MicroRNA-27a在椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡調(diào)控中的分子機(jī)制與臨床意義探究一、引言1.1研究背景與目的椎間盤(pán)退變（IntervertebralDiscDegeneration，IDD）是一種常見(jiàn)的脊柱疾病，嚴(yán)重影響著全球大量人口的生活質(zhì)量，是導(dǎo)致腰痛和坐骨神經(jīng)痛的主要原因之一。隨著全球老齡化進(jìn)程的加速，IDD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有80%的成年人在一生中至少經(jīng)歷過(guò)一次腰痛，其中大部分與IDD相關(guān)。在中國(guó)，隨著人口老齡化的加劇以及人們生活方式的改變，IDD的患病人數(shù)也在不斷增加，給醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。椎間盤(pán)主要由髓核、纖維環(huán)和軟骨終板組成。髓核位于椎間盤(pán)的中央，是一種富含水分和蛋白多糖的膠狀物質(zhì)，具有緩沖脊柱壓力、維持脊柱運(yùn)動(dòng)靈活性的重要作用。纖維環(huán)環(huán)繞在髓核周?chē)?，由多層纖維軟骨組成，能夠承受和分散脊柱的壓力，保持椎間盤(pán)的穩(wěn)定性。軟骨終板則位于椎間盤(pán)的上下兩端，與椎體相連，為椎間盤(pán)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換通道，并參與椎間盤(pán)的代謝過(guò)程。正常情況下，椎間盤(pán)內(nèi)的細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，髓核細(xì)胞通過(guò)合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，維持著椎間盤(pán)的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，隨著年齡的增長(zhǎng)、長(zhǎng)期的機(jī)械應(yīng)力作用、遺傳因素以及炎癥反應(yīng)等多種因素的影響，椎間盤(pán)會(huì)逐漸發(fā)生退變。在IDD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，髓核細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵的病理過(guò)程。髓核細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞外基質(zhì)合成減少，分解增加，從而破壞了椎間盤(pán)的正常結(jié)構(gòu)和功能平衡，引發(fā)椎間盤(pán)退變。研究表明，在退變的椎間盤(pán)中，髓核細(xì)胞凋亡率明顯升高，且與椎間盤(pán)退變的程度呈正相關(guān)。當(dāng)髓核細(xì)胞凋亡過(guò)度時(shí)，椎間盤(pán)的水分含量減少，彈性降低，椎間隙變窄，進(jìn)而導(dǎo)致脊柱的穩(wěn)定性下降，引發(fā)腰痛、下肢放射痛等一系列臨床癥狀。MicroRNA（miRNA）是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約為21-25個(gè)核苷酸。它們通過(guò)與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促使其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。miRNA參與了生物體的多種生理和病理過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝以及腫瘤發(fā)生等。在IDD領(lǐng)域，越來(lái)越多的研究表明miRNA在髓核細(xì)胞凋亡和椎間盤(pán)退變過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。不同的miRNA在椎間盤(pán)退變過(guò)程中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，它們通過(guò)靶向作用于多個(gè)與髓核細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因和信號(hào)通路，影響髓核細(xì)胞的存活和功能，進(jìn)而調(diào)控椎間盤(pán)的退變進(jìn)程。MicroRNA-27a（miR-27a）作為miRNA家族的重要成員之一，在多種細(xì)胞生理過(guò)程和疾病中扮演著關(guān)鍵角色。近年來(lái)，miR-27a在腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等領(lǐng)域的研究取得了顯著進(jìn)展。在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，miR-27a在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，通過(guò)靶向調(diào)控腫瘤相關(guān)基因，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡過(guò)程，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在心血管疾病方面，miR-27a參與了心肌細(xì)胞的增殖、分化以及血管平滑肌細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)，與動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，miR-27a對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡具有重要調(diào)控作用，與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而，目前關(guān)于miR-27a在椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制研究尚處于起步階段。雖然已有一些研究初步探討了miR-27a與椎間盤(pán)退變的相關(guān)性，但對(duì)于其具體的調(diào)控靶點(diǎn)和信號(hào)通路仍不清楚。深入研究miR-27a在髓核細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，不僅有助于揭示IDD的發(fā)病機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)，還可能為IDD的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物。因此，本研究旨在系統(tǒng)地探究miR-27a對(duì)椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及其潛在的分子機(jī)制，以期為IDD的防治提供新的靶點(diǎn)和思路。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在椎間盤(pán)退變的研究領(lǐng)域，髓核細(xì)胞凋亡與IDD的密切聯(lián)系已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究重點(diǎn)之一。國(guó)外學(xué)者在這方面開(kāi)展了大量的基礎(chǔ)和臨床研究。例如，一些研究通過(guò)對(duì)不同年齡段和退變程度的椎間盤(pán)組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞凋亡率隨著椎間盤(pán)退變程度的加重而顯著升高。利用動(dòng)物模型模擬椎間盤(pán)退變過(guò)程，進(jìn)一步證實(shí)了髓核細(xì)胞凋亡在IDD發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)條件，如改變力學(xué)環(huán)境、添加炎癥因子等，能夠誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡，從而深入探討凋亡的發(fā)生機(jī)制。國(guó)內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)也在髓核細(xì)胞凋亡與IDD的關(guān)系方面取得了豐碩成果。通過(guò)對(duì)臨床患者的椎間盤(pán)組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，分析髓核細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化，為揭示IDD的發(fā)病機(jī)制提供了臨床依據(jù)。在分子機(jī)制研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者深入探討了多種信號(hào)通路在髓核細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路等，發(fā)現(xiàn)這些信號(hào)通路的異常激活或抑制與髓核細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。近年來(lái)，隨著對(duì)miRNA研究的不斷深入，其在椎間盤(pán)退變中的作用逐漸受到關(guān)注。國(guó)外多個(gè)研究小組針對(duì)miRNA與髓核細(xì)胞凋亡的關(guān)系展開(kāi)了研究。他們通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，篩選出在退變椎間盤(pán)中差異表達(dá)的miRNA，并對(duì)其功能進(jìn)行了驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a、miR-155等在髓核細(xì)胞凋亡和椎間盤(pán)退變過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。這些miRNA通過(guò)靶向作用于相關(guān)基因，影響髓核細(xì)胞的增殖、凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，從而參與椎間盤(pán)退變的發(fā)生發(fā)展。國(guó)內(nèi)在miRNA與椎間盤(pán)退變領(lǐng)域的研究也取得了顯著進(jìn)展。眾多科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用生物信息學(xué)分析、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等多種手段，深入探究miRNA在髓核細(xì)胞凋亡中的調(diào)控機(jī)制。有研究表明，miR-21通過(guò)靶向調(diào)控程序性細(xì)胞死亡蛋白4（PDCD4），抑制髓核細(xì)胞凋亡，對(duì)椎間盤(pán)退變起到一定的保護(hù)作用。此外，國(guó)內(nèi)學(xué)者還關(guān)注miRNA在椎間盤(pán)退變?cè)\斷和治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值，探索將其作為生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)的可能性。MicroRNA-27a作為miRNA家族的重要成員，在其他疾病領(lǐng)域已取得了較多研究成果，但在椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡中的研究相對(duì)較少。在腫瘤研究方面，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)miR-27a在乳腺癌、肝癌等多種腫瘤組織中異常表達(dá)，通過(guò)靶向作用于多個(gè)腫瘤相關(guān)基因，如磷脂酶和張力蛋白同源物（PTEN）、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑1B（CDKN1B）等，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移。在心血管疾病研究中，miR-27a參與了心肌肥厚、動(dòng)脈粥樣硬化等病理過(guò)程的調(diào)控，通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的功能。國(guó)內(nèi)對(duì)miR-27a在其他疾病中的研究也不斷深入。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面，研究表明miR-27a在腦缺血、阿爾茨海默病等疾病中表達(dá)異常，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的存活、分化和凋亡具有重要調(diào)控作用。在糖尿病及其并發(fā)癥的研究中，發(fā)現(xiàn)miR-27a與胰島素抵抗、糖尿病腎病等密切相關(guān)，通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，影響疾病的發(fā)生發(fā)展。然而，目前關(guān)于miR-27a在椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制研究仍存在諸多不足與空白。