miR-143靶向己糖激酶調(diào)控腫瘤糖代謝的機(jī)制與臨床意義探究一、引言1.1研究背景與意義腫瘤，作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。腫瘤細(xì)胞具有獨(dú)特的代謝特征，其中糖代謝異常尤為顯著，這一現(xiàn)象早在20世紀(jì)20年代就被德國(guó)科學(xué)家OttoWarburg所發(fā)現(xiàn)，即著名的“Warburg效應(yīng)”。腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下，也主要通過糖酵解途徑來獲取能量，這種低效的能量代謝方式與正常細(xì)胞有著本質(zhì)的區(qū)別。腫瘤細(xì)胞的糖代謝異常不僅為其快速增殖和生長(zhǎng)提供了能量基礎(chǔ)，還參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移以及免疫逃逸等多個(gè)關(guān)鍵過程。糖酵解產(chǎn)生的大量乳酸會(huì)改變腫瘤微環(huán)境的pH值，使得腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境更加酸性，這種酸性環(huán)境一方面有利于腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，使其更容易突破周圍組織的屏障，向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；另一方面，酸性微環(huán)境還可以抑制免疫細(xì)胞的活性，如T細(xì)胞、NK細(xì)胞等，從而幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。腫瘤細(xì)胞異常的糖代謝還會(huì)導(dǎo)致其對(duì)葡萄糖的攝取和利用能力增強(qiáng)，與正常細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)有限的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)一步影響機(jī)體的正常生理功能，導(dǎo)致患者出現(xiàn)消瘦、乏力、貧血等一系列惡病質(zhì)癥狀，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。己糖激酶（Hexokinase，HK）作為糖代謝途徑中的關(guān)鍵限速酶，在腫瘤細(xì)胞的糖代謝異常中發(fā)揮著核心作用。己糖激酶能夠催化葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，從而啟動(dòng)糖酵解和磷酸戊糖途徑，為腫瘤細(xì)胞提供能量和生物合成的前體物質(zhì)。在多種腫瘤中，己糖激酶的表達(dá)水平顯著升高，其活性也明顯增強(qiáng)，這使得腫瘤細(xì)胞能夠更高效地?cái)z取和利用葡萄糖，滿足其快速增殖和生長(zhǎng)的需求。己糖激酶的高表達(dá)還與腫瘤的惡性程度、分期以及患者的預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)己糖激酶的腫瘤患者往往具有更差的生存率和更高的復(fù)發(fā)率。因此，己糖激酶成為了腫瘤治療領(lǐng)域的一個(gè)重要潛在靶點(diǎn)，通過抑制己糖激酶的活性或表達(dá)，有望阻斷腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，它們通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA參與了生物體的多種生理和病理過程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝等。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miRNA的表達(dá)譜會(huì)發(fā)生顯著改變，一些miRNA可以作為癌基因促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而另一些則可以作為抑癌基因發(fā)揮抑制腫瘤的作用。越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤糖代謝的調(diào)控中也扮演著重要角色，它們可以通過靶向調(diào)控糖代謝相關(guān)酶的表達(dá)，來影響腫瘤細(xì)胞的糖代謝重編程。miR-143作為一種重要的抑癌miRNA，近年來被發(fā)現(xiàn)與腫瘤糖代謝密切相關(guān)。研究表明，miR-143可以直接靶向己糖激酶，通過抑制己糖激酶的表達(dá)和活性，來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的糖代謝過程。當(dāng)miR-143表達(dá)水平降低時(shí)，己糖激酶的表達(dá)會(huì)相應(yīng)升高，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的糖酵解活性增強(qiáng)，能量供應(yīng)增加，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)；反之，當(dāng)miR-143表達(dá)水平升高時(shí)，己糖激酶的表達(dá)受到抑制，腫瘤細(xì)胞的糖代謝能力下降，其增殖和生長(zhǎng)也會(huì)受到抑制。miR-143還可以通過調(diào)控其他與糖代謝相關(guān)的基因和信號(hào)通路，來間接影響腫瘤細(xì)胞的糖代謝。深入研究miR-143通過靶向己糖激酶調(diào)控腫瘤糖代謝的作用及其機(jī)制，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。從理論層面來看，這有助于我們更深入地理解腫瘤細(xì)胞糖代謝異常的分子機(jī)制，揭示miRNA在腫瘤代謝調(diào)控中的新功能和作用途徑，豐富和完善腫瘤發(fā)生發(fā)展的理論體系。