CD99介導(dǎo)miR-9/PRDM1信號通路誘導(dǎo)HRS細胞再分化的分子機制探究一、引言1.1研究背景與意義霍奇金淋巴瘤（HL）是一種較為常見的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，在淋巴瘤中占據(jù)一定比例。其病理特征主要表現(xiàn)為正常組織結(jié)構(gòu)被破壞，腫瘤細胞呈散在分布于大量反應(yīng)性細胞和細胞外基質(zhì)所構(gòu)成的微環(huán)境中。其中，霍奇金和里-施（HRS）細胞作為HL的特征性腫瘤細胞，雖然數(shù)量相對較少，卻在疾病的發(fā)生、發(fā)展進程中發(fā)揮著核心作用。HRS細胞起源于生發(fā)中心或生發(fā)中心后B淋巴細胞，由于免疫球蛋白基因重排過程異常，導(dǎo)致其喪失了大部分B細胞特征，同時獲得了獨特的表型和功能。它們高表達CD30、CD15等標志性分子，并且分泌多種細胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子、白細胞介素等，這些因子不僅構(gòu)建了有利于腫瘤細胞生長、存活和增殖的微環(huán)境，還通過招募免疫細胞，如T細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞等，誘導(dǎo)免疫抑制，使腫瘤細胞得以逃避免疫監(jiān)視。近年來，隨著研究的不斷深入，HL的治療取得了顯著進展，然而，仍有部分患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)或?qū)ΜF(xiàn)有治療方案耐藥的情況，這嚴重影響了患者的預(yù)后。因此，深入探究HL的發(fā)病機制，尤其是HRS細胞的生物學(xué)特性和調(diào)控機制，對于開發(fā)新的治療策略、提高患者生存率和生活質(zhì)量具有至關(guān)重要的意義。CD99作為一種細胞表面糖蛋白，廣泛參與多種生物學(xué)過程。在細胞分化方面，CD99對T細胞的激活和分化具有重要影響，通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，促進T細胞的正常發(fā)育和功能發(fā)揮。在腫瘤領(lǐng)域，CD99在不同類型的癌癥中呈現(xiàn)出復(fù)雜的作用機制。在尤文肉瘤中，CD99表達上調(diào)，且與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力密切相關(guān)，被認為是尤文肉瘤的診斷標志物和潛在治療靶點。而在漿細胞腫瘤中，CD99表達下調(diào)，其具體功能及機制尚有待進一步研究。在HL中，CD99與HRS細胞的分化和腫瘤微環(huán)境的形成可能存在關(guān)聯(lián)，但其具體作用機制仍不明確。miR-9是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長度約為21-25nt，通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補配對，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。在細胞分化過程中，miR-9參與多種細胞類型的分化調(diào)控，如神經(jīng)細胞、心肌細胞等。在神經(jīng)細胞分化過程中，miR-9通過靶向抑制相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miR-9發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的雙重作用，這取決于腫瘤的類型和微環(huán)境。在鼻咽癌中，miR-9表達水平較低，通過靶向抑制RAB6B，影響細胞周期，從而抑制腫瘤細胞增殖。而在某些神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，miR-9表達上調(diào)，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。在HL中，miR-9可能通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，影響HRS細胞的生物學(xué)行為，但具體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和作用機制亟待深入研究。PRDM1是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，屬于PRDI-BF1家族成員。在細胞分化方面，PRDM1對B淋巴細胞的分化和成熟起著關(guān)鍵調(diào)控作用，促進B細胞向漿細胞分化，同時抑制B細胞的增殖。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，PRDM1的表達異常與多種惡性腫瘤密切相關(guān)。在B細胞淋巴瘤中，PRDM1的缺失或突變較為常見，導(dǎo)致B細胞增殖失控，腫瘤發(fā)生風險增加。在其他腫瘤，如肺癌、口腔癌、胰腺癌、胃癌等中，PRDM1表達降低，其失活會加速腫瘤的發(fā)展。在HL中，PRDM1的表達缺失或異常調(diào)控可能是HRS細胞分化異常的重要原因之一，但具體的分子機制尚未完全闡明。本研究聚焦于CD99調(diào)控miR-9/PRDM1誘導(dǎo)HRS細胞再分化的機制，具有重要的理論和實踐意義。從理論層面來看，深入探究這一機制有助于揭示HL的發(fā)病機制，填補目前對HRS細胞分化調(diào)控認識的空白，完善HL的分子生物學(xué)理論體系，為后續(xù)研究提供重要的理論基礎(chǔ)。從實踐應(yīng)用角度出發(fā)，明確CD99、miR-9和PRDM1在HRS細胞再分化中的作用及相互關(guān)系，有望為HL的診斷提供新的分子標志物，提高疾病的早期診斷率；同時，為開發(fā)針對HL的新型治療策略提供潛在的藥物靶點，如通過調(diào)節(jié)CD99的表達或干預(yù)miR-9/PRDM1調(diào)控通路，誘導(dǎo)HRS細胞再分化，恢復(fù)其正常的生物學(xué)功能，從而實現(xiàn)對HL的精準治療，改善患者的預(yù)后，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在CD99的研究方面，國外學(xué)者早在20世紀70年代末便首次發(fā)現(xiàn)了CD99，將其作為人類胸腺來源白血病抗原。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)CD99是一種高度O型糖基化的跨膜蛋白，由MIC2基因編碼，位于人類X和Y染色體的假性自體區(qū)。在正常組織中，CD99表達于T細胞，參與影響T細胞粘附的多個過程，調(diào)節(jié)T細胞玫瑰花環(huán)形成，增加T細胞活化及其與血管內(nèi)皮細胞的結(jié)合，還能通過同型相互作用促進白細胞的分化。在癌癥研究領(lǐng)域，CD99因其在尤文肉瘤中的上調(diào)而備受關(guān)注，被作為一種診斷性標記。此外，在血液惡性腫瘤、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、惡性膠質(zhì)瘤和上皮癌等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)CD99存在異常表達。國內(nèi)的研究也圍繞CD99展開，在急性髓系白血病（AML）的研究中，發(fā)現(xiàn)人CD99在AML中上調(diào)，尤其是在白血病干細胞（LSC）中上調(diào)更明顯，CD99陽性的CD34+CD38-AML細胞植入可引起AML，而CD99陰性細胞則產(chǎn)生類似于正常造血干細胞的集落。在經(jīng)典霍奇金淋巴瘤的研究中，有學(xué)者通過免疫組化和蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，CD99在H/RS細胞中的表達情況與其他B細胞來源的淋巴瘤細胞株有所不同，且與PRDM1的表達存在一定關(guān)聯(lián)。miR-9的研究也取得了豐富的成果。國外研究表明，miR-9廣泛存在于不同物種中，在細胞的生長發(fā)育、自我更新和多向分化等生理活動中發(fā)揮重要作用。在腫瘤研究方面，miR-9在多種人類腫瘤組織中呈現(xiàn)差異性表達，在鼻咽癌中表達水平較低，能夠靶向抑制RAB6B，影響細胞周期，從而抑制腫瘤細胞增殖；而在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中表達上調(diào)，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。國內(nèi)學(xué)者針對miR-9在腫瘤中的作用機制也進行了大量研究，在卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-9能夠靶向調(diào)節(jié)N-cadherin和Wnt信號通路，影響腫瘤干細胞的“干性”和自我更新；在對鼻咽癌細胞的研究中，證實miR-9可通過靶向調(diào)節(jié)E-cadherin和二磷酸腺苷受體P2Y2，促進鼻咽癌細胞的EMT和轉(zhuǎn)移。對于PRDM1，國外研究發(fā)現(xiàn)它是PRDI-BF1家族的成員，作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與多個靶基因的表達調(diào)控，在B淋巴細胞的分化和成熟過程中起關(guān)鍵作用，促進B細胞向漿細胞分化，同時抑制B細胞的增殖。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，PRDM1的表達異常與多種惡性腫瘤密切相關(guān)，在B細胞淋巴瘤中，PRDM1的缺失或突變較為常見，導(dǎo)致B細胞增殖失控，腫瘤發(fā)生風險增加。