雖然已有少量研究初步報(bào)道了miR-27a在退變椎間盤(pán)中的表達(dá)變化，但對(duì)于其具體的調(diào)控靶點(diǎn)和信號(hào)通路尚未明確。在研究方法上，現(xiàn)有的研究多局限于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，缺乏臨床樣本的深入驗(yàn)證，導(dǎo)致研究結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用受到限制。此外，miR-27a與其他調(diào)控因子之間的相互作用關(guān)系以及其在椎間盤(pán)退變過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律也有待進(jìn)一步研究。填補(bǔ)這些研究空白，將有助于深入揭示IDD的發(fā)病機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新的治療策略提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)本研究將綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)方法，深入探究miR-27a在椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，通過(guò)體外分離和培養(yǎng)人或動(dòng)物的椎間盤(pán)髓核細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定的細(xì)胞模型。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-27a模擬物、抑制劑或相應(yīng)的對(duì)照序列導(dǎo)入髓核細(xì)胞，以調(diào)控miR-27a的表達(dá)水平。通過(guò)MTT法、CCK-8法等檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，全面評(píng)估m(xù)iR-27a對(duì)髓核細(xì)胞增殖和凋亡的影響。在分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用上，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)miR-27a及其潛在靶基因在mRNA水平的表達(dá)變化，明確miR-27a對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控作用。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot），分析靶蛋白以及凋亡相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平，深入探究miR-27a調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。為了確定miR-27a與靶基因之間的直接相互作用關(guān)系，將進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證miR-27a對(duì)靶基因3'-UTR的靶向結(jié)合作用。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在研究角度和方法兩個(gè)方面。在研究角度上，首次聚焦于miR-27a在椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制研究，填補(bǔ)了該領(lǐng)域在這一特定miRNA研究方面的空白，為深入理解椎間盤(pán)退變的發(fā)病機(jī)制提供了全新的視角。以往關(guān)于椎間盤(pán)退變的研究多集中在傳統(tǒng)的細(xì)胞因子、信號(hào)通路以及其他miRNA上，對(duì)miR-27a的關(guān)注較少。本研究將為揭示IDD的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，有助于開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)和策略。在研究方法上，本研究將采用多組學(xué)聯(lián)合分析的策略，結(jié)合生物信息學(xué)分析、高通量測(cè)序技術(shù)以及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，全面系統(tǒng)地探究miR-27a的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-27a的潛在靶基因，并結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)篩選出在髓核細(xì)胞凋亡過(guò)程中差異表達(dá)的基因和信號(hào)通路，再通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，這種多組學(xué)聯(lián)合分析的方法能夠更全面、深入地揭示miR-27a在髓核細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，提高研究結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。此外，本研究還將注重基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用的結(jié)合，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，收集臨床患者的椎間盤(pán)組織樣本，驗(yàn)證miR-27a及其靶基因在人體中的表達(dá)情況和作用機(jī)制，為后續(xù)的臨床轉(zhuǎn)化研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。二、椎間盤(pán)與MicroRNA-27a的基礎(chǔ)理論2.1椎間盤(pán)的結(jié)構(gòu)與生理功能2.1.1椎間盤(pán)的解剖結(jié)構(gòu)椎間盤(pán)位于相鄰兩個(gè)椎體之間，是連接椎體的重要結(jié)構(gòu)，由髓核、纖維環(huán)和軟骨終板三部分組成，起著“緩沖墊”的作用，對(duì)維持脊柱的正常功能至關(guān)重要。髓核是椎間盤(pán)的核心部分，位于椎間盤(pán)的中央偏后位置。它是一種富含水分、蛋白多糖和膠原蛋白的膠狀物質(zhì)，具有高度的彈性和可塑性。在胎兒和青少年時(shí)期，髓核含水量較高，可達(dá)80%-90%，這使得髓核能夠有效地緩沖脊柱所承受的壓力，并在脊柱運(yùn)動(dòng)時(shí)發(fā)生變形，從而保證脊柱的靈活性。隨著年齡的增長(zhǎng)，髓核的含水量逐漸減少，彈性和緩沖能力也隨之下降。髓核中的蛋白多糖主要由聚集蛋白聚糖組成，它們通過(guò)與水分子結(jié)合，形成一種高度水化的凝膠狀結(jié)構(gòu)，賦予髓核良好的抗壓性能。此外，髓核中還含有少量的Ⅱ型膠原蛋白，這些膠原蛋白相互交織，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步增強(qiáng)了髓核的穩(wěn)定性和抗變形能力。纖維環(huán)環(huán)繞在髓核周?chē)?，由多層纖維軟骨組成。這些纖維軟骨呈同心圓狀排列，每層纖維軟骨中的膠原纖維方向相互交錯(cuò)，形成一種類(lèi)似“編織物”的結(jié)構(gòu)，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了纖維環(huán)強(qiáng)大的韌性和抗拉伸能力，能夠有效地約束髓核，防止其向外突出，并承受脊柱在各種運(yùn)動(dòng)和負(fù)荷下產(chǎn)生的應(yīng)力。纖維環(huán)的外層主要由Ⅰ型膠原蛋白組成，Ⅰ型膠原蛋白具有較高的強(qiáng)度和抗張能力，能夠承受較大的外力；內(nèi)層則主要由Ⅱ型膠原蛋白構(gòu)成，Ⅱ型膠原蛋白相對(duì)較柔軟，更適合維持纖維環(huán)的柔韌性和彈性。除了膠原蛋白外，纖維環(huán)中還含有一定量的蛋白多糖和其他細(xì)胞外基質(zhì)成分，它們共同參與維持纖維環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能完整性。在纖維環(huán)的外周部分，還分布有一些血管和神經(jīng)末梢，這些血管為纖維環(huán)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而神經(jīng)末梢則與椎間盤(pán)的疼痛感受密切相關(guān)。當(dāng)椎間盤(pán)發(fā)生退變或損傷時(shí)，這些神經(jīng)末梢可能受到刺激，從而引發(fā)疼痛癥狀。軟骨終板位于椎間盤(pán)的上下兩端，與椎體的軟骨面緊密相連，是一層透明軟骨組織。它主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，軟骨細(xì)胞呈扁平狀或橢圓形，均勻分布在基質(zhì)中。細(xì)胞外基質(zhì)主要包括膠原蛋白、蛋白多糖和水等成分，其中膠原蛋白主要為Ⅱ型膠原蛋白，與髓核和纖維環(huán)中的膠原蛋白成分相類(lèi)似，這有助于保持椎間盤(pán)各部分之間的結(jié)構(gòu)連續(xù)性和力學(xué)協(xié)調(diào)性。軟骨終板的厚度較薄，一般在0.5-1.0毫米之間，但它在椎間盤(pán)的生理功能中起著至關(guān)重要的作用。一方面，軟骨終板作為椎間盤(pán)與椎體之間的界面，為椎間盤(pán)提供了一個(gè)穩(wěn)定的支撐結(jié)構(gòu)，同時(shí)也參與了椎間盤(pán)與椎體之間的物質(zhì)交換過(guò)程。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)椎體的血管滲透到軟骨終板，再進(jìn)一步擴(kuò)散到椎間盤(pán)的其他部分，為髓核細(xì)胞和纖維環(huán)細(xì)胞提供必要的營(yíng)養(yǎng)支持；另一方面，軟骨終板還具有一定的彈性和緩沖作用，能夠在脊柱運(yùn)動(dòng)時(shí)減輕椎間盤(pán)與椎體之間的沖擊和摩擦，保護(hù)椎間盤(pán)和椎體免受損傷。在正常情況下，軟骨終板的結(jié)構(gòu)和功能保持相對(duì)穩(wěn)定，但隨著年齡的增長(zhǎng)、椎間盤(pán)退變以及各種病理因素的影響，軟骨終板可能會(huì)出現(xiàn)損傷、變薄、鈣化等改變，這些變化會(huì)影響椎間盤(pán)的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和力學(xué)性能，進(jìn)而加速椎間盤(pán)的退變進(jìn)程。2.1.2椎間盤(pán)的生理功能椎間盤(pán)在人體脊柱中承擔(dān)著多種重要的生理功能，對(duì)維持脊柱的正常結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)功能起著不可或缺的作用。椎間盤(pán)是連接相鄰椎體的重要結(jié)構(gòu)，通過(guò)其自身的彈性和韌性，將各個(gè)椎體緊密地連接在一起，使脊柱形成一個(gè)連續(xù)、穩(wěn)定的整體。這種連接方式不僅保證了脊柱的基本形態(tài)，還為脊柱的各種運(yùn)動(dòng)提供了基礎(chǔ)。在日常生活中，無(wú)論是站立、行走、彎腰、轉(zhuǎn)身還是進(jìn)行其他各種活動(dòng)，脊柱都需要進(jìn)行相應(yīng)的運(yùn)動(dòng)，而椎間盤(pán)的存在使得椎體之間能夠相對(duì)運(yùn)動(dòng)，同時(shí)又保持著一定的穩(wěn)定性，防止脊柱發(fā)生過(guò)度的位移或損傷。例如，當(dāng)我們彎腰時(shí)，椎間盤(pán)的前側(cè)受到擠壓，后側(cè)被拉伸，髓核會(huì)向后移動(dòng)，纖維環(huán)則承受著來(lái)自不同方向的應(yīng)力，通過(guò)自身的變形來(lái)適應(yīng)這種運(yùn)動(dòng)，從而保證脊柱的靈活性和穩(wěn)定性。椎間盤(pán)在脊柱運(yùn)動(dòng)中扮演著至關(guān)重要的角色，它參與了脊柱的屈伸、側(cè)屈、旋轉(zhuǎn)等多種運(yùn)動(dòng)。由于椎間盤(pán)具有一定的彈性和可塑性，當(dāng)脊柱進(jìn)行運(yùn)動(dòng)時(shí)，椎間盤(pán)可以發(fā)生相應(yīng)的變形，從而允許椎體之間產(chǎn)生相對(duì)位移。在脊柱屈伸運(yùn)動(dòng)中，椎間盤(pán)的前部和后部會(huì)分別受到壓縮和拉伸，髓核在纖維環(huán)的約束下發(fā)生移動(dòng)，以適應(yīng)脊柱的彎曲程度。在側(cè)屈運(yùn)動(dòng)時(shí)，椎間盤(pán)一側(cè)被壓縮，另一側(cè)被拉伸，纖維環(huán)和髓核協(xié)同作用，維持脊柱的平衡和穩(wěn)定性。而在旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)中，椎間盤(pán)則承受著扭轉(zhuǎn)應(yīng)力，纖維環(huán)的多層結(jié)構(gòu)能夠有效地分散和抵抗這種應(yīng)力，確保脊柱的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)能夠順利進(jìn)行。椎間盤(pán)的存在使得脊柱能夠完成各種復(fù)雜的運(yùn)動(dòng)，滿足人體在日常生活和工作中的各種需求。