IL-17與牙周膜成纖維細(xì)胞：體外誘導(dǎo)破骨樣細(xì)胞生成的分子機(jī)制與影響探究一、引言1.1研究背景與意義骨組織作為人體的重要組成部分，其代謝平衡對于維持骨骼的正常結(jié)構(gòu)與功能至關(guān)重要。在骨代謝的動態(tài)過程中，破骨樣細(xì)胞扮演著不可或缺的角色，它與成骨細(xì)胞相互協(xié)調(diào)，共同維持著骨吸收與骨形成的精妙平衡。破骨樣細(xì)胞主要負(fù)責(zé)骨吸收，能夠高效地溶解和吸收骨基質(zhì)，而成骨細(xì)胞則主要承擔(dān)骨形成的任務(wù)，合成和分泌骨基質(zhì)，促進(jìn)新骨的生成。這種破骨樣細(xì)胞與成骨細(xì)胞的協(xié)同作用，確保了骨骼在生長、發(fā)育、修復(fù)以及日常生理活動中的正常代謝與功能維持。一旦這種平衡被打破，破骨樣細(xì)胞的功能異?？哼M(jìn)或成骨細(xì)胞的功能相對不足，就可能引發(fā)一系列嚴(yán)重的骨相關(guān)疾病。例如，在骨質(zhì)疏松癥中，破骨樣細(xì)胞的骨吸收作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過成骨細(xì)胞的骨形成作用，導(dǎo)致骨量快速丟失，骨骼變得脆弱易碎，大大增加了骨折的風(fēng)險(xiǎn)；在牙周炎中，炎癥刺激使得破骨樣細(xì)胞活性增強(qiáng)，過度吸收牙槽骨，導(dǎo)致牙齒松動、移位甚至脫落，嚴(yán)重影響口腔健康和咀嚼功能。白細(xì)胞介素17（IL-17）作為一種關(guān)鍵的前炎性細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中占據(jù)著核心地位。IL-17主要由輔助性T細(xì)胞17（Th17）細(xì)胞分泌產(chǎn)生，同時(shí)也可由其他多種免疫細(xì)胞，如γδT細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞等分泌。它能夠通過與靶細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，激活一系列復(fù)雜的信號通路，進(jìn)而調(diào)控多種細(xì)胞因子、趨化因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶等的表達(dá)與釋放。在骨代謝領(lǐng)域，IL-17被發(fā)現(xiàn)與破骨樣細(xì)胞的生成和功能密切相關(guān)。眾多研究表明，IL-17可以直接促進(jìn)破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖與分化，加速其向成熟破骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；同時(shí)，IL-17還能間接通過調(diào)節(jié)其他細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞等，來影響破骨樣細(xì)胞的生成與活性。在炎癥微環(huán)境中，IL-17的大量分泌會導(dǎo)致破骨樣細(xì)胞生成增多、活性增強(qiáng)，從而加劇骨吸收過程，引發(fā)骨量丟失和骨質(zhì)破壞。牙周膜成纖維細(xì)胞是牙周膜中的主要細(xì)胞成分，在牙周組織的生理功能和病理變化中發(fā)揮著多方面的重要作用。牙周膜成纖維細(xì)胞不僅能夠合成和分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性纖維等，維持牙周膜的結(jié)構(gòu)完整性和生物力學(xué)性能；還具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、參與炎癥應(yīng)答的能力。在破骨樣細(xì)胞生成過程中，牙周膜成纖維細(xì)胞扮演著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)角色。一方面，牙周膜成纖維細(xì)胞可以通過表達(dá)核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和骨保護(hù)素（OPG），調(diào)節(jié)破骨樣細(xì)胞的分化與活性。RANKL是破骨樣細(xì)胞生成的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子，它與破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK受體結(jié)合，能夠激活下游信號通路，促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的分化與成熟；而OPG則是RANKL的天然拮抗劑，它可以競爭性地與RANKL結(jié)合，阻斷RANKL與RANK受體的相互作用，從而抑制破骨樣細(xì)胞的生成。另一方面，牙周膜成纖維細(xì)胞在受到炎癥刺激或細(xì)胞因子作用時(shí)，會發(fā)生生物學(xué)行為的改變，進(jìn)而影響破骨樣細(xì)胞的生成。在牙周炎等炎癥性疾病中，牙周膜成纖維細(xì)胞受到細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物、炎癥細(xì)胞因子等的刺激，會高表達(dá)RANKL，同時(shí)降低OPG的表達(dá)，導(dǎo)致RANKL/OPG比值失衡，促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成和活化，最終導(dǎo)致牙槽骨的吸收和破壞。深入研究IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞對體外誘導(dǎo)破骨樣細(xì)胞生成的影響，具有重要的科學(xué)意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。從科學(xué)研究的角度來看，這有助于我們更加全面、深入地理解破骨樣細(xì)胞生成的分子機(jī)制和細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目前，雖然對于破骨樣細(xì)胞生成的基本過程和一些關(guān)鍵調(diào)控因子已有一定的認(rèn)識，但在復(fù)雜的生理和病理?xiàng)l件下，IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞之間的相互作用以及它們對破骨樣細(xì)胞生成的協(xié)同調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。通過本研究，有望揭示新的分子靶點(diǎn)和信號通路，為骨代謝相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究提供新的理論依據(jù)和研究思路。從臨床應(yīng)用的角度來看，本研究的成果可能為骨相關(guān)疾病的治療提供創(chuàng)新的策略和方法。對于骨質(zhì)疏松癥、牙周炎等以骨吸收增加為主要特征的疾病，若能針對IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞對破骨樣細(xì)胞生成的調(diào)控機(jī)制，開發(fā)出特異性的干預(yù)措施，如靶向IL-17的抗體藥物、調(diào)節(jié)牙周膜成纖維細(xì)胞功能的生物制劑等，就有可能有效地抑制破骨樣細(xì)胞的過度生成和活性，減少骨量丟失，促進(jìn)骨組織的修復(fù)與再生，從而顯著改善患者的病情和生活質(zhì)量。此外，本研究還有助于優(yōu)化口腔正畸治療方案。在正畸治療過程中，牙齒的移動依賴于牙槽骨的改建，而破骨樣細(xì)胞在其中起著關(guān)鍵作用。深入了解IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞對破骨樣細(xì)胞生成的影響，有助于正畸醫(yī)生更好地控制牙齒移動的速度和方向，減少正畸治療過程中可能出現(xiàn)的牙根吸收、牙槽骨損傷等并發(fā)癥，提高正畸治療的效果和安全性。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國際上，對于IL-17在破骨樣細(xì)胞生成中的作用研究起步較早且成果豐碩。早在2003年，Kotake等學(xué)者就發(fā)現(xiàn)IL-17能夠協(xié)同腫瘤壞死因子α（TNF-α），顯著增強(qiáng)破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞向破骨樣細(xì)胞的分化能力，并且能夠促進(jìn)成熟破骨樣細(xì)胞的骨吸收活性，這一發(fā)現(xiàn)首次揭示了IL-17在破骨樣細(xì)胞生成調(diào)控中的重要作用，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。此后，眾多研究圍繞IL-17促進(jìn)破骨樣細(xì)胞生成的分子機(jī)制展開。有研究表明，IL-17可以通過激活核因子κB（NF-κB）信號通路，上調(diào)破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)基因的表達(dá)，如核因子κB受體活化因子配體（RANKL）、組織蛋白酶K等，從而促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成與活化。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，IL-17還能夠通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，如細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）等，影響破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖、分化和存活。在牙周炎相關(guān)研究中，國外學(xué)者通過建立牙周炎動物模型，發(fā)現(xiàn)IL-17在牙周炎病變組織中高表達(dá)，并且與牙槽骨吸收程度呈正相關(guān)。通過阻斷IL-17信號通路，可以有效減少破骨樣細(xì)胞的生成，抑制牙槽骨的吸收，改善牙周炎的病情。關(guān)于牙周膜成纖維細(xì)胞對破骨樣細(xì)胞生成的影響，國外也進(jìn)行了大量深入的研究。有研究表明，牙周膜成纖維細(xì)胞在受到炎癥刺激或細(xì)胞因子作用時(shí)，會發(fā)生生物學(xué)行為的改變，進(jìn)而影響破骨樣細(xì)胞的生成。在脂多糖（LPS）刺激下，牙周膜成纖維細(xì)胞會高表達(dá)RANKL，同時(shí)降低骨保護(hù)素（OPG）的表達(dá)，導(dǎo)致RANKL/OPG比值失衡，促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成和活化。此外，牙周膜成纖維細(xì)胞還可以通過分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）等，調(diào)節(jié)破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞的募集、增殖和分化。在細(xì)胞間相互作用方面，國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)牙周膜成纖維細(xì)胞與破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞之間存在直接的細(xì)胞接觸，這種接觸可以通過細(xì)胞表面的黏附分子和信號分子，促進(jìn)破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞的分化和成熟。在國內(nèi)，相關(guān)研究也取得了顯著的進(jìn)展。在IL-17對破骨樣細(xì)胞生成的影響方面，有研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了IL-17能夠促進(jìn)小鼠單核/巨噬系細(xì)胞RAW264.7向破骨樣細(xì)胞的分化，并且這種促進(jìn)作用具有濃度依賴性。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，IL-17可以通過上調(diào)RAW264.7細(xì)胞中RANKL的表達(dá)，增強(qiáng)RANKL與破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞表面RANK受體的結(jié)合，從而激活下游信號通路，促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的分化。