滬蘇浙皖地方計(jì)量校準(zhǔn)規(guī)范熒光法葉綠素aCalibrationSpecificationforFluorescenceInstrumentsofChlorophylla CalibrationSpecificationforFluorescenceInstrumentsofChlorophylla歸口單位郝瑋（安徽省計(jì)量科學(xué)研究院）徐?。ò不帐∮?jì)量科學(xué)研究院）李連（安徽省計(jì)量科學(xué)研究院） 言????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????6????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????7???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????8???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????4A標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????6Ca測(cè)定儀校準(zhǔn)記錄參考格式?????????????????????????????????????????????????11Da測(cè)定儀校準(zhǔn)證書內(nèi)頁(yè)參考格式???????????????????????????????????????????11Ea?????????????????????????????? JJF1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》為基礎(chǔ)和依GB/T6682-2008HJ897-a

a本規(guī)范適用于測(cè)量范圍（0.2～200）μg/La測(cè)定儀的校GB/T14581-1993HJ494-2009HJ897- aHJ/T91-2002a測(cè)定儀（以下簡(jiǎn)稱儀器）a的熒光誘導(dǎo)技術(shù)，通過a產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光，熒光強(qiáng)aa的濃度值。儀器一般1所示。

111環(huán)境溫度：5℃～40電源電壓及頻率：AC(220±22)V，(50±0.5HzB3%（k=2），標(biāo)準(zhǔn)溶液的A。吸量管、容量瓶：A《HJ897-2017a45章中使用的在儀器常用測(cè)量范圍內(nèi)，按照均勻取點(diǎn)的原則設(shè)置5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)配制對(duì)應(yīng)不同葉（0.2～200μg/L50μg/L、100μg/L、150μg/L、200μg/L3次重復(fù)測(cè)量，用最小二乘法擬Ba濃度示值平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到y(tǒng)a

式中y——aa——b——x——B標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值，μg/L按公式（2）B濃度值，按照公式（3）計(jì)算線性誤差（不包含最低濃度點(diǎn)），xyi

xixsi

式中yi——ia濃度的平均值，μg/L；xi——iB濃度值，μg/L；xsi——iB標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值，μg/L；xi——i點(diǎn)的線性誤差，%選用對(duì)應(yīng)葉綠素a20μg/L的羅丹明B7（4） c=

(c7s=s

式中ci——儀器第ic——7sr——儀器重復(fù)性，%值c010min11h，記錄儀器測(cè)量值ci，按公式（7）cicic0

式中S——ci——10mina2份，作為儀器的校1Ba濃133按公式（8）計(jì)算儀器示值誤差crc=ccs

式中cr——c——3cs——a濃度值，μg/LJJF1071-20105.12的要求，C，校準(zhǔn)證書（內(nèi)頁(yè)）D。1

B被列入可能致癌/BBB標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（20℃下），1000mL10mg/L的羅丹明B儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液。再用分度吸量管移取29mL羅丹明B儲(chǔ)備溶液置于1000mL290μg/LB稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液。BB儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液需在（0～4）℃下避光保存，防止分B24h內(nèi)使用。

素，離心分離后分別于750nm、664nm、647nm630nm波長(zhǎng)處測(cè)定提取液吸光a的濃度。丙酮溶液：9+1900mL丙酮（4.1）100mL1.0g（4.2）100mL實(shí)驗(yàn)用水，攪拌成懸47mm0.45μm～0.7μm采樣瓶：1L500mL1000×g（3000r/min～4000r/min）玻璃刻度離心管：15mL10mm針式濾器：0.45μmGB/T14581、HJ/T91HJ494中的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行樣品的采集。樣品的采0.5m1L500mL沉降性固體（如泥沙等），2L30min，取水面下5cm樣品，轉(zhuǎn)移至采樣瓶（5.1）。在每升樣品中加入1mL樣品采集后應(yīng)在0℃～4℃避光保存、運(yùn)輸，24h（24h內(nèi)不能送達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)過濾，濾膜避光冷凍運(yùn)輸），樣品濾膜于-20℃避光保存，14d內(nèi)分析完畢。體積，見表1，用量筒量取一定體積的混勻樣品，進(jìn)行過濾，最后用少量蒸餾水沖50kPa，在樣品剛剛完全通過濾膜時(shí)結(jié)束抽濾，用鑷a的損失及水分對(duì)丙酮溶液濃度的B.1將樣品濾膜放置于研磨裝置（5.3）3mL～4mL丙酮溶液（4.3），研5min以上。將完全破碎后的細(xì)胞提取液轉(zhuǎn)移至玻璃刻度離心管（5.5）中，用丙酮溶液（4.3）10mL。4℃避光浸泡2h24h2～3次。10min（5.7）a（試樣）將試樣移至比色皿中，以丙酮溶液（4.3）為參比溶液，于波長(zhǎng)750nm、664nm、647nm、630nm處測(cè)量吸光度。750nm0.005，否則需a的質(zhì)量濃度（mg/L），按照公式（B.1）1——a的質(zhì)量濃度，mg/L；A664——664nm波長(zhǎng)下的吸光度值；A647——647nm波長(zhǎng)下的吸光度值；A630——630nm波長(zhǎng)下的吸光度值；A750——750nma的質(zhì)量濃度（μg/L），按照公式（B.2）

——aV——取樣體積，L儀器測(cè)量值B值測(cè)量值標(biāo)準(zhǔn)值測(cè)量時(shí)間測(cè)量值儀器測(cè)量值 分光光度法測(cè)量值儀器測(cè)量值示值誤差aB校準(zhǔn)方法：在儀器常用測(cè)量范圍（0.2～200）μg/L內(nèi)，按照均勻取點(diǎn)的原則0.2μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L、200μg/L5a標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)，B3B標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值和儀器的葉綠素a濃度示值平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到儀器的線性BB標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度值進(jìn)行比較（不電源電壓及頻率：AC(220±22V，(50±0.5Hz

xixsi式中xi——iBxsi——iBxi——i點(diǎn)的線性誤差，%[u(x)]2c2(x)u2(x)c2(x)u2(x

cxi

，c

=-B濃度值引入的不確定度分量u(xi（n=3（N=15，aE.1。E.1B儀器測(cè)量值B濃度值yaya Nsy/

Bxsi以50μg/L的葉綠素a濃度點(diǎn)為例，線性方程計(jì)算的羅丹明B濃度值為：xi717.09μg/Lxi0.29%111 x uxy/x

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度分量u(cs有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身引入的不確定度分量urel(cs由有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的證書可知，羅丹明B的濃度為1.003mg/mLUrel3k2u(c)=Urel3% s 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋過程引入的不確定度分量urel(csa50μg/LB標(biāo)準(zhǔn)溶液為例，需經(jīng)兩次稀釋，第一次稀釋用到10mL單標(biāo)線吸量管和1000mL單標(biāo)線容量瓶，第二次稀釋需要50mL分度吸量管（吸取36mL）和500mL單標(biāo)線容量瓶。1010mL單標(biāo)線吸量管的最大允許誤差為±0.020mL，1000mL單標(biāo)線容量瓶的最大500mL單標(biāo)線容量瓶的最大允許誤差為±10u2rel=

10001000

3636500500

通過溫度變化范圍與體積膨脹系數(shù)確定，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1產(chǎn)生的體積變化率為±（2×2.1×10-4），引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

a50μg/L u2 =(0.12%)2+(0.023%)2(0.16%)2+(0.029%)2+(0.024%)2u2(c)+u2(c