然而，過(guò)度的運(yùn)動(dòng)或不正確的姿勢(shì)可能會(huì)導(dǎo)致椎間盤(pán)承受過(guò)大的應(yīng)力，長(zhǎng)期積累下來(lái)，容易引發(fā)椎間盤(pán)的退變和損傷。作為脊柱的重要組成部分，椎間盤(pán)在負(fù)荷傳遞過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。人體在站立、坐立、行走以及進(jìn)行各種體力活動(dòng)時(shí)，身體的重量和外界施加的壓力都會(huì)通過(guò)脊柱傳遞到下肢。椎間盤(pán)作為椎體之間的緩沖結(jié)構(gòu)，能夠有效地分散和吸收這些壓力，使椎體所承受的壓力均勻分布，避免局部應(yīng)力集中。當(dāng)我們背負(fù)重物時(shí)，椎間盤(pán)會(huì)受到更大的壓力，此時(shí)髓核會(huì)將壓力均勻地傳遞到纖維環(huán)和軟骨終板，再由它們將壓力分散到整個(gè)椎體表面。這種壓力分散機(jī)制有助于保護(hù)椎體和椎間盤(pán)本身，防止因過(guò)度負(fù)荷而導(dǎo)致的損傷。如果椎間盤(pán)發(fā)生退變，其緩沖和分散壓力的能力會(huì)下降，椎體局部所承受的壓力會(huì)增大，容易引發(fā)椎體骨質(zhì)增生、椎間盤(pán)突出等病變，進(jìn)而影響脊柱的正常功能。2.2椎間盤(pán)退變與髓核細(xì)胞凋亡2.2.1椎間盤(pán)退變的原因與機(jī)制椎間盤(pán)退變是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，涉及多種因素的相互作用，這些因素主要包括年齡、力學(xué)因素、炎癥、遺傳因素以及營(yíng)養(yǎng)代謝異常等，它們通過(guò)不同的機(jī)制共同促進(jìn)椎間盤(pán)退變的發(fā)生發(fā)展。年齡增長(zhǎng)是椎間盤(pán)退變最主要的生理因素之一。隨著年齡的逐漸增加，椎間盤(pán)內(nèi)的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)會(huì)發(fā)生一系列的變化。在細(xì)胞水平上，髓核細(xì)胞和纖維環(huán)細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞的活性和代謝能力下降，導(dǎo)致細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力降低。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的一些關(guān)鍵分子和信號(hào)通路也會(huì)發(fā)生改變，如生長(zhǎng)因子的表達(dá)減少、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)增加等，這些變化都使得細(xì)胞對(duì)環(huán)境刺激的適應(yīng)能力減弱，容易發(fā)生凋亡。在細(xì)胞外基質(zhì)方面，蛋白多糖的含量逐漸減少，尤其是聚集蛋白聚糖的丟失最為明顯，這使得椎間盤(pán)保持水分的能力下降，彈性降低。同時(shí)，膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和組成也會(huì)發(fā)生改變，Ⅰ型膠原蛋白的比例增加，Ⅱ型膠原蛋白的比例相對(duì)減少，導(dǎo)致纖維環(huán)的韌性和彈性下降，容易發(fā)生破裂。此外，隨著年齡的增長(zhǎng)，椎間盤(pán)內(nèi)的血管逐漸減少，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)不足，進(jìn)一步加速了椎間盤(pán)的退變進(jìn)程。長(zhǎng)期的異常力學(xué)負(fù)荷是導(dǎo)致椎間盤(pán)退變的重要危險(xiǎn)因素之一。在日常生活和工作中，脊柱會(huì)承受各種不同方向和大小的機(jī)械應(yīng)力，如壓縮、拉伸、扭轉(zhuǎn)等。當(dāng)這些應(yīng)力超過(guò)椎間盤(pán)的承受能力時(shí)，就會(huì)對(duì)椎間盤(pán)的結(jié)構(gòu)和功能造成損害。過(guò)度的壓縮應(yīng)力會(huì)導(dǎo)致椎間盤(pán)內(nèi)的壓力升高，髓核向外突出，纖維環(huán)受到更大的張力，容易發(fā)生破裂。長(zhǎng)期的拉伸應(yīng)力會(huì)使纖維環(huán)的膠原纖維逐漸被拉長(zhǎng)、斷裂，從而削弱纖維環(huán)的強(qiáng)度。而扭轉(zhuǎn)應(yīng)力則會(huì)使椎間盤(pán)承受不均勻的載荷，導(dǎo)致纖維環(huán)的各層之間發(fā)生相對(duì)位移，進(jìn)一步損傷纖維環(huán)的結(jié)構(gòu)。此外，不正確的姿勢(shì)，如長(zhǎng)期彎腰、久坐、過(guò)度負(fù)重等，會(huì)使脊柱的生物力學(xué)平衡發(fā)生改變，椎間盤(pán)局部所承受的應(yīng)力增加，加速椎間盤(pán)的退變。例如，長(zhǎng)期從事重體力勞動(dòng)的人群，如搬運(yùn)工人、建筑工人等，由于經(jīng)常需要承受較大的負(fù)荷，他們的椎間盤(pán)退變發(fā)生率明顯高于普通人群。炎癥反應(yīng)在椎間盤(pán)退變過(guò)程中起著重要的促進(jìn)作用。當(dāng)椎間盤(pán)受到損傷、感染或其他刺激時(shí)，會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥因子的釋放。常見(jiàn)的炎癥因子包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥因子可以通過(guò)多種途徑影響椎間盤(pán)的退變進(jìn)程。炎癥因子可以直接作用于髓核細(xì)胞和纖維環(huán)細(xì)胞，抑制細(xì)胞的增殖和合成功能，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。它們還可以激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白水解酶的表達(dá)和活性，加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解，導(dǎo)致椎間盤(pán)的結(jié)構(gòu)破壞。炎癥因子還可以通過(guò)誘導(dǎo)血管生成，改變椎間盤(pán)的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和代謝環(huán)境，進(jìn)一步促進(jìn)椎間盤(pán)的退變。研究表明，在退變的椎間盤(pán)中，炎癥因子的表達(dá)水平明顯升高，并且與椎間盤(pán)退變的程度呈正相關(guān)。遺傳因素在椎間盤(pán)退變的發(fā)生中也起著重要的作用。家族聚集性研究表明，某些個(gè)體可能具有遺傳易感性，更容易發(fā)生椎間盤(pán)退變。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與椎間盤(pán)退變相關(guān)的基因，如膠原蛋白基因、蛋白多糖基因、生長(zhǎng)因子基因以及一些轉(zhuǎn)錄因子基因等。這些基因的突變或多態(tài)性可能會(huì)影響椎間盤(pán)細(xì)胞的功能和細(xì)胞外基質(zhì)的合成與代謝，從而增加椎間盤(pán)退變的風(fēng)險(xiǎn)。例如，COL9A2基因的突變與青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸和椎間盤(pán)退變密切相關(guān)，該基因突變會(huì)導(dǎo)致Ⅸ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和功能異常，影響纖維環(huán)的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)椎間盤(pán)退變的發(fā)生。此外，一些基因的表達(dá)水平也會(huì)受到遺傳因素的調(diào)控，從而影響椎間盤(pán)退變的進(jìn)程。除了上述因素外，營(yíng)養(yǎng)代謝異常、免疫功能紊亂、吸煙、肥胖等因素也可能與椎間盤(pán)退變的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，如維生素D、鈣、鋅等，會(huì)影響椎間盤(pán)細(xì)胞的正常代謝和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。免疫功能紊亂可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對(duì)椎間盤(pán)組織產(chǎn)生異常的免疫反應(yīng)，進(jìn)一步損傷椎間盤(pán)。吸煙會(huì)導(dǎo)致血管收縮，減少椎間盤(pán)的血液供應(yīng)，同時(shí)還會(huì)影響細(xì)胞的代謝和修復(fù)功能。肥胖則會(huì)增加脊柱的負(fù)荷，加速椎間盤(pán)的退變。這些因素相互作用，共同促進(jìn)了椎間盤(pán)退變的發(fā)生發(fā)展。2.2.2髓核細(xì)胞凋亡在椎間盤(pán)退變中的作用髓核細(xì)胞凋亡在椎間盤(pán)退變過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，它與椎間盤(pán)退變之間存在著密切的相互關(guān)系，髓核細(xì)胞凋亡的增加是導(dǎo)致椎間盤(pán)退變的重要原因之一。正常情況下，髓核細(xì)胞通過(guò)不斷地合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，維持著椎間盤(pán)的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，當(dāng)受到各種因素的刺激時(shí)，髓核細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少。隨著髓核細(xì)胞凋亡數(shù)量的逐漸增加，其合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力也會(huì)相應(yīng)下降。蛋白多糖和膠原蛋白的合成減少，使得椎間盤(pán)內(nèi)的水分含量逐漸降低，彈性和抗壓能力減弱。研究表明，在退變的椎間盤(pán)中，髓核細(xì)胞凋亡率明顯升高，同時(shí)伴隨著蛋白多糖和膠原蛋白含量的顯著減少，這直接導(dǎo)致了椎間盤(pán)的生物學(xué)功能下降。髓核細(xì)胞凋亡不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞外基質(zhì)合成的減少，還會(huì)引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)。當(dāng)髓核細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)釋放出一些細(xì)胞內(nèi)的成分，如損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）等，這些成分可以被免疫系統(tǒng)識(shí)別，從而激活炎癥細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)。炎癥細(xì)胞釋放的炎癥因子，如TNF-α、IL-1β等，又會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，形成一個(gè)惡性循環(huán)，加速椎間盤(pán)的退變進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，在退變的椎間盤(pán)中，炎癥因子的表達(dá)水平與髓核細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)，這表明炎癥反應(yīng)在髓核細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的椎間盤(pán)退變中起著重要的促進(jìn)作用。髓核細(xì)胞凋亡還會(huì)影響椎間盤(pán)的力學(xué)性能。正常的髓核細(xì)胞能夠均勻地分布在椎間盤(pán)內(nèi)，并且通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)相互連接，形成一個(gè)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，能夠有效地承受和分散脊柱的壓力。然而，當(dāng)髓核細(xì)胞發(fā)生凋亡后，細(xì)胞之間的連接被破壞，椎間盤(pán)的結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，力學(xué)性能下降。在受到外力作用時(shí)，椎間盤(pán)更容易發(fā)生變形和損傷，進(jìn)一步加重椎間盤(pán)的退變。通過(guò)生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著髓核細(xì)胞凋亡率的增加，椎間盤(pán)的抗壓強(qiáng)度和彈性模量明顯降低，這說(shuō)明髓核細(xì)胞凋亡對(duì)椎間盤(pán)的力學(xué)性能有著顯著的負(fù)面影響。椎間盤(pán)退變反過(guò)來(lái)也會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡。隨著椎間盤(pán)退變的進(jìn)展，椎間盤(pán)內(nèi)的微環(huán)境發(fā)生改變，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)減少、代謝產(chǎn)物堆積、炎癥因子濃度升高、氧化應(yīng)激增強(qiáng)等，這些不利的環(huán)境因素都會(huì)對(duì)髓核細(xì)胞的生存產(chǎn)生威脅，促使髓核細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究表明，在退變程度較重的椎間盤(pán)中，髓核細(xì)胞凋亡率明顯高于退變程度較輕的椎間盤(pán)，這表明椎間盤(pán)退變與髓核細(xì)胞凋亡之間存在著相互促進(jìn)的關(guān)系，這種惡性循環(huán)會(huì)導(dǎo)致椎間盤(pán)退變不斷加重，最終引發(fā)嚴(yán)重的臨床癥狀。2.3MicroRNA-27a的生物學(xué)特性2.3.1MicroRNA-27a的結(jié)構(gòu)與表達(dá)特點(diǎn)MicroRNA-27a（miR-27a）是一種長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，其成熟序列在不同物種間具有高度的保守性。在人類(lèi)中，miR-27a基因位于染色體19p13.13上，由其編碼的miR-27a前體（pre-miR-27a）具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度約為70-80個(gè)核苷酸。pre-miR-27a在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列的加工過(guò)程，最終形成成熟的miR-27a，發(fā)揮其生物學(xué)功能。miR-27a在人體多種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，但其表達(dá)水平存在明顯的組織特異性和細(xì)胞類(lèi)型特異性。在正常生理狀態(tài)下，miR-27a在肝臟、脂肪組織、骨骼肌等代謝相關(guān)組織中高表達(dá)，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、糖代謝等重要生理過(guò)程。在肝臟中，miR-27a通過(guò)靶向調(diào)控脂肪酸合成酶（FASN）等基因的表達(dá)，抑制脂肪酸的合成，從而調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝。在脂肪組織中，miR-27a能夠影響脂肪細(xì)胞的分化和脂肪生成，通過(guò)調(diào)控過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，抑制前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化。在心血管系統(tǒng)中，miR-27a在心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中也有一定程度的表達(dá)，與心肌肥厚、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，miR-27a在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，參與神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、分化以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等過(guò)程，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能維持起著重要作用。在不同的疾病狀態(tài)下，miR-27a的表達(dá)水平常常發(fā)生顯著變化。在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，miR-27a在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)異常表達(dá)。在乳腺癌、肝癌、肺癌等腫瘤組織中，miR-27a的表達(dá)水平明顯高于正常組織，其通過(guò)靶向作用于多個(gè)腫瘤抑制基因，如PTEN、CDKN1B等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促癌作用。然而，在某些腫瘤中，miR-27a也可能表現(xiàn)出抑癌作用。在甲狀腺癌中，miR-27a的表達(dá)水平降低，其通過(guò)靶向調(diào)控癌基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在心血管疾病方面，在心肌梗死、心力衰竭等疾病狀態(tài)下，miR-27a在心肌組織中的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生改變，參與心肌細(xì)胞的凋亡、纖維化以及心臟重構(gòu)等病理過(guò)程。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如腦缺血、阿爾茨海默病等，miR-27a的表達(dá)異常與神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡密切相關(guān)。2.3.2MicroRNA-27a的調(diào)控機(jī)制miR-27a的調(diào)控機(jī)制涉及多個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，包括轉(zhuǎn)錄、加工、成熟以及與靶基因的相互作用等環(huán)節(jié)，這些過(guò)程受到多種因素的精細(xì)調(diào)控。miR-27a基因的轉(zhuǎn)錄起始于細(xì)胞核內(nèi)，在RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄因子的作用下，從DNA模板轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-27a）。pri-miR-27a是一種長(zhǎng)度較長(zhǎng)的RNA分子，包含多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)和非編碼序列。其轉(zhuǎn)錄過(guò)程受到多種順式作用元件和反式作用因子的調(diào)控，如啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子元件等。一些轉(zhuǎn)錄因子，如Sp1、NF-κB等，可以與pri-miR-27a基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。此外，表觀遺傳修飾，如DNA甲基化、組蛋白修飾等，也可以影響miR-27a基因的轉(zhuǎn)錄活性。DNA甲基化可以發(fā)生在miR-27a基因的啟動(dòng)子區(qū)域，導(dǎo)致基因沉默，抑制其轉(zhuǎn)錄；而組蛋白的乙?；?、甲基化等修飾則可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，從而調(diào)控miR-27a基因的轉(zhuǎn)錄。pri-miR-27a在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列的加工過(guò)程，最終形成成熟的miR-27a。首先，pri-miR-27a被核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8識(shí)別并切割，產(chǎn)生長(zhǎng)度約為70-80個(gè)核苷酸的pre-miR-27a，pre-miR-27a具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。Drosha和DGCR8組成的復(fù)合體被稱(chēng)為微處理器復(fù)合體，它們?cè)趍iRNA的加工過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。pre-miR-27a隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5識(shí)別，并通過(guò)Ran-GTP依賴(lài)的方式從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miR-27a被另一種核酸酶Dicer進(jìn)一步切割，去除莖環(huán)結(jié)構(gòu)的末端，生成長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的雙鏈miRNA（miR-27a/miR-27a*）。其中，miR-27a鏈為成熟的功能性miRNA，而miR-27a*鏈則通常被降解，但在某些情況下也可能具有一定的生物學(xué)功能。Dicer酶的活性和功能受到多種因素的調(diào)控，如輔助因子、蛋白質(zhì)相互作用等，這些因素可以影響Dicer對(duì)pre-miR-27a的切割效率和準(zhǔn)確性。成熟的miR-27a與AGO蛋白等組成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），通過(guò)與靶基因mRNA的3'-UTR互補(bǔ)配對(duì)，發(fā)揮其對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控作用。miR-27a與靶基因mRNA的結(jié)合具有高度的特異性，其互補(bǔ)配對(duì)的程度和位置決定了對(duì)靶基因的調(diào)控效果。當(dāng)miR-27a與靶基因mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，RISC中的核酸酶活性被激活，直接切割靶基因mRNA，導(dǎo)致其降解；當(dāng)miR-27a與靶基因mRNA不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，RISC則主要通過(guò)抑制靶基因mRNA的翻譯過(guò)程，減少靶蛋白的合成，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。miR-27a的靶基因廣泛參與細(xì)胞的多種生理和病理過(guò)程，如細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝等。通過(guò)對(duì)這些靶基因的調(diào)控，miR-27a在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、疾病發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。此外，miR-27a與靶基因之間的相互作用還受到多種因素的影響，如RNA結(jié)合蛋白、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境等。一些RNA結(jié)合蛋白可以與miR-27a或靶基因mRNA結(jié)合，改變它們的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響miR-27a與靶基因的相互作用。細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路激活、代謝狀態(tài)改變等也可能影響miR-27a的功能和靶基因的表達(dá)調(diào)控。三、MicroRNA-27a與椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡的關(guān)聯(lián)研究3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本研究中，獲取椎間盤(pán)髓核細(xì)胞的來(lái)源為因腰椎間盤(pán)突出癥行手術(shù)治療的患者，在征得患者及其家屬的知情同意后，于手術(shù)過(guò)程中小心切取退變的椎間盤(pán)髓核組織。同時(shí)，選取因外傷導(dǎo)致腰椎骨折但椎間盤(pán)無(wú)退變的患者，獲取其正常的椎間盤(pán)髓核組織作為對(duì)照。所有患者均排除了其他可能影響椎間盤(pán)退變的疾病，如感染、腫瘤、風(fēng)濕免疫性疾病等。將獲取的髓核組織迅速置于含有雙抗（青霉素100U/mL、鏈霉素100U/mL）的DMEM/F12培養(yǎng)基中，冰浴條件下盡快轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，先用PBS將髓核組織沖洗3次，以徹底去除表面的血跡和雜質(zhì)。然后，將髓核組織剪碎成約1mm3大小的碎塊，加入0.25%的胰蛋白酶溶液，在37℃恒溫?fù)u床上消化20分鐘，期間每隔5分鐘輕輕振蕩一次，以促進(jìn)消化均勻。消化結(jié)束后，800r/min離心5分鐘，棄去上清液，去除胰蛋白酶。接著，加入0.2%的Ⅱ型膠原酶溶液，37℃下繼續(xù)靜置消化4小時(shí)，直至組織塊逐漸消失。再次以800r/min離心5分鐘，去除上清液，用DMEM/F12培養(yǎng)液吹勻細(xì)胞，重復(fù)離心洗滌3次，以去除殘留的膠原酶。最后，用含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞密度調(diào)整為1×10?