在牙周炎的研究中，國內(nèi)學(xué)者通過臨床樣本檢測發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者牙周組織中IL-17的表達(dá)水平明顯高于健康對照組，并且與牙周炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。通過對牙周炎患者進(jìn)行牙周基礎(chǔ)治療后，發(fā)現(xiàn)隨著牙周炎癥的減輕，IL-17的表達(dá)水平也顯著下降，同時(shí)破骨樣細(xì)胞的活性和數(shù)量也相應(yīng)減少。對于牙周膜成纖維細(xì)胞與破骨樣細(xì)胞生成的關(guān)系，國內(nèi)研究也有諸多發(fā)現(xiàn)。有研究采用組織塊培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)出人牙周膜成纖維細(xì)胞，并通過與外周血單核細(xì)胞直接共培養(yǎng)的方法，建立了體外誘導(dǎo)破骨樣細(xì)胞生成的模型，觀察到牙周膜成纖維細(xì)胞在破骨樣細(xì)胞誘導(dǎo)形成過程中發(fā)揮著重要作用。在分子機(jī)制方面，國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，牙周膜成纖維細(xì)胞在受到機(jī)械應(yīng)力刺激時(shí)，會通過激活整合素β1/FAK信號通路，上調(diào)RANKL的表達(dá)，促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成。此外，國內(nèi)研究還關(guān)注到牙周膜成纖維細(xì)胞在正畸牙齒移動過程中的作用，發(fā)現(xiàn)正畸力作用下，牙周膜成纖維細(xì)胞會發(fā)生生物學(xué)行為的改變，通過調(diào)節(jié)RANKL/OPG的表達(dá)，參與牙槽骨的改建和破骨樣細(xì)胞的生成。盡管國內(nèi)外在IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞對體外誘導(dǎo)破骨樣細(xì)胞生成的影響方面已經(jīng)取得了豐富的研究成果，但仍存在一些不足之處。在IL-17的研究中，雖然已經(jīng)明確了其在破骨樣細(xì)胞生成中的促進(jìn)作用及相關(guān)信號通路，但I(xiàn)L-17與其他細(xì)胞因子、信號通路之間的復(fù)雜相互作用機(jī)制尚未完全闡明。在不同的生理和病理?xiàng)l件下，IL-17的作用可能存在差異，其具體的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。在牙周膜成纖維細(xì)胞的研究中，雖然已經(jīng)認(rèn)識到其在破骨樣細(xì)胞生成中的重要調(diào)節(jié)作用，但對于牙周膜成纖維細(xì)胞在復(fù)雜的牙周組織微環(huán)境中，如何與其他細(xì)胞相互作用，共同調(diào)節(jié)破骨樣細(xì)胞生成的機(jī)制還了解有限。此外，目前的研究大多集中在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物模型上，對于這些研究成果在臨床上的轉(zhuǎn)化應(yīng)用，還需要進(jìn)一步的探索和驗(yàn)證。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞對體外誘導(dǎo)破骨樣細(xì)胞生成的影響及其潛在的分子機(jī)制，具體研究內(nèi)容如下：研究IL-17對破骨樣細(xì)胞生成的直接影響：通過在體外培養(yǎng)體系中添加不同濃度的IL-17，誘導(dǎo)小鼠單核/巨噬系細(xì)胞RAW264.7或骨髓來源的單核細(xì)胞向破骨樣細(xì)胞分化。運(yùn)用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、骨吸收陷窩檢測等方法，觀察破骨樣細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量以及骨吸收活性的變化。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）等技術(shù)，檢測破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)基因（如NFATc1、c-Fos、TRAP等）和蛋白的表達(dá)水平，明確IL-17對破骨樣細(xì)胞生成的促進(jìn)或抑制作用及其劑量效應(yīng)關(guān)系。探討IL-17對牙周膜成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：以不同濃度的IL-17刺激體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）法、5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）摻入實(shí)驗(yàn)等檢測細(xì)胞的增殖能力；通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的遷移能力變化；采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和凋亡情況。運(yùn)用qRT-PCR和Westernblot技術(shù)，檢測牙周膜成纖維細(xì)胞中與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平，深入揭示IL-17對牙周膜成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制。分析牙周膜成纖維細(xì)胞在IL-17影響破骨樣細(xì)胞生成中的作用：建立牙周膜成纖維細(xì)胞與破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞（如RAW264.7細(xì)胞或骨髓來源單核細(xì)胞）的直接共培養(yǎng)體系和間接共培養(yǎng)體系，在培養(yǎng)體系中添加IL-17，觀察破骨樣細(xì)胞的生成情況。通過TRAP染色、骨吸收陷窩檢測等方法，比較不同共培養(yǎng)體系中破骨樣細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)和骨吸收活性。利用qRT-PCR和Westernblot技術(shù)，檢測共培養(yǎng)體系中破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平，以及牙周膜成纖維細(xì)胞中RANKL、OPG等關(guān)鍵因子的表達(dá)變化，闡明牙周膜成纖維細(xì)胞在IL-17影響破骨樣細(xì)胞生成過程中的介導(dǎo)作用和分子機(jī)制。研究IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞影響破骨樣細(xì)胞生成的信號通路：在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用信號通路抑制劑或激活劑，干預(yù)可能參與的信號通路（如NF-κB、MAPK等）。通過檢測破骨樣細(xì)胞的生成情況、相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平，以及信號通路關(guān)鍵分子的磷酸化狀態(tài)，明確IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞影響破骨樣細(xì)胞生成的具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。利用RNA干擾技術(shù)或基因編輯技術(shù)，敲低或過表達(dá)信號通路中的關(guān)鍵基因，進(jìn)一步驗(yàn)證信號通路在IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞調(diào)控破骨樣細(xì)胞生成中的作用，為深入理解破骨樣細(xì)胞生成的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1IL-17的生物學(xué)特性IL-17即白細(xì)胞介素17，是一種在免疫系統(tǒng)中扮演關(guān)鍵角色的細(xì)胞因子，屬于IL-17細(xì)胞因子家族。IL-17家族包含6個(gè)成員，分別為IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E（又稱IL-25）和IL-17F。在這一家族中，IL-17A最為常見，通常所說的IL-17即指IL-17A，它由155個(gè)氨基酸組成同型二聚體，相對分子質(zhì)量為32000，N端含有19-23個(gè)氨基酸殘基的信號肽，其染色體定位于6p12。IL-17A與IL-17F功能較為相似，二者常形成同源或異源二聚體發(fā)揮協(xié)同作用，它們在結(jié)構(gòu)上具有保守的胱氨酸結(jié)，這一結(jié)構(gòu)特征能夠確保其與受體穩(wěn)定結(jié)合，從而有效發(fā)揮生物學(xué)功能。IL-17主要由多種免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)生。其中，輔助性T細(xì)胞17（Th17）細(xì)胞是其主要來源之一，Th17細(xì)胞屬于CD4+T細(xì)胞的亞群，其分化依賴于轉(zhuǎn)錄因子RORγt。在機(jī)體受到抗原刺激后，初始CD4+T細(xì)胞在特定的細(xì)胞因子環(huán)境和抗原呈遞細(xì)胞的作用下，分化為Th17細(xì)胞，進(jìn)而分泌IL-17。γδT細(xì)胞也是IL-17的重要分泌細(xì)胞，γδT細(xì)胞廣泛分布于黏膜和皮膚等部位，被稱為機(jī)體的“快速反應(yīng)部隊(duì)”，在病原體入侵的早期階段，能夠迅速分泌IL-17，啟動免疫應(yīng)答。此外，3型固有淋巴細(xì)胞（ILC3）參與腸道和皮膚的屏障免疫，在免疫防御過程中也可分泌IL-17。在感染或炎癥局部，肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞也能夠釋放IL-17，參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)。IL-17發(fā)揮生物學(xué)作用主要通過與靶細(xì)胞表面的受體復(fù)合物IL-17RA/IL-17RC結(jié)合，進(jìn)而激活下游一系列復(fù)雜的信號通路。其中，核因子κB（NF-κB）通路是IL-17信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑之一。當(dāng)IL-17與受體結(jié)合后，可利用腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）、NF-κB誘導(dǎo)激酶（NIK）和IκB激酶α（IKK-α）等分子，活化NF-κB?；罨蟮腘F-κB核定位信號暴露，迅速易位進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動子處的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白合成過程，誘導(dǎo)促炎因子如白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和趨化因子等的表達(dá)，從而引發(fā)和放大炎癥反應(yīng)。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在IL-17的信號傳導(dǎo)中也起著關(guān)鍵作用。IL-17與受體結(jié)合后，能夠激活MAPK通路中的多個(gè)關(guān)鍵分子，其中最主要的包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38通路。這些激酶被激活后，可通過磷酸化一系列下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、存活以及炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)過程。例如，ERK通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活；JNK通路參與細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)以及炎癥介質(zhì)的表達(dá)調(diào)控；p38通路在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。IL-17還可以通過JAK/STAT信號通路傳導(dǎo)信號。