ICS65.020.01CCSB21DB63青海省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB63/T2288—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由青海省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所、青海省農(nóng)作物種子站、海南州農(nóng)牧業(yè)綜合服務(wù)中心、青海省鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展指導(dǎo)中心。本文件主要起草人：王寒冬、沈?；ⅰ⑼趵?、徐金青、邊海燕、韓文婷、李春橋、薛明珍、王煥強(qiáng)、李俊仁、包天忠、趙璨、王健斌、陳同睿、尤恩、鄧超。本文件由青海省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳監(jiān)督實(shí)施。DB63/T2288—20241青稞品種鑒定技術(shù)規(guī)程SNP分子標(biāo)記法本文件規(guī)定了青稞（HordeumvalgareL.var.nudumHook.f.）品種鑒定SNP分子標(biāo)記方法的術(shù)語(yǔ)和定義、縮略語(yǔ)、儀器設(shè)備及試劑、溶液配制、KASP引物信息、引物選擇、操作程序、數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計(jì)、結(jié)果應(yīng)用等技術(shù)要求。本文件適用于青稞品種及種質(zhì)資源的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/T3543.4農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)GB/T3543.5農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程真實(shí)性和品種純度鑒定GB4404.1糧食作物種子第1部分：禾谷類GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19495.3轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸提取純化方法GB/T30988多酚類植物基因組DNA提取純化及測(cè)試方法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1推薦引物用本文件進(jìn)行品種及種質(zhì)資源鑒定時(shí)選用的一套SNP引物。3.2參照品種具有所用SNP位點(diǎn)上不同等位變異的品種。3.3送檢樣品送到種子檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)的樣品。DB63/T2288—202423.4試驗(yàn)樣品在實(shí)驗(yàn)室中從送檢樣品中分離出來(lái)的部分樣品，供檢驗(yàn)項(xiàng)目使用。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAcid）KASP：競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KompetitiveAlleleSpecificPCR）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）SNP：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性（SingleNucleotidePolymorphism）5儀器設(shè)備及試劑儀器設(shè)備及試劑見附錄A，所用試劑均為分析純。本文件所使用的超純水應(yīng)符合GB/T6682的要求。6溶液配制見附錄B。7KASP引物信息8KASP引物選擇組所有引物進(jìn)行擴(kuò)增。9操作程序9.1樣品準(zhǔn)備按照GB/T3543.5的規(guī)定，送檢樣品質(zhì)量應(yīng)符合GB4404.1糧食作物種子第1部分：禾谷類中對(duì)大麥種子純度的要求。試驗(yàn)樣品的分樣應(yīng)符合GB/T3543.2的規(guī)定。按照GB/T3543.4的規(guī)定進(jìn)行發(fā)芽，供發(fā)芽的籽粒數(shù)須大于等于50粒。植株長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，按單株采取葉片進(jìn)行樣品制備。9.2DNA樣品制備按照GB/T19495.3的方法或采用商用的植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取。每個(gè)送檢品種制備的DNA樣品數(shù)量須大于等于50個(gè)單株；單提、單檢。試驗(yàn)樣品DNA純度、濃度測(cè)試應(yīng)符合GB/T30988的規(guī)定。9.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀SNP分型DB63/T2288—20243SNP分型操作流程如下：a)將2μLDNA樣品編號(hào)后分別加到96孔PCR板上對(duì)應(yīng)編號(hào)的反應(yīng)孔中，每塊PCR板均須加2個(gè)陰性對(duì)照（即用2μL超純水替代DNA樣品，其余所加試劑完全一致）。每塊PCR板只檢測(cè)一個(gè)送檢品種。b)依試驗(yàn)樣品量，按照表1配制KASP基因分型混合液。配制前所有試劑均應(yīng)渦旋振蕩，補(bǔ)足損失的體積。表1KASP基因分型混合液5118c)使用微量移液器將9.3SNP分型操作流程2）中的KASP基因分型混合液分別加入到9.3SNP分型操作流程1）已加入DNA樣品的PCR板上的反應(yīng)孔中，每孔加8μL。d)用熒光透視的膜將PCR板密封，然后轉(zhuǎn)速3000rpm，離心時(shí)間30sec。e)KASP反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，程序設(shè)置見表2。