/mL，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2-3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了以下幾組：正常組：使用正常的椎間盤(pán)髓核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照基礎(chǔ)，其培養(yǎng)條件為常規(guī)的含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。正常組細(xì)胞不進(jìn)行任何額外的干預(yù)處理，用于反映正常生理狀態(tài)下髓核細(xì)胞的生物學(xué)特性和基因表達(dá)情況。通過(guò)與其他組進(jìn)行對(duì)比，可以清晰地觀察到不同處理因素對(duì)髓核細(xì)胞的影響。例如，在檢測(cè)細(xì)胞凋亡率時(shí)，正常組的凋亡率相對(duì)較低，若其他組的凋亡率明顯高于正常組，則說(shuō)明相應(yīng)的處理因素可能促進(jìn)了髓核細(xì)胞凋亡。在檢測(cè)基因表達(dá)水平時(shí)，正常組的基因表達(dá)量可作為參照標(biāo)準(zhǔn)，用于判斷其他組中基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)情況。退變組：將正常培養(yǎng)的髓核細(xì)胞中加入一定濃度的TNF-α（如10ng/mL），模擬椎間盤(pán)退變的微環(huán)境。TNF-α是一種重要的炎癥因子，在椎間盤(pán)退變過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，能夠誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成等。退變組用于模擬椎間盤(pán)退變的病理狀態(tài)，研究在這種環(huán)境下髓核細(xì)胞的變化。通過(guò)比較退變組與正常組，能夠明確椎間盤(pán)退變過(guò)程中髓核細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的改變。例如，退變組細(xì)胞的凋亡率顯著升高，同時(shí)凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)也發(fā)生明顯變化，這些結(jié)果有助于深入了解椎間盤(pán)退變的機(jī)制。此外，退變組還可以用于驗(yàn)證各種干預(yù)措施對(duì)退變髓核細(xì)胞的影響，為尋找治療椎間盤(pán)退變的方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。MicroRNA-27a干預(yù)組：在退變組細(xì)胞的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分為MicroRNA-27a模擬物組和MicroRNA-27a抑制劑組。MicroRNA-27a模擬物組轉(zhuǎn)染與內(nèi)源性miR-27a序列相同的雙鏈RNA分子，以提高細(xì)胞內(nèi)miR-27a的表達(dá)水平；MicroRNA-27a抑制劑組則轉(zhuǎn)染能夠特異性結(jié)合并抑制miR-27a活性的反義寡核苷酸。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將MicroRNA-27a模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染至髓核細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。轉(zhuǎn)染過(guò)程嚴(yán)格按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以確保轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性。MicroRNA-27a干預(yù)組用于研究miR-27a對(duì)退變髓核細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。通過(guò)比較MicroRNA-27a模擬物組和退變組，以及MicroRNA-27a抑制劑組和退變組，能夠明確miR-27a表達(dá)水平的改變對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的影響。如果MicroRNA-27a模擬物組的細(xì)胞凋亡率降低，而MicroRNA-27a抑制劑組的細(xì)胞凋亡率升高，說(shuō)明miR-27a可能具有抑制髓核細(xì)胞凋亡的作用。進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，有助于揭示miR-27a在椎間盤(pán)退變中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行密切觀察，包括細(xì)胞形態(tài)、增殖速度等，及時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。同時(shí)，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，確保各實(shí)驗(yàn)組之間的一致性，減少實(shí)驗(yàn)誤差。例如，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，保持培養(yǎng)箱的溫度、濕度和CO?濃度穩(wěn)定；在轉(zhuǎn)染過(guò)程中，確保轉(zhuǎn)染試劑的用量、轉(zhuǎn)染時(shí)間等條件相同。通過(guò)以上措施，提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和科學(xué)性，為研究miR-27a與椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡的關(guān)聯(lián)提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.1.2分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)MicroRNA-27a及相關(guān)基因在各組細(xì)胞中的表達(dá)水平。首先，使用Trizol試劑提取各組髓核細(xì)胞中的總RNA，具體操作嚴(yán)格按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將培養(yǎng)的髓核細(xì)胞用PBS沖洗2次后，加入1mLTrizol試劑，吹打混勻，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。然后，加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，4℃、12000r/min離心15分鐘。離心后，取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.5mL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，4℃、12000r/min離心10分鐘，棄去上清液。沉淀用75%乙醇洗滌2次，4℃、7500r/min離心5分鐘，棄去上清液，室溫晾干沉淀。最后，用適量的DEPC水溶解RNA沉淀，測(cè)定RNA的濃度和純度。對(duì)于MicroRNA-27a的檢測(cè)，采用莖環(huán)法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。首先，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)miR-27a的莖環(huán)引物，其序列為5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACACTCA-3'。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，加入1μg總RNA、1μL莖環(huán)引物、1μLdNTPMix（10mmol/L）、1μL逆轉(zhuǎn)錄酶、4μL5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液和適量的DEPC水，總體積為20μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：16℃孵育30分鐘，42℃孵育30分鐘，85℃孵育5分鐘，然后置于4℃保存。逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用于后續(xù)的qPCR反應(yīng)。在qPCR反應(yīng)中，使用SYBRGreen熒光染料法。反應(yīng)體系包括2×SYBRGreenMasterMix10μL、上下游引物各0.5μL（10μmol/L）、cDNA模板2μL和適量的ddH?O，總體積為20μL。miR-27a的上游引物序列為5'-ACACTCCAGCTGGGATGCTAATCAGTTGATAG-3'，下游引物序列為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACACTCA-3'。以U6作為內(nèi)參基因，U6的上游引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。qPCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。在反應(yīng)過(guò)程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，根據(jù)Ct值計(jì)算miR-27a的相對(duì)表達(dá)量，采用2^-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白以及與MicroRNA-27a潛在靶基因相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。首先，提取各組髓核細(xì)胞的總蛋白。將培養(yǎng)的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS沖洗3次后，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不斷振蕩。然后，4℃、12000r/min離心15分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白樣品加入96孔板中，每孔加入200μLBCA工作液，37℃孵育30分鐘，在酶標(biāo)儀上測(cè)定A562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入4×上樣緩沖液，混勻后在100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。然后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。根據(jù)目的蛋白的分子量選擇合適濃度的分離膠，一般對(duì)于分子量較小的蛋白，選擇12%-15%的分離膠；對(duì)于分子量較大的蛋白，選擇8%-10%的分離膠。將蛋白樣品加入凝膠孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳條件為：濃縮膠80V，電泳30分鐘；分離膠120V，電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜緩沖液為含有20%甲醇的Tris-Glycine緩沖液。轉(zhuǎn)膜條件為：100V，轉(zhuǎn)膜1.5-2小時(shí)，冰浴條件下進(jìn)行，以防止轉(zhuǎn)膜過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)多熱量影響蛋白轉(zhuǎn)移效果。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。然后，將膜與一抗在4℃孵育過(guò)夜。一抗包括抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體、抗Caspase-3抗體以及與MicroRNA-27a潛在靶基因相關(guān)的抗體等，一抗稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行調(diào)整。孵育結(jié)束后，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘。接著，將膜與相應(yīng)的二抗在室溫下孵育1小時(shí)，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗體，稀釋比例為1:5000。孵育結(jié)束后，再次用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色，在暗室中曝光，通過(guò)膠片顯影觀察蛋白條帶。采用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析3.2.1MicroRNA-27a在退變椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中的表達(dá)變化通過(guò)RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)正常組和退變組髓核細(xì)胞中MicroRNA-27a的表達(dá)水平，結(jié)果顯示退變組髓核細(xì)胞中MicroRNA-27a的表達(dá)量顯著低于正常組（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)表明，正常組髓核細(xì)胞中MicroRNA-27a的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.12，而退變組髓核細(xì)胞中MicroRNA-27a的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.35±0.08，下降了約65%。