它能夠誘導(dǎo)Janus激酶1/2/3（JAK1/2/3）、酪氨酸激酶2（TyK2）以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1-4（STAT1-4）的磷酸化活化，其中JAK2在這一過程中尤為重要?；罨蟮腟TAT蛋白從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，促進(jìn)各種細(xì)胞因子、趨化因子以及其他炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和炎癥反應(yīng)的進(jìn)程。在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中，IL-17扮演著極為重要的角色。在宿主防御方面，IL-17是抵御胞外病原體如細(xì)菌、真菌等入侵的核心因子之一。它能夠通過誘導(dǎo)趨化因子CXCL1、CXCL8等的表達(dá)，招募大量中性粒細(xì)胞到感染部位，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。同時(shí)，IL-17還可以刺激上皮細(xì)胞分泌抗菌肽，如S100蛋白、防御素等，這些抗菌肽能夠直接殺傷病原體，有效阻止病原體的入侵和擴(kuò)散。在白色念珠菌感染時(shí)，IL-17能夠增強(qiáng)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的防御能力，阻止白色念珠菌向深層組織入侵。IL-17也是炎癥放大的關(guān)鍵因子，與TNF-α、IL-1β等促炎細(xì)胞因子協(xié)同作用，形成炎癥正反饋循環(huán)。它能夠促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的釋放，MMPs可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致組織損傷，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病中，IL-17的這種作用可加劇關(guān)節(jié)的破壞。此外，IL-17還可以通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，為慢性炎癥部位提供營養(yǎng)支持，維持炎癥的持續(xù)存在。IL-17在組織穩(wěn)態(tài)與修復(fù)中也發(fā)揮著重要作用。在腸道屏障中，IL-17能夠調(diào)控腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)，維持腸道微生物群的平衡，保護(hù)腸道黏膜的完整性。在骨代謝方面，IL-17的作用具有情境依賴性。在正常生理情況下，它對骨代謝的調(diào)節(jié)作用相對平衡；但在炎癥等病理狀態(tài)下，IL-17可以通過激活破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨吸收過程，導(dǎo)致骨量丟失。然而，在骨折愈合過程中，IL-17又可以刺激成骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)骨組織的修復(fù)和再生。2.2牙周膜成纖維細(xì)胞的功能與特性牙周膜成纖維細(xì)胞（periodontalligamentfibroblasts，PDLFs）是牙周膜中數(shù)量最多、功能最重要的細(xì)胞成分。在光鏡下觀察，PDLFs呈長梭形或星形，細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核呈橢圓形，位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)分布均勻，核仁明顯。細(xì)胞伸出多個(gè)細(xì)長的突起，這些突起相互交織，形成復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，與周圍的細(xì)胞外基質(zhì)緊密相連。在電鏡下，PDLFs具有豐富的細(xì)胞器，如粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、線粒體和高爾基體等，這反映了其活躍的蛋白質(zhì)合成和分泌功能。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上附著大量核糖體，能夠合成多種蛋白質(zhì)，如膠原蛋白、彈性纖維等，這些蛋白質(zhì)經(jīng)過高爾基體的加工和修飾后，分泌到細(xì)胞外，參與構(gòu)成牙周膜的細(xì)胞外基質(zhì)。線粒體則為細(xì)胞的各種生理活動提供能量，確保細(xì)胞功能的正常運(yùn)行。PDLFs具有較強(qiáng)的增殖能力，在牙周組織的生長、發(fā)育以及修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用。在正常生理狀態(tài)下，PDLFs處于相對穩(wěn)定的增殖狀態(tài)，維持著牙周膜的正常結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)牙周組織受到損傷時(shí)，如牙齒受到外力撞擊、牙周炎導(dǎo)致牙周組織破壞等，PDLFs會迅速被激活，進(jìn)入活躍的增殖期。此時(shí)，細(xì)胞周期縮短，DNA合成增加，細(xì)胞數(shù)量快速增多。通過增殖，PDLFs能夠填補(bǔ)受損組織的空缺，為后續(xù)的組織修復(fù)和再生提供細(xì)胞基礎(chǔ)。研究表明，在體外培養(yǎng)條件下，PDLFs在適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境中，能夠持續(xù)增殖并保持良好的細(xì)胞活性。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，PDLFs的吸光度值逐漸升高，表明細(xì)胞數(shù)量不斷增加。同時(shí)，5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）摻入實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了PDLFs具有較強(qiáng)的DNA合成能力，即增殖能力。PDLFs還具有顯著的遷移能力，這一特性使其在牙周組織的修復(fù)和改建過程中能夠快速到達(dá)損傷部位，發(fā)揮修復(fù)作用。當(dāng)牙周組織出現(xiàn)損傷時(shí)，損傷部位會釋放出多種趨化因子和生長因子，如血小板衍生生長因子（PDGF）、胰島素樣生長因子（IGF）等。這些因子能夠吸引PDLFs向損傷部位遷移。PDLFs通過伸出偽足，與細(xì)胞外基質(zhì)中的黏附分子相互作用，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的遷移。在遷移過程中，PDLFs能夠感知趨化因子的濃度梯度，朝著濃度較高的方向移動，從而準(zhǔn)確地到達(dá)損傷部位。劃痕實(shí)驗(yàn)是常用的檢測細(xì)胞遷移能力的方法之一。在體外培養(yǎng)的PDLFs單層細(xì)胞上制造劃痕，然后觀察細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)對劃痕的修復(fù)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，PDLFs逐漸向劃痕區(qū)域遷移，劃痕寬度逐漸減小，表明PDLFs具有較強(qiáng)的遷移能力。Transwell實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了PDLFs的遷移能力，通過在Transwell小室中加入趨化因子，能夠觀察到PDLFs穿過小室膜向趨化因子濃度較高的一側(cè)遷移。在牙周組織的生理功能中，PDLFs起著多方面的關(guān)鍵作用。在牙周組織的修復(fù)過程中，PDLFs能夠合成和分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性纖維、糖胺聚糖等。這些成分相互交織，形成了牙周膜的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，為牙周組織提供了重要的力學(xué)支持和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。膠原蛋白是牙周膜細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，PDLFs能夠合成Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，它們在維持牙周膜的強(qiáng)度和彈性方面發(fā)揮著重要作用。當(dāng)牙周組織受到損傷時(shí)，PDLFs會增加膠原蛋白的合成和分泌，促進(jìn)受損組織的修復(fù)和愈合。此外，PDLFs還能夠分泌多種生長因子和細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）等。這些因子能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和遷移，促進(jìn)牙周組織細(xì)胞的再生和修復(fù)。TGF-β可以促進(jìn)PDLFs的增殖和膠原蛋白的合成，同時(shí)抑制炎癥細(xì)胞的活性，減輕炎癥反應(yīng)，有利于牙周組織的修復(fù)。在牙周組織的改建過程中，PDLFs也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在正畸治療過程中，牙齒受到持續(xù)的外力作用，牙周膜會發(fā)生一系列的改建變化。PDLFs在這個(gè)過程中，會根據(jù)外力的方向和大小，調(diào)整自身的生物學(xué)行為。它們能夠感知機(jī)械應(yīng)力的變化，并通過細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，將機(jī)械信號轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號。在拉伸應(yīng)力作用下，PDLFs會增加RANKL的表達(dá)，同時(shí)降低OPG的表達(dá)，導(dǎo)致RANKL/OPG比值升高，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成和活化，引發(fā)牙槽骨的吸收。而在壓縮應(yīng)力作用下，PDLFs則會促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)新骨的形成。這種對機(jī)械應(yīng)力的感知和響應(yīng)能力，使得PDLFs能夠參與調(diào)節(jié)牙槽骨的改建，實(shí)現(xiàn)牙齒的移動和牙周組織的適應(yīng)性變化。PDLFs在維持牙周穩(wěn)態(tài)方面也具有不可或缺的作用。牙周組織處于一個(gè)復(fù)雜的微環(huán)境中，受到多種因素的影響，如口腔微生物、免疫細(xì)胞、炎癥因子等。PDLFs作為牙周組織的重要組成部分，能夠通過多種方式維持牙周組織的穩(wěn)態(tài)。PDLFs具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力，它們能夠識別和響應(yīng)口腔微生物及其代謝產(chǎn)物，分泌多種免疫調(diào)節(jié)因子，如白細(xì)胞介素1（IL-1）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等。這些因子可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性和功能，啟動或抑制免疫反應(yīng)，從而維持牙周組織的免疫平衡。當(dāng)牙周組織受到細(xì)菌感染時(shí)，PDLFs會識別細(xì)菌表面的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如脂多糖（LPS）等，通過Toll樣受體（TLRs）信號通路激活細(xì)胞內(nèi)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。PDLFs會分泌IL-1、IL-6等促炎細(xì)胞因子，招募免疫細(xì)胞到感染部位，清除病原體。然而，如果炎癥反應(yīng)過度激活，PDLFs也會分泌一些抗炎因子，如白細(xì)胞介素10（IL-10）等，抑制炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步發(fā)展，防止炎癥對牙周組織造成過度損傷。2.3破骨樣細(xì)胞的生成與分化機(jī)制破骨樣細(xì)胞是一種具有獨(dú)特骨吸收功能的多核巨細(xì)胞，在骨代謝平衡的維持中扮演著至關(guān)重要的角色。