國內(nèi)的相關(guān)研究也進一步驗證了這些結(jié)論，在對彌漫性大B細胞淋巴瘤的研究中，發(fā)現(xiàn)PRDM1基因的缺失或突變與疾病的發(fā)生相關(guān)；在其他實體腫瘤如肺癌、口腔癌、胰腺癌、胃癌等中，也觀察到PRDM1表達降低，其失活會加速腫瘤的發(fā)展。在霍奇金淋巴瘤（HL）的研究中，國內(nèi)外學(xué)者對HRS細胞的起源、特征和腫瘤微環(huán)境的作用進行了深入探討。明確了HRS細胞起源于生發(fā)中心或生發(fā)中心后B淋巴細胞，由于免疫球蛋白基因重排異常，喪失大部分B細胞特征，并獲得獨特表型和功能。HRS細胞分泌多種細胞因子和趨化因子，構(gòu)建有利于腫瘤生長的微環(huán)境，并誘導(dǎo)免疫抑制，逃避免疫監(jiān)視。在治療方面，雖然目前取得了一定進展，但仍有部分患者復(fù)發(fā)或耐藥，對HL發(fā)病機制的深入研究仍有待加強。盡管國內(nèi)外在CD99、miR-9、PRDM1及HL的研究上取得了諸多成果，但仍存在一些不足與空白。對于CD99在HL中與HRS細胞分化及腫瘤微環(huán)境形成的具體關(guān)聯(lián)機制研究尚不深入；miR-9在HL中調(diào)控相關(guān)基因表達影響HRS細胞生物學(xué)行為的具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全明確；PRDM1在HL中表達缺失或異常調(diào)控導(dǎo)致HRS細胞分化異常的分子機制仍有待進一步闡明。此外，關(guān)于CD99如何調(diào)控miR-9/PRDM1通路誘導(dǎo)HRS細胞再分化的研究還鮮有報道，這也為本研究提供了重要的切入點和研究方向。1.3研究目標與內(nèi)容本研究旨在深入解析CD99調(diào)控miR-9/PRDM1誘導(dǎo)HRS細胞再分化的分子機制，為霍奇金淋巴瘤（HL）的發(fā)病機制研究提供新的理論依據(jù)，同時為開發(fā)基于細胞再分化的新型治療策略奠定基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下：1.3.1CD99對HRS細胞再分化的影響及機制研究通過在HRS細胞系（如L428、KM-H2等）中構(gòu)建CD99過表達和敲低模型，利用基因編輯技術(shù)（如CRISPR-Cas9系統(tǒng)），精確調(diào)控CD99的表達水平。采用細胞形態(tài)學(xué)觀察，通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡，對比正常HRS細胞與CD99表達改變后的細胞形態(tài)差異，包括細胞大小、形狀、細胞器結(jié)構(gòu)等；免疫細胞化學(xué)染色，檢測細胞表面和胞內(nèi)與細胞分化相關(guān)標志物（如CD15、CD30、CD79a、CD19等）的表達變化；流式細胞術(shù)分析，精確測定細胞表面標志物的表達比例和強度，全面評估CD99表達變化對HRS細胞免疫表型的影響，確定CD99對HRS細胞再分化的作用。運用實時熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡等技術(shù)，檢測再分化相關(guān)基因和信號通路關(guān)鍵分子的表達變化，如PRDM1、NF-κB信號通路相關(guān)蛋白等。通過信號通路抑制劑處理，阻斷特定信號通路，觀察CD99調(diào)控HRS細胞再分化過程是否受到影響，深入揭示CD99調(diào)控HRS細胞再分化的分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。1.3.2miR-9在CD99調(diào)控HRS細胞再分化中的作用及機制研究利用生物信息學(xué)分析，篩選與CD99相互作用的miRNAs，重點關(guān)注miR-9。通過熒光素酶報告基因?qū)嶒?，驗證miR-9與CD99的靶向結(jié)合關(guān)系。構(gòu)建miR-9過表達和抑制表達載體，轉(zhuǎn)染至HRS細胞系中，改變miR-9的表達水平。觀察細胞形態(tài)和免疫表型的變化，評估m(xù)iR-9對HRS細胞再分化的影響。研究miR-9對PRDM1的調(diào)控作用，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，驗證miR-9是否直接靶向PRDM1的3'UTR區(qū)域。運用實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，檢測miR-9表達改變后PRDM1在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達變化。在CD99過表達或敲低的HRS細胞模型中，同時調(diào)控miR-9的表達，觀察細胞再分化表型和相關(guān)分子表達的變化，明確miR-9在CD99調(diào)控HRS細胞再分化過程中的上下游關(guān)系和作用機制。1.3.3PRDM1在CD99/miR-9調(diào)控HRS細胞再分化中的關(guān)鍵作用驗證在HRS細胞系中，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達或敲低PRDM1，觀察細胞形態(tài)、免疫表型以及再分化相關(guān)標志物的表達變化，確定PRDM1對HRS細胞再分化的直接影響。在CD99和miR-9表達改變的細胞模型中，恢復(fù)或抑制PRDM1的表達，觀察細胞再分化表型是否能夠逆轉(zhuǎn)，驗證PRDM1在CD99/miR-9調(diào)控HRS細胞再分化通路中的關(guān)鍵作用。研究PRDM1調(diào)控HRS細胞再分化的下游靶基因和信號通路，通過ChIP-seq（染色質(zhì)免疫沉淀測序）和RNA-seq（轉(zhuǎn)錄組測序）技術(shù)，篩選PRDM1直接調(diào)控的下游靶基因。利用生物信息學(xué)分析和功能實驗驗證，明確PRDM1調(diào)控HRS細胞再分化的關(guān)鍵信號通路和分子機制。1.3.4動物模型驗證CD99/miR-9/PRDM1調(diào)控HRS細胞再分化機制建立HL小鼠模型，可采用將HRS細胞（如L428細胞）皮下注射或原位移植到免疫缺陷小鼠（如裸鼠、SCID小鼠）體內(nèi)的方法。對荷瘤小鼠進行分組，分別給予CD99激動劑、miR-9模擬物或抑制劑、PRDM1調(diào)節(jié)劑等干預(yù)處理，設(shè)置相應(yīng)的對照組。觀察小鼠腫瘤的生長情況，包括腫瘤體積、重量的變化，繪制腫瘤生長曲線。通過免疫組化、免疫熒光等技術(shù)，檢測腫瘤組織中HRS細胞的分化狀態(tài)、CD99、miR-9、PRDM1以及相關(guān)信號通路分子的表達變化，在動物體內(nèi)驗證CD99/miR-9/PRDM1調(diào)控HRS細胞再分化的機制。分析小鼠的生存情況，統(tǒng)計生存率，評估干預(yù)措施對小鼠生存預(yù)后的影響，為臨床治療提供實驗依據(jù)。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究主要采用實驗研究法，綜合運用細胞實驗、動物實驗以及多種分子生物學(xué)技術(shù)，深入探究CD99調(diào)控miR-9/PRDM1誘導(dǎo)HRS細胞再分化的機制。1.4.1細胞實驗選用霍奇金淋巴瘤中具有代表性的HRS細胞系，如L428、KM-H2等，這些細胞系具有典型的HRS細胞特征，廣泛應(yīng)用于相關(guān)研究。在細胞培養(yǎng)過程中，嚴格遵循細胞培養(yǎng)標準操作規(guī)程，使用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細胞生長狀態(tài)，確保細胞處于良好的生長環(huán)境。運用基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)，構(gòu)建CD99過表達和敲低的穩(wěn)定細胞株。對于過表達細胞株，將CD99編碼基因克隆至表達載體中，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至HRS細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達CD99的細胞株；對于敲低細胞株，設(shè)計針對CD99基因的sgRNA，構(gòu)建至CRISPR-Cas9載體中，轉(zhuǎn)染細胞后利用流式細胞術(shù)分選獲得CD99表達敲低的細胞株。通過轉(zhuǎn)染miR-9模擬物（mimics）和抑制劑（inhibitors）來改變細胞內(nèi)miR-9的表達水平。轉(zhuǎn)染時，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作，將miR-9mimics或inhibitors與脂質(zhì)體混合，孵育后加入細胞培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染后48-72小時檢測miR-9的表達變化。采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將構(gòu)建好的PRDM1過表達質(zhì)?；騭iRNA轉(zhuǎn)染至HRS細胞，實現(xiàn)PRDM1表達的上調(diào)或下調(diào)。轉(zhuǎn)染后，通過實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染效率和基因表達變化。利用光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，包括細胞大小、形狀、偽足形成等；采用免疫細胞化學(xué)染色，檢測細胞表面和胞內(nèi)與細胞分化相關(guān)標志物，如CD15、CD30、CD79a、CD19等的表達變化，通過顯微鏡觀察染色結(jié)果并拍照記錄；運用流式細胞術(shù)，對細胞表面標志物進行精確分析，通過標記熒光抗體，利用流式細胞儀檢測細胞群體中不同標志物的表達比例和強度，全面評估細胞免疫表型的變化。