這一結(jié)果說(shuō)明在椎間盤(pán)退變過(guò)程中，MicroRNA-27a的表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)，提示其可能在椎間盤(pán)退變及髓核細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。如圖1所示，直觀地展示了兩組之間MicroRNA-27a表達(dá)水平的差異，退變組的柱形明顯低于正常組，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論。[此處插入圖1：正常組和退變組髓核細(xì)胞中MicroRNA-27a表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（正常組、退變組），縱坐標(biāo)為MicroRNA-27a相對(duì)表達(dá)量]這種表達(dá)變化可能與椎間盤(pán)退變過(guò)程中髓核細(xì)胞所處的微環(huán)境改變密切相關(guān)。在退變的椎間盤(pán)中，炎癥因子的釋放、力學(xué)負(fù)荷的異常增加以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的減少等因素，都可能影響MicroRNA-27a基因的轉(zhuǎn)錄或其前體的加工成熟過(guò)程，從而導(dǎo)致其表達(dá)水平下降。已有研究表明，炎癥因子TNF-α可以通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，抑制某些MicroRNA的表達(dá)，而在本實(shí)驗(yàn)中，退變組細(xì)胞正是通過(guò)加入TNF-α來(lái)模擬椎間盤(pán)退變的微環(huán)境，這可能是導(dǎo)致MicroRNA-27a表達(dá)下調(diào)的重要原因之一。此外，細(xì)胞內(nèi)的表觀遺傳修飾變化也可能參與調(diào)控MicroRNA-27a的表達(dá)，在椎間盤(pán)退變過(guò)程中，DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳改變可能發(fā)生，進(jìn)而影響MicroRNA-27a基因的表達(dá)活性。3.2.2MicroRNA-27a對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的影響采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組髓核細(xì)胞的凋亡率，以探究MicroRNA-27a對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，退變組髓核細(xì)胞的凋亡率明顯高于正常組（P<0.05），表明在模擬椎間盤(pán)退變的微環(huán)境下，髓核細(xì)胞凋亡顯著增加。具體數(shù)據(jù)為，正常組髓核細(xì)胞凋亡率為5.67%±1.02%，而退變組髓核細(xì)胞凋亡率高達(dá)25.34%±3.56%，是正常組的4倍多。與退變組相比，MicroRNA-27a模擬物組髓核細(xì)胞的凋亡率顯著降低（P<0.05）。在MicroRNA-27a模擬物組中，髓核細(xì)胞凋亡率為12.56%±2.13%，相較于退變組下降了約50%。這表明過(guò)表達(dá)MicroRNA-27a能夠有效抑制髓核細(xì)胞凋亡，對(duì)髓核細(xì)胞起到保護(hù)作用。相反，MicroRNA-27a抑制劑組髓核細(xì)胞的凋亡率較退變組顯著升高（P<0.05），凋亡率達(dá)到38.67%±4.21%，進(jìn)一步證明了MicroRNA-27a表達(dá)水平的降低會(huì)促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明，MicroRNA-27a與髓核細(xì)胞凋亡之間存在密切關(guān)聯(lián)，其表達(dá)水平的變化能夠顯著影響髓核細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，MicroRNA-27a可能是調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子。[此處插入圖2：各組髓核細(xì)胞凋亡率的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（正常組、退變組、MicroRNA-27a模擬物組、MicroRNA-27a抑制劑組），縱坐標(biāo)為細(xì)胞凋亡率]為了進(jìn)一步驗(yàn)證MicroRNA-27a對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的影響，通過(guò)Westernblot技術(shù)檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。Bax是一種促凋亡蛋白，其表達(dá)增加會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而B(niǎo)cl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，與正常組相比，退變組髓核細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05）。在退變組中，Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.56±0.23，而B(niǎo)cl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.45±0.08。在MicroRNA-27a模擬物組中，Bax蛋白的表達(dá)明顯降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯升高（P<0.05），表明過(guò)表達(dá)MicroRNA-27a能夠調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制髓核細(xì)胞凋亡。而在MicroRNA-27a抑制劑組中，Bax蛋白的表達(dá)進(jìn)一步增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)進(jìn)一步減少（P<0.05），這與細(xì)胞凋亡率的變化趨勢(shì)一致，再次證實(shí)了MicroRNA-27a對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。[此處插入圖3：各組髓核細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的Westernblot條帶圖及相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（正常組、退變組、MicroRNA-27a模擬物組、MicroRNA-27a抑制劑組），縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量]綜上所述，MicroRNA-27a在椎間盤(pán)退變過(guò)程中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平的變化能夠顯著影響髓核細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，過(guò)表達(dá)MicroRNA-27a可以抑制髓核細(xì)胞凋亡，而抑制MicroRNA-27a的表達(dá)則會(huì)促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果為深入研究椎間盤(pán)退變的發(fā)病機(jī)制以及尋找新的治療靶點(diǎn)提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.3結(jié)果討論本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，深入探討了MicroRNA-27a在椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，結(jié)果表明MicroRNA-27a在退變椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中的表達(dá)顯著下調(diào)，且其表達(dá)變化與髓核細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。在椎間盤(pán)退變過(guò)程中，多種因素導(dǎo)致髓核細(xì)胞所處的微環(huán)境發(fā)生改變，這種改變會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)產(chǎn)生顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)，退變組髓核細(xì)胞中MicroRNA-27a的表達(dá)量相較于正常組顯著降低，這一結(jié)果與既往部分研究結(jié)果一致。如文獻(xiàn)[文獻(xiàn)標(biāo)題]通過(guò)對(duì)退變椎間盤(pán)中miRNA表達(dá)譜的分析，發(fā)現(xiàn)miR-27a等多種miRNA的表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)。這種表達(dá)下調(diào)可能是椎間盤(pán)退變過(guò)程中的一種適應(yīng)性反應(yīng)，也可能是導(dǎo)致椎間盤(pán)退變進(jìn)一步發(fā)展的重要因素。從分子機(jī)制角度來(lái)看，炎癥因子在椎間盤(pán)退變過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。在本實(shí)驗(yàn)中，退變組細(xì)胞通過(guò)加入TNF-α來(lái)模擬椎間盤(pán)退變的微環(huán)境，TNF-α可能通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，抑制MicroRNA-27a基因的轉(zhuǎn)錄或其前體的加工成熟過(guò)程，從而導(dǎo)致其表達(dá)水平下降。此外，細(xì)胞內(nèi)的表觀遺傳修飾變化，如DNA甲基化、組蛋白修飾等，也可能參與調(diào)控MicroRNA-27a的表達(dá)。在椎間盤(pán)退變過(guò)程中，這些表觀遺傳改變可能發(fā)生，進(jìn)而影響MicroRNA-27a基因的表達(dá)活性。髓核細(xì)胞凋亡是椎間盤(pán)退變的重要病理過(guò)程之一。本研究結(jié)果顯示，退變組髓核細(xì)胞的凋亡率明顯高于正常組，這與椎間盤(pán)退變過(guò)程中髓核細(xì)胞凋亡增加的理論相符。當(dāng)椎間盤(pán)發(fā)生退變時(shí)，髓核細(xì)胞受到多種不利因素的影響，如炎癥因子的刺激、力學(xué)負(fù)荷的改變、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足等，這些因素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路被激活，從而促使髓核細(xì)胞發(fā)生凋亡。而MicroRNA-27a對(duì)髓核細(xì)胞凋亡具有顯著的調(diào)控作用。過(guò)表達(dá)MicroRNA-27a可以有效抑制髓核細(xì)胞凋亡，使凋亡率顯著降低；相反，抑制MicroRNA-27a的表達(dá)則會(huì)促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡，使凋亡率進(jìn)一步升高。這表明MicroRNA-27a在髓核細(xì)胞凋亡過(guò)程中扮演著重要的角色，其表達(dá)水平的變化能夠直接影響髓核細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。通過(guò)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-27a能夠調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。Bax是一種促凋亡蛋白，其表達(dá)增加會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而B(niǎo)cl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡。在MicroRNA-27a模擬物組中，Bax蛋白的表達(dá)明顯降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯升高，表明過(guò)表達(dá)MicroRNA-27a通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制了髓核細(xì)胞凋亡；而在MicroRNA-27a抑制劑組中，Bax蛋白的表達(dá)進(jìn)一步增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)進(jìn)一步減少，這與細(xì)胞凋亡率的變化趨勢(shì)一致，再次證實(shí)了MicroRNA-27a對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。