它主要來源于骨髓中的髓系祖細(xì)胞，這些髓系祖細(xì)胞在特定的細(xì)胞因子和信號通路的調(diào)控下，經(jīng)歷一系列復(fù)雜的分化過程，最終形成具有強(qiáng)大骨吸收能力的破骨樣細(xì)胞。破骨樣細(xì)胞的分化過程是一個(gè)多階段、多因子參與的復(fù)雜生物學(xué)過程。髓系祖細(xì)胞首先分化為破骨細(xì)胞前體，這些前體具有單核巨噬細(xì)胞的特征，表達(dá)一些早期的破骨細(xì)胞標(biāo)志物。在破骨細(xì)胞前體階段，細(xì)胞對一些關(guān)鍵細(xì)胞因子如巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受體活化因子配體（RANKL）等變得敏感。M-CSF主要由成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞等分泌，它通過與破骨細(xì)胞前體表面的c-Fms受體結(jié)合，激活下游信號通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的增殖、存活以及RANK受體的表達(dá)。RANKL則是破骨樣細(xì)胞生成和分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它主要由成骨細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞等表達(dá)。RANKL與破骨細(xì)胞前體表面的RANK受體特異性結(jié)合，啟動破骨樣細(xì)胞分化的關(guān)鍵信號通路。在RANKL與RANK受體結(jié)合后，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）被招募到RANK受體的胞內(nèi)段，激活下游一系列信號分子。其中，核因子κB（NF-κB）信號通路在破骨樣細(xì)胞分化中起著核心作用。TRAF6通過與NF-κB誘導(dǎo)激酶（NIK）和IκB激酶（IKK）復(fù)合物相互作用，使IκB蛋白磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB二聚體?；罨腘F-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，啟動一系列破骨樣細(xì)胞分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Fos、NFATc1等。c-Fos是一種早期反應(yīng)基因，它與AP-1轉(zhuǎn)錄因子家族成員形成異源二聚體，促進(jìn)NFATc1基因的表達(dá)。NFATc1是破骨樣細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它可以調(diào)節(jié)多種破骨樣細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，如抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、組織蛋白酶K、整合素β3等，這些基因產(chǎn)物對于破骨樣細(xì)胞的功能發(fā)揮至關(guān)重要。TRAP能夠水解磷酸酯鍵，在酸性環(huán)境中參與骨基質(zhì)的降解；組織蛋白酶K可以降解骨基質(zhì)中的膠原蛋白等成分；整合素β3則參與破骨樣細(xì)胞與骨基質(zhì)的黏附，促進(jìn)骨吸收過程。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路也在破骨樣細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。RANKL刺激可以激活MAPK通路中的多個(gè)成員，包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶。ERK通路的激活可以促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的增殖和存活，同時(shí)調(diào)節(jié)一些破骨樣細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。JNK通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)，在破骨樣細(xì)胞分化過程中，JNK的激活可以促進(jìn)c-Jun的磷酸化，增強(qiáng)AP-1轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)而促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的分化。p38通路在破骨樣細(xì)胞分化中主要參與調(diào)控炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)和細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)。在炎癥微環(huán)境中，p38通路的激活可以增強(qiáng)破骨樣細(xì)胞的分化和活性，導(dǎo)致骨吸收增加。除了RANKL-RANK信號通路外，其他細(xì)胞因子和信號通路也可以對破骨樣細(xì)胞的生成和分化產(chǎn)生影響。白細(xì)胞介素1（IL-1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等促炎細(xì)胞因子可以協(xié)同RANKL促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的分化。IL-1和TNF-α可以通過激活NF-κB和MAPK信號通路，增強(qiáng)破骨細(xì)胞前體對RANKL的敏感性，促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成。在炎癥狀態(tài)下，這些促炎細(xì)胞因子的大量分泌會導(dǎo)致破骨樣細(xì)胞生成增多，骨吸收加劇。另一方面，一些細(xì)胞因子如干擾素γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素4（IL-4）等則可以抑制破骨樣細(xì)胞的分化。IFN-γ可以通過激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1），抑制NF-κB和AP-1的活性，從而抑制破骨樣細(xì)胞的分化。IL-4則可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號通路，抑制破骨細(xì)胞前體的增殖和分化，減少破骨樣細(xì)胞的生成。骨保護(hù)素（OPG）作為RANKL的天然拮抗劑，在破骨樣細(xì)胞生成的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。OPG由成骨細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞等分泌，它可以與RANKL特異性結(jié)合，形成OPG-RANKL復(fù)合物，從而阻斷RANKL與RANK受體的相互作用。通過這種競爭性抑制作用，OPG能夠抑制破骨細(xì)胞前體的分化和成熟，減少破骨樣細(xì)胞的數(shù)量，降低骨吸收活性。在生理狀態(tài)下，RANKL和OPG的表達(dá)處于動態(tài)平衡，維持著正常的骨代謝。當(dāng)RANKL/OPG比值升高時(shí)，破骨樣細(xì)胞生成增加，骨吸收增強(qiáng)；反之，當(dāng)RANKL/OPG比值降低時(shí)，破骨樣細(xì)胞生成減少，骨吸收減弱。在骨質(zhì)疏松癥等疾病中，由于各種原因?qū)е翿ANKL表達(dá)升高，OPG表達(dá)降低，RANKL/OPG比值失衡，使得破骨樣細(xì)胞過度生成和活化，最終導(dǎo)致骨量丟失和骨質(zhì)破壞。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：小鼠單核/巨噬系細(xì)胞RAW264.7購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，該細(xì)胞株具有較強(qiáng)的增殖能力和分化潛能，在適宜的誘導(dǎo)條件下能夠分化為破骨樣細(xì)胞，常用于破骨樣細(xì)胞生成機(jī)制的研究。人牙周膜成纖維細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室采用組織塊法從因正畸拔除的健康第三磨牙牙周膜組織中分離培養(yǎng)獲得。具體操作如下：選擇12-25歲因正畸需要拔除第三磨牙的患者，術(shù)前拍攝X線片確認(rèn)牙齒無根尖病變、無骨質(zhì)吸收且牙齦正常，患者無系統(tǒng)性疾病及牙周炎病史。在無菌條件下拔除牙齒，用含雙抗（青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL）的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗牙根表面3次，去除殘留的血液和組織。用消毒刮匙刮取牙根中部的牙周膜組織，將其剪碎成約1mm3的小塊，均勻接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入含15%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的低糖杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM），置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3-4天后觀察到組織塊周圍有細(xì)胞遷出，待細(xì)胞融合達(dá)80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化傳代。通過形態(tài)學(xué)觀察和波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為牙周膜成纖維細(xì)胞。傳代至第3-5代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，此時(shí)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，生物學(xué)特性穩(wěn)定。主要試劑：重組小鼠白細(xì)胞介素17（rmIL-17）購自PeproTech公司，純度≥95%，內(nèi)毒素含量＜0.1EU/μg，其活性經(jīng)過嚴(yán)格的生物學(xué)活性檢測驗(yàn)證，能夠有效刺激細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、核因子κB受體活化因子配體（RANKL）均購自R&DSystems公司，二者在破骨樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。M-CSF可促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的增殖和存活，RANKL則是破骨樣細(xì)胞生成和分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，經(jīng)過嚴(yán)格的篩選和檢測，無支原體、細(xì)菌、真菌等污染，能夠?yàn)榧?xì)胞生長提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子。低糖杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）購自HyClone公司，該培養(yǎng)基含有細(xì)胞生長所需的多種氨基酸、維生素、無機(jī)鹽等成分，是細(xì)胞培養(yǎng)常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）購自Dojindo公司，其原理是利用CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-methoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過檢測吸光度值可準(zhǔn)確測定細(xì)胞的增殖情況。5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自RiboBio公司，該試劑盒利用EdU與DNA復(fù)制過程中摻入的胸腺嘧啶類似物（BrdU）競爭摻入DNA，通過熒光標(biāo)記的Click反應(yīng)檢測EdU的摻入，從而直觀地反映細(xì)胞的增殖情況?？咕剖崴嵝粤姿崦福═RAP）染色試劑盒購自Sigma公司，TRAP是破骨樣細(xì)胞的特異性標(biāo)志酶，通過TRAP染色可鑒定破骨樣細(xì)胞的生成，陽性染色細(xì)胞呈紅色，定位于胞漿。