DB65/T4091—2018細(xì)毛羊羊毛自然長度的分子檢測技術(shù)規(guī)程2018-1-25發(fā)布2018-2-25實施新疆維吾爾自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I標(biāo)準(zhǔn)下載本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》要求編寫。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆維吾爾自治區(qū)畜牧廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)和新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：黃錫霞、田可川、趙冰茹、王旭光、狄江、田月珍、徐新明、付雪峰、吳偉偉、11范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了LAMB1基因rs159769941SNP位點輔助鑒定細(xì)毛羊羊毛自然長度的分子檢測方法的原理、主要試劑和溶液配制、儀器設(shè)備及耗材、檢測方法、結(jié)果判定、廢棄物處理和防止污染的措施。本標(biāo)準(zhǔn)適用于LAMB1基因rs159769941SNP位點輔助鑒定細(xì)毛羊羊毛自然長度的分子檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法GB/T19915.9豬鏈球菌2型溶血素基因PCR檢測方法SN/T1193基因檢驗實驗室技術(shù)要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。層粘連蛋白β1基因(laminin-beta-1,LAMB1)由細(xì)胞外基底膜異源三聚體的糖蛋白組成，定位在綿羊4號染色體上，由33個外顯子組成，編碼1953個氨基酸，存在于血清中，參與細(xì)胞附著和趨化作用，可能通過其β1鏈綁定層粘連蛋白受體。LAMB1作為血管基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的主要功能成分，在細(xì)胞粘附遷移、胚胎發(fā)育、血管生成、組織分化等生物過程中發(fā)揮重要作用。LAMB1主要通過與細(xì)胞上的各種受體結(jié)合而發(fā)揮作用，大多數(shù)受體是整合素家族成員之一，介導(dǎo)細(xì)胞與基質(zhì)和細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附。LAMB1基因rs159769941SNP位成脯氨酸(P)。研究表明，該突變與細(xì)毛羊羊毛的自然長度性狀密切相關(guān)，當(dāng)基因型為TT型時，則待測細(xì)毛羊?qū)儆谘蛎匀婚L度長的細(xì)毛羊；當(dāng)基因型為TC型或CC型時，則待測細(xì)毛羊?qū)儆谘蛎匀婚L度短于TT基因型的細(xì)毛羊。細(xì)毛羊fine-woolsheep2單核苷酸多態(tài)性singlenucleotidepolymorphism(SNP)的作用和適宜的反應(yīng)條件下，根據(jù)模板序列設(shè)計的兩條引物分別與模板DNA序列發(fā)生退火而相互結(jié)合，接著在DNA聚合酶的作用是根據(jù)單鏈DNA片段在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中所呈現(xiàn)的不同帶型來檢測基因突變的一種方LAMB1基因rs159769941SNP位點定位于綿羊4號染時間長的問題?；谶@個點突變設(shè)計引物對該區(qū)3標(biāo)準(zhǔn)下載g)氯仿-異戊醇(24:1)k)N,N,N’,N’一四甲基乙二胺(TEMED)1)過硫酸銨(NH?)2S?O?)n)硝酸銀(AgNO?)o)尿素p)甲酰胺r)二甲苯青FFu)6×LoadingBufferv)DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記(Marker)b)微波爐(額定功率800W)j)紫外分光光度計1)高壓電泳儀(0V～3000V、0mA～400mA、額定功率400W)n)染色盒(55cm×38cm×8cm)47檢測方法每只細(xì)毛羊頸靜脈采血量為2mL~5mL,ACD(每6mL新鮮血液中加入1mLACD)或肝素鈉(1%)清液加入新的離心管中，再加入400μL(等體積)的氯仿：異戊醇(24:1),上下翻動5min,直到00μL(2倍體積)的預(yù)冷無水乙醇，上下翻動2min,然后12000r/min低溫離心10min,棄去上清液；取2pμLDNA溶液置入微量離心管中，用水稀釋100倍。