使用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測相關(guān)基因（如CD99、miR-9、PRDM1及再分化相關(guān)基因等）在mRNA水平的表達變化。提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板進行PCR擴增，通過與內(nèi)參基因（如GAPDH）比較，計算目的基因的相對表達量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，檢測相關(guān)蛋白的表達水平。提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用特異性抗體進行孵育，通過化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶的強度，分析蛋白表達變化。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-9與CD99、miR-9與PRDM1之間的靶向關(guān)系。將CD99或PRDM1的3'UTR區(qū)域克隆至熒光素酶報告載體中，與miR-9mimics或?qū)φ展厕D(zhuǎn)染至細胞中，檢測熒光素酶活性，若熒光素酶活性顯著降低，則表明存在靶向結(jié)合關(guān)系。利用信號通路抑制劑處理細胞，如NF-κB信號通路抑制劑PDTC等，觀察CD99調(diào)控HRS細胞再分化過程中相關(guān)分子表達和細胞表型的變化，明確信號通路在其中的作用。運用基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)，構(gòu)建CD99過表達和敲低的穩(wěn)定細胞株。對于過表達細胞株，將CD99編碼基因克隆至表達載體中，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至HRS細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達CD99的細胞株；對于敲低細胞株，設(shè)計針對CD99基因的sgRNA，構(gòu)建至CRISPR-Cas9載體中，轉(zhuǎn)染細胞后利用流式細胞術(shù)分選獲得CD99表達敲低的細胞株。通過轉(zhuǎn)染miR-9模擬物（mimics）和抑制劑（inhibitors）來改變細胞內(nèi)miR-9的表達水平。轉(zhuǎn)染時，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作，將miR-9mimics或inhibitors與脂質(zhì)體混合，孵育后加入細胞培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染后48-72小時檢測miR-9的表達變化。采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將構(gòu)建好的PRDM1過表達質(zhì)?；騭iRNA轉(zhuǎn)染至HRS細胞，實現(xiàn)PRDM1表達的上調(diào)或下調(diào)。轉(zhuǎn)染后，通過實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染效率和基因表達變化。利用光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，包括細胞大小、形狀、偽足形成等；采用免疫細胞化學(xué)染色，檢測細胞表面和胞內(nèi)與細胞分化相關(guān)標志物，如CD15、CD30、CD79a、CD19等的表達變化，通過顯微鏡觀察染色結(jié)果并拍照記錄；運用流式細胞術(shù)，對細胞表面標志物進行精確分析，通過標記熒光抗體，利用流式細胞儀檢測細胞群體中不同標志物的表達比例和強度，全面評估細胞免疫表型的變化。使用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測相關(guān)基因（如CD99、miR-9、PRDM1及再分化相關(guān)基因等）在mRNA水平的表達變化。提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板進行PCR擴增，通過與內(nèi)參基因（如GAPDH）比較，計算目的基因的相對表達量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，檢測相關(guān)蛋白的表達水平。提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用特異性抗體進行孵育，通過化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶的強度，分析蛋白表達變化。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-9與CD99、miR-9與PRDM1之間的靶向關(guān)系。將CD99或PRDM1的3'UTR區(qū)域克隆至熒光素酶報告載體中，與miR-9mimics或?qū)φ展厕D(zhuǎn)染至細胞中，檢測熒光素酶活性，若熒光素酶活性顯著降低，則表明存在靶向結(jié)合關(guān)系。利用信號通路抑制劑處理細胞，如NF-κB信號通路抑制劑PDTC等，觀察CD99調(diào)控HRS細胞再分化過程中相關(guān)分子表達和細胞表型的變化，明確信號通路在其中的作用。通過轉(zhuǎn)染miR-9模擬物（mimics）和抑制劑（inhibitors）來改變細胞內(nèi)miR-9的表達水平。轉(zhuǎn)染時，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作，將miR-9mimics或inhibitors與脂質(zhì)體混合，孵育后加入細胞培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染后48-72小時檢測miR-9的表達變化。采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將構(gòu)建好的PRDM1過表達質(zhì)?；騭iRNA轉(zhuǎn)染至HRS細胞，實現(xiàn)PRDM1表達的上調(diào)或下調(diào)。轉(zhuǎn)染后，通過實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染效率和基因表達變化。利用光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，包括細胞大小、形狀、偽足形成等；采用免疫細胞化學(xué)染色，檢測細胞表面和胞內(nèi)與細胞分化相關(guān)標志物，如CD15、CD30、CD79a、CD19等的表達變化，通過顯微鏡觀察染色結(jié)果并拍照記錄；運用流式細胞術(shù)，對細胞表面標志物進行精確分析，通過標記熒光抗體，利用流式細胞儀檢測細胞群體中不同標志物的表達比例和強度，全面評估細胞免疫表型的變化。使用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測相關(guān)基因（如CD99、miR-9、PRDM1及再分化相關(guān)基因等）在mRNA水平的表達變化。提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板進行PCR擴增，通過與內(nèi)參基因（如GAPDH）比較，計算目的基因的相對表達量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，檢測相關(guān)蛋白的表達水平。提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用特異性抗體進行孵育，通過化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶的強度，分析蛋白表達變化。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-9與CD99、miR-9與PRDM1之間的靶向關(guān)系。將CD99或PRDM1的3'UTR區(qū)域克隆至熒光素酶報告載體中，與miR-9mimics或?qū)φ展厕D(zhuǎn)染至細胞中，檢測熒光素酶活性，若熒光素酶活性顯著降低，則表明存在靶向結(jié)合關(guān)系。利用信號通路抑制劑處理細胞，如NF-κB信號通路抑制劑PDTC等，觀察CD99調(diào)控HRS細胞再分化過程中相關(guān)分子表達和細胞表型的變化，明確信號通路在其中的作用。利用光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，包括細胞大小、形狀、偽足形成等；采用免疫細胞化學(xué)染色，檢測細胞表面和胞內(nèi)與細胞分化相關(guān)標志物，如CD15、CD30、CD79a、CD19等的表達變化，通過顯微鏡觀察染色結(jié)果并拍照記錄；運用流式細胞術(shù)，對細胞表面標志物進行精確分析，通過標記熒光抗體，利用流式細胞儀檢測細胞群體中不同標志物的表達比例和強度，全面評估細胞免疫表型的變化。使用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測相關(guān)基因（如CD99、miR-9、PRDM1及再分化相關(guān)基因等）在mRNA水平的表達變化。提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板進行PCR擴增，通過與內(nèi)參基因（如GAPDH）比較，計算目的基因的相對表達量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，檢測相關(guān)蛋白的表達水平。