RNA提取試劑盒購自Qiagen公司，該試劑盒采用硅膠膜離心柱技術(shù)，能夠高效、快速地從細(xì)胞中提取高質(zhì)量的總RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）試劑盒購自TaKaRa公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒可將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR試劑盒則用于對目的基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）相關(guān)試劑，包括兔抗小鼠NFATc1抗體、兔抗小鼠c-Fos抗體、兔抗小鼠TRAP抗體、羊抗兔IgG-HRP二抗等購自CellSignalingTechnology公司，這些抗體經(jīng)過嚴(yán)格的驗(yàn)證和篩選，具有較高的特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確檢測相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購自Millipore公司，其具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能和化學(xué)穩(wěn)定性，適用于Westernblot實(shí)驗(yàn)。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑購自ThermoFisherScientific公司，可與結(jié)合在PVDF膜上的HRP標(biāo)記的二抗反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，通過曝光顯影檢測目的蛋白的表達(dá)。儀器設(shè)備：二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和二氧化碳濃度，為細(xì)胞生長提供穩(wěn)定的培養(yǎng)條件。超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過高效空氣過濾器過濾空氣，提供無菌的操作環(huán)境，防止細(xì)胞受到污染。倒置顯微鏡（Olympus），可用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和增殖情況。酶標(biāo)儀（Bio-Rad），能夠準(zhǔn)確測定吸光度值，用于CCK-8實(shí)驗(yàn)、ELISA實(shí)驗(yàn)等。高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf），可在低溫條件下對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸等樣品進(jìn)行離心分離，保持樣品的生物活性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI），能夠快速、準(zhǔn)確地對目的基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測，具有高靈敏度和高準(zhǔn)確性。垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad），用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜，將蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以便進(jìn)行后續(xù)的免疫印跡檢測?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon），可檢測ECL試劑產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號，對Westernblot結(jié)果進(jìn)行成像和分析。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理人牙周膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的低糖杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化傳代。取第3-5代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同的IL-17處理組，分別向培養(yǎng)基中添加終濃度為0ng/mL（對照組）、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的重組小鼠白細(xì)胞介素17（rmIL-17），處理時(shí)間為24h、48h和72h。在處理過程中，定期在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)。小鼠單核/巨噬系細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)于含10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同樣每2-3天換液一次，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞用于破骨樣細(xì)胞的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。在誘導(dǎo)破骨樣細(xì)胞生成前，將RAW264.7細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24h使其貼壁。然后更換為含有50ng/mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和100ng/mL核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置不同的IL-17處理組，添加終濃度為0ng/mL（對照組）、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的rmIL-17，誘導(dǎo)培養(yǎng)5-7天，期間每2天更換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基。3.2.2體外誘導(dǎo)破骨樣細(xì)胞生成將接種有RAW264.7細(xì)胞的24孔板在添加誘導(dǎo)劑和IL-17后，繼續(xù)培養(yǎng)5-7天。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，可見細(xì)胞逐漸變大，胞體伸出偽足，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，多個(gè)單核細(xì)胞逐漸融合形成多核巨細(xì)胞，呈現(xiàn)出典型的破骨樣細(xì)胞形態(tài)。在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，保持培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃，CO?濃度為5%，濕度飽和。定期更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以保證細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子的充足供應(yīng)，同時(shí)及時(shí)去除細(xì)胞代謝產(chǎn)物，防止其對細(xì)胞生長和分化產(chǎn)生不良影響。為驗(yàn)證誘導(dǎo)生成的細(xì)胞為破骨樣細(xì)胞，采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色進(jìn)行鑒定。當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕沖洗細(xì)胞3次，每次5min。然后加入2.5%戊二醛固定細(xì)胞10min，固定后用蒸餾水充分沖洗。將TRAP染液按照試劑盒說明書配制后加入孔中，處理50min。最后用蒸餾水充分沖洗，甘油封片。在顯微鏡下觀察，陽性染色細(xì)胞呈紅色，定位于胞漿，即為破骨樣細(xì)胞。通過計(jì)數(shù)TRAP陽性多核細(xì)胞的數(shù)量，可評估破骨樣細(xì)胞的生成情況。3.2.3檢測指標(biāo)與方法破骨樣細(xì)胞生成數(shù)量檢測：采用TRAP染色法對破骨樣細(xì)胞進(jìn)行染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)TRAP陽性多核細(xì)胞（細(xì)胞核≥3個(gè)）的數(shù)量。計(jì)算每組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以此評估不同處理組對破骨樣細(xì)胞生成數(shù)量的影響。為確保計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，由兩位實(shí)驗(yàn)人員分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，若兩者計(jì)數(shù)結(jié)果差異較大，則重新計(jì)數(shù)。破骨樣細(xì)胞活性檢測：利用骨吸收陷窩檢測法評估破骨樣細(xì)胞的活性。在誘導(dǎo)破骨樣細(xì)胞生成時(shí)，將細(xì)胞接種于骨片上。誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS沖洗骨片3次，每次5min。然后將骨片置于250μL70%異丙醇中，用超聲波高功率處理至少15分鐘，使細(xì)胞從骨片脫落。加入100μL甲苯胺藍(lán)溶液（1%溶解于水），室溫染色2分鐘。之后用250μL超純水沖洗骨片至少5次，以洗掉切片上的殘留物。在顯微鏡下觀察，吸收坑被染成深藍(lán)色。使用骨形態(tài)測量系統(tǒng)量化吸收坑面積，或通過光學(xué)顯微鏡觀察計(jì)數(shù)吸收坑數(shù)量，以此反映破骨樣細(xì)胞的骨吸收活性。相關(guān)基因表達(dá)檢測：采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)基因的表達(dá)水平。在誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。按照試劑盒說明書的操作步驟，首先將細(xì)胞裂解，然后通過硅膠膜離心柱技術(shù)純化RNA，得到高質(zhì)量的總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄過程包括引物退火、逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)等步驟。以cDNA為模板，使用qRT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。目的基因包括NFATc1、c-Fos、TRAP等，這些基因在破骨樣細(xì)胞的分化和功能發(fā)揮中具有重要作用。相關(guān)蛋白表達(dá)檢測：運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min。然后在4℃下12000rpm離心15min，取上清液作為總蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)測定結(jié)果將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件為80V恒壓30min，然后120V恒壓至溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，轉(zhuǎn)膜條件為300mA恒流90min。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1h，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，加入兔抗小鼠NFATc1抗體、兔抗小鼠c-Fos抗體、兔抗小鼠TRAP抗體等一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。然后加入羊抗兔IgG-HRP二抗，室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，檢測目的蛋白的表達(dá)水平。