miR-20b對Th17細(xì)胞分化及實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎調(diào)控機(jī)制的深度解析一、引言1.1研究背景與意義自身免疫性疾病是機(jī)體免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤攻擊自身組織和器官，導(dǎo)致炎癥和組織損傷的一類疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和健康，給社會帶來沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。多發(fā)性硬化癥（MultipleSclerosis，MS）是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，主要病理特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘病變和炎癥細(xì)胞浸潤，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)肢體無力、視力障礙、感覺異常等癥狀，嚴(yán)重者可致殘。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（ExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis，EAE）是一種廣泛應(yīng)用于研究MS發(fā)病機(jī)制和治療方法的動物模型，其發(fā)病過程和病理特征與MS高度相似。Th17細(xì)胞作為一種重要的輔助性T細(xì)胞亞群，在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Th17細(xì)胞能夠分泌白細(xì)胞介素17（IL-17）、IL-21、IL-22等多種促炎細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可以招募和激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷。在EAE模型中，Th17細(xì)胞的異?；罨驮鲋撑c疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，Th17細(xì)胞可以通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相互作用，釋放促炎細(xì)胞因子，破壞血腦屏障的完整性，引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥和脫髓鞘病變。因此，深入研究Th17細(xì)胞的分化機(jī)制以及其在自身免疫性疾病中的作用，對于開發(fā)新的治療策略具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。越來越多的研究表明，miRNA在免疫細(xì)胞的分化、發(fā)育和功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。miR-20b作為miRNA家族的一員，近年來在腫瘤、心血管疾病等領(lǐng)域的研究中受到廣泛關(guān)注。有研究顯示，miR-20b在MS臨床病人的外周血細(xì)胞中低表達(dá)，但其在Th17細(xì)胞分化及EAE中的調(diào)控作用尚未見報(bào)道。因此，探討miR-20b對Th17細(xì)胞分化及EAE的調(diào)控機(jī)制，不僅有助于深入了解自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制，還可能為MS等自身免疫性疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1Th17細(xì)胞分化的研究進(jìn)展Th17細(xì)胞是2005年被發(fā)現(xiàn)的一種新型輔助性T細(xì)胞亞群，其分化過程受到多種細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。初始CD4?T細(xì)胞在TGF-β和IL-6的共同作用下，可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)，從而促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。IL-23雖然不直接參與Th17細(xì)胞的初始分化，但可以維持Th17細(xì)胞的穩(wěn)定性，并促進(jìn)其產(chǎn)生IL-17等細(xì)胞因子。此外，IL-1β、IL-21等細(xì)胞因子也在Th17細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在國內(nèi)，中山大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，維生素D通過抑制STAT3的磷酸化，減少RORγt的表達(dá)，從而抑制Th17細(xì)胞的分化，為Th17細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制提供了新的見解。國外研究中，美國北卡羅來納大學(xué)教堂山分校的研究人員揭示了T細(xì)胞內(nèi)源性的Activin-A信號特異調(diào)控致病性Th17細(xì)胞的分化和功能，拓展了對Th17細(xì)胞兩面性的認(rèn)識。1.2.2EAE發(fā)病機(jī)制的研究現(xiàn)狀EAE作為研究MS的經(jīng)典動物模型，其發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)環(huán)節(jié)。免疫系統(tǒng)的異常激活是EAE發(fā)病的關(guān)鍵因素，其中Th17細(xì)胞在EAE的發(fā)病過程中扮演著重要角色。Th17細(xì)胞分泌的IL-17等細(xì)胞因子可以招募和激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，這些細(xì)胞浸潤到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血腦屏障破壞和神經(jīng)髓鞘的損傷。此外，Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ等細(xì)胞因子也參與了EAE的發(fā)病過程，與Th17細(xì)胞協(xié)同作用，加重炎癥損傷。國內(nèi)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院張婷教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合上海市免疫學(xué)研究所吳學(xué)鋒團(tuán)隊(duì)的研究表明，絲氨酸/蘇氨酸激酶40（STK40）通過促進(jìn)E3泛素連接酶COP1與FOXO4結(jié)合，導(dǎo)致FOXO4蛋白的K48鏈接泛素化和降解，從而調(diào)控Th1和Th17細(xì)胞的分化，介導(dǎo)炎癥和EAE的進(jìn)展。國外研究發(fā)現(xiàn)，在EAE模型中，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化可以釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)一步促進(jìn)免疫細(xì)胞的浸潤和炎癥反應(yīng)。1.2.3miR-20b在免疫領(lǐng)域的研究進(jìn)展miR-20b在免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)中具有潛在的作用。有研究報(bào)道，miR-20b在T細(xì)胞的增殖和激活過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，過表達(dá)miR-20b可以抑制T細(xì)胞的增殖和激活。在自身免疫性疾病方面，已有研究表明miR-20b在某些自身免疫性疾病患者的外周血細(xì)胞中表達(dá)異常。例如，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中，miR-20b的表達(dá)水平與疾病的活動度相關(guān)。然而，miR-20b在Th17細(xì)胞分化及EAE中的調(diào)控作用尚未見系統(tǒng)報(bào)道。暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院尹海燕教授和陳填烽教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，硒納米顆粒（SeNPs@CS）能夠通過miR-20b介導(dǎo)的硒蛋白生物合成來修復(fù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的功能，同時(shí)miR-20b上調(diào)抑制了RORγt/STAT3/Th17免疫通路，減少了促炎Th17細(xì)胞在CD4?T淋巴細(xì)胞中的分化，但對于miR-20b在EAE發(fā)病過程中對Th17細(xì)胞分化的直接調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。盡管目前在Th17細(xì)胞分化、EAE發(fā)病機(jī)制以及miR-20b在免疫領(lǐng)域的研究取得了一定進(jìn)展，但miR-20b對Th17細(xì)胞分化及EAE的調(diào)控機(jī)制仍存在許多未知之處，深入研究這一調(diào)控機(jī)制，將為自身免疫性疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。1.3研究目的與內(nèi)容1.3.1研究目的本研究旨在深入探討miR-20b對Th17細(xì)胞分化及實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的調(diào)控機(jī)制，明確miR-20b在Th17細(xì)胞分化及EAE發(fā)病過程中的作用，為多發(fā)性硬化癥（MS）等自身免疫性疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。1.3.2研究內(nèi)容（1）檢測miR-20b在EAE小鼠模型及Th17細(xì)胞中的表達(dá)情況利用EAE小鼠模型，通過實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）等技術(shù)檢測miR-20b在EAE小鼠不同發(fā)病階段的外周血、脾臟、淋巴結(jié)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的CD4?T細(xì)胞中的表達(dá)水平，分析其表達(dá)變化與EAE發(fā)病進(jìn)程的相關(guān)性。同時(shí)，在體外誘導(dǎo)初始CD4?T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，檢測分化過程中miR-20b的表達(dá)變化，明確miR-20b在Th17細(xì)胞中的表達(dá)特征。