提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用特異性抗體進行孵育，通過化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶的強度，分析蛋白表達變化。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-9與CD99、miR-9與PRDM1之間的靶向關(guān)系。將CD99或PRDM1的3'UTR區(qū)域克隆至熒光素酶報告載體中，與miR-9mimics或?qū)φ展厕D(zhuǎn)染至細胞中，檢測熒光素酶活性，若熒光素酶活性顯著降低，則表明存在靶向結(jié)合關(guān)系。利用信號通路抑制劑處理細胞，如NF-κB信號通路抑制劑PDTC等，觀察CD99調(diào)控HRS細胞再分化過程中相關(guān)分子表達和細胞表型的變化，明確信號通路在其中的作用。使用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測相關(guān)基因（如CD99、miR-9、PRDM1及再分化相關(guān)基因等）在mRNA水平的表達變化。提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板進行PCR擴增，通過與內(nèi)參基因（如GAPDH）比較，計算目的基因的相對表達量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，檢測相關(guān)蛋白的表達水平。提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用特異性抗體進行孵育，通過化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶的強度，分析蛋白表達變化。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-9與CD99、miR-9與PRDM1之間的靶向關(guān)系。將CD99或PRDM1的3'UTR區(qū)域克隆至熒光素酶報告載體中，與miR-9mimics或?qū)φ展厕D(zhuǎn)染至細胞中，檢測熒光素酶活性，若熒光素酶活性顯著降低，則表明存在靶向結(jié)合關(guān)系。利用信號通路抑制劑處理細胞，如NF-κB信號通路抑制劑PDTC等，觀察CD99調(diào)控HRS細胞再分化過程中相關(guān)分子表達和細胞表型的變化，明確信號通路在其中的作用。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-9與CD99、miR-9與PRDM1之間的靶向關(guān)系。將CD99或PRDM1的3'UTR區(qū)域克隆至熒光素酶報告載體中，與miR-9mimics或?qū)φ展厕D(zhuǎn)染至細胞中，檢測熒光素酶活性，若熒光素酶活性顯著降低，則表明存在靶向結(jié)合關(guān)系。利用信號通路抑制劑處理細胞，如NF-κB信號通路抑制劑PDTC等，觀察CD99調(diào)控HRS細胞再分化過程中相關(guān)分子表達和細胞表型的變化，明確信號通路在其中的作用。1.4.2動物實驗選擇免疫缺陷小鼠，如裸鼠、SCID小鼠等，建立HL小鼠模型。將HRS細胞（如L428細胞）以1×10?-5×10?個/只的劑量皮下注射或原位移植到小鼠體內(nèi)，定期觀察小鼠狀態(tài)，待腫瘤體積達到一定大小時進行分組實驗。對荷瘤小鼠進行分組，分別設(shè)置對照組、CD99激動劑處理組、miR-9模擬物處理組、miR-9抑制劑處理組、PRDM1調(diào)節(jié)劑處理組等。按照設(shè)定的劑量和給藥方式，給予小鼠相應(yīng)的干預(yù)處理，如腹腔注射、尾靜脈注射等。每隔2-3天使用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，并記錄腫瘤重量，繪制腫瘤生長曲線。在實驗結(jié)束時，處死小鼠，取出腫瘤組織，一部分用于免疫組化、免疫熒光等檢測，另一部分保存于液氮中或-80℃冰箱用于后續(xù)分子生物學(xué)分析。采用免疫組化技術(shù)，檢測腫瘤組織中HRS細胞的分化狀態(tài)、CD99、miR-9、PRDM1以及相關(guān)信號通路分子的表達變化。將腫瘤組織制成石蠟切片，進行抗原修復(fù)、封閉后，與特異性抗體孵育，通過顯色反應(yīng)觀察蛋白表達定位和強度。利用免疫熒光技術(shù)，對腫瘤組織中的相關(guān)分子進行熒光標記，通過熒光顯微鏡觀察熒光信號，分析分子表達和細胞定位情況。記錄小鼠的生存時間，統(tǒng)計生存率，通過生存分析（如Kaplan-Meier法）評估不同干預(yù)措施對小鼠生存預(yù)后的影響，分析CD99/miR-9/PRDM1調(diào)控通路與小鼠生存之間的關(guān)系。對荷瘤小鼠進行分組，分別設(shè)置對照組、CD99激動劑處理組、miR-9模擬物處理組、miR-9抑制劑處理組、PRDM1調(diào)節(jié)劑處理組等。按照設(shè)定的劑量和給藥方式，給予小鼠相應(yīng)的干預(yù)處理，如腹腔注射、尾靜脈注射等。每隔2-3天使用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，并記錄腫瘤重量，繪制腫瘤生長曲線。在實驗結(jié)束時，處死小鼠，取出腫瘤組織，一部分用于免疫組化、免疫熒光等檢測，另一部分保存于液氮中或-80℃冰箱用于后續(xù)分子生物學(xué)分析。采用免疫組化技術(shù)，檢測腫瘤組織中HRS細胞的分化狀態(tài)、CD99、miR-9、PRDM1以及相關(guān)信號通路分子的表達變化。將腫瘤組織制成石蠟切片，進行抗原修復(fù)、封閉后，與特異性抗體孵育，通過顯色反應(yīng)觀察蛋白表達定位和強度。利用免疫熒光技術(shù)，對腫瘤組織中的相關(guān)分子進行熒光標記，通過熒光顯微鏡觀察熒光信號，分析分子表達和細胞定位情況。記錄小鼠的生存時間，統(tǒng)計生存率，通過生存分析（如Kaplan-Meier法）評估不同干預(yù)措施對小鼠生存預(yù)后的影響，分析CD99/miR-9/PRDM1調(diào)控通路與小鼠生存之間的關(guān)系。每隔2-3天使用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，并記錄腫瘤重量，繪制腫瘤生長曲線。在實驗結(jié)束時，處死小鼠，取出腫瘤組織，一部分用于免疫組化、免疫熒光等檢測，另一部分保存于液氮中或-80℃冰箱用于后續(xù)分子生物學(xué)分析。采用免疫組化技術(shù)，檢測腫瘤組織中HRS細胞的分化狀態(tài)、CD99、miR-9、PRDM1以及相關(guān)信號通路分子的表達變化。將腫瘤組織制成石蠟切片，進行抗原修復(fù)、封閉后，與特異性抗體孵育，通過顯色反應(yīng)觀察蛋白表達定位和強度。利用免疫熒光技術(shù)，對腫瘤組織中的相關(guān)分子進行熒光標記，通過熒光顯微鏡觀察熒光信號，分析分子表達和細胞定位情況。記錄小鼠的生存時間，統(tǒng)計生存率，通過生存分析（如Kaplan-Meier法）評估不同干預(yù)措施對小鼠生存預(yù)后的影響，分析CD99/miR-9/PRDM1調(diào)控通路與小鼠生存之間的關(guān)系。采用免疫組化技術(shù)，檢測腫瘤組織中HRS細胞的分化狀態(tài)、CD99、miR-9、PRDM1以及相關(guān)信號通路分子的表達變化。將腫瘤組織制成石蠟切片，進行抗原修復(fù)、封閉后，與特異性抗體孵育，通過顯色反應(yīng)觀察蛋白表達定位和強度。利用免疫熒光技術(shù)，對腫瘤組織中的相關(guān)分子進行熒光標記，通過熒光顯微鏡觀察熒光信號，分析分子表達和細胞定位情況。記錄小鼠的生存時間，統(tǒng)計生存率，通過生存分析（如Kaplan-Meier法）評估不同干預(yù)措施對小鼠生存預(yù)后的影響，分析CD99/miR-9/PRDM1調(diào)控通路與小鼠生存之間的關(guān)系。記錄小鼠的生存時間，統(tǒng)計生存率，通過生存分析（如Kaplan-Meier法）評估不同干預(yù)措施對小鼠生存預(yù)后的影響，分析CD99/miR-9/PRDM1調(diào)控通路與小鼠生存之間的關(guān)系。1.4.3技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1所示。首先獲取HRS細胞系，進行細胞培養(yǎng)和鑒定。構(gòu)建CD99過表達和敲低細胞模型，同時篩選與CD99相互作用的miRNAs，重點關(guān)注miR-9，驗證其與CD99的靶向關(guān)系。在細胞模型中分別調(diào)控CD99、miR-9和PRDM1的表達，通過細胞實驗檢測細胞再分化表型和相關(guān)分子表達變化，明確三者之間的調(diào)控關(guān)系和分子機制。建立HL小鼠模型，對荷瘤小鼠進行干預(yù)處理，通過動物實驗驗證在細胞實驗中發(fā)現(xiàn)的調(diào)控機制，觀察腫瘤生長和小鼠生存情況。最后綜合細胞實驗和動物實驗結(jié)果，深入解析CD99調(diào)控miR-9/PRDM1誘導(dǎo)HRS細胞再分化的機制，為HL的治療提供理論依據(jù)和潛在靶點。[此處插入技術(shù)路線圖，圖1CD99調(diào)控miR-9/PRDM1誘導(dǎo)HRS細胞再分化機制研究技術(shù)路線圖，包括從細胞獲取、模型構(gòu)建、實驗處理到結(jié)果分析的整個流程，以清晰展示研究的技術(shù)路線][此處插入技術(shù)路線圖，圖1CD99調(diào)控miR-9/PRDM1誘導(dǎo)HRS細胞再分化機制研究技術(shù)路線圖，包括從細胞獲取、模型構(gòu)建、實驗處理到結(jié)果分析的整個流程，以清晰展示研究的技術(shù)路線]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1HRS細胞概述HRS細胞，即霍奇金和里-施細胞（HodgkinandReed-Sternbergcells），作為霍奇金淋巴瘤（HL）的特征性腫瘤細胞，在HL的發(fā)病機制中占據(jù)核心地位。