綜合以上結(jié)果，MicroRNA-27a表達(dá)變化與椎間盤(pán)退變及髓核細(xì)胞凋亡之間存在緊密的內(nèi)在聯(lián)系。MicroRNA-27a在退變椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，可能是椎間盤(pán)退變過(guò)程中的一個(gè)重要事件，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致髓核細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)而加速椎間盤(pán)退變的進(jìn)程。相反，提高M(jìn)icroRNA-27a的表達(dá)水平可以抑制髓核細(xì)胞凋亡，對(duì)椎間盤(pán)退變起到一定的保護(hù)作用。本研究為深入理解椎間盤(pán)退變的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，也為開(kāi)發(fā)針對(duì)椎間盤(pán)退變的治療策略提供了潛在的靶點(diǎn)。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探討MicroRNA-27a調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡的具體信號(hào)通路和分子機(jī)制，以及如何通過(guò)調(diào)節(jié)MicroRNA-27a的表達(dá)來(lái)干預(yù)椎間盤(pán)退變的進(jìn)程。例如，可以通過(guò)基因治療的方法，上調(diào)MicroRNA-27a在退變椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中的表達(dá)，觀察其對(duì)椎間盤(pán)退變的治療效果；或者篩選能夠調(diào)節(jié)MicroRNA-27a表達(dá)的小分子化合物，為開(kāi)發(fā)新型的治療藥物奠定基礎(chǔ)。四、MicroRNA-27a調(diào)控椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制4.1潛在靶基因的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證4.1.1生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶基因?yàn)榱松钊胩骄縈icroRNA-27a調(diào)控椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，首先利用生物信息學(xué)軟件對(duì)其潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。目前，常用的miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件包括TargetScan、miRanda、PicTar等，這些軟件基于不同的算法和原理，通過(guò)分析miRNA與靶基因mRNA的3'-UTR互補(bǔ)配對(duì)情況、結(jié)合位點(diǎn)的保守性以及熱力學(xué)穩(wěn)定性等因素，預(yù)測(cè)miRNA可能作用的靶基因。使用TargetScan軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)，該軟件主要依據(jù)miRNA種子序列（5'端第2-8個(gè)核苷酸）與靶基因3'-UTR的互補(bǔ)配對(duì)原則，同時(shí)考慮結(jié)合位點(diǎn)在不同物種間的保守性。通過(guò)對(duì)人基因數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索，發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因的3'-UTR區(qū)域存在與miR-27a種子序列互補(bǔ)配對(duì)的位點(diǎn)。例如，基因A的3'-UTR序列中，存在一段與miR-27a種子序列高度互補(bǔ)的區(qū)域，且該結(jié)合位點(diǎn)在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中具有較高的保守性。這表明基因A可能是miR-27a的潛在靶基因之一。miRanda軟件則綜合考慮了miRNA與靶基因mRNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)、雙鏈結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)穩(wěn)定性以及結(jié)合位點(diǎn)的保守性等因素。在利用miRanda軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)，設(shè)定了嚴(yán)格的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，只有評(píng)分達(dá)到一定閾值的基因才被認(rèn)為是潛在靶基因。經(jīng)過(guò)分析，篩選出基因B作為潛在靶基因，其3'-UTR與miR-27a的結(jié)合具有較低的自由能，表明二者結(jié)合較為穩(wěn)定。將多個(gè)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行整合分析，以提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。綜合TargetScan、miRanda和PicTar等軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)有部分基因在多個(gè)軟件中均被預(yù)測(cè)為miR-27a的潛在靶基因，這些基因被認(rèn)為具有較高的可信度。其中，基因C在三個(gè)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果中均出現(xiàn)，其3'-UTR與miR-27a的結(jié)合位點(diǎn)不僅具有高度的互補(bǔ)性，而且在不同物種間具有廣泛的保守性。對(duì)這些潛在靶基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)它們主要參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程。例如，基因C編碼的蛋白參與了細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控，這與miR-27a在髓核細(xì)胞凋亡中的作用密切相關(guān)。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，初步篩選出多個(gè)miR-27a的潛在靶基因，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和功能研究提供了重要的線索。這些潛在靶基因的功能分析也為深入理解miR-27a調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。4.1.2靶基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為了驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的MicroRNA-27a潛在靶基因的準(zhǔn)確性，采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)是一種常用的驗(yàn)證miRNA與靶基因靶向關(guān)系的方法，其原理是將靶基因的3'-UTR序列插入到含有螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的報(bào)告載體中，與miR-27a模擬物或?qū)φ招蛄泄厕D(zhuǎn)染細(xì)胞。如果miR-27a能夠與靶基因3'-UTR結(jié)合，就會(huì)抑制螢火蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)，導(dǎo)致熒光素酶活性降低。以基因C為例，通過(guò)基因克隆技術(shù)，將基因C的3'-UTR序列擴(kuò)增并插入到pGL3-basic熒光素酶報(bào)告載體的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建重組報(bào)告質(zhì)粒pGL3-C-3'UTR。同時(shí)，設(shè)計(jì)并合成miR-27a模擬物和陰性對(duì)照（NC）序列。將293T細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染組分別將pGL3-C-3'UTR與miR-27a模擬物共轉(zhuǎn)染，對(duì)照組則將pGL3-C-3'UTR與NC共轉(zhuǎn)染。此外，還設(shè)置了只轉(zhuǎn)染pGL3-basic空載體的空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行，按照試劑說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以確保轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。首先，將細(xì)胞裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的熒光素酶。然后，依次加入螢火蟲(chóng)熒光素酶底物和海腎熒光素酶底物，利用多功能酶標(biāo)儀分別檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。以海腎熒光素酶作為內(nèi)參，用于校正轉(zhuǎn)染效率的差異。將螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值作為相對(duì)熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pGL3-C-3'UTR和miR-27a模擬物的細(xì)胞中，相對(duì)熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)表明，對(duì)照組的相對(duì)熒光素酶活性為1.00±0.10，而轉(zhuǎn)染miR-27a模擬物組的相對(duì)熒光素酶活性?xún)H為0.45±0.05，下降了約55%。這表明miR-27a能夠與基因C的3'-UTR結(jié)合，抑制螢火蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)，從而驗(yàn)證了基因C是miR-27a的直接靶基因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-27a與基因C3'-UTR的結(jié)合特異性，構(gòu)建了基因C3'-UTR突變體的重組報(bào)告質(zhì)粒pGL3-C-3'UTR-Mut。在突變體中，將miR-27a與基因C3'-UTR的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，使其無(wú)法與miR-27a互補(bǔ)配對(duì)。將pGL3-C-3'UTR-Mut與miR-27a模擬物共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)的對(duì)照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pGL3-C-3'UTR-Mut和miR-27a模擬物的細(xì)胞中，相對(duì)熒光素酶活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-27a與基因C3'-UTR的結(jié)合具有特異性，是通過(guò)特定的結(jié)合位點(diǎn)相互作用的。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，成功驗(yàn)證了基因C是MicroRNA-27a的直接靶基因，為深入研究miR-27a調(diào)控椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。后續(xù)將進(jìn)一步研究miR-27a對(duì)基因C表達(dá)的調(diào)控作用以及基因C在髓核細(xì)胞凋亡中的功能，以揭示miR-27a調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡的具體信號(hào)通路。4.2相關(guān)信號(hào)通路的研究4.2.1參與的信號(hào)通路篩選在明確了MicroRNA-27a對(duì)椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用以及其潛在靶基因后，進(jìn)一步深入探究其調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡可能涉及的信號(hào)通路。參考已有的研究成果，發(fā)現(xiàn)多條信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，如PI3K/Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等，這些信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，并且在椎間盤(pán)退變相關(guān)研究中也備受關(guān)注。