利用EAE小鼠模型，通過實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）等技術(shù)檢測miR-20b在EAE小鼠不同發(fā)病階段的外周血、脾臟、淋巴結(jié)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的CD4?T細(xì)胞中的表達(dá)水平，分析其表達(dá)變化與EAE發(fā)病進(jìn)程的相關(guān)性。同時(shí)，在體外誘導(dǎo)初始CD4?T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，檢測分化過程中miR-20b的表達(dá)變化，明確miR-20b在Th17細(xì)胞中的表達(dá)特征。（2）研究miR-20b對Th17細(xì)胞分化的影響構(gòu)建miR-20b過表達(dá)和低表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至初始CD4?T細(xì)胞中，在Th17細(xì)胞極化條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)。通過檢測Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)水平、Th17細(xì)胞標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22等的分泌量，以及Th17細(xì)胞的比例，探討miR-20b對Th17細(xì)胞分化的影響。運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染、基因編輯等技術(shù)，驗(yàn)證miR-20b對Th17細(xì)胞分化影響的特異性和穩(wěn)定性。構(gòu)建miR-20b過表達(dá)和低表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至初始CD4?T細(xì)胞中，在Th17細(xì)胞極化條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)。通過檢測Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)水平、Th17細(xì)胞標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22等的分泌量，以及Th17細(xì)胞的比例，探討miR-20b對Th17細(xì)胞分化的影響。運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染、基因編輯等技術(shù)，驗(yàn)證miR-20b對Th17細(xì)胞分化影響的特異性和穩(wěn)定性。（3）篩選和驗(yàn)證miR-20b調(diào)控Th17細(xì)胞分化的靶基因利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-20b可能的靶基因，結(jié)合Th17細(xì)胞分化相關(guān)的信號通路和分子，篩選出與Th17細(xì)胞分化密切相關(guān)的候選靶基因。通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Westernblot）、實(shí)時(shí)定量PCR等方法，驗(yàn)證miR-20b與候選靶基因之間的靶向關(guān)系。進(jìn)一步通過基因過表達(dá)和基因敲低實(shí)驗(yàn)，研究靶基因?qū)h17細(xì)胞分化的影響，以及miR-20b是否通過調(diào)控靶基因來影響Th17細(xì)胞的分化。利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-20b可能的靶基因，結(jié)合Th17細(xì)胞分化相關(guān)的信號通路和分子，篩選出與Th17細(xì)胞分化密切相關(guān)的候選靶基因。通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Westernblot）、實(shí)時(shí)定量PCR等方法，驗(yàn)證miR-20b與候選靶基因之間的靶向關(guān)系。進(jìn)一步通過基因過表達(dá)和基因敲低實(shí)驗(yàn)，研究靶基因?qū)h17細(xì)胞分化的影響，以及miR-20b是否通過調(diào)控靶基因來影響Th17細(xì)胞的分化。（4）探討miR-20b對EAE發(fā)病進(jìn)程的影響構(gòu)建攜帶miR-20b的慢病毒載體，通過尾靜脈注射等方式將其導(dǎo)入EAE小鼠體內(nèi)，使miR-20b在小鼠體內(nèi)過表達(dá)。觀察EAE小鼠的發(fā)病時(shí)間、臨床癥狀評分、體重變化等，評估m(xù)iR-20b過表達(dá)對EAE發(fā)病進(jìn)程的影響。對小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行組織病理學(xué)分析，檢測炎癥細(xì)胞浸潤、脫髓鞘程度等指標(biāo)，進(jìn)一步明確miR-20b對EAE病理改變的作用。同時(shí)，構(gòu)建miR-20b敲低的EAE小鼠模型，觀察其發(fā)病情況，驗(yàn)證miR-20b對EAE發(fā)病進(jìn)程的影響。構(gòu)建攜帶miR-20b的慢病毒載體，通過尾靜脈注射等方式將其導(dǎo)入EAE小鼠體內(nèi)，使miR-20b在小鼠體內(nèi)過表達(dá)。觀察EAE小鼠的發(fā)病時(shí)間、臨床癥狀評分、體重變化等，評估m(xù)iR-20b過表達(dá)對EAE發(fā)病進(jìn)程的影響。對小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行組織病理學(xué)分析，檢測炎癥細(xì)胞浸潤、脫髓鞘程度等指標(biāo)，進(jìn)一步明確miR-20b對EAE病理改變的作用。同時(shí)，構(gòu)建miR-20b敲低的EAE小鼠模型，觀察其發(fā)病情況，驗(yàn)證miR-20b對EAE發(fā)病進(jìn)程的影響。（5）研究miR-20b影響EAE發(fā)病進(jìn)程的機(jī)制檢測miR-20b過表達(dá)或敲低的EAE小鼠體內(nèi)Th17細(xì)胞的數(shù)量、比例以及功能狀態(tài)，分析miR-20b是否通過調(diào)控Th17細(xì)胞來影響EAE的發(fā)病進(jìn)程。研究miR-20b對EAE小鼠體內(nèi)其他免疫細(xì)胞，如Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等的影響，探討miR-20b是否通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞之間的平衡來影響EAE的發(fā)病。檢測EAE小鼠體內(nèi)與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞因子和信號通路的變化，揭示miR-20b影響EAE發(fā)病進(jìn)程的分子機(jī)制。檢測miR-20b過表達(dá)或敲低的EAE小鼠體內(nèi)Th17細(xì)胞的數(shù)量、比例以及功能狀態(tài)，分析miR-20b是否通過調(diào)控Th17細(xì)胞來影響EAE的發(fā)病進(jìn)程。研究miR-20b對EAE小鼠體內(nèi)其他免疫細(xì)胞，如Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等的影響，探討miR-20b是否通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞之間的平衡來影響EAE的發(fā)病。檢測EAE小鼠體內(nèi)與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞因子和信號通路的變化，揭示miR-20b影響EAE發(fā)病進(jìn)程的分子機(jī)制。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1Th17細(xì)胞的分化2.1.1T淋巴細(xì)胞及其分化概述T淋巴細(xì)胞，又稱T細(xì)胞，來源于骨髓的多能干細(xì)胞，在胸腺中發(fā)育成熟。作為淋巴細(xì)胞的主要組分，T細(xì)胞在人體特異性免疫過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，其細(xì)胞膜上存在多種表面抗原和受體，這些標(biāo)志性分子賦予了T細(xì)胞獨(dú)特的免疫識別和應(yīng)答能力。依據(jù)功能和表面標(biāo)志的差異，T淋巴細(xì)胞可分為多個(gè)亞群，如細(xì)胞毒T細(xì)胞（CTL）、輔助性T細(xì)胞（Th）、調(diào)節(jié)/抑制性T細(xì)胞（Treg）和記憶T細(xì)胞等。細(xì)胞毒T細(xì)胞能夠直接殺傷被病原體感染的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等靶細(xì)胞，如同免疫系統(tǒng)中的“殺手”，通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，破壞靶細(xì)胞膜，誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡；輔助性T細(xì)胞則在免疫反應(yīng)中扮演著“指揮官”的角色，通過分泌細(xì)胞因子，輔助和調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，如促進(jìn)B細(xì)胞的活化、增殖和分化，使其產(chǎn)生抗體，介導(dǎo)體液免疫，同時(shí)也能增強(qiáng)細(xì)胞毒T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等的活性，參與細(xì)胞免疫；調(diào)節(jié)/抑制性T細(xì)胞主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，維持自身免疫耐受，避免免疫反應(yīng)過度損傷機(jī)體，在自身免疫性疾病、感染性疾病和腫瘤等的發(fā)生發(fā)展過程中，Treg細(xì)胞的平衡調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要；記憶T細(xì)胞則在再次免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，當(dāng)機(jī)體再次接觸相同抗原時(shí)，記憶T細(xì)胞能夠迅速活化、增殖，產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，為機(jī)體提供持久的免疫保護(hù)。初始T細(xì)胞在受到抗原刺激后，會發(fā)生一系列的分化過程，逐漸發(fā)育為具有不同功能的效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。這一過程受到多種因素的嚴(yán)格調(diào)控，包括抗原的性質(zhì)、濃度、持續(xù)時(shí)間，以及細(xì)胞因子、共刺激分子等的作用。其中，細(xì)胞因子在T細(xì)胞分化過程中起著核心調(diào)控作用，不同的細(xì)胞因子組合能夠誘導(dǎo)初始T細(xì)胞向不同的亞群分化。