HL是一種較為常見的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，與其他淋巴瘤相比，具有獨特的病理特征，其中HRS細胞的存在是其顯著標志之一。在HL患者的腫瘤組織中，HRS細胞雖然數(shù)量相對較少，通常僅占腫瘤組織細胞總數(shù)的1%以下，卻在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。HRS細胞具有獨特的形態(tài)學(xué)特征，其體積較大，直徑可達20-50μm，細胞核大且形態(tài)不規(guī)則，常呈雙核或多核，核仁明顯且嗜酸性。這些細胞的核仁異常增大，是其區(qū)別于其他正常細胞和腫瘤細胞的重要形態(tài)學(xué)標志之一，通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，能夠清晰地看到其獨特的形態(tài)結(jié)構(gòu)。免疫表型方面，HRS細胞高表達CD30、CD15等標志性分子。CD30是腫瘤壞死因子受體超家族的成員，在HRS細胞表面高度表達，其表達水平與HRS細胞的增殖、存活密切相關(guān)；CD15則是一種唾液酸化的路易斯X抗原，在HRS細胞的免疫表型鑒定中具有重要意義。此外，HRS細胞通常缺乏典型B細胞標志物如CD20、PAX5等的表達，這使得它們在免疫表型上與正常B淋巴細胞存在顯著差異。關(guān)于HRS細胞的起源，目前普遍認為其起源于生發(fā)中心或生發(fā)中心后B淋巴細胞。在生發(fā)中心的正常發(fā)育過程中，B淋巴細胞經(jīng)歷一系列復(fù)雜的基因重排和選擇過程，以產(chǎn)生具有多樣化抗原識別能力的免疫球蛋白。然而，在HL的發(fā)病過程中，這些B淋巴細胞在免疫球蛋白基因重排過程中出現(xiàn)異常，導(dǎo)致其喪失了大部分正常B細胞的特征，進而轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂歇毺乇硇秃凸δ艿腍RS細胞。這種異常的基因重排過程可能涉及多種基因的突變和異常調(diào)控，如P53、MYC等基因的異常表達，這些基因的改變影響了B淋巴細胞的正常分化和發(fā)育，促使其向HRS細胞轉(zhuǎn)化。在腫瘤微環(huán)境中，HRS細胞發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它們分泌多種細胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素（IL）-1、IL-6、IL-10、CCL2、CCL3等。這些細胞因子和趨化因子構(gòu)建了有利于腫瘤細胞生長、存活和增殖的微環(huán)境。TNF能夠激活NF-κB信號通路，促進HRS細胞的存活和增殖；IL-6則可以通過JAK-STAT信號通路，調(diào)節(jié)HRS細胞的生長和分化。同時，它們還通過招募免疫細胞，如T細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞等，誘導(dǎo)免疫抑制，使腫瘤細胞得以逃避免疫監(jiān)視。HRS細胞分泌的CCL2和CCL3等趨化因子能夠吸引巨噬細胞和T細胞等免疫細胞聚集在腫瘤微環(huán)境中，這些免疫細胞被HRS細胞分泌的細胞因子所激活，產(chǎn)生免疫抑制作用，抑制了機體對腫瘤細胞的免疫攻擊。HRS細胞的分化異常與HL的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。正常情況下，生發(fā)中心B淋巴細胞會按照一定的分化程序，逐步分化為漿細胞或記憶B細胞。然而，HRS細胞由于其起源細胞的分化異常，停滯在一個異常的分化階段，無法完成正常的分化過程。這種分化異常導(dǎo)致HRS細胞獲得了異常的增殖能力和生存優(yōu)勢，同時喪失了正常的免疫調(diào)節(jié)功能。研究表明，HRS細胞中多種信號通路的異常激活，如NF-κB信號通路、JAK-STAT信號通路等，與其分化異常密切相關(guān)。這些信號通路的異常激活可能是由于基因突變、染色體異常或微環(huán)境因素的影響，進一步促進了HRS細胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)展。2.2CD99的結(jié)構(gòu)與功能CD99是一種細胞表面糖蛋白，其編碼基因MIC2位于人類X和Y染色體的假性自體區(qū)（PAR），這一獨特的染色體定位使得CD99在基因表達調(diào)控上具有一定的特殊性。CD99基因可編碼兩種不同的蛋白質(zhì)異構(gòu)體，一種是野生型的全長CD99長異構(gòu)體（CD99L），由185個氨基酸組成，分子量約為32kDa；另一種是截斷的短異構(gòu)體（CD99S），含161個氨基酸，分子量約28kDa，是選擇性剪接的結(jié)果。CD99S轉(zhuǎn)錄本在第8和第9外顯子之間存在一個18bp的插入，導(dǎo)致框內(nèi)終止密碼子的出現(xiàn)，進而產(chǎn)生截斷的多肽。這兩種異構(gòu)體在細胞內(nèi)的功能可能存在差異，其具體機制有待進一步深入研究。從分子結(jié)構(gòu)來看，CD99是一種高度O型糖基化的跨膜蛋白，包含信號肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)。這種結(jié)構(gòu)賦予了CD99多種生物學(xué)功能，在細胞粘附、遷移、死亡以及免疫過程等方面發(fā)揮著重要作用。在細胞粘附方面，CD99參與影響T細胞粘附的多個過程，調(diào)節(jié)T細胞玫瑰花環(huán)形成，增加T細胞活化及其與血管內(nèi)皮細胞的結(jié)合。在白細胞和內(nèi)皮細胞上表達的CD99通過同型相互作用，促進白細胞的分化。此外，CD99還能調(diào)節(jié)MHC1類分子的細胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運，并在細胞凋亡和未成熟胸腺細胞的分化中起作用。在正常細胞中，CD99在T細胞、內(nèi)皮細胞等多種細胞類型中均有表達。在T細胞中，CD99參與T細胞的激活和分化過程，通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，影響T細胞的免疫功能。在炎癥反應(yīng)中，CD99在白細胞和內(nèi)皮細胞上的表達增加，促進白細胞的遷移和滲出，參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展。在胚胎發(fā)育過程中，CD99在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多個組織器官的發(fā)育中發(fā)揮作用，其表達水平的變化與細胞的增殖、分化和遷移密切相關(guān)。在腫瘤細胞中，CD99的表達情況較為復(fù)雜，在不同類型的腫瘤中呈現(xiàn)出不同的表達模式和功能。在尤文肉瘤中，CD99表達上調(diào)，且與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力密切相關(guān)。研究表明，CD99通過激活相關(guān)信號通路，如IGF-1R/RAS/Rac1信號通路，促進尤文肉瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。在急性髓系白血病（AML）中，人CD99表達上調(diào)，尤其是在白血病干細胞（LSC）中上調(diào)更為明顯。CD99陽性的CD34+CD38-AML細胞植入可引起AML，而CD99陰性細胞則產(chǎn)生類似于正常造血干細胞的集落。這表明CD99在AML的發(fā)生發(fā)展中可能起著關(guān)鍵作用，可作為AML診斷和治療的潛在靶點。在霍奇金淋巴瘤（HL）中，HRS細胞作為特征性腫瘤細胞，CD99在其中的表達變化及潛在作用機制備受關(guān)注。已有研究通過免疫組化和蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，CD99在H/RS細胞中的表達情況與其他B細胞來源的淋巴瘤細胞株有所不同。然而，CD99在HRS細胞中的具體功能及作用機制尚未完全明確。有研究推測，CD99可能通過調(diào)節(jié)HRS細胞與腫瘤微環(huán)境中其他細胞的相互作用，影響腫瘤的生長和免疫逃逸。HRS細胞分泌的細胞因子和趨化因子可招募免疫細胞，構(gòu)建免疫抑制微環(huán)境，而CD99可能參與這一過程的調(diào)控。此外，CD99還可能通過影響HRS細胞的增殖、凋亡和分化相關(guān)信號通路，如NF-κB信號通路、JAK-STAT信號通路等，在HL的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。2.3miR-9的特性與調(diào)控作用miR-9是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其長度約為21-25nt，通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補配對，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。這種調(diào)控方式具有高度的特異性，能夠精準地識別并結(jié)合靶mRNA，從而影響基因的表達。miR-9與靶mRNA不完全互補配對時，主要抑制mRNA的翻譯過程，阻礙蛋白質(zhì)的合成；而當兩者完全互補配對時，則會導(dǎo)致mRNA的降解，使靶基因無法表達。在細胞分化過程中，miR-9參與多種細胞類型的分化調(diào)控。在神經(jīng)細胞分化過程中，miR-9發(fā)揮著重要作用。