從臨床應(yīng)用角度而言，miR-143有望成為腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)估的新型生物標(biāo)志物。通過檢測(cè)腫瘤組織或患者體液中miR-143的表達(dá)水平，可以輔助醫(yī)生更準(zhǔn)確地診斷腫瘤，判斷腫瘤的惡性程度和預(yù)后情況，為制定個(gè)性化的治療方案提供重要依據(jù)。以miR-143為靶點(diǎn)開發(fā)新型的腫瘤治療策略，如miR-143模擬物、反義寡核苷酸等，有可能為腫瘤的治療帶來新的突破，提高腫瘤患者的生存率和生活質(zhì)量。因此，本研究對(duì)于深入了解腫瘤發(fā)病機(jī)制以及推動(dòng)腫瘤精準(zhǔn)治療的發(fā)展具有重要的意義。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探討miR-143通過靶向己糖激酶調(diào)控腫瘤糖代謝的具體作用機(jī)制，為腫瘤的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。通過一系列實(shí)驗(yàn)，明確miR-143與己糖激酶在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)系，驗(yàn)證miR-143對(duì)己糖激酶的直接靶向作用，解析miR-143調(diào)控腫瘤糖代謝的上下游信號(hào)通路，評(píng)估m(xù)iR-143作為腫瘤治療靶點(diǎn)的可行性和有效性。在研究方法上，本研究創(chuàng)新性地整合了生物信息學(xué)分析、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)以及臨床樣本檢測(cè)。通過構(gòu)建基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)（gNET），整合分析腫瘤miRNA和基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，更全面、準(zhǔn)確地篩選出潛在的miR-143與己糖激酶的調(diào)控關(guān)系，克服了傳統(tǒng)生物信息學(xué)方法僅關(guān)注mRNA水平的局限性。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用基因編輯技術(shù)如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，精準(zhǔn)敲除或過表達(dá)miR-143和己糖激酶基因，深入研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞糖代謝關(guān)鍵指標(biāo)如葡萄糖攝取、乳酸生成、ATP合成等的影響，以及對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的改變。利用動(dòng)物模型模擬腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-143對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用，以及與己糖激酶的相互調(diào)控關(guān)系，為臨床應(yīng)用提供更具說服力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。結(jié)合臨床樣本檢測(cè)，分析miR-143和己糖激酶在腫瘤患者組織和血清中的表達(dá)水平，探討其與腫瘤臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性，為腫瘤的早期診斷、預(yù)后評(píng)估和個(gè)性化治療提供新的生物標(biāo)志物和治療策略。二、miR-143與腫瘤糖代謝的研究基礎(chǔ)2.1miR-143的生物學(xué)特性miR-143屬于微小RNA家族中的一員，其結(jié)構(gòu)具有微小RNA的典型特征。成熟的miR-143是一條長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的單鏈RNA分子，它不具備開放閱讀框，無法編碼蛋白質(zhì)，卻蘊(yùn)含著重要的生物學(xué)信息。從其核苷酸序列來看，具有高度的保守性，在不同物種間，miR-143的序列相似度較高，這暗示著其在進(jìn)化過程中承擔(dān)著關(guān)鍵且保守的生物學(xué)功能。miR-143的生成是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的過程。首先，在細(xì)胞核內(nèi)，由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-143），pri-miR-143通常長(zhǎng)度較大，包含了多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后，在核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8組成的微處理器復(fù)合物的作用下，pri-miR-143被切割成約70-100個(gè)核苷酸的前體miRNA（pre-miR-143），pre-miR-143呈發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。接著，pre-miR-143在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5的協(xié)助下，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miR-143被另一種核酸酶Dicer識(shí)別并進(jìn)一步切割，去除發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)部，最終生成成熟的miR-143。