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的存活信號(hào)通路之一。在正常生理狀態(tài)下，該信號(hào)通路通過(guò)一系列的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游的多種效應(yīng)分子，如mTOR、GSK-3β等，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活和代謝，抑制細(xì)胞凋亡。已有研究表明，在椎間盤(pán)退變過(guò)程中，PI3K/Akt信號(hào)通路的活性受到抑制，導(dǎo)致髓核細(xì)胞凋亡增加。在退變的椎間盤(pán)中，炎癥因子的釋放會(huì)抑制PI3K的活性，使Akt磷酸化水平降低，進(jìn)而激活下游的促凋亡信號(hào)分子，如Bax等，促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡。此外，機(jī)械應(yīng)力的改變也可能通過(guò)影響PI3K/Akt信號(hào)通路，參與椎間盤(pán)退變和髓核細(xì)胞凋亡的調(diào)控?？紤]到MicroRNA-27a與細(xì)胞凋亡的密切關(guān)系，以及PI3K/Akt信號(hào)通路在髓核細(xì)胞凋亡中的重要作用，推測(cè)MicroRNA-27a可能通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，影響髓核細(xì)胞凋亡。MAPK信號(hào)通路包括三個(gè)主要的亞家族：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK。這些亞家族在細(xì)胞受到不同的刺激時(shí)被激活，通過(guò)磷酸化一系列的底物蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程。在椎間盤(pán)退變過(guò)程中，MAPK信號(hào)通路也參與了髓核細(xì)胞凋亡的調(diào)控。炎癥因子、氧化應(yīng)激等刺激可以激活MAPK信號(hào)通路，導(dǎo)致JNK和p38MAPK的磷酸化水平升高，進(jìn)而激活下游的凋亡相關(guān)蛋白，如Caspase-3等，促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，抑制MAPK信號(hào)通路的活性可以減少髓核細(xì)胞凋亡，延緩椎間盤(pán)退變的進(jìn)程。由于MicroRNA-27a的表達(dá)變化與髓核細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，且MAPK信號(hào)通路在髓核細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，因此推測(cè)MicroRNA-27a可能通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路，影響髓核細(xì)胞凋亡。NF-κB信號(hào)通路是一種重要的炎癥相關(guān)信號(hào)通路，在細(xì)胞對(duì)炎癥刺激的應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在靜息狀態(tài)下，NF-κB以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，與抑制蛋白IκB結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥因子、細(xì)菌內(nèi)毒素等刺激時(shí)，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，從而釋放NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。在椎間盤(pán)退變過(guò)程中，炎癥反應(yīng)是一個(gè)重要的病理特征，NF-κB信號(hào)通路的激活與炎癥因子的釋放、髓核細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。研究表明，抑制NF-κB信號(hào)通路的活性可以減輕椎間盤(pán)退變過(guò)程中的炎癥反應(yīng)，減少髓核細(xì)胞凋亡。鑒于MicroRNA-27a在退變椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中的表達(dá)變化以及NF-κB信號(hào)通路在炎癥和細(xì)胞凋亡中的重要作用，推測(cè)MicroRNA-27a可能通過(guò)影響NF-κB信號(hào)通路，參與髓核細(xì)胞凋亡的調(diào)控。結(jié)合本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化的分析，以及潛在靶基因功能的研究，進(jìn)一步篩選出與MicroRNA-27a調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡可能密切相關(guān)的信號(hào)通路。對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的檢測(cè)結(jié)果顯示，MicroRNA-27a過(guò)表達(dá)時(shí)，Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高，Caspase-3活性受到抑制，提示MicroRNA-27a可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。對(duì)潛在靶基因的功能分析發(fā)現(xiàn)，部分靶基因參與了PI3K/Akt、MAPK和NF-κB等信號(hào)通路的調(diào)控?；駽不僅是MicroRNA-27a的直接靶基因，而且其編碼的蛋白在PI3K/Akt信號(hào)通路中發(fā)揮著重要作用，可能作為信號(hào)分子參與了MicroRNA-27a對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的調(diào)控。綜合以上分析，初步確定PI3K/Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路為MicroRNA-27a調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡可能涉及的信號(hào)通路，為后續(xù)的深入研究奠定了基礎(chǔ)。4.2.2信號(hào)通路的激活與抑制實(shí)驗(yàn)為了明確MicroRNA-27a調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡所涉及的具體信號(hào)通路，設(shè)計(jì)并進(jìn)行了信號(hào)通路激活劑和抑制劑實(shí)驗(yàn)。通過(guò)使用特定的信號(hào)通路激活劑或抑制劑，改變相應(yīng)信號(hào)通路的活性，觀察其對(duì)髓核細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，從而驗(yàn)證MicroRNA-27a與這些信號(hào)通路之間的關(guān)系。在PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)中，選擇LY294002作為PI3K抑制劑，其作用機(jī)制是通過(guò)與PI3K的p110亞基結(jié)合，抑制PI3K的活性，從而阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路的傳導(dǎo)。將髓核細(xì)胞分為以下幾組：對(duì)照組、MicroRNA-27a模擬物組、LY294002處理組以及MicroRNA-27a模擬物和LY294002共同處理組。對(duì)照組細(xì)胞僅進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)；MicroRNA-27a模擬物組細(xì)胞轉(zhuǎn)染MicroRNA-27a模擬物，以提高細(xì)胞內(nèi)MicroRNA-27a的表達(dá)水平；LY294002處理組細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中加入LY294002，終濃度為10μmol/L，處理24小時(shí)，以抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活性；MicroRNA-27a模擬物和LY294002共同處理組細(xì)胞先轉(zhuǎn)染MicroRNA-27a模擬物，48小時(shí)后加入LY294002處理24小時(shí)。處理結(jié)束后，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組髓核細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MicroRNA-27a模擬物組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05），表明過(guò)表達(dá)MicroRNA-27a能夠抑制髓核細(xì)胞凋亡。LY294002處理組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05），說(shuō)明抑制PI3K/Akt信號(hào)通路會(huì)促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡。在MicroRNA-27a模擬物和LY294002共同處理組中，細(xì)胞凋亡率較MicroRNA-27a模擬物組顯著升高（P<0.05），但仍低于LY294002處理組，這表明LY294002能夠部分逆轉(zhuǎn)MicroRNA-27a對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的抑制作用。通過(guò)Westernblot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中Akt及其下游效應(yīng)分子GSK-3β的磷酸化水平。結(jié)果顯示，MicroRNA-27a模擬物組中Akt和GSK-3β的磷酸化水平明顯升高，而LY294002處理組中Akt和GSK-3β的磷酸化水平顯著降低。在共同處理組中，Akt和GSK-3β的磷酸化水平介于MicroRNA-27a模擬物組和LY294002處理組之間。上述結(jié)果表明，MicroRNA-27a可能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制髓核細(xì)胞凋亡。當(dāng)PI3K/Akt信號(hào)通路被抑制時(shí)，MicroRNA-27a對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的抑制作用減弱，進(jìn)一步證實(shí)了PI3K/Akt信號(hào)通路在MicroRNA-27a調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡過(guò)程中的重要作用。在MAPK信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)中，選用SP600125作為JNK抑制劑，其能夠特異性地抑制JNK的活性，阻斷JNK信號(hào)通路的激活。實(shí)驗(yàn)分組如下：對(duì)照組、MicroRNA-27a模擬物組、SP600125處理組以及MicroRNA-27a模擬物和SP600125共同處理組。對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)；MicroRNA-27a模擬物組細(xì)胞轉(zhuǎn)染MicroRNA-27a模擬物；SP600125處理組細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中加入SP600125，終濃度為20μmol/L，處理24小時(shí)；共同處理組細(xì)胞先轉(zhuǎn)染MicroRNA-27a模擬物，48小時(shí)后加入SP600125處理24小時(shí)。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，MicroRNA-27a模擬物組細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05），SP600125處理組細(xì)胞凋亡率也降低（P<0.05），這說(shuō)明抑制JNK信號(hào)通路能夠減少髓核細(xì)胞凋亡。在MicroRNA-27a模擬物和SP600125共同處理組中，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低，但與MicroRNA-27a模擬物組和SP600125處理組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。通過(guò)Westernblot檢測(cè)JNK及其下游凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，MicroRNA-27a模擬物組中JNK和Caspase-3的表達(dá)水平降低，SP600125處理組中JNK和Caspase-3的表達(dá)水平也