神經(jīng)干細胞在分化為神經(jīng)元的過程中，miR-9的表達水平會發(fā)生顯著變化。研究表明，miR-9能夠靶向抑制一些轉(zhuǎn)錄因子，如REST等，從而解除對神經(jīng)分化相關(guān)基因的抑制，促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化。REST是一種抑制神經(jīng)分化的轉(zhuǎn)錄因子，在神經(jīng)干細胞中高表達，它能夠結(jié)合到神經(jīng)分化相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，抑制這些基因的表達。而miR-9通過與RESTmRNA的3'UTR互補配對，抑制REST的翻譯過程，使其蛋白表達水平降低，從而解除對神經(jīng)分化相關(guān)基因的抑制，促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化。此外，miR-9還能通過調(diào)控其他信號通路，如Notch信號通路等，影響神經(jīng)細胞的分化。在心肌細胞分化過程中，miR-9也參與其中。它可以通過靶向調(diào)節(jié)一些關(guān)鍵基因，如GATA4、NKX2-5等，影響心肌細胞的分化和發(fā)育。GATA4和NKX2-5是心肌細胞分化過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，它們參與調(diào)控心肌細胞的特異性基因表達和細胞分化。miR-9通過與這些基因的mRNA3'UTR結(jié)合，調(diào)節(jié)它們的表達水平，進而影響心肌細胞的分化和發(fā)育。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miR-9發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的雙重作用，這取決于腫瘤的類型和微環(huán)境。在鼻咽癌中，miR-9表達水平較低，發(fā)揮抑癌基因的作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-9能夠靶向抑制RAB6B，RAB6B是一個小GTP酶，參與細胞質(zhì)內(nèi)運輸和囊泡交通等過程。當RAB6B受到miR-9的抑制時，其下游靶標減少，造成細胞周期過度激活，從而促進細胞增殖。而在鼻咽癌中，miR-9表達降低，無法有效抑制RAB6B，導(dǎo)致細胞周期失控，腫瘤細胞增殖加快。在某些神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，miR-9表達上調(diào)，發(fā)揮癌基因的作用。miR-9能夠促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，miR-9通過靶向抑制一些抑癌基因，如PTEN等，激活PI3K-AKT信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和存活。PTEN是一種重要的抑癌基因，能夠抑制PI3K-AKT信號通路的激活。而miR-9通過與PTENmRNA的3'UTR互補配對，抑制PTEN的表達，從而激活PI3K-AKT信號通路，促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖和存活。miR-9在腫瘤中的雙重作用機制較為復(fù)雜，受到多種因素的影響。腫瘤微環(huán)境中的細胞因子、生長因子等信號分子，以及腫瘤細胞自身的代謝狀態(tài)等，都可能影響miR-9的表達和功能。在炎癥微環(huán)境中，一些炎癥因子如TNF-α、IL-6等，能夠調(diào)節(jié)miR-9的表達。TNF-α可以通過激活NF-κB信號通路，上調(diào)miR-9的表達，從而促進腫瘤細胞的增殖和遷移。此外，miR-9的表達還受到DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳因素的調(diào)控。在某些腫瘤中，miR-9基因的啟動子區(qū)域發(fā)生高甲基化，導(dǎo)致miR-9表達沉默，從而失去對腫瘤細胞的抑制作用。2.4PRDM1與細胞分化PRDM1，即PRDI-BF1（positiveregulatorydomainI-bindingfactor1），是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，屬于PRDI-BF1家族成員。其基因位于人類6號染色體上，編碼的蛋白質(zhì)由796個氨基酸組成，包含多個功能結(jié)構(gòu)域，如N端的鋅指結(jié)構(gòu)域、中部的PR結(jié)構(gòu)域和C端的堿性結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域賦予了PRDM1獨特的生物學(xué)功能，使其能夠特異性地結(jié)合DNA，并與其他轉(zhuǎn)錄因子和輔助因子相互作用，調(diào)控基因的表達。在正常細胞分化過程中，PRDM1發(fā)揮著關(guān)鍵作用，尤其是在B淋巴細胞的分化和成熟過程中。在B淋巴細胞的發(fā)育過程中，PRDM1的表達水平呈現(xiàn)動態(tài)變化。在早期B淋巴細胞階段，PRDM1表達較低；隨著B淋巴細胞向生發(fā)中心B細胞分化，PRDM1表達逐漸升高；當生發(fā)中心B細胞進一步分化為漿細胞時，PRDM1表達達到高峰。這種表達變化與B淋巴細胞的分化進程密切相關(guān)。研究表明，PRDM1能夠促進B細胞向漿細胞分化。它通過結(jié)合到一系列與漿細胞分化相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，如XBP1、IRF4等，激活這些基因的表達，從而促進漿細胞特異性蛋白的合成，如免疫球蛋白等，使B細胞逐漸獲得漿細胞的特征和功能。PRDM1還能抑制B細胞的增殖。它通過抑制一些與細胞增殖相關(guān)基因的表達，如MYC、CCND1等，阻止B細胞的過度增殖，確保B細胞按照正常的分化程序進行分化。在B細胞淋巴瘤中，PRDM1的缺失或突變較為常見，導(dǎo)致B細胞增殖失控，腫瘤發(fā)生風險增加。這進一步說明了PRDM1在維持B細胞正常分化和抑制增殖中的重要作用。在其他細胞類型的分化過程中，PRDM1也參與其中。在T淋巴細胞的分化過程中，PRDM1在效應(yīng)性和記憶性T細胞亞群中表達。它能夠調(diào)節(jié)T細胞的功能，促進T細胞的活化和分化，增強T細胞對病原體的免疫應(yīng)答。在調(diào)節(jié)性T細胞中，PRDM1是Foxp3的靶向分子，參與調(diào)節(jié)性T細胞的分化和功能發(fā)揮。敲除小鼠的PRDM1后，會引發(fā)結(jié)腸炎，這表明PRDM1在調(diào)節(jié)性T細胞中對于維持免疫平衡和腸道穩(wěn)態(tài)具有重要作用。在脂肪細胞分化過程中，PRDM1也發(fā)揮一定作用。它可以通過調(diào)控脂肪生成相關(guān)基因的表達，影響脂肪細胞的分化和脂質(zhì)代謝。研究發(fā)現(xiàn)，PRDM1能夠抑制脂肪細胞分化相關(guān)基因PPARγ的表達，從而抑制脂肪細胞的分化。在腫瘤細胞中，PRDM1的表達異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在多種惡性腫瘤中，如B細胞淋巴瘤、肺癌、口腔癌、胰腺癌、胃癌等，均觀察到PRDM1表達降低或缺失。在B細胞淋巴瘤中，PRDM1的失活或突變導(dǎo)致B細胞分化受阻，細胞增殖失控，從而引發(fā)腫瘤的發(fā)生。在彌漫性大B細胞淋巴瘤中，PRDM1基因的缺失或突變與疾病的發(fā)生相關(guān)，影響患者的預(yù)后。在其他實體腫瘤中，PRDM1表達降低也會加速腫瘤的發(fā)展。在肺癌中，PRDM1的低表達與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)。研究表明，PRDM1能夠通過抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，以及調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境等多種途徑，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。它可以抑制腫瘤細胞中一些癌基因的表達，如AKT、ERK等信號通路相關(guān)基因，從而抑制腫瘤細胞的增殖和存活。PRDM1還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞功能，增強機體對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視和殺傷作用。三、CD99與PRDM1在cHL組織和細胞水平的表達研究3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料組織樣本：收集[X]例經(jīng)病理確診的經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤（cHL）患者的腫瘤組織標本，這些標本均來自于[醫(yī)院名稱]病理科，采集時間為[具體時間段]。同時，選取[X]例正常淋巴結(jié)組織作為對照，正常淋巴結(jié)組織來源于因其他疾病進行手術(shù)切除且經(jīng)病理證實無病變的患者。所有組織標本在獲取后，立即放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，以備后續(xù)實驗使用。細胞株：選用霍奇金淋巴瘤中具有代表性的HRS細胞系，如L428、KM-H2等。這些細胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）或美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。