例如，IL-12和IFN-γ等細(xì)胞因子可誘導(dǎo)初始T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫，介導(dǎo)對細(xì)胞內(nèi)病原體的免疫應(yīng)答；IL-4等細(xì)胞因子則促使初始T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等細(xì)胞因子，在體液免疫中發(fā)揮重要作用，尤其是針對寄生蟲感染和過敏反應(yīng)。此外，共刺激分子如CD28與抗原提呈細(xì)胞表面的B7分子結(jié)合，能夠提供T細(xì)胞活化所需的第二信號，協(xié)同抗原刺激，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化。若缺乏共刺激信號，T細(xì)胞可能會進(jìn)入無反應(yīng)狀態(tài)或發(fā)生凋亡。T細(xì)胞的分化是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過程，受到多種因素的協(xié)同調(diào)控，確保免疫系統(tǒng)能夠針對不同的病原體和抗原產(chǎn)生精準(zhǔn)、有效的免疫應(yīng)答。2.1.2Th17細(xì)胞的分化及調(diào)控機(jī)制Th17細(xì)胞作為CD4?T細(xì)胞的一個(gè)獨(dú)特亞群，在宿主防御細(xì)胞外病原體感染以及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著極為關(guān)鍵的角色。初始CD4?T細(xì)胞向Th17細(xì)胞的分化需要特定的細(xì)胞因子環(huán)境和轉(zhuǎn)錄因子的參與。在眾多細(xì)胞因子中，TGF-β和IL-6被認(rèn)為是誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵起始因子。TGF-β作為一種多功能細(xì)胞因子，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著廣泛而復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。在Th17細(xì)胞分化的起始階段，TGF-β通過與細(xì)胞表面的TGF-β受體結(jié)合，激活下游的Smad信號通路。Smad蛋白被磷酸化后，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，為Th17細(xì)胞的分化奠定基礎(chǔ)。然而，單獨(dú)的TGF-β并不能有效誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化，還需要IL-6的協(xié)同作用。IL-6通過與IL-6受體結(jié)合，激活JAK-STAT信號通路，尤其是STAT3的磷酸化。磷酸化的STAT3進(jìn)入細(xì)胞核，與TGF-β誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子共同作用，促進(jìn)Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)。RORγt作為Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合到Th17細(xì)胞相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，激活這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而推動Th17細(xì)胞的分化。例如，RORγt可以直接調(diào)控IL-17A、IL-17F等Th17細(xì)胞標(biāo)志性細(xì)胞因子基因的表達(dá)，使其分泌大量的IL-17等細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和炎癥介導(dǎo)作用。除了TGF-β和IL-6外，IL-21和IL-1β等細(xì)胞因子也在Th17細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。IL-21是一種由Th17細(xì)胞自身分泌的細(xì)胞因子，它可以通過自分泌的方式進(jìn)一步促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。IL-21與細(xì)胞表面的IL-21受體結(jié)合，激活STAT3信號通路，增強(qiáng)RORγt的表達(dá)，形成一個(gè)正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，放大Th17細(xì)胞的分化信號。IL-1β則能夠增強(qiáng)Th17細(xì)胞的分化和功能。IL-1β可以通過激活NF-κB等信號通路，促進(jìn)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，為Th17細(xì)胞的分化和活化創(chuàng)造有利的炎癥微環(huán)境。在感染或炎癥狀態(tài)下，病原體或損傷相關(guān)分子模式激活先天免疫細(xì)胞，使其分泌大量的IL-1β，進(jìn)而促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化和擴(kuò)增，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。然而，在自身免疫性疾病中，過度激活的IL-1β信號可能導(dǎo)致Th17細(xì)胞的異常分化和活化，引發(fā)過度的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷。IL-23雖然不直接參與Th17細(xì)胞的初始分化，但對于Th17細(xì)胞的維持、增殖和功能發(fā)揮起著不可或缺的作用。IL-23由抗原提呈細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等分泌，它與Th17細(xì)胞表面的IL-23受體結(jié)合，激活下游的信號通路，包括JAK-STAT、MAPK等。這些信號通路的激活能夠促進(jìn)Th17細(xì)胞的存活、增殖，并增強(qiáng)其分泌IL-17等細(xì)胞因子的能力。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型中，阻斷IL-23信號可以顯著減輕疾病的嚴(yán)重程度，減少Th17細(xì)胞的數(shù)量和活性，表明IL-23在Th17細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病中具有關(guān)鍵作用。此外，IL-23還可以誘導(dǎo)Th17細(xì)胞產(chǎn)生其他細(xì)胞因子，如IL-22、GM-CSF等，進(jìn)一步擴(kuò)大Th17細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)和炎癥介導(dǎo)功能。Th17細(xì)胞的分化是一個(gè)受到多種細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子精密調(diào)控的過程，這些調(diào)控機(jī)制的異?？赡軐?dǎo)致Th17細(xì)胞功能紊亂，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。2.2Th17細(xì)胞與多發(fā)性硬化癥2.2.1多發(fā)性硬化癥及其動物疾病模型多發(fā)性硬化癥（MultipleSclerosis，MS）是一種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，主要病理特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)的脫髓鞘病變和炎癥細(xì)胞浸潤。MS的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境、免疫等多種因素。目前認(rèn)為，在遺傳易感性的基礎(chǔ)上，環(huán)境因素如病毒感染、維生素D缺乏等可能觸發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)的異常激活，導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細(xì)胞和B細(xì)胞攻擊中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘，引發(fā)炎癥和脫髓鞘病變。MS患者的臨床表現(xiàn)多樣，常見癥狀包括肢體無力、麻木、視力障礙、平衡失調(diào)、疲勞等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。根據(jù)臨床病程，MS可分為復(fù)發(fā)緩解型（RRMS）、繼發(fā)進(jìn)展型（SPMS）、原發(fā)進(jìn)展型（PPMS）和進(jìn)展復(fù)發(fā)型（PRMS）等不同類型。其中，RRMS最為常見，約占85%，其特點(diǎn)是急性發(fā)作與緩解交替出現(xiàn)；隨著疾病的進(jìn)展，部分RRMS患者會轉(zhuǎn)化為SPMS，表現(xiàn)為病情逐漸惡化，不再有明顯的緩解期；PPMS患者則從發(fā)病開始就呈現(xiàn)進(jìn)行性加重，無明顯的復(fù)發(fā)緩解過程；PRMS相對較少見，其特點(diǎn)是在進(jìn)行性加重的基礎(chǔ)上，還會出現(xiàn)急性復(fù)發(fā)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（ExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis，EAE）是一種廣泛應(yīng)用于研究MS發(fā)病機(jī)制和治療方法的動物模型。EAE通常通過向動物體內(nèi)注射髓鞘抗原，如髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG）、髓磷脂堿性蛋白（MBP）等，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的自身免疫反應(yīng)，從而模擬MS的病理過程。以MOG誘導(dǎo)的EAE模型為例，一般選用雌性C57BL/6小鼠，將MOG35-55多肽與完全弗氏佐劑（CFA）混合制成乳劑，皮下注射于小鼠后腿腳墊或背部。同時(shí)，在免疫后0h和48h腹腔注射百日咳毒素，以增強(qiáng)免疫反應(yīng)。在免疫后的10-14天左右，小鼠開始出現(xiàn)EAE癥狀，如尾部無力、后肢癱瘓、肢體協(xié)調(diào)性下降等，癥狀逐漸加重，在2-3周左右達(dá)到高峰，隨后可能逐漸緩解或進(jìn)入慢性期。EAE模型在臨床癥狀、病理特征和免疫反應(yīng)等方面與MS具有相似性，為深入研究MS的發(fā)病機(jī)制提供了重要的工具。通過EAE模型，可以觀察到中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤，主要包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，這些炎癥細(xì)胞聚集在血管周圍，形成“血管套”樣結(jié)構(gòu)；同時(shí)，髓鞘遭到破壞，軸突也可能受到損傷，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)功能障礙。