成熟的miR-143會(huì)與AGO蛋白等組裝形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），從而發(fā)揮其對(duì)靶基因的調(diào)控作用。在正常組織中，miR-143呈現(xiàn)出特定的表達(dá)模式，它在多種組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，且表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，參與維持細(xì)胞的正常生理功能。在正常的胃腸道組織中，miR-143能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化，確保胃腸道黏膜細(xì)胞的有序更新，維持胃腸道的正常結(jié)構(gòu)和功能；在心血管系統(tǒng)中，miR-143參與血管平滑肌細(xì)胞的表型調(diào)控，對(duì)血管的舒張和收縮功能起到重要的調(diào)節(jié)作用。然而，在腫瘤組織中，miR-143的表達(dá)水平常常發(fā)生顯著變化，大多數(shù)情況下呈現(xiàn)表達(dá)下調(diào)的趨勢(shì)。研究表明，在結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中，miR-143的表達(dá)量明顯低于正常組織。這種表達(dá)差異與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，低表達(dá)的miR-143使得其對(duì)靶基因的抑制作用減弱，從而導(dǎo)致一系列與腫瘤相關(guān)的生物學(xué)過程失衡，如細(xì)胞增殖失控、凋亡受阻、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)等。作為非編碼RNA，miR-143具有獨(dú)特的特點(diǎn)。它不能編碼蛋白質(zhì)，卻能通過與靶基因mRNA的3'-UTR互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。這種調(diào)控方式具有高度的特異性，一個(gè)miR-143分子可以靶向多個(gè)不同的基因，同時(shí)一個(gè)基因的mRNA也可能受到多個(gè)miRNA的共同調(diào)控，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miR-143的表達(dá)具有組織特異性和時(shí)空特異性，在不同的組織和細(xì)胞類型中，以及在生物體發(fā)育的不同階段，miR-143的表達(dá)水平和功能都可能存在差異。這些特點(diǎn)使得miR-143在生物體內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控中扮演著不可或缺的角色，也為其在腫瘤診斷、治療和預(yù)后評(píng)估等方面的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。2.2腫瘤糖代謝的特征與機(jī)制腫瘤細(xì)胞的糖代謝具有顯著不同于正常細(xì)胞的特征，其中最為突出的是Warburg效應(yīng)，即腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下，也主要通過糖酵解途徑來獲取能量，而不是像正常細(xì)胞那樣進(jìn)行有氧氧化。正常細(xì)胞在有氧環(huán)境中，葡萄糖首先通過糖酵解途徑轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸隨后進(jìn)入線粒體，在丙酮酸脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，進(jìn)而進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)），通過氧化磷酸化產(chǎn)生大量的ATP，每分子葡萄糖徹底氧化可產(chǎn)生約36-38分子ATP。而腫瘤細(xì)胞中，大量的葡萄糖被攝取并通過糖酵解途徑快速代謝為丙酮酸，其中大部分丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下被還原為乳酸，并排出細(xì)胞外，只有少量丙酮酸進(jìn)入線粒體參與TCA循環(huán)，每分子葡萄糖通過糖酵解僅產(chǎn)生2分子ATP。腫瘤細(xì)胞糖酵解產(chǎn)生乳酸的過程非常迅速，其糖酵解能力是正常細(xì)胞的20-30倍。腫瘤細(xì)胞這種異常的糖代謝方式具有多方面的生物學(xué)意義。從能量供應(yīng)角度來看，雖然糖酵解產(chǎn)生ATP的效率較低，但速度快，能夠滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖對(duì)能量的迫切需求。在腫瘤生長(zhǎng)過程中，腫瘤組織內(nèi)部往往存在缺氧微環(huán)境，腫瘤細(xì)胞所處的局部氧濃度較低，這會(huì)限制線粒體的有氧氧化功能。糖酵解不依賴于氧氣，即使在缺氧條件下也能持續(xù)進(jìn)行，為腫瘤細(xì)胞提供能量，保證其生存和增殖。腫瘤細(xì)胞的快速增殖需要大量的生物合成原料，如核苷酸、脂肪酸、氨基酸等，用于合成DNA、RNA、細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)等生物大分子。糖酵解途徑產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，如葡萄糖-6-磷酸、3-磷酸甘油醛等，可以作為原料參與磷酸戊糖途徑和其他合成代謝途徑，為腫瘤細(xì)胞的生物合成提供豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)。