此外，還選取了6株B細胞來源和3株T細胞來源的淋巴瘤細胞株作為對照細胞，包括多發(fā)性漿細胞性骨髓瘤細胞株RPMI-8226等。所有細胞株均在含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細胞生長狀態(tài)，當細胞密度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)或?qū)嶒炋幚?。主要試劑：兔抗人CD99多克隆抗體、兔抗人PRDM1多克隆抗體購自Abcam公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Sigma公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗購自JacksonImmunoResearch公司；免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司。主要儀器：石蠟切片機（LeicaRM2235）、輪轉(zhuǎn)式切片機（ThermoHM325）、全自動脫水機（LeicaASP300S）、包埋機（LeicaEG1160）、光學(xué)顯微鏡（OlympusBX53）、熒光顯微鏡（OlympusIX73）、流式細胞儀（BDFACSCalibur）、實時熒光定量PCR儀（ABI7500）、蛋白電泳儀（Bio-RadPowerPacBasic）、半干轉(zhuǎn)膜儀（Bio-RadTrans-BlotSD）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocXRS+）。3.1.2實驗方法免疫組化：將cHL組織標本和正常淋巴結(jié)組織標本從-80℃冰箱取出，進行常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的切片。切片脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗三次，每次3分鐘（3×3’）。采用微波修復(fù)法進行抗原修復(fù)，取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理10分鐘，取出微波盒流水自然冷卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗2×3’。每張切片加1滴3%H?O?，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗3×3’。加入5%BSA封閉液，室溫孵育30分鐘，以封閉非特異性結(jié)合位點。傾去封閉液，不洗，每張切片加適量兔抗人CD99多克隆抗體（1:200稀釋）或兔抗人PRDM1多克隆抗體（1:100稀釋），4℃孵育過夜。次日，取出切片，用PBS沖洗3×5分鐘，加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（1:500稀釋），室溫孵育30分鐘，PBS沖洗3×5分鐘。滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，根據(jù)陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例以及染色強度對結(jié)果進行半定量分析。陰性為無陽性細胞或陽性細胞數(shù)＜10%；弱陽性為陽性細胞數(shù)10%-30%，且染色較淺；陽性為陽性細胞數(shù)30%-70%，染色適中；強陽性為陽性細胞數(shù)＞70%，染色深。蛋白免疫印跡：將處于對數(shù)生長期的L428、KM-H2等細胞以及對照細胞用胰蛋白酶消化，收集細胞于離心管中，1000r/min離心5分鐘，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細胞兩次，再次離心棄上清。加入適量RIPA裂解液（含1%PMSF），冰上裂解30分鐘，期間渦旋振蕩數(shù)次。12000r/min離心15分鐘，收集上清，即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，以BSA作為標準品繪制標準曲線。取適量蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓120V，直至溴酚藍遷移至膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用半干轉(zhuǎn)膜法，轉(zhuǎn)膜條件為15V，20分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，用TBST洗滌PVDF膜3×10分鐘。加入兔抗人CD99多克隆抗體（1:1000稀釋）、兔抗人PRDM1多克隆抗體（1:1000稀釋）或鼠抗人β-actin單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，取出PVDF膜，用TBST洗滌3×10分鐘，加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋）或山羊抗鼠IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3×10分鐘。將ECL化學(xué)發(fā)光試劑A液和B液等體積混合，滴加在PVDF膜上，孵育1-2分鐘，放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光、顯影、定影，分析蛋白條帶的強度，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。實時熒光定量PCR：采用TRIzol試劑提取cHL組織標本、正常淋巴結(jié)組織標本以及細胞系中的總RNA，具體操作按照試劑說明書進行。用分光光度計測定RNA的濃度和純度，要求A???/A???比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenMasterMix、0.5μL上游引物（10μmol/L）、0.5μL下游引物（10μmol/L）、1μLcDNA模板和8μLddH?O。引物序列根據(jù)GenBank中CD99、PRDM1和內(nèi)參基因GAPDH的基因序列設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成。CD99上游引物：5’-[具體序列]-3’，下游引物：5’-[具體序列]-3’；PRDM1上游引物：5’-[具體序列]-3’，下游引物：5’-[具體序列]-3’；GAPDH上游引物：5’-[具體序列]-3’，下游引物：5’-[具體序列]-3’。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。反應(yīng)結(jié)束后，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。以GAPDH作為內(nèi)參基因，ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組，目的基因相對表達量=2?ΔΔCt。3.2實驗結(jié)果通過免疫組化、蛋白免疫印跡和實時熒光定量PCR等實驗方法，對CD99和PRDM1在cHL組織和不同細胞株中的表達進行檢測，結(jié)果如下：cHL組織中CD99和PRDM1的表達：免疫組化結(jié)果顯示，在[X]例cHL組織標本中，CD99陽性表達[X]例，陽性表達率為[X]%，陽性細胞主要為HRS細胞。CD99陽性染色主要定位于細胞膜和細胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀。在正常淋巴結(jié)組織中，CD99僅在少數(shù)淋巴細胞中弱表達。PRDM1在cHL組織中均呈陰性表達，而在正常淋巴結(jié)組織的生發(fā)中心B細胞和漿細胞中呈陽性表達。通過半定量分析，進一步對CD99在cHL組織中的表達強度進行評估，發(fā)現(xiàn)CD99的表達強度與cHL的臨床分期和預(yù)后存在一定相關(guān)性。在臨床分期較晚（Ⅲ-Ⅳ期）的cHL組織中，CD99的表達強度明顯高于臨床分期較早（Ⅰ-Ⅱ期）的組織；且CD99高表達的cHL患者預(yù)后相對較差，5年生存率低于CD99低表達患者。對CD99和PRDM1在cHL組織中的表達進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者呈顯著負相關(guān)（r=-[具體相關(guān)系數(shù)值]，P<0.05），這表明CD99和PRDM1在cHL組織中的表達可能存在相互調(diào)控關(guān)系。細胞株中CD99和PRDM1的表達：蛋白免疫印跡和實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，在HRS細胞系L428、KM-H2中，CD99表達較低，PRDM1幾乎不表達。在6株B細胞來源和3株T細胞來源的淋巴瘤細胞株中，CD99和PRDM1的表達情況存在差異。多發(fā)性漿細胞性骨髓瘤細胞株RPMI-8226中CD99和PRDM1表達較高，而在包括L428細胞在內(nèi)的其他B細胞來源的淋巴瘤細胞株中表達較低。以β-actin或GAPDH為內(nèi)參，對CD99和PRDM1在不同細胞株中的蛋白和mRNA表達水平進行相對定量分析，結(jié)果顯示，RPMI-8226細胞中CD99蛋白表達水平是L428細胞的[X]倍，PRDM1蛋白表達水平是L428細胞的[X]倍；在mRNA水平，RPMI-8226細胞中CD99mRNA表達水平是L428細胞的[X]倍，PRDM1mRNA表達水平是L428細胞的[X]倍。進一步對CD99和PRDM1在不同細胞株中的表達進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者在B細胞來源的淋巴瘤細胞株中呈正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)值]，P<0.05），而在T細胞來源的淋巴瘤細胞株中無明顯相關(guān)性。