺、30ng/ml重組小鼠干細胞因子、10ng/ml重組小鼠IL-3的RPMI1640培養(yǎng)基。陽性對照各劑量組和受試物組均應設立3個復孔。7.2.5.2細胞刺激收集“7.2.5.1”培養(yǎng)后細胞，離心后棄上清，切換為臺式液重懸，按試驗分組進行分配?？瞻讓φ占毎蛔鎏幚?，陰性對照組、陽性對照組、受試物組的處理液中均添加終濃度為10μM的P物質。7.2.5.3樣品收集6T/SPMA008-2023將上述細胞于37℃孵育30min，收集細胞培養(yǎng)板中所有細胞和處理液，于3000r/min離心5min，取上清進行ELISA檢測。7.2.5.4ELISA檢測ELISA檢測按照組胺酶聯(lián)免疫試劑盒的使用說明書進行。在正式檢測前，應設定稀釋比例并進行預實驗，確定ELISA檢測試驗組的稀釋比例，以保證檢測數值落在標準曲線范圍內。根據實驗室的儀器特點，可選用具有類似功能的檢測設備，如熒光酶標儀、熒光分光光度計等。8結果計算8.1脫顆粒率計算脫顆粒率=照片區(qū)域內的脫顆粒細胞數量/照片區(qū)域內的細胞總數量×100%。8.2組胺含量計算推薦使用專業(yè)曲線制作軟件，以組胺酶聯(lián)免疫試劑盒內附標準品的濃度為縱坐標，OD450值為橫坐標，制作標準曲線，根據受試物組的OD450值，查出相應的濃度；或用標準品的濃度與OD450值計算出標準曲線的回歸方程式，將受試物組的OD450值代入方程式，計算組胺含量。取各組3個復孔的平均值作為最終的組胺含量結果。8.3脫顆粒/組胺釋放抑制率計算式中：T—受試物組脫顆粒率/組胺含量的3次平均值；C—陰性對照組脫顆粒率/組胺含量的3次平均值。9試驗有效性判定9.1脫顆粒抑制率檢測每批次試驗應設置陽性對照組，要求每批次測試陽性對照組均能檢出脫顆粒抑制產生的效果，且與陰性對照組相比，脫顆粒抑制率≥20%，判定試驗體系有效。9.2組胺釋放量檢測每批次試驗應設置陰性對照組和陽性對照組，要求每批次陰性對照組與空白對照組相比，組胺含量上調≥20%且差異具統(tǒng)計學意義（P<0.05陽性對照組每批次均具有組胺抑制作用，且與陰性對照組相比，組胺抑制率≥20%且差異具統(tǒng)計學意義（P<0.05），判定試驗體系有效。10結果報告10.1脫顆粒抑制率檢測7T/SPMA008-2023受試物在某一測試濃度下的脫顆粒細胞數量百分比（脫顆粒率）應表述為：脫顆粒率平均值±標準差（SD）。評價受試物抑制脫顆粒產生的能力，受試物組與陰性對照組的差異應具有統(tǒng)計學意義（P<0.05且有抑制率具體數值。對于受試物脫顆粒抑制率的表述，應包含受試濃度。10.2組胺釋放量檢測受試物在某一測試濃度下的組胺釋放量應表述為：組胺含量的平均值±標準差（SD）。評價受試物抑制組胺釋放的能力，受試物組與陰性對照組的組胺含量差異應具有統(tǒng)計學