152023-09-15發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件主要起草人：王萍、劉杰才、陳貴華、許珂、尚鵬、李石恒、I籽用西葫蘆種子病毒RT-PCR檢測技術規(guī)程本文件規(guī)定了籽用西葫蘆種子病毒RT-P本文件適用于籽用西葫蘆種子中黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvi黃瓜花葉病毒cucumbermos西瓜花葉病毒watermelonmosaicvir種類。受侵染的病株葉片表現(xiàn)花葉、畸形、新生小西葫蘆黃化花葉病毒zucchiniyellowmosaic可由多種蚜蟲以非持久性方式傳播，也能通124.2核酸染料。4.310mol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液：在160mL水中加入80.0g氫氧化鈉，溶解后，冷卻至室溫，再4.40.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?)溶液(pH8.0):稱取186g乙二胺四乙酸二鈉，加入70mL水中，緩慢滴加氫氧化鈉溶液(見4.3)直至EDTA-Na2完全溶解，用氫氧化鈉溶液(見4.3)調pH至8.04.51mol/I三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCI)溶液(pH8.0):稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷溶解于800mL水中，用鹽酸調pH至8.0加水定容至1000mL。在121℃條件下滅菌20min。4.6TE緩沖液(pH8.0):分別量取10mL三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液(見4.5)和2mL乙二胺四乙酸二鈉溶液(見4.4),加水定容至1000mL。在121℃條件下滅菌20min。4.750×TAE緩沖液：稱取242.2g三羥甲基氨基甲烷(Tris),先用500mL水加熱攪拌溶解后，加入100mL乙二胺四乙酸二鈉溶液(見4.4),用冰乙酸調pH至8.0,然后加水定容至1000mL。使用時用水4.8加樣緩沖液：稱取250.0mg溴酚藍，加入10mL水，在室溫下溶解12h;稱取250.0mg二甲基苯腈藍，加10mL水溶解；稱取50.0g蔗糖，加30mL水溶解?；旌弦陨?種溶液，加水定容至100mL,在4℃下保存。4.9DNA分子量標準：可以清楚區(qū)分100bp～500bp的DNA片段。TGCTGCGTCTGAGAAATG-3。預期擴增目的片段大小為485bp(參見附錄A中的A.2)。TACTGCATTGTGTTCACACC-3'。預期擴增目的片段大小為283bp(參見附錄A中的A.3)。4.14引物溶液：用TE緩沖液(見4.6)將上述引物稀釋到10μmol/L。4.19大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a。5.1分析天平。5.2組織研磨儀。5.5Nanodrop微量分光光度計。5.6凝膠成像系統(tǒng)或照相系統(tǒng)。3采集適量的籽用西葫蘆種子，放入自封袋中封口后及時進行分析。如需保存可置于-80℃冰箱中。8.1.1每個對照和試樣設置2次重復。8.1.2RNA提?。哼x取感染病毒的籽用西葫蘆種子50粒，冷凍研磨至粉狀后，稱取0.1g待測樣品置于滅菌2mL離心管中，加入1mLTRIzol試劑后混勻，比值為1.8～2.0時，可用于RT-PCR檢測。8.1.4RNA質量檢測：稱量1g瓊脂糖加入到100mL1×TAE緩沖液中，加熱混勻。冷卻后加入2μ8.2.1每個對照和試樣設置2次重復。0ligo(dT)18引物和RNase-FreeddH?O,混勻，65℃孵育5min,冰浴2min。然后加入10μL2×TS反應液，1μL反轉錄酶和1μLgDNARemover,輕輕混勻，42℃孵育30min。85℃加熱5sec終止反應，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.3.1每個對照和試樣PCR擴增設置2次重復。8.3.2按表1依次加入反應試劑，混勻，分裝到PCR管中。410μmol/L上游引物10μmol/L下游引物8.3.3將PCR管放在離心機上，瞬時離心2sec,然后取出PCR管，放入PCR儀中。8.3.4PCR反應程序：94℃預變性3min;94℃變性30sec,退火30sec(CMV58℃,WMV50℃,8.3.5反應結束后取出PCR管，對PCR擴增產物進行電泳檢測。勻，將其倒入電泳槽，插上梳板。室溫下凝固成凝膠后，倒入1×TAE緩沖液中，垂直向上輕輕拔去梳8.4.2電泳結束后，取出瓊脂糖凝膠，置于凝膠成像儀上成像，進行結果分析。如需通過序列分析確認PCR擴增片段是否為目的DNA片段，按照8.4.3的規(guī)定執(zhí)行。8.4.3PCR產物用凝膠回收試劑盒純化目的片段，并在4℃連接至pMD18-T載體，轉化到大腸桿菌感9.1.1判定條件：RT-PCR特異性擴增產物在345bp處有無條帶(參見附錄B中的圖B.2)9.2.1判定條件：RT-PCR產物在485bp處有無條帶(參見附錄B中的圖B.2)9.2.4陽性對照未擴增出WMV特異性條帶，試樣、陰性對照和空白對照擴增出WMV特異性條帶或條帶不清楚。說明檢測結果無效，將實驗中的所有9.3.4陽性對照未擴增出ZYMV特異性條帶，陰性對照和空白對照擴增出ZYMV特異性條帶或條帶不清楚。說明檢測結果無效，將實驗中的所有試劑更換，并重新提取樣品RNA，進行RT-PCR檢測。56(資料性)籽用西葫蘆種子CMV/WMV/ZYMV特異性片段序列A.1CMV特異性片段序列1TTCGATAAGAAGCTTGTTTCGCGCATT50GAAATTTGATTCTACCGTGTGGGTGACGGTCCGTAAAGTTCCTGCCTCT100TCGGACCTGTCC150ACCGGTACTGGTTTATCAGTATGCTGCATC200AATTGTTGTATGATCTTTCGGCGATGCGCGCTGATAT250AAGTACGCCGTTCTCGTGTATTCAAAAGACGATGCTCT300GTTAGTACTTCATGTCGACATCGAGCACCAACGCATTCCCACGTCTA.2WMV特異性片段序列1CCAGTGGCAAAGGTGATAAGCCACAA50CAAGGAACCAACAAAAGCTGGCACAGTCAGCAAAGAT200ATACAAGCCTAATCAAGTTGATTTGTTTAACACTCGAG400AGCAAGTTGAGTACCCACTAAAGCCAATTGTTGAAAATG450TTGAGACAAATCATGCATCATTTCTCAGACGCAGCAA.3ZYMV特異性片段序列1ATGCAGAGGCACCATACATGCCGAGGTATGGTTTGCTTCGAAATCTACG99AAAACTCCTGAAAGAGCCCGCGAAGCTGTTGCGCAGATGAAAGCAGCA197CACCACTAGCGAAGA245AACATGCACACCTTGTTAGGTGTGAACACAATGCAGTA7(資料性)籽用西葫蘆種子CMV/WMV/ZYMVRT-PCR檢測電泳圖B.1籽用西葫蘆種子總RNA電泳圖譜見圖B.1。圖B.1籽用西葫蘆種子總RNA電泳圖B.2籽用西葫蘆種子CMV/WMV/ZYMVRT-PCR檢測電泳圖見圖B.2。34PC1PC2NC1500bp