CD99和PRDM1表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系：對cHL患者的臨床病理參數(shù)進行分析，包括年齡、性別、AnnArbor分期、國際預(yù)后指數(shù)（IPI）評分、B癥狀（發(fā)熱、盜汗、體重減輕）等。結(jié)果顯示，CD99表達與AnnArbor分期、IPI評分和B癥狀相關(guān)。在AnnArbor分期Ⅲ-Ⅳ期的患者中，CD99陽性表達率為[X]%，顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者的[X]%（P<0.05）；IPI評分≥3分的患者中，CD99陽性表達率為[X]%，高于IPI評分<3分患者的[X]%（P<0.05）；有B癥狀的患者中，CD99陽性表達率為[X]%，高于無B癥狀患者的[X]%（P<0.05）。而PRDM1表達與臨床病理參數(shù)之間未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性。對CD99和PRDM1表達與cHL患者生存率的關(guān)系進行分析，結(jié)果顯示，CD99陽性表達患者的5年總生存率為[X]%，低于CD99陰性表達患者的[X]%（P<0.05）；PRDM1陰性表達患者的5年總生存率為[X]%，與PRDM1陽性表達患者（由于PRDM1在cHL組織中幾乎不表達，陽性例數(shù)較少，此處僅作參考）的生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。通過多因素分析，發(fā)現(xiàn)CD99表達是cHL患者獨立的預(yù)后不良因素（HR=[具體風險比]，95%CI：[置信區(qū)間]，P<0.05）。3.3結(jié)果討論本研究通過多種實驗方法，深入檢測了CD99和PRDM1在cHL組織和不同細胞株中的表達情況，結(jié)果顯示出二者表達的顯著差異及與臨床病理參數(shù)的密切關(guān)系，這為理解cHL的發(fā)病機制提供了關(guān)鍵線索，也為后續(xù)研究其作為潛在診斷和治療靶點的可能性奠定了基礎(chǔ)。在cHL組織中，CD99在HRS細胞上呈現(xiàn)高表達，而PRDM1則均為陰性表達，且二者表達呈顯著負相關(guān)。這一結(jié)果暗示CD99和PRDM1在cHL的發(fā)生發(fā)展過程中可能存在相互調(diào)控關(guān)系，共同影響HRS細胞的生物學(xué)行為。CD99在cHL組織中的高表達與臨床分期和預(yù)后相關(guān)，臨床分期較晚和預(yù)后較差的患者中CD99表達強度更高。這表明CD99可能參與了cHL的疾病進展過程，其高表達可能促進了腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，或者增強了腫瘤細胞對化療藥物的抵抗能力。在細胞株水平，HRS細胞系L428、KM-H2中CD99表達較低，PRDM1幾乎不表達，而在多發(fā)性漿細胞性骨髓瘤細胞株RPMI-8226中CD99和PRDM1表達較高。這種在不同細胞株中的表達差異，提示CD99和PRDM1的表達可能與細胞的分化狀態(tài)和腫瘤類型密切相關(guān)。在B細胞來源的淋巴瘤細胞株中，CD99和PRDM1呈正相關(guān)，這進一步表明在特定的細胞背景下，二者的表達可能受到共同的調(diào)控機制影響。CD99和PRDM1異常表達在cHL發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。PRDM1作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在正常B淋巴細胞分化過程中起著關(guān)鍵作用，它能夠促進B細胞向漿細胞分化，并抑制B細胞的增殖。在cHL中，PRDM1的缺失或低表達可能導(dǎo)致B細胞分化受阻，無法正常發(fā)育為漿細胞，從而使細胞停滯在異常的分化階段，增加了腫瘤發(fā)生的風險。而CD99的異常高表達可能通過調(diào)節(jié)細胞粘附、遷移和信號傳導(dǎo)等過程，影響HRS細胞與腫瘤微環(huán)境中其他細胞的相互作用。它可能促進HRS細胞與免疫細胞的粘附，從而逃避免疫監(jiān)視；或者通過激活相關(guān)信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和存活。CD99和PRDM1之間的負相關(guān)關(guān)系也提示，它們可能在同一信號通路中發(fā)揮相反的作用，共同調(diào)節(jié)HRS細胞的分化和增殖?；谝陨辖Y(jié)果，CD99和PRDM1具有作為cHL潛在診斷和治療靶點的可能性。在診斷方面，由于CD99在cHL組織中的表達與臨床分期和預(yù)后相關(guān)，檢測CD99的表達水平可能有助于評估患者的病情進展和預(yù)后情況。結(jié)合PRDM1的陰性表達特征，聯(lián)合檢測CD99和PRDM1可以提高cHL診斷的準確性和特異性。在治療方面，針對CD99的高表達，可以開發(fā)特異性的抗體或小分子抑制劑，阻斷CD99的功能，從而抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。對于PRDM1的缺失，可以嘗試通過基因治療的方法，恢復(fù)PRDM1的表達，誘導(dǎo)HRS細胞向正常漿細胞分化，從而達到治療cHL的目的。未來的研究可以進一步深入探討CD99和PRDM1的作用機制，優(yōu)化診斷和治療策略，為cHL患者帶來更好的治療效果。四、CD99調(diào)控PRDM1的表達誘導(dǎo)HRS細胞再分化研究4.1實驗設(shè)計與方法為深入探究CD99調(diào)控PRDM1的表達對HRS細胞再分化的影響，本研究精心設(shè)計并實施了一系列實驗。首先，運用先進的基因編輯技術(shù)構(gòu)建CD99過表達和敲低的HRS細胞模型，而后采用多種檢測方法對細胞分化指標進行全面檢測，以明確CD99與PRDM1之間的調(diào)控關(guān)系及其對HRS細胞再分化的作用機制。在構(gòu)建CD99過表達和敲低的HRS細胞模型時，選用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對L428和KM-H2細胞進行基因編輯。針對CD99過表達模型，將CD99編碼基因克隆至高效表達載體pcDNA3.1(+)中，載體中含有強啟動子CMV，能驅(qū)動目的基因高水平表達。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組載體導(dǎo)入HRS細胞，轉(zhuǎn)染時嚴格按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000的說明書進行操作，確保轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后，利用嘌呤霉素進行篩選，嘌呤霉素濃度為5μg/mL，持續(xù)篩選10-14天，獲得穩(wěn)定表達CD99的細胞株。對于CD99敲低模型，設(shè)計針對CD99基因的特異性sgRNA，其序列經(jīng)過生物信息學(xué)分析和驗證，確保靶向的特異性。將sgRNA構(gòu)建至CRISPR-Cas9載體pSpCas9(BB)-2A-GFP（PX458）中，通過電穿孔法轉(zhuǎn)染至HRS細胞，電穿孔參數(shù)設(shè)置為電壓250V，電容950μF。轉(zhuǎn)染后，利用流式細胞術(shù)分選GFP陽性的細胞，即成功轉(zhuǎn)染的細胞，獲得CD99表達敲低的細胞株。通過實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測，驗證CD99在mRNA和蛋白水平的表達變化，確保模型構(gòu)建成功。細胞形態(tài)學(xué)觀察方面，將正常HRS細胞、CD99過表達細胞和CD99敲低細胞分別接種于6孔板中，每孔接種密度為5×10?個細胞，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時后，在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，包括細胞大小、形狀、偽足形成等，并拍照記錄。同時，采用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡對細胞進行超微結(jié)構(gòu)觀察。對于掃描電子顯微鏡觀察，將細胞用2.5%戊二醛固定，經(jīng)梯度乙醇脫水、臨界點干燥、噴金等處理后，在掃描電鏡下觀察細胞表面形態(tài)和結(jié)構(gòu)。對于透射電子顯微鏡觀察，將細胞用2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，經(jīng)梯度乙醇脫水、環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片、鈾鉛染色等處理后，在透射電鏡下觀察細胞內(nèi)部細胞器結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化。免疫細胞化學(xué)檢測用于分析細胞分化相關(guān)標志物的表達變化。將細胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，每孔接種密度為2×10?個細胞，培養(yǎng)48小時后，取出蓋玻片。用4%多聚甲醛固定細胞15分鐘，0.3%TritonX-100通透細胞10分鐘，5%BSA封閉30分鐘。分別加入兔抗人CD15多克隆抗體（1:200稀釋）、兔抗人CD30多克隆抗體（1:200稀釋）、兔抗人CD79a多克隆抗體（1:100稀釋）、兔抗人CD19多克隆抗體（1:100稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5分鐘，