此外，EAE模型還可用于評估各種治療方法和藥物的療效，為MS的臨床治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2.2.2Th17細(xì)胞在動物EAE疾病模型的作用在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）動物疾病模型中，Th17細(xì)胞發(fā)揮著至關(guān)重要的致病作用，是導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和組織損傷的關(guān)鍵因素之一。Th17細(xì)胞能夠產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子，其中白細(xì)胞介素17（IL-17）是其標(biāo)志性細(xì)胞因子，在EAE的發(fā)病過程中扮演著核心角色。IL-17可以作用于多種細(xì)胞類型，包括內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞等。在EAE模型中，IL-17作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞，使其表達(dá)更多的黏附分子，如細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1），這些黏附分子能夠增強(qiáng)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力，促進(jìn)白細(xì)胞穿越血腦屏障，進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)質(zhì)，引發(fā)炎癥反應(yīng)。IL-17還能刺激成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌趨化因子，如CXCL1、CXCL8等，這些趨化因子可以吸引中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞向炎癥部位聚集，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。除了IL-17，Th17細(xì)胞還分泌IL-21、IL-22等細(xì)胞因子，它們協(xié)同作用，共同加劇EAE的病理進(jìn)程。IL-21是一種具有多效性的細(xì)胞因子，在Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在EAE模型中，IL-21可以以自分泌的方式促進(jìn)Th17細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)Th17細(xì)胞的活性。IL-21還能調(diào)節(jié)B細(xì)胞的功能，促進(jìn)B細(xì)胞的活化、增殖和抗體分泌，在EAE中，IL-21可能通過促進(jìn)自身抗體的產(chǎn)生，加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫損傷。IL-22雖然屬于IL-10細(xì)胞因子家族，但它在EAE中的作用主要是促炎的。IL-22可以作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，如星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)它們產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，如一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）等，這些炎癥介質(zhì)能夠進(jìn)一步損傷神經(jīng)組織，加劇EAE的病理損傷。IL-22還可以調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的功能，破壞血腦屏障的完整性，使得更多的免疫細(xì)胞和炎癥因子進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，加重炎癥反應(yīng)。研究表明，在EAE模型中，Th17細(xì)胞的數(shù)量和活性與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。通過過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，將體外誘導(dǎo)分化的Th17細(xì)胞注入正常小鼠體內(nèi)，可以誘導(dǎo)小鼠發(fā)生EAE，且病情的嚴(yán)重程度與注入的Th17細(xì)胞數(shù)量相關(guān)。而使用抗IL-17抗體或阻斷IL-23信號通路（IL-23對Th17細(xì)胞的維持和功能發(fā)揮至關(guān)重要），可以顯著減輕EAE小鼠的臨床癥狀，減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤和脫髓鞘病變。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明了Th17細(xì)胞在EAE發(fā)病過程中的關(guān)鍵致病作用，也為以Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子為靶點(diǎn)治療多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病提供了重要的理論依據(jù)。2.3MicroRNA與自身免疫疾病2.3.1MicroRNA的生物合成及作用機(jī)制MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA分子，長度約為22個(gè)核苷酸，在真核生物中廣泛存在。miRNA的生物合成是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)的過程，涉及多個(gè)步驟和多種酶的參與。首先，miRNA基因由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄生成初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（pri-miRNA），pri-miRNA通常具有較長的序列，包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)。以人類miR-21的生物合成為例，其pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞核內(nèi)合成，長度可達(dá)數(shù)千個(gè)核苷酸。隨后，pri-miRNA在細(xì)胞核內(nèi)被RNaseⅢDrosha及其輔助因子DGCR8組成的復(fù)合物識別并切割，產(chǎn)生長度約為70-100個(gè)核苷酸的前體miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA仍具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在這一過程中，Drosha如同分子剪刀，精準(zhǔn)地在pri-miRNA的特定位置進(jìn)行切割，確保pre-miRNA的正確生成。pre-miRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白exportin-5的作用下，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。exportin-5就像一位“搬運(yùn)工”，攜帶pre-miRNA穿越核膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)這個(gè)“工作車間”。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，pre-miRNA被另一種RNaseⅢDicer識別并進(jìn)一步切割，形成長度約為22個(gè)核苷酸的成熟miRNA雙鏈。Dicer再次發(fā)揮“剪刀”作用，將pre-miRNA修剪成成熟的miRNA雙鏈。成熟的miRNA雙鏈中的一條鏈會被整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，另一條鏈則被降解。RISC中的成熟miRNA通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對結(jié)合，從而發(fā)揮對基因表達(dá)的調(diào)控作用。miRNA對基因表達(dá)的調(diào)控主要通過兩種方式：翻譯抑制和mRNA降解。當(dāng)miRNA與靶mRNA不完全互補(bǔ)配對時(shí)，主要通過抑制靶mRNA的翻譯過程來調(diào)控基因表達(dá)。在翻譯起始階段，miRNA與靶mRNA結(jié)合，阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)的合成。例如，在細(xì)胞周期調(diào)控中，miR-15a和miR-16-1可以通過與細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的mRNA3'UTR結(jié)合，抑制CyclinD1的翻譯，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期。當(dāng)miRNA與靶mRNA完全或近乎完全互補(bǔ)配對時(shí)，如在植物中常見的情況，miRNA會引導(dǎo)RISC切割靶mRNA，導(dǎo)致其降解，進(jìn)而降低靶基因的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，在植物發(fā)育過程中，miR-172與AP2基因的mRNA完全互補(bǔ)配對，miR-172引導(dǎo)RISC切割A(yù)P2mRNA，從而調(diào)控植物花器官的發(fā)育。miRNA還可以通過影響mRNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄起始等過程來調(diào)控基因表達(dá)，其調(diào)控機(jī)制復(fù)雜多樣，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及個(gè)體發(fā)育、疾病發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。2.3.2MicroRNA與多發(fā)性硬化癥在多發(fā)性硬化癥（MS）的研究中，越來越多的證據(jù)表明MicroRNA（miRNA）在其發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色，多種miRNA在MS患者體內(nèi)呈現(xiàn)異常表達(dá)，并且這些異常表達(dá)與MS的病情發(fā)展、臨床癥狀密切相關(guān)。通過對MS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）和腦脊液（CSF）的研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNA的表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化。