表2實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序1123g)當(dāng)數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)較低，分群較散時(shí)，可以增加循環(huán)后進(jìn)行熒光讀取，同時(shí)保證陰性對(duì)照沒有被擴(kuò)增。程序設(shè)置如下：94℃變性20sec，57℃復(fù)性/延伸60sec，此步驟進(jìn)行3個(gè)循環(huán)。再按照9.3SNP分型操作流程6）進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)的讀取。10數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計(jì)樣品每個(gè)SNP位點(diǎn)的等位變異采用熒光定量PCR儀檢出的熒光信號(hào)表示。通過讀取熒光信號(hào)確定試驗(yàn)樣品在該位點(diǎn)的等位變異并進(jìn)行記錄和統(tǒng)計(jì)。11結(jié)果應(yīng)用當(dāng)送檢品種樣品間差異位點(diǎn)數(shù)大于等于2，則判定為“不同品種”；當(dāng)送檢品種樣品間差異位點(diǎn)數(shù)等于1，判定為“近似品種”；當(dāng)送檢品種樣品間差異位點(diǎn)數(shù)等于0，判定為“極近似品種或相同品種”。DB63/T2288—20244另外，可將試驗(yàn)結(jié)果直接與附錄D參照品種SNP堿基類型進(jìn)行比對(duì)，當(dāng)與參照品種一致時(shí)，可以鑒定為某一品種。DB63/T2288—20245主要儀器設(shè)備及試劑A.1主要儀器設(shè)備實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、電子恒溫不銹鋼水浴鍋、電子天平（精度0.01g、0.0001g各一臺(tái)）、磁力攪拌機(jī)、高速臺(tái)式離心機(jī)、高通量組織研磨儀、微量分光光度計(jì)、高壓滅菌鍋、酸度計(jì)、微量移液器、冰箱。A.2主要試劑乙二胺四乙酸二納、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、十六烷基三甲基溴化銨、β-巰基乙醇、Tris-飽和酚、三氯甲烷、異丙醇、無(wú)水乙醇、2×KASPMastermix、KBDAssaymix、超純水。DB63/T2288—20246溶液配制B.1DNA提取試劑B.1.10.5mol/L乙二胺四乙酸二納鹽（EDTApH8.0）溶液稱取9.305g的EDTA-Na2·2H2O，加40mL超純水，充分溶解，用0.8g~1.1gNaOH固體調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至50ml。在103.4kPa（121℃)條件下滅菌20min，室溫保存。B.1.21mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸（Tris-HClpH8.0）溶液稱取6.06g的Tris，加40ml的超純水，充分溶解。用1.8mL~2.2mL的濃HCl（36%~38%）調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至50ml。滅菌溫度和時(shí)間同B.1.1，室溫保存。B.1.3DNA提取液依次加入十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）8g、氯化鈉32.7g、10mLTris-HCl溶液（pH8.0）（見B.1.2）和4mLEDTA溶液（pH8.0）（見B.1.1），再加入超純水，充分溶解后，用超純水定容至400mL。滅菌溫度和時(shí)間同B.1.1，4℃保存。B.1.410倍DNA溶解液取10mL1mol/LTris-HCl溶液（pH8.0見B.1.2）和2mL0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）（見B.1.1加入超純水，混合均勻，定容至100ml。分裝后滅菌，滅菌溫度和時(shí)間同B.1.1，室溫保存。DB63/T2288—20247推薦KASP引物見表C.1表C.1推薦KASP引物ⅠⅠⅠPrimer_Common:CGCTGGCAGCTCCAⅠⅠⅠⅠⅡⅡPrimer_Common:TCGTGCACGCCⅡ8表C.1推薦KASP引物（續(xù)）ⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡPrimer_Common:CGGAGGCTGⅡⅡⅡPrimer_Common:CCGAAGAGCTCGGⅡ9表C.1推薦KASP引物（續(xù)）ⅡPrimer_Common:CAGGAAGGCGCACCGAⅡPrimer_Common:TGCTGTCCAGTⅡⅡPrimer_Common:GAAGAAGCGGCCCAAⅡPrimer_Common:GAAAGTCTTCGCAAAAAGTDB63/T2288—2024參照品種SNP堿基類型參照品種推薦引物變異位點(diǎn)SNP堿基類型見表D.1表D.1參照品種推薦引物變異位點(diǎn)SNP堿基類型1H_12H_13H_14H_1TRCTMAKCTGGTTGARCYCAKGTGGTTKARCYCAKGTGGTTKTRCYCAKGTGRTCGARCYCAKCTGGTTKARCTCAKGTGRTTGTRCYCAKSYGGTTGTRCYMAKCCGRTTGTRCYMAKSTGGTTKTRYYCAKCCGGTTGTRCYCAKGTGGTCGARCYMAKGTGGTTKTRCYCAKCCGGYCGTRCTMAGCCGGCCGTRCYCAKCCGRCCG昆侖8號(hào)TRCTCAKCCGGTCKTRCTCAKCCGGTCGTACTMAKCTGGTTGTRCYMAKCCGRTTGTRCTCAKCTGGTTGARCYMAKCTGRYTGTACTCAGCTGRCTGTACTCAKCTGGTTG表D.1參照品種推薦引物變異位點(diǎn)SNP堿基類型（續(xù)）5H_16H_17H_1CARGGAGCYGGGKTCAGGRARCYGRRGTCAGGRAGCYGRGTTCAGGGAGCCGGGGTCAGGGARCYGRGTTCARGGARCYGRGKTCAGGGAGYYRGGTTCAGGGAG