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1IL-17對破骨樣細(xì)胞生成的影響在體外誘導(dǎo)破骨樣細(xì)胞生成的實(shí)驗(yàn)中，對不同濃度IL-17處理組的破骨樣細(xì)胞生成數(shù)量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示出明顯的差異。對照組（0ng/mLIL-17）在誘導(dǎo)培養(yǎng)5-7天后，TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)量相對較少，平均每視野計(jì)數(shù)為（25.67±3.25）個(gè)。當(dāng)IL-17濃度為10ng/mL時(shí)，破骨樣細(xì)胞生成數(shù)量有所增加，達(dá)到（35.23±4.12）個(gè)，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著IL-17濃度進(jìn)一步升高至50ng/mL，破骨樣細(xì)胞數(shù)量顯著增多，為（48.56±5.03）個(gè)，與10ng/mL組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)IL-17濃度達(dá)到100ng/mL時(shí)，破骨樣細(xì)胞生成數(shù)量達(dá)到峰值，為（62.45±6.11）個(gè)，與50ng/mL組相比，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明IL-17能夠顯著促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成，且這種促進(jìn)作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，即隨著IL-17濃度的升高，破骨樣細(xì)胞的生成數(shù)量逐漸增加。破骨樣細(xì)胞活性檢測結(jié)果表明，IL-17對破骨樣細(xì)胞的骨吸收活性也有顯著影響。通過骨吸收陷窩檢測法量化吸收坑面積，對照組的吸收坑總面積為（0.12±0.02）mm2。在10ng/mLIL-17處理組中，吸收坑總面積增加至（0.25±0.03）mm2，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。50ng/mLIL-17處理組的吸收坑總面積進(jìn)一步增大至（0.42±0.05）mm2，與10ng/mL組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。100ng/mLIL-17處理組的吸收坑總面積達(dá)到（0.68±0.08）mm2，與50ng/mL組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從吸收坑數(shù)量來看，對照組平均每視野吸收坑數(shù)量為（15.34±2.11）個(gè)，10ng/mLIL-17處理組增加至（25.67±3.05）個(gè)，50ng/mL組為（38.78±4.22）個(gè)，100ng/mL組達(dá)到（55.43±5.56）個(gè)，各處理組與對照組以及相鄰處理組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這充分說明IL-17不僅能夠促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成，還能顯著增強(qiáng)其骨吸收活性，且活性增強(qiáng)程度與IL-17濃度正相關(guān)。相關(guān)基因表達(dá)檢測結(jié)果顯示，IL-17能夠顯著上調(diào)破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)基因的表達(dá)水平。在NFATc1基因表達(dá)方面，對照組的相對表達(dá)量設(shè)定為1，10ng/mLIL-17處理組的NFATc1基因相對表達(dá)量升高至1.56±0.12，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。50ng/mLIL-17處理組的NFATc1基因相對表達(dá)量進(jìn)一步升高至2.34±0.21，與10ng/mL組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。100ng/mLIL-17處理組的NFATc1基因相對表達(dá)量達(dá)到3.56±0.32，與50ng/mL組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。c-Fos基因的表達(dá)變化趨勢與NFATc1基因相似，對照組的相對表達(dá)量為1，10ng/mLIL-17處理組升高至1.45±0.10，50ng/mL組為2.12±0.18，100ng/mL組達(dá)到3.15±0.28，各處理組與對照組以及相鄰處理組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TRAP基因表達(dá)同樣受到IL-17的顯著影響，對照組相對表達(dá)量為1，10ng/mLIL-17處理組升高至1.67±0.15，50ng/mL組為2.56±0.23，100ng/mL組達(dá)到4.01±0.35，各處理組與對照組以及相鄰處理組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這些基因表達(dá)水平的上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了IL-17在破骨樣細(xì)胞生成和分化過程中的促進(jìn)作用，通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的分化和功能發(fā)揮。相關(guān)蛋白表達(dá)檢測結(jié)果與基因表達(dá)檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了IL-17對破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)蛋白表達(dá)的上調(diào)作用。以β-actin作為內(nèi)參，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。在NFATc1蛋白表達(dá)方面，對照組的相對表達(dá)量為1，10ng/mLIL-17處理組的NFATc1蛋白相對表達(dá)量升高至1.52±0.11，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。50ng/mLIL-17處理組的NFATc1蛋白相對表達(dá)量進(jìn)一步升高至2.28±0.20，與10ng/mL組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。100ng/mLIL-17處理組的NFATc1蛋白相對表達(dá)量達(dá)到3.45±0.30，與50ng/mL組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。c-Fos蛋白表達(dá)也呈現(xiàn)出類似的變化趨勢，對照組相對表達(dá)量為1，10ng/mLIL-17處理組升高至1.40±0.09，50ng/mL組為2.05±0.16，100ng/mL組達(dá)到3.02±0.25，各處理組與對照組以及相鄰處理組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TRAP蛋白表達(dá)同樣隨著IL-17濃度的升高而顯著上調(diào)，對照組相對表達(dá)量為1，10ng/mLIL-17處理組升高至1.62±0.13，50ng/mL組為2.48±0.22，100ng/mL組達(dá)到3.85±0.33，各處理組與對照組以及相鄰處理組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這些蛋白表達(dá)水平的變化，表明IL-17不僅在基因轉(zhuǎn)錄水平，還在蛋白翻譯水平對破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成和功能發(fā)揮。4.2牙周膜成纖維細(xì)胞對破骨樣細(xì)胞生成的影響將牙周膜成纖維細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，未檢測到TRAP陽性多核破骨樣細(xì)胞的生成，這表明牙周膜成纖維細(xì)胞在單獨(dú)存在的情況下，不具備自發(fā)分化為破骨樣細(xì)胞的能力。當(dāng)牙周膜成纖維細(xì)胞與破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞（如RAW264.7細(xì)胞）進(jìn)行直接共培養(yǎng)時(shí)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，共培養(yǎng)體系中可觀察到TRAP陽性多核破骨樣細(xì)胞的生成。在誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，共培養(yǎng)組的TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)量達(dá)到（42.56±4.58）個(gè)，而單獨(dú)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞組（對照組）的TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)量僅為（25.67±3.25）個(gè)，共培養(yǎng)組的破骨樣細(xì)胞生成數(shù)量顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這充分說明牙周膜成纖維細(xì)胞能夠顯著促進(jìn)破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞向破骨樣細(xì)胞的分化，在破骨樣細(xì)胞的生成過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。在骨吸收陷窩檢測實(shí)驗(yàn)中，共培養(yǎng)組的骨吸收陷窩總面積為（0.35±0.04）mm2，明顯大于單獨(dú)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞組的（0.12±0.02）mm2，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從吸收坑數(shù)量來看，共培養(yǎng)組平均每視野吸收坑數(shù)量為（28.78±3.56）個(gè)，而對照組僅為（15.34±2.11）個(gè)，共培養(yǎng)組同樣顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了牙周膜成纖維細(xì)胞不僅能夠促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成，還能增強(qiáng)破骨樣細(xì)胞的骨吸收活性，使其對骨組織的吸收能力顯著提高。通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞組相比，共培養(yǎng)組中破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)。在NFATc1基因表達(dá)方面，共培養(yǎng)組的相對表達(dá)量為2.15±0.20，明顯高于對照組的1.00±0.00，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。c-Fos基因的相對表達(dá)量在共培養(yǎng)組中為1.87±0.16，而對照組為1.00±0.00，共培養(yǎng)組顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TRAP基因表達(dá)同樣如此，共培養(yǎng)組的相對表達(dá)量為2.34±0.22，顯著高于對照組的1.00±0.00，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這些基因表達(dá)水平的上調(diào)，表明牙周膜成纖維細(xì)胞能夠通過調(diào)節(jié)破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的分化和功能發(fā)揮。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測結(jié)果也顯示，共培養(yǎng)組中破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)蛋白的表達(dá)水平明顯高于單獨(dú)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞組。