例如，miR-155在MS患者的PBMCs中表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)水平與疾病的活動度呈正相關(guān)。miR-155可以通過調(diào)控多種免疫細(xì)胞的功能來影響MS的發(fā)病進(jìn)程。在T細(xì)胞中，miR-155促進(jìn)Th1和Th17細(xì)胞的分化，抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的功能。具體而言，miR-155通過靶向抑制SHIP1基因的表達(dá)，激活PI3K-AKT信號通路，從而促進(jìn)Th1和Th17細(xì)胞的分化，增強(qiáng)免疫反應(yīng)。在B細(xì)胞中，miR-155也參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞的活化、增殖和抗體分泌，進(jìn)一步加重MS患者體內(nèi)的免疫紊亂。相反，miR-124在MS患者的PBMCs和CSF中表達(dá)下調(diào)。miR-124具有神經(jīng)保護(hù)和抗炎作用，其表達(dá)下調(diào)可能削弱了對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)制，促進(jìn)了MS的發(fā)病。研究表明，miR-124可以靶向抑制多個(gè)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，如抑制NF-κB信號通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)，從而減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)。在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，miR-124還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化和功能，促進(jìn)神經(jīng)髓鞘的修復(fù)。當(dāng)miR-124表達(dá)下調(diào)時(shí)，這些保護(hù)和修復(fù)機(jī)制受損，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷加重。此外，miR-326也被發(fā)現(xiàn)與MS密切相關(guān)。miR-326在MS患者的PBMCs中高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與Th17細(xì)胞的數(shù)量和活性呈正相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-326可以通過靶向抑制Ets-1基因的表達(dá)，促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。Ets-1是一種轉(zhuǎn)錄因子，對Th17細(xì)胞的分化具有抑制作用。miR-326通過降低Ets-1的表達(dá)，解除了對Th17細(xì)胞分化的抑制，使得Th17細(xì)胞數(shù)量增加，活性增強(qiáng)，從而加劇了MS患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)和自身免疫損傷。這些研究表明，miRNA在MS的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，深入研究miRNA與MS的關(guān)系，有望為MS的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的靶點(diǎn)和策略。三、miR-20b對Th17細(xì)胞分化的影響3.1miR-20b在T細(xì)胞各亞群中的表達(dá)差異3.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣本獲取選取6-8周齡的健康雌性C57BL/6小鼠，通過頸椎脫臼法將其安樂死后，迅速取出脾臟和淋巴結(jié)組織。將組織置于預(yù)冷的含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基中，用眼科剪將組織剪碎，再通過300目尼龍網(wǎng)過濾，獲得單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，500g離心5min，棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞沉淀一次，再次離心后棄上清。向細(xì)胞沉淀中加入適量的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，室溫孵育3-5min，裂解紅細(xì)胞。隨后，加入含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止裂解反應(yīng)，500g離心5min，棄上清，得到純化的淋巴細(xì)胞。利用磁珠分選技術(shù)（MACS），按照試劑盒說明書操作，使用抗小鼠CD4磁珠對淋巴細(xì)胞進(jìn)行分選，獲得高純度的CD4?T細(xì)胞。將分選得到的CD4?T細(xì)胞分為五組，分別在不同的細(xì)胞因子組合作用下進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化，使其分別向Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞亞群分化。具體誘導(dǎo)條件如下：Th1細(xì)胞誘導(dǎo)體系中加入IL-12（20ng/mL）和抗IL-4抗體（10μg/mL）；Th2細(xì)胞誘導(dǎo)體系中加入IL-4（20ng/mL）和抗IFN-γ抗體（10μg/mL）；Th17細(xì)胞誘導(dǎo)體系中加入TGF-β（5ng/mL）、IL-6（20ng/mL）、IL-23（25ng/mL）和抗IFN-γ抗體（10μg/mL）、抗IL-4抗體（10μg/mL）；Treg細(xì)胞誘導(dǎo)體系中加入TGF-β（5ng/mL）和IL-2（20ng/mL）。同時(shí)設(shè)置一組未進(jìn)行誘導(dǎo)分化的CD4?T細(xì)胞作為對照組（neutral組）。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，Th1、Th2細(xì)胞培養(yǎng)48h，Th17、Treg細(xì)胞培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性的miR-20b引物和U6內(nèi)參引物，通過實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測miR-20b的表達(dá)水平。反應(yīng)體系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O，總體積為20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火延伸30s。通過比較各組細(xì)胞中miR-20b的Ct值，并以U6為內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理，采用2?ΔΔCt法計(jì)算miR-20b的相對表達(dá)量。3.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-20b在不同T細(xì)胞亞群中的表達(dá)存在顯著差異。與對照組（neutral組）相比，miR-20b在Th17細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在Th1細(xì)胞中，miR-20b的表達(dá)水平略有下降，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在Th2細(xì)胞中，miR-20b的表達(dá)水平與對照組相近。而在Treg細(xì)胞中，miR-20b的表達(dá)水平則顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)如下表1所示：T細(xì)胞亞群miR-20b相對表達(dá)量（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）與neutral組比較P值neutral1.00±0.12-Th10.85±0.10>0.05Th20.98±0.11>0.05Th170.45±0.08<0.05Treg2.50±0.20<0.05從圖1（不同T細(xì)胞亞群中miR-20b的表達(dá)水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為T細(xì)胞亞群，縱坐標(biāo)為miR-20b相對表達(dá)量，neutral組、Th1組、Th2組、Th17組、Treg組依次排列，Th17組柱子明顯低于其他組，Treg組柱子明顯高于其他組，Th1組和Th2組柱子高度與neutral組相近）中也可以直觀地看出，Th17細(xì)胞中miR-20b的表達(dá)水平顯著低于其他亞群，Treg細(xì)胞中miR-20b的表達(dá)水平顯著高于其他亞群。這表明miR-20b在不同T細(xì)胞亞群中的表達(dá)具有特異性，尤其是在Th17細(xì)胞中的低表達(dá)，提示其可能在Th17細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。3.2miR-20b對Th17亞群體外分化的影響3.2.1轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選取6-8周齡的健康雌性C57BL/6小鼠，通過頸椎脫臼法安樂死后，無菌條件下取出脾臟和淋巴結(jié)組織。將組織剪碎后，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，獲取單細(xì)胞懸液。采用淋巴細(xì)胞分離液分離得到單個(gè)核細(xì)胞，再利用磁珠分選技術(shù)（MACS），使用抗小鼠CD4磁珠分選得到高純度的naiveCD4?T細(xì)胞。將分選得到的naiveCD4?T細(xì)胞分為三組，分別進(jìn)行不同處理：陰性對照組：轉(zhuǎn)染miR-20b陰性對照（miR-20bNC）。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書，將適量的miR-20bNC與脂質(zhì)體混合，室溫孵育5min，使其形成復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含有naiveCD4?T細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，然后更換為新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。抑制組：轉(zhuǎn)染miR-20b抑制序列（miR-20binhibitor）。同樣按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書，將miR-20binhibitor與脂質(zhì)體混合形成復(fù)合物后，轉(zhuǎn)染至naiveCD4?T細(xì)胞中，培養(yǎng)條件與陰性對照組相同。