葡萄糖-6-磷酸可以進(jìn)入磷酸戊糖途徑，產(chǎn)生核糖-5-磷酸用于核苷酸的合成，同時(shí)產(chǎn)生的NADPH為脂肪酸和膽固醇的合成提供還原當(dāng)量；3-磷酸甘油醛可以轉(zhuǎn)化為磷酸二羥丙酮，進(jìn)一步合成甘油，與脂肪酸結(jié)合形成甘油三酯，用于細(xì)胞膜的構(gòu)建。腫瘤細(xì)胞通過糖酵解還可以獲取一些特殊的代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生存和發(fā)展具有重要作用。腫瘤細(xì)胞通過糖酵解產(chǎn)生大量乳酸，乳酸可以被腫瘤細(xì)胞利用作為能量來源，還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的酸堿度，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。乳酸使腫瘤微環(huán)境酸化，這種酸性環(huán)境一方面可以激活一些蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移開辟道路；另一方面，酸性環(huán)境可以抑制免疫細(xì)胞的活性，如T細(xì)胞、NK細(xì)胞等，幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。腫瘤細(xì)胞糖代謝異常的發(fā)生機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多個(gè)層面的調(diào)控異常。在基因水平上，癌基因的激活和抑癌基因的失活在腫瘤糖代謝異常中起著關(guān)鍵作用。Ras、Myc、PI3K/Akt等癌基因的激活可以上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如GLUT1、GLUT3等）和糖酵解關(guān)鍵酶（如己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶等）的表達(dá)，促進(jìn)葡萄糖的攝取和糖酵解的進(jìn)行。Ras基因激活后，可以通過Raf-MEK-ERK信號(hào)通路，上調(diào)GLUT1的表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取；Myc基因可以直接結(jié)合到己糖激酶2（HK2）、磷酸果糖激酶1（PFK1）等糖酵解關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)糖酵解活性。而PTEN、p53等抑癌基因的失活則會(huì)解除對(duì)糖代謝的抑制作用，導(dǎo)致糖代謝異常。PTEN是一種磷酸酶，可以通過去磷酸化作用抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，當(dāng)PTEN失活時(shí)，PI3K/Akt信號(hào)通路被過度激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的糖代謝；p53作為一種重要的抑癌基因，能夠直接或間接調(diào)控多個(gè)糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，如抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1、GLUT4的表達(dá)，下調(diào)己糖激酶HK1、HK2的活性等，當(dāng)p53基因發(fā)生突變或缺失時(shí)，其對(duì)糖代謝的調(diào)控作用喪失，腫瘤細(xì)胞的糖酵解活性增強(qiáng)。腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境因素，如缺氧、酸性環(huán)境等，也會(huì)對(duì)糖代謝產(chǎn)生重要影響。腫瘤組織生長(zhǎng)迅速，其血管生成往往相對(duì)滯后，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部局部缺氧。缺氧條件下，缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）會(huì)大量表達(dá)并穩(wěn)定。HIF-1α是一種轉(zhuǎn)錄因子，可以與許多糖代謝相關(guān)基因的缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如GLUT1、GLUT3）、糖酵解關(guān)鍵酶（如HK2、PFK1、丙酮酸激酶M2等）以及乳酸脫氫酶A（LDHA）等基因的轉(zhuǎn)錄，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的糖酵解能力。腫瘤細(xì)胞通過糖酵解產(chǎn)生大量乳酸，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境酸化。酸性環(huán)境可以激活一些信號(hào)通路，如NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)一步上調(diào)糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，維持腫瘤細(xì)胞的糖酵解活性。酸性環(huán)境還可以影響腫瘤細(xì)胞表面的離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取和乳酸的排出，適應(yīng)腫瘤細(xì)胞的代謝需求。腫瘤細(xì)胞的代謝重編程還與代謝酶的異常表達(dá)和活性改變密切相關(guān)。除了上述提到的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解關(guān)鍵酶外，一些參與三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑等其他糖代謝途徑的酶也會(huì)發(fā)生表達(dá)和活性的變化。