紫外分光光度計260nm和280nm測定純DNA的OD?6/ODz?o比值應(yīng)為1.8。若比值大于1.8,說明有RNA存在，應(yīng)用RNA酶處理樣品；若小于1.8,說明樣品中含有蛋白質(zhì)和酚，%瓊脂糖凝膠制備加熱煮沸，取出后室溫放置降溫，待溫度降至約55℃時加入0.4L核酸染料并混勻；將混勻液緩慢倒5DB65/T4091—2018PCR擴增條件：95℃預(yù)變性3min;94℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸60s,35個循環(huán)；72℃梳子、隔板(厚度一致或者邊緣較窄)、燒杯和玻璃棒等。灌膠時不會產(chǎn)生氣泡);把平口玻璃膠板放在空的試管架上，隔板放置在玻璃6取7μLPCR擴增產(chǎn)物與8μL變性緩沖液混合；98℃變性10min,取出后冰浴7min完全變性；切斷電泳槽電源，將已變性的混合液用10μL的移液器準(zhǔn)確點入每個膠孔中，靜置約10min,使樣品全部下沉；然后接通電源，15V/cm恒定電壓下電泳5min~10min,觀察到溴酚藍(深藍色)和二甲苯氰(藍綠色)兩條帶分開后，5V/cm～7V/cm恒壓，電泳16h。電泳結(jié)束后，將凝膠從電泳槽上卸下，小心將凝膠從玻璃板中取出，切去一小角作為標(biāo)記，置于去離子水中浸泡，開啟搖床，準(zhǔn)備銀染。向漂洗過的凝膠中加入500mL20%的乙醇，60r/min15min,用水漂洗30s。加入500mL0.5g0.1%的AgNO?,60r/min30min,用水漂洗30s。加入300mL2%的NaOH顯色液，60r/min約10min出現(xiàn)棕色條帶，用水漂洗30s。加入500mL4%的乙酸，60r/min3min,用水漂洗30s。保留條帶，水平切去上下多余部分，使用凝膠成像系統(tǒng)照像，置于白板上分辨基因型。8結(jié)果判定若DNA完整性檢測結(jié)果如圖1所示，條帶整齊明亮，則表示提取DNA的完整性好，符合PCR擴增產(chǎn)物檢測的要求。若DNA完整性檢測結(jié)果如圖2所示，主帶下有少許彌散條帶，彌散帶下沿為100bp~500bp;甚至無主帶，彌散帶區(qū)間不符，則表示提取DNA降解嚴(yán)重，不符合下一步檢測的要求。67圖10.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA圖譜(示完整性)圖20.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA圖譜(示不完整性)8.2PCR擴增產(chǎn)物檢測擴增產(chǎn)物若僅出現(xiàn)201bp條帶，沒有非特異性擴增條帶，而且?guī)兔髁燎逦?，則表示擴增特異性好，可進行下一步檢測。圖3LAMB1基因rs159769941PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜(示特異性)對引物的PCR擴增產(chǎn)物進行SSCP分析，不同個體結(jié)果應(yīng)表現(xiàn)出3種基因型(TT、TC、CC)之一(圖4)。TT型表示攜帶該基因型的細(xì)毛羊羊毛自然長度最長；CC型表示攜帶該基因型的細(xì)毛羊羊毛自然長度中等；TC型表示攜帶該基因型的細(xì)毛羊羊毛自然長度最短。8圖4LAMB1基因rs159769941SNP位點PCR產(chǎn)物的SSCP電泳圖譜(示基因分型)9廢棄物處理和防止污染的措施檢測過程中的廢棄物應(yīng)高壓滅菌后再做處理，有毒有害廢棄物應(yīng)經(jīng)過除害再做處理，處理應(yīng)符合環(huán)保要求。檢測過程中人員安全防護和防止交叉污染的措施按照GB/T19915.9和SN/T1193中的規(guī)定執(zhí)行。9標(biāo)準(zhǔn)下載附錄A(規(guī)范性附錄)c)T10E10:Tris0.6g,EDTA1.9g,定容至500mL,調(diào)節(jié)pH為8。d)T10E1:Tris1.2g,EDTA0.4g,定容至1000mL,調(diào)節(jié)pH為8。e)70%乙醇：70mL無水乙醇加水定容至100mL,-20℃保存。h)5×TBE緩沖液：Tris堿27g,硼酸13.8g,0.5mol/LEDTA(p