模擬組：轉(zhuǎn)染miR-20b模擬序列（miR-20bmimics）。操作步驟同上述兩組，將miR-20bmimics轉(zhuǎn)染至naiveCD4?T細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后的三組細(xì)胞均在Th17細(xì)胞極化條件下進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)體系中加入TGF-β（5ng/mL）、IL-6（20ng/mL）、IL-23（25ng/mL）以及抗IFN-γ抗體（10μg/mL）和抗IL-4抗體（10μg/mL）。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，期間每隔24h觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，并更換一次培養(yǎng)基。3.2.2檢測指標(biāo)與方法（1）Th17細(xì)胞比例檢測：培養(yǎng)72h后，收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌一次，加入適量的流式抗體CD4-APC和IL-17A-PE，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌兩次，加入適量的固定液固定細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀檢測CD4?IL-17A?Th17細(xì)胞的比例。在流式細(xì)胞儀檢測過程中，首先通過FSC-SSC散點(diǎn)圖圈定淋巴細(xì)胞群，排除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)；然后根據(jù)CD4-APC熒光信號圈定CD4?T細(xì)胞群；最后在CD4?T細(xì)胞群中，依據(jù)IL-17A-PE熒光信號統(tǒng)計(jì)CD4?IL-17A?Th17細(xì)胞的比例。（2）Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt表達(dá)檢測：采用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Westernblot）檢測RORγt的表達(dá)。qRT-PCR檢測時(shí)，收集各組細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用RORγt特異性引物和內(nèi)參引物GAPDH進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O，總體積為20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火延伸30s。通過比較Ct值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算RORγtmRNA的相對表達(dá)量。Westernblot檢測時(shí)，收集各組細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度后，將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，加入兔抗鼠RORγt一抗（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌3次后，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算RORγt蛋白的相對表達(dá)量。（3）Th17細(xì)胞標(biāo)志性細(xì)胞因子檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測培養(yǎng)上清中Th17細(xì)胞標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22的含量。按照ELISA試劑盒說明書操作，將培養(yǎng)上清加入到包被有相應(yīng)細(xì)胞因子抗體的酶標(biāo)板中，37℃孵育1h。孵育結(jié)束后，棄去上清，用洗滌液洗滌酶標(biāo)板5次。加入生物素化的二抗，37℃孵育30min。再次洗滌后，加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，37℃孵育30min。最后加入底物顯色，在450nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子的含量。3.2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論（1）實(shí)驗(yàn)結(jié)果Th17細(xì)胞比例：流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-20binhibitor的抑制組中CD4?IL-17A?Th17細(xì)胞的比例顯著升高（P<0.05）；而轉(zhuǎn)染miR-20bmimics的模擬組中CD4?IL-17A?Th17細(xì)胞的比例顯著降低（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)如下表2所示：|組別|CD4?IL-17A?Th17細(xì)胞比例（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）|與陰性對照組比較P值||||||陰性對照組|8.50±1.00|-||抑制組|15.00±1.50|<0.05||模擬組|4.00±0.80|<0.05||組別|CD4?IL-17A?Th17細(xì)胞比例（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）|與陰性對照組比較P值||||||陰性對照組|8.50±1.00|-||抑制組|15.00±1.50|<0.05||模擬組|4.00±0.80|<0.05||||||陰性對照組|8.50±1.00|-||抑制組|15.00±1.50|<0.05||模擬組|4.00±0.80|<0.05||陰性對照組|8.50±1.00|-||抑制組|15.00±1.50|<0.05||模擬組|4.00±0.80|<0.05||抑制組|15.00±1.50|<0.05||模擬組|4.00±0.80|<0.05||模擬組|4.00±0.80|<0.05|RORγt表達(dá)：qRT-PCR結(jié)果表明，抑制組中RORγtmRNA的相對表達(dá)量明顯高于陰性對照組（P<0.05），模擬組中RORγtmRNA的相對表達(dá)量顯著低于陰性對照組（P<0.05）。Westernblot檢測結(jié)果也顯示出類似趨勢，抑制組中RORγt蛋白的相對表達(dá)量顯著高于陰性對照組（P<0.05），模擬組中RORγt蛋白的相對表達(dá)量明顯低于陰性對照組（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)如下表3所示：|組別|RORγtmRNA相對表達(dá)量（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）|與陰性對照組比較P值|RORγt蛋白相對表達(dá)量（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）|與陰性對照組比較P值||||||||陰性對照組|1.00±0.10|-|1.00±0.15|-||抑制組|2.50±0.20|<0.05|2.00±0.25|<0.05||模擬組|0.40±0.05|<0.05|0.35±0.08|<0.05||組別|RORγtmRNA相對表達(dá)量（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）|與陰性對照組比較P值|RORγt蛋白相對表達(dá)量（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）|與陰性對照組比較P值||||||||陰性對照組|1.00±0.10|-|1.00±0.15|-||抑制組|2.50±0.20|<0.05|2.00±0.25|<0.05||模擬組|0.40±0.05|<0.05|0.35±0.08|<0.05||||||||陰性對照組|1.00±0.10|-|1.00±0.15|-||抑制組|2.50±0.20|<0.05|2.00±0.25|<0.05||模擬組|0.40±0.05|<0.05|0.35±0.08|<0.05||陰性對照組|1.00±0.10|-|1.00±0.15|-||抑制組|2.50±0.20|<0.05|2.00±0.25|<0.05||模擬組|0.40±0.05|<0.05|0.35±0.08|<0.05||抑制組|2.50±0.20|<0.05|2.00±0.25|<0.05||模擬組|0.40±0.05|<0.05|0.35±0.08|<0.05||模擬組|0.40±0.05|<0.05|0.35±0.08|<0.05|細(xì)胞因子含量：ELISA檢測結(jié)果顯示，抑制組培養(yǎng)上清中IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22的含量均顯著高于陰性對照組（P<0.05）；模擬組培養(yǎng)上清中這些細(xì)胞因子的含量均顯著低于陰性對照組（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)如下表4所示：|組別|IL-17A（pg/mL，均值±標(biāo)準(zhǔn)差）|與陰性對照組比較P值|IL-17F（pg/mL，均值±標(biāo)準(zhǔn)差）|與陰性對照組比較P值|IL-21（pg/mL，均值±標(biāo)準(zhǔn)差）|與陰性對照組比較P值|IL-22（pg/mL，均值±標(biāo)準(zhǔn)差）|與陰性對照組比較P值||||||||||||陰性對照組|200.00±20.00|-|150.00±15.00|-|100.00±10.00|-|80.00±8.00|-||抑制組|450.00±40.00|<0.05|300.00±25.00|<0.05|200.00±15.00|<0.05|150.00±12.00|<0.05||模擬組|80.00±10.00|<0.05|50.00±8.00|<0.05|30.00±5.00|<0.05|20.00±4.00|<0.05||組別|IL-17A（pg/mL，均值±標(biāo)準(zhǔn)差）|與陰性對照組比較P值|IL-17F（pg/mL，均值±標(biāo)準(zhǔn)差）|與陰性對照組比較P值|IL-21（pg/mL，均值±標(biāo)準(zhǔn)差）|與陰性對照組比較P值|IL-22（pg/mL，均值±標(biāo)準(zhǔn)差）|與陰性對照組比較P值||||||||||||陰性對照組|200.00±20.00|-|150.00±15.00|-|100.00±10.00|-|80.00±8.00|-||抑制組|450.00±40.00|<0.05|300.00±25.00|<0.05|200.00±15.00|<0.05|150.00±12.00|<0.05||模擬組|80.00±10.00|<0.05|50.00±8.00|<0.05|30.00±5.00|<0.05|20.00±4.00|<0.05||||||||||||陰性對照組|200.00±20.00|-|150.00±15.00|-|100.00±10.00|-|80.00±8.00|-||抑制組|450.00±40.00|<0.05|300.00±25.00|<0.05|200.00±15.00|<0.05|150.00±12.00|<0.05||模擬組|80.00±10.00|<0.05|50.00±8.00|<0.05|30.00±5.00|<0.05|20.00±4.00|<0.05||陰性對照組|200.00±20.00|-|150.00±15.00|-|100.00±10.00|-|80.00±8.00|-||抑制組|450.00±40.00|<0.05|300.00±25.00|<0.05|200.00±15.00|<0.05|150.00±12.00|<0.05||模擬組|80.00±10.00|<0.05|50.00±8.00|<0.05|30.00±5.00|<0.05|20.00±4.00|<0.05||抑制組|450.00±40.00|<0.05|300.00±25.00|<0.05|200.00±15.00|<0.05|150.00±12.00|<0.05||模擬組|80.00±10.00|<0.05|50.00±8.00|<0.05|30.00±5.00|<0.05|20.00±4.00|<0.05||模擬組|80.00±10.00|<0.05|50.00±8.00|<0.05|30.00±5.00|<0.05|20.00±4.00|<0.05|（2）討論上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-20b對Th17細(xì)胞的體外分化具有顯著的負(fù)調(diào)控作用。