在腫瘤細(xì)胞中，丙酮酸脫氫酶激酶（PDK）的表達(dá)上調(diào)，PDK可以磷酸化丙酮酸脫氫酶（PDH），使其失活，從而抑制丙酮酸進(jìn)入線粒體參與三羧酸循環(huán)，促使丙酮酸更多地轉(zhuǎn)化為乳酸，增強(qiáng)糖酵解；磷酸戊糖途徑中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）表達(dá)升高，為腫瘤細(xì)胞的生物合成提供更多的NADPH和核糖-5-磷酸。2.3miR-143與腫瘤關(guān)系的研究現(xiàn)狀近年來，miR-143與腫瘤的關(guān)系成為了腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，眾多研究揭示了miR-143在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等多個(gè)關(guān)鍵過程中發(fā)揮著重要作用。在腫瘤發(fā)生階段，大量研究表明miR-143在多種腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，這種低表達(dá)與腫瘤的起始密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌中，相關(guān)研究通過對(duì)大量臨床樣本的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中miR-143的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織。進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)表明，miR-143表達(dá)的降低會(huì)導(dǎo)致其對(duì)下游靶基因的抑制作用減弱，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)miR-143可以靶向抑制KRAS基因的表達(dá)，當(dāng)miR-143表達(dá)下調(diào)時(shí)，KRAS基因表達(dá)升高，激活下游的Raf-MEK-ERK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。在乳腺癌中，同樣存在miR-143的低表達(dá)現(xiàn)象，且其表達(dá)水平與乳腺癌的組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)。低表達(dá)的miR-143通過調(diào)控相關(guān)靶基因，如c-Myc等，影響細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡，使得乳腺癌細(xì)胞更容易逃脫正常的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，啟動(dòng)腫瘤的發(fā)生過程。在腫瘤發(fā)展過程中，miR-143參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等生物學(xué)行為的調(diào)控。在肝癌細(xì)胞系中，過表達(dá)miR-143可以顯著抑制細(xì)胞的增殖能力，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。其作用機(jī)制主要是通過靶向抑制一些與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的基因，如BCL-2等抗凋亡基因以及CCND1等細(xì)胞周期調(diào)控基因，從而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。miR-143還可以影響腫瘤細(xì)胞的分化狀態(tài)。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，研究發(fā)現(xiàn)miR-143的表達(dá)水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的分化程度呈正相關(guān)，高表達(dá)miR-143可以促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞向正常的神經(jīng)細(xì)胞方向分化，降低其惡性程度。這一過程可能是通過調(diào)控與神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后不良的重要原因之一，miR-143在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中也扮演著關(guān)鍵角色。在肺癌中，miR-143可以通過抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，來阻止腫瘤的轉(zhuǎn)移。研究表明，miR-143可以靶向調(diào)控一些與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的基因和蛋白，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件，而miR-143可以通過抑制MMPs的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。在黑色素瘤中，miR-143還可以通過影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程來調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移。EMT是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要過程，miR-143可以通過抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如Snail、Slug等，阻止上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。