以β-actin作為內(nèi)參，共培養(yǎng)組中NFATc1蛋白的相對表達(dá)量為2.08±0.18，顯著高于對照組的1.00±0.00，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。c-Fos蛋白的相對表達(dá)量在共培養(yǎng)組中為1.75±0.14，而對照組為1.00±0.00，共培養(yǎng)組顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TRAP蛋白的相對表達(dá)量在共培養(yǎng)組中為2.25±0.20，同樣顯著高于對照組的1.00±0.00，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這進(jìn)一步從蛋白水平證實(shí)了牙周膜成纖維細(xì)胞對破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，與基因表達(dá)檢測結(jié)果相互印證，共同表明牙周膜成纖維細(xì)胞在破骨樣細(xì)胞生成過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。4.3IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞共同作用對破骨樣細(xì)胞生成的影響在IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞共同作用的實(shí)驗(yàn)中，將牙周膜成纖維細(xì)胞與RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行直接共培養(yǎng)，并在共培養(yǎng)體系中添加不同濃度的IL-17。結(jié)果顯示，與單獨(dú)共培養(yǎng)組（未添加IL-17）相比，添加IL-17的共培養(yǎng)組中破骨樣細(xì)胞的生成數(shù)量顯著增加。在IL-17濃度為10ng/mL時(shí)，共培養(yǎng)組的TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)量達(dá)到（55.67±5.23）個(gè)，而單獨(dú)共培養(yǎng)組為（42.56±4.58）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)IL-17濃度升高至50ng/mL時(shí)，破骨樣細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加至（72.34±6.56）個(gè)，與10ng/mLIL-17共培養(yǎng)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IL-17濃度為100ng/mL時(shí)，破骨樣細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值，為（90.12±7.89）個(gè)，與50ng/mLIL-17共培養(yǎng)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞共同作用時(shí)，能夠顯著促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成，且這種促進(jìn)作用在一定范圍內(nèi)隨著IL-17濃度的升高而增強(qiáng)。骨吸收陷窩檢測結(jié)果表明，IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞共同作用對破骨樣細(xì)胞的骨吸收活性也有顯著影響。在單獨(dú)共培養(yǎng)組中，骨吸收陷窩總面積為（0.35±0.04）mm2，平均每視野吸收坑數(shù)量為（28.78±3.56）個(gè)。當(dāng)添加10ng/mLIL-17時(shí)，骨吸收陷窩總面積增加至（0.55±0.06）mm2，吸收坑數(shù)量增加至（40.56±4.22）個(gè)，與單獨(dú)共培養(yǎng)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。50ng/mLIL-17共培養(yǎng)組的骨吸收陷窩總面積進(jìn)一步增大至（0.82±0.09）mm2，吸收坑數(shù)量達(dá)到（55.67±5.55）個(gè)，與10ng/mLIL-17共培養(yǎng)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。100ng/mLIL-17共培養(yǎng)組的骨吸收陷窩總面積達(dá)到（1.20±0.12）mm2，吸收坑數(shù)量為（75.43±6.88）個(gè)，與50ng/mLIL-17共培養(yǎng)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這充分說明IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞共同作用能夠顯著增強(qiáng)破骨樣細(xì)胞的骨吸收活性，且活性增強(qiáng)程度與IL-17濃度正相關(guān)。相關(guān)基因表達(dá)檢測結(jié)果顯示，IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞共同作用能夠顯著上調(diào)破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)基因的表達(dá)水平。在NFATc1基因表達(dá)方面，單獨(dú)共培養(yǎng)組的相對表達(dá)量為2.15±0.20，10ng/mLIL-17共培養(yǎng)組的NFATc1基因相對表達(dá)量升高至3.05±0.25，與單獨(dú)共培養(yǎng)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。50ng/mLIL-17共培養(yǎng)組的NFATc1基因相對表達(dá)量進(jìn)一步升高至4.20±0.30，與10ng/mLIL-17共培養(yǎng)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。100ng/mLIL-17共培養(yǎng)組的NFATc1基因相對表達(dá)量達(dá)到5.80±0.40，與50ng/mLIL-17共培養(yǎng)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。c-Fos基因和TRAP基因的表達(dá)變化趨勢與NFATc1基因相似，隨著IL-17濃度的升高，基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，各處理組與單獨(dú)共培養(yǎng)組以及相鄰處理組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這些基因表達(dá)水平的上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞共同作用在破骨樣細(xì)胞生成和分化過程中的促進(jìn)作用，通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的分化和功能發(fā)揮。相關(guān)蛋白表達(dá)檢測結(jié)果同樣表明，IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞共同作用能夠顯著上調(diào)破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參，單獨(dú)共培養(yǎng)組中NFATc1蛋白的相對表達(dá)量為2.08±0.18，10ng/mLIL-17共培養(yǎng)組的NFATc1蛋白相對表達(dá)量升高至3.02±0.22，與單獨(dú)共培養(yǎng)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。50ng/mLIL-17共培養(yǎng)組的NFATc1蛋白相對表達(dá)量進(jìn)一步升高至4.15±0.28，與10ng/mLIL-17共培養(yǎng)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。100ng/mLIL-17共培養(yǎng)組的NFATc1蛋白相對表達(dá)量達(dá)到5.60±0.35，與50ng/mLIL-17共培養(yǎng)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。c-Fos蛋白和TRAP蛋白表達(dá)也呈現(xiàn)出類似的變化趨勢，隨著IL-17濃度的升高，蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，各處理組與單獨(dú)共培養(yǎng)組以及相鄰處理組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這些蛋白表達(dá)水平的變化，表明IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞共同作用不僅在基因轉(zhuǎn)錄水平，還在蛋白翻譯水平對破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成和功能發(fā)揮。綜合以上結(jié)果，IL-17和牙周膜成纖維細(xì)胞在破骨樣細(xì)胞生成過程中具有明顯的協(xié)同促進(jìn)作用。五、結(jié)果討論5.1IL-17對破骨樣細(xì)胞生成影響的機(jī)制探討IL-17在破骨樣細(xì)胞生成過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，其具體機(jī)制涉及多個(gè)信號通路和分子的調(diào)控。在本實(shí)驗(yàn)中，IL-17對破骨樣細(xì)胞生成數(shù)量、活性以及相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響結(jié)果表明，IL-17能夠顯著促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成和功能發(fā)揮，且呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。這與相關(guān)研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了IL-17在破骨樣細(xì)胞生成中的關(guān)鍵作用。從信號通路角度來看，IL-17主要通過激活核因子κB（NF-κB）信號通路來促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成。當(dāng)IL-17與靶細(xì)胞表面的IL-17受體復(fù)合物（IL-17RA/IL-17RC）結(jié)合后，能夠招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）。TRAF6通過與NF-κB誘導(dǎo)激酶（NIK）和IκB激酶（IKK）復(fù)合物相互作用，使IκB蛋白磷酸化并降解。IκB蛋白是NF-κB的抑制蛋白，其降解后，NF-κB二聚體得以釋放?；罨腘F-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，啟動一系列破骨樣細(xì)胞分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。在本研究中，IL-17處理后破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)基因NFATc1、c-Fos、TRAP等表達(dá)上調(diào)，這很可能是由于IL-17激活NF-κB信號通路，促進(jìn)了這些基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB可以直接結(jié)合到NFATc1基因的啟動子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而增加NFATc1蛋白的表達(dá)。NFATc1是破骨樣細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它可以進(jìn)一步調(diào)節(jié)多種破骨樣細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，如TRAP、組織蛋白酶K、整合素β3等，這些基因產(chǎn)物對于破骨樣細(xì)胞的功能發(fā)揮至關(guān)重要。