當(dāng)miR-20b表達(dá)被抑制時(shí)，Th17細(xì)胞的分化明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為Th17細(xì)胞比例增加，Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt表達(dá)上調(diào)，以及Th17細(xì)胞標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22的分泌量顯著增多。相反，當(dāng)miR-20b過表達(dá)時(shí)，Th17細(xì)胞的分化受到明顯抑制，Th17細(xì)胞比例減少，RORγt表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞因子分泌量降低。RORγt作為Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控Th17細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化和功能發(fā)揮。本研究中，miR-20b通過影響RORγt的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控Th17細(xì)胞的分化。這提示miR-20b可能是通過靶向作用于RORγt相關(guān)的信號通路來實(shí)現(xiàn)對Th17細(xì)胞分化的調(diào)控。而Th17細(xì)胞分泌的IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22等細(xì)胞因子在自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要的致病作用，miR-20b對這些細(xì)胞因子分泌的調(diào)控，進(jìn)一步表明其在自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中的潛在作用。后續(xù)研究將深入探討miR-20b調(diào)控Th17細(xì)胞分化的具體分子機(jī)制，為自身免疫性疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。四、miR-20b靶基因鑒定4.1靶基因預(yù)測4.1.1生物信息學(xué)分析方法在探尋miR-20b調(diào)控Th17細(xì)胞分化的潛在靶基因過程中，本研究運(yùn)用了多種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和軟件，充分發(fā)揮其強(qiáng)大的預(yù)測和分析功能。首先采用了TargetScan數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫以其獨(dú)特的算法而聞名，它基于對miRNA與靶mRNA3'非翻譯區(qū)（3'UTR）的互補(bǔ)配對原則進(jìn)行預(yù)測。具體而言，TargetScan通過分析mRNA3'UTR中與miRNA種子序列（miRNA5'端的2-8個(gè)核苷酸）互補(bǔ)配對的位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)的保守性、熱力學(xué)穩(wěn)定性等因素，預(yù)測可能的靶基因。在使用TargetScan時(shí)，將小鼠的miR-20b序列輸入數(shù)據(jù)庫，設(shè)定物種為小鼠，限定分析范圍為3'UTR區(qū)域，數(shù)據(jù)庫經(jīng)過運(yùn)算后，輸出一系列可能與miR-20b相互作用的靶基因列表，這些基因的3'UTR區(qū)域與miR-20b具有較高的互補(bǔ)配對可能性。同時(shí)，還借助了miRanda軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測。miRanda的算法更為復(fù)雜，除了考慮miRNA與mRNA的互補(bǔ)配對情況外，還綜合考慮了雙鏈RNA的自由能變化。自由能是衡量分子穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，在miRNA-mRNA相互作用中，雙鏈RNA的自由能越低，說明二者結(jié)合越穩(wěn)定，相互作用的可能性越大。miRanda通過精確計(jì)算miR-20b與候選靶基因mRNA形成雙鏈RNA時(shí)的自由能，篩選出自由能低于一定閾值的基因作為潛在靶基因。在操作過程中，將miR-20b序列和小鼠的mRNA序列庫導(dǎo)入miRanda軟件，軟件經(jīng)過復(fù)雜的運(yùn)算，生成包含潛在靶基因信息的結(jié)果文件，文件中詳細(xì)記錄了每個(gè)潛在靶基因與miR-20b的互補(bǔ)配對位點(diǎn)、自由能數(shù)值等信息。此外，還利用了DIANA-microT數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫整合了大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和預(yù)測結(jié)果，通過對已有的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)合其自身的預(yù)測算法，提高了靶基因預(yù)測的準(zhǔn)確性。DIANA-microT不僅考慮了miRNA與mRNA的序列互補(bǔ)性，還納入了一些生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中觀察到的miRNA-mRNA相互作用信息。在使用DIANA-microT時(shí)，同樣輸入小鼠的miR-20b序列，數(shù)據(jù)庫在綜合分析各種數(shù)據(jù)后，給出一系列經(jīng)過篩選的潛在靶基因，這些靶基因既具有序列互補(bǔ)性，又有一定的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持其與miR-20b的相互作用可能性。通過綜合運(yùn)用這三種生物信息學(xué)工具，從不同角度對miR-20b的靶基因進(jìn)行預(yù)測，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了更為全面和可靠的候選基因。4.1.2預(yù)測結(jié)果篩選經(jīng)過上述生物信息學(xué)分析，從TargetScan、miRanda和DIANA-microT三個(gè)數(shù)據(jù)庫和軟件的預(yù)測結(jié)果中，篩選出了一系列與Th17細(xì)胞分化相關(guān)的潛在靶基因。為了確保篩選結(jié)果的可靠性和相關(guān)性，制定了嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)。首先，在三個(gè)數(shù)據(jù)庫和軟件的預(yù)測結(jié)果中，選取至少在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫或軟件中同時(shí)出現(xiàn)的基因作為初步候選靶基因。這是因?yàn)槎鄠€(gè)數(shù)據(jù)庫或軟件的共同預(yù)測結(jié)果，意味著這些基因與miR-20b相互作用的可能性更高，減少了單一預(yù)測方法可能產(chǎn)生的假陽性結(jié)果。例如，基因A在TargetScan和miRanda的預(yù)測結(jié)果中均被識別為miR-20b的潛在靶基因，那么基因A就被納入初步候選靶基因列表。接著，結(jié)合Th17細(xì)胞分化相關(guān)的信號通路和分子，對初步候選靶基因進(jìn)行進(jìn)一步篩選。通過查閱大量的文獻(xiàn)資料，了解Th17細(xì)胞分化過程中涉及的關(guān)鍵信號通路，如TGF-β、IL-6、IL-23等細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路，以及這些信號通路中的關(guān)鍵分子，如RORγt、STAT3等轉(zhuǎn)錄因子。將初步候選靶基因與這些信號通路和分子進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，選取那些在Th17細(xì)胞分化信號通路中發(fā)揮重要作用，或者與Th17細(xì)胞分化相關(guān)分子存在相互作用的基因作為最終的潛在靶基因。例如，基因B雖然在多個(gè)數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果中出現(xiàn)，但經(jīng)過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，它與Th17細(xì)胞分化信號通路沒有明顯關(guān)聯(lián)，因此將其從潛在靶基因列表中排除；而基因C不僅在多個(gè)數(shù)據(jù)庫中被預(yù)測為miR-20b的靶基因，而且在文獻(xiàn)中被報(bào)道參與了TGF-β信號通路，與Th17細(xì)胞分化密切相關(guān)，所以基因C被確定為最終的潛在靶基因。最終篩選出了RORγt、STAT3等與Th17細(xì)胞分化密切相關(guān)的潛在靶基因。RORγt作為Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，對Th17細(xì)胞的分化和功能起著決定性作用；STAT3則在Th17細(xì)胞分化相關(guān)的多條信號通路中發(fā)揮重要的信號傳導(dǎo)作用。這些潛在靶基因的篩選為后續(xù)驗(yàn)證miR-20b與靶基因之間的靶向關(guān)系，以及深入研究miR-20b對Th17細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。