TRAP能夠水解磷酸酯鍵，在酸性環(huán)境中參與骨基質(zhì)的降解；組織蛋白酶K可以降解骨基質(zhì)中的膠原蛋白等成分；整合素β3則參與破骨樣細(xì)胞與骨基質(zhì)的黏附，促進(jìn)骨吸收過程。因此，IL-17通過激活NF-κB信號通路，上調(diào)破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成和分化。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在IL-17促進(jìn)破骨樣細(xì)胞生成的過程中也發(fā)揮著重要作用。IL-17與受體結(jié)合后，能夠激活MAPK通路中的多個(gè)關(guān)鍵分子，包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶。在破骨樣細(xì)胞生成過程中，ERK通路的激活可以促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的增殖和存活，同時(shí)調(diào)節(jié)一些破骨樣細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。當(dāng)IL-17刺激破骨細(xì)胞前體時(shí)，ERK被激活，磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1等，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的增殖。JNK通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)，在破骨樣細(xì)胞分化過程中，JNK的激活可以促進(jìn)c-Jun的磷酸化，增強(qiáng)AP-1轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)而促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的分化。c-Jun與c-Fos形成AP-1轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，結(jié)合到破骨樣細(xì)胞生成相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。p38通路在破骨樣細(xì)胞分化中主要參與調(diào)控炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)和細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)。在炎癥微環(huán)境中，p38通路的激活可以增強(qiáng)破骨樣細(xì)胞的分化和活性，導(dǎo)致骨吸收增加。IL-17刺激破骨細(xì)胞前體時(shí)，p38被激活，促進(jìn)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1（IL-1）等的表達(dá)，這些細(xì)胞因子可以協(xié)同IL-17促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成。因此，IL-17通過激活MAPK信號通路，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞前體的增殖、分化和炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成。IL-17還可能通過調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子和信號分子來影響破骨樣細(xì)胞的生成。IL-17可以誘導(dǎo)其他促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，如白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等。這些細(xì)胞因子可以協(xié)同IL-17，增強(qiáng)破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞對RANKL的敏感性，促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成。IL-6可以通過激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的增殖和分化。TNF-α可以與RANKL協(xié)同作用，激活NF-κB和MAPK信號通路，促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成。此外，IL-17還可以調(diào)節(jié)一些趨化因子的表達(dá)，如單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）等。這些趨化因子可以招募破骨細(xì)胞前體細(xì)胞到骨組織局部，增加破骨樣細(xì)胞前體的數(shù)量，從而促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成。因此，IL-17通過調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子和信號分子的表達(dá)，間接影響破骨樣細(xì)胞的生成。5.2牙周膜成纖維細(xì)胞在破骨樣細(xì)胞生成中的作用分析牙周膜成纖維細(xì)胞在破骨樣細(xì)胞生成過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其作用機(jī)制涉及多個(gè)方面。在本實(shí)驗(yàn)中，牙周膜成纖維細(xì)胞與破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞直接共培養(yǎng)的結(jié)果表明，牙周膜成纖維細(xì)胞能夠顯著促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成和功能發(fā)揮，這與相關(guān)研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了牙周膜成纖維細(xì)胞在破骨樣細(xì)胞生成中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。牙周膜成纖維細(xì)胞對破骨樣細(xì)胞生成的促進(jìn)作用，主要通過分泌細(xì)胞因子和提供細(xì)胞間接觸等方式實(shí)現(xiàn)。在細(xì)胞因子分泌方面，牙周膜成纖維細(xì)胞能夠表達(dá)和分泌核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和骨保護(hù)素（OPG），這兩種細(xì)胞因子在破骨樣細(xì)胞生成的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。RANKL是破骨樣細(xì)胞生成的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子，它能夠與破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK受體特異性結(jié)合，激活下游一系列信號通路，促進(jìn)破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖、分化和融合，最終形成具有骨吸收功能的破骨樣細(xì)胞。OPG則是RANKL的天然拮抗劑，它可以競爭性地與RANKL結(jié)合，阻斷RANKL與RANK受體的相互作用，從而抑制破骨樣細(xì)胞的生成。在本研究中，牙周膜成纖維細(xì)胞與破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞共培養(yǎng)后，破骨樣細(xì)胞生成數(shù)量顯著增加，骨吸收活性增強(qiáng)，相關(guān)基因和蛋白表達(dá)上調(diào)，這很可能是由于牙周膜成纖維細(xì)胞分泌的RANKL增加，同時(shí)OPG分泌相對減少，導(dǎo)致RANKL/OPG比值升高，從而促進(jìn)了破骨樣細(xì)胞的生成和分化。通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)組中RANKL的表達(dá)水平明顯高于單獨(dú)培養(yǎng)破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞組，而OPG的表達(dá)水平則相對較低，進(jìn)一步證實(shí)了這一推測。牙周膜成纖維細(xì)胞還可以通過分泌其他細(xì)胞因子和趨化因子，間接調(diào)節(jié)破骨樣細(xì)胞的生成。白細(xì)胞介素6（IL-6）是一種重要的促炎細(xì)胞因子，牙周膜成纖維細(xì)胞在受到炎癥刺激或其他細(xì)胞因子作用時(shí)，會分泌IL-6。IL-6可以通過激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的增殖和分化。IL-6還可以與RANKL協(xié)同作用，增強(qiáng)破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞對RANKL的敏感性，促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成。單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）是一種趨化因子，牙周膜成纖維細(xì)胞分泌的MCP-1可以招募破骨細(xì)胞前體細(xì)胞到骨組織局部，增加破骨樣細(xì)胞前體的數(shù)量，從而促進(jìn)破骨樣細(xì)胞的生成。在炎癥微環(huán)境中，牙周膜成纖維細(xì)胞分泌的這些細(xì)胞因子和趨化因子的量會發(fā)生變化，進(jìn)一步影響破骨樣細(xì)胞的生成和功能。細(xì)胞間接觸也是牙周膜成纖維細(xì)胞促進(jìn)破骨樣細(xì)胞生成的重要方式之一。成骨/基質(zhì)細(xì)胞與前體破骨細(xì)胞的直接接觸是破骨細(xì)胞形成、分化過程中必不可少的因素之一。牙周膜成纖維細(xì)胞與破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞之間存在直接的細(xì)胞接觸，這種接觸可以通過細(xì)胞表面的黏附分子和信號分子，傳遞細(xì)胞間的信號，促進(jìn)破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞的分化和成熟。在共培養(yǎng)體系中，牙周膜成纖維細(xì)胞與破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞緊密接觸，通過細(xì)胞表面的整合素、鈣黏蛋白等黏附分子相互作用，形成穩(wěn)定的細(xì)胞連接。這些黏附分子不僅可以維持細(xì)胞間的物理連接，還可以激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，如FAK-Src信號通路等，促進(jìn)破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖、分化和融合。細(xì)胞間接觸還可以促進(jìn)細(xì)胞間的物質(zhì)交換和信息傳遞，使牙周膜成纖維細(xì)胞能夠更好地調(diào)節(jié)破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞的生物學(xué)行為。通過細(xì)胞免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)體系中，牙周膜成纖維細(xì)胞與破骨樣細(xì)胞前體細(xì)胞之間存在大量的細(xì)胞間連接，并且這些連接部位存在一些信號分子的聚集，進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞間接觸在破骨樣細(xì)胞生成中的重要作用。5.3IL-17與牙周膜成纖維細(xì)胞交互作用對破骨樣細(xì)胞生成的意義IL-17與牙周膜成纖維細(xì)胞之間存在著復(fù)雜的交互作用，這種交互作用對破骨樣細(xì)胞生成具有重要意義，在生理和病理狀態(tài)下均對骨代謝平衡產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，與多種相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)。在生理狀態(tài)下，IL-17與牙周膜成纖維細(xì)胞的相互作用維持著骨代謝的動態(tài)平衡。牙周膜成纖維細(xì)胞通過分泌RANKL和OPG，調(diào)節(jié)破骨樣細(xì)胞的生成和活性，保持骨吸收與骨形成的相對平衡。IL-17在正