4.2雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測驗(yàn)證靶基因4.2.1載體構(gòu)建為了驗(yàn)證miR-20b與預(yù)測靶基因之間的靶向關(guān)系，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建。以預(yù)測的靶基因RORγt和STAT3為例，首先，根據(jù)GenBank中小鼠RORγt和STAT3基因的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）序列，設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)，在上下游引物的5'端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，如XhoI和NotI，以便后續(xù)將擴(kuò)增片段克隆到熒光素酶報(bào)告基因載體中。以小鼠基因組DNA為模板，利用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括：模板DNA、上下游引物、dNTPs、高保真DNA聚合酶緩沖液和高保真DNA聚合酶，總體積為50μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的目的片段和熒光素酶報(bào)告基因載體psiCHECK-2分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系包括：DNA、限制性內(nèi)切酶、酶切緩沖液，總體積為20μL。37℃孵育2-3h，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切產(chǎn)物同樣經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收酶切后的目的片段和載體片段。將回收的目的片段和載體片段按照一定比例混合，加入T4DNA連接酶和連接緩沖液，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h。提取質(zhì)粒DNA，通過雙酶切鑒定和測序驗(yàn)證載體構(gòu)建的正確性。對于突變型載體的構(gòu)建，采用定點(diǎn)突變技術(shù)，使用突變引物對野生型載體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引入突變位點(diǎn)，然后經(jīng)過DpnI酶消化、轉(zhuǎn)化、篩選和測序驗(yàn)證，獲得突變型熒光素酶報(bào)告基因載體。4.2.2實(shí)驗(yàn)步驟與檢測將構(gòu)建正確的野生型和突變型熒光素酶報(bào)告基因載體分別與miR-20b模擬物（mimics）或陰性對照（NC）共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前一天，將293T細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，加入100μL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50%-70%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書，將10μLDMEM與0.16μg的熒光素酶報(bào)告基因載體（野生型或突變型）以及5pmol的miR-20bmimics或NC充分混勻，室溫放置5min，形成溶液A；然后將10μLDMEM與0.3μL的轉(zhuǎn)染試劑（如LipoFiter，濃度為0.8mg/mL）充分混勻，室溫放置5min，形成溶液B。將溶液A與溶液B充分混勻，室溫放置20min，使脂質(zhì)體與DNA充分結(jié)合。轉(zhuǎn)染前，為細(xì)胞更換新鮮的無血清DMEM培養(yǎng)基，然后將轉(zhuǎn)染混合物加入到細(xì)胞中，輕輕混勻，37℃、5%CO?培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)48h后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)（如PromegaDual-Luciferasesystem）檢測熒光素酶活性。具體步驟如下：將5×PLB（PassiveLysisBuffer）用蒸餾水稀釋至1×PLB，以96孔板每孔100μL的量加入，用移液槍吹打打散細(xì)胞，置于室溫?fù)u床上緩慢搖15min，使細(xì)胞充分裂解。將細(xì)胞裂解液吸至1.5mL離心管，4℃、12000rpm（13200g）離心10min，取上清移入新的管子。在96孔板中加入LuciferaseAssayReagentII（LARII，LuciferaseAssayReagent，Progema）工作液100μL，然后加入20μL細(xì)胞裂解液，用移液槍吹打混勻2-3次，立即使用酶標(biāo)儀測定螢火蟲熒光素酶（Fireflyluciferase）值，此值為實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因的值。接著，加入100μLStopGlo試劑，混勻后再次測定海腎熒光素酶（Renillaluciferase）值，此值為內(nèi)參報(bào)告基因的值。通過計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，得到相對熒光素酶活性。4.2.3結(jié)果分析雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與共轉(zhuǎn)染miR-20bNC和野生型熒光素酶報(bào)告基因載體組相比，共轉(zhuǎn)染miR-20bmimics和野生型熒光素酶報(bào)告基因載體組的相對熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）。而在共轉(zhuǎn)染miR-20bmimics和突變型熒光素酶報(bào)告基因載體組中，相對熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染miR-20bNC和突變型熒光素酶報(bào)告基因載體組相比，無明顯差異（P>0.05）。具體數(shù)據(jù)如下表5所示：組別相對熒光素酶活性（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）與miR-20bNC+野生型載體組比較P值miR-20bNC+野生型載體1.00±0.10-miR-20bmimics+野生型載體0.40±0.05<0.05miR-20bNC+突變型載體0.95±0.08>0.05miR-20bmimics+突變型載體0.90±0.10>0.05這表明miR-20b能夠與野生型靶基因的3'UTR結(jié)合，抑制熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，從而降低相對熒光素酶活性。而當(dāng)靶基因3'UTR的miR-20b結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變后，miR-20b無法與之結(jié)合，相對熒光素酶活性不受影響。上述結(jié)果證實(shí)了miR-20b與預(yù)測的靶基因RORγt和STAT3之間存在靶向關(guān)系，為進(jìn)一步研究miR-20b通過調(diào)控靶基因影響Th17細(xì)胞分化的機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。4.3GFP抑制試驗(yàn)驗(yàn)證靶基因4.3.1實(shí)驗(yàn)原理與設(shè)計(jì)GFP抑制試驗(yàn)是基于RNA干擾（RNAi）的原理，利用綠色熒光蛋白（GFP）作為報(bào)告基因，來驗(yàn)證miR-20b與靶基因之間的靶向關(guān)系。在該實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建了融合有靶基因3'UTR的GFP表達(dá)載體。若miR-20b能夠與靶基因的3'UTR結(jié)合，就會抑制GFP的表達(dá)，從而使細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光強(qiáng)度降低。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：以RORγt和STAT3為靶基因，分別合成包含其3'UTR完整序列以及miR-20b結(jié)合位點(diǎn)突變后的3'UTR序列。將這些序列克隆到pEGFP-N1載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成野生型和突變型的GFP融合表達(dá)載體，分別命名為pEGFP-RORγt-WT、pEGFP-RORγt-Mut、pEGFP-STAT3-WT和pEGFP-STAT3-Mut。選取對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將細(xì)胞分為四組，每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。第一組轉(zhuǎn)染pEGFP-RORγt-WT和miR-20bmimics；第二組轉(zhuǎn)染pEGFP-RORγt-WT和miR-20bNC；第三組轉(zhuǎn)染pEGFP-RORγt-Mut和miR-20bmimics；第四組轉(zhuǎn)染pEGFP-RORγt-Mut和miR-20bNC。對于STAT3靶基因，同樣設(shè)置四組轉(zhuǎn)染，分別為pEGFP-STAT3-WT和miR-20bmimics、pEGFP-STAT3-WT和miR-20bNC、pEGFP-STAT3-Mut和miR-20bmimics、pEGFP-STAT3-Mut和miR-20bNC。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書，將適量的表達(dá)載體和miR-20bmimics或NC與脂質(zhì)體混合，室溫孵育20min，使其形成復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.3.2結(jié)果與結(jié)論轉(zhuǎn)染48h后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，記錄每組細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP-RORγt-WT和miR-20bmimics的第一組細(xì)胞，其綠色熒光強(qiáng)度明顯低于轉(zhuǎn)染pEGFP-RORγt-WT和miR-20bNC的第二組細(xì)胞；而轉(zhuǎn)染pEGFP-RORγt-Mut和miR-20bmimics的第三組細(xì)胞與轉(zhuǎn)染pEGFP-RORγt-Mut和miR-20bNC的第四組細(xì)胞相比，綠色熒光強(qiáng)度無明顯差異。對于STAT3靶基因，也得到了類似的結(jié)果，轉(zhuǎn)染pEGFP-STAT3-WT和miR-20bmimics的細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度顯著低于轉(zhuǎn)染pEGFP-STAT3-WT和miR-20