值得注意的是，越來越多的研究開始關(guān)注miR-143與腫瘤糖代謝之間的關(guān)聯(lián)。腫瘤細(xì)胞的糖代謝異常是腫瘤的重要特征之一，而miR-143通過對(duì)糖代謝關(guān)鍵酶的調(diào)控，參與了腫瘤細(xì)胞糖代謝的重編程過程。研究發(fā)現(xiàn)，miR-143可以直接靶向己糖激酶，抑制其表達(dá)和活性，從而影響腫瘤細(xì)胞的葡萄糖攝取和糖酵解過程。當(dāng)miR-143表達(dá)降低時(shí)，己糖激酶的表達(dá)升高，腫瘤細(xì)胞的糖酵解活性增強(qiáng)，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供更多的能量和生物合成原料；反之，當(dāng)miR-143表達(dá)升高時(shí)，己糖激酶的表達(dá)受到抑制，腫瘤細(xì)胞的糖代謝能力下降，其生長(zhǎng)和增殖也會(huì)受到抑制。miR-143還可能通過調(diào)控其他與糖代謝相關(guān)的基因和信號(hào)通路，如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、磷酸戊糖途徑相關(guān)酶等，間接影響腫瘤細(xì)胞的糖代謝。這些研究為深入理解腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及尋找新的腫瘤治療靶點(diǎn)提供了重要的線索。三、己糖激酶在腫瘤糖代謝中的關(guān)鍵作用3.1己糖激酶的生物學(xué)特性己糖激酶（Hexokinase，HK）是一類能夠催化己糖（主要是葡萄糖）磷酸化生成己糖-6-磷酸的酶，在糖代謝過程中占據(jù)著核心地位。從結(jié)構(gòu)上看，己糖激酶具有較為復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，其空間構(gòu)象以片層結(jié)構(gòu)為主，這種結(jié)構(gòu)為其發(fā)揮酶活性提供了基礎(chǔ)。在哺乳類動(dòng)物體內(nèi)，己糖激酶存在四種不同的同工酶，分別為HKⅠ、HKⅡ、HKⅢ和HKⅣ。HKⅠ主要在腦組織中高表達(dá)，同時(shí)在外周血及骨髓細(xì)胞中也有少量分布。它與葡萄糖具有高度的親和力，其米氏常數(shù)（Km）較小，這意味著在較低的葡萄糖濃度下，HKⅠ就能有效地催化葡萄糖的磷酸化反應(yīng)。HKⅠ的C端與N端序列存在約30%的同源性，這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)暗示了其可能的進(jìn)化起源和功能調(diào)控機(jī)制。研究表明，HKⅠ的活性中心位于C端的一半序列上，用ATP的同功異質(zhì)體（8-azinoATP）處理HKⅠ后，它可以被限制性蛋白水解酶水解成48和52kDa的兩個(gè)片斷，進(jìn)一步證實(shí)了其活性位點(diǎn)的位置。HKⅡ?qū)儆谝葝u素敏感型，主要分布于脂肪及肌組織中，在心臟、骨骼肌等組織中也有微量表達(dá)。它在腫瘤糖代謝研究中備受關(guān)注，因?yàn)槠湓诙喾N腫瘤組織中的表達(dá)和活性顯著升高。HKⅡ的N端及C端序列都各有一個(gè)催化位點(diǎn)，這與HKⅠ的單催化位點(diǎn)不同。HKⅡ可以通過疏水作用色譜分成兩種亞型（HKⅡa和HKⅡb），它們的比率會(huì)隨著細(xì)胞的生理狀態(tài)和分化階段的變化而改變。在分化較好的瘤細(xì)胞中，HKⅡa的含量相對(duì)較高；而在腫瘤細(xì)胞中，微粒型的HKⅡ占比增加。HKⅢ在肝、腎和腸組織中僅有微量表達(dá)。目前對(duì)HKⅢ的研究相對(duì)較少，但其在這些組織中的存在暗示了其在維持局部糖代謝平衡方面可能發(fā)揮著一定的作用。HKⅣ又被稱為葡萄糖激酶，僅在肝臟和胰腺中存在。它與前三種同工酶在結(jié)構(gòu)和功能上存在較大差異。HKⅣ的分子量約為50kDa，明顯小于其他三種同工酶（分子量約為100kDa）。HKⅣ對(duì)葡萄糖具有較高的特異性，其對(duì)底物的親和力較低，Km值約為10mM，而肌肉己糖激酶（如HKⅡ）的Km值僅為0.1mM。HKⅣ不受反應(yīng)產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖的別構(gòu)抑制，這使得其在血糖濃度升高時(shí)，能夠持續(xù)催化葡萄糖的磷酸化反應(yīng)，將多余的葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，從而參與血糖的調(diào)節(jié)。此外，HKⅣ是一種誘導(dǎo)酶，血漿中葡萄糖濃度升高以及胰島素都可以誘導(dǎo)其合成。在正常細(xì)胞中，己糖激酶的活性相對(duì)較低，維持著細(xì)胞正常的糖代謝水平，以滿足細(xì)胞的基本生理需求。正常肝細(xì)胞中的HKⅣ負(fù)責(zé)維持肝臟對(duì)血糖的適度調(diào)節(jié)，在血糖穩(wěn)定時(shí)，其活性保持在一定水平，避免過度消耗葡萄糖。然而，在腫瘤細(xì)胞中，己糖激酶的活性發(fā)生了顯著變化。大量研究表明，在多種腫瘤組織，如肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、食管癌等中，己糖激酶的表達(dá)量和活性均明顯增加。尤其是HKⅡ，在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)最為顯著。腫瘤細(xì)胞中己糖激酶活性的增強(qiáng)，使得腫瘤細(xì)胞能夠更高效地?cái)z取葡萄糖，并將其磷酸化，從而啟動(dòng)糖酵解和磷酸戊糖途徑。這為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供了大量的能量和生物合成前體物質(zhì)，滿足了腫瘤細(xì)胞對(duì)物質(zhì)和能量的高需求。腫瘤細(xì)胞中己糖激酶與線粒體的結(jié)合方式也發(fā)生了改變。在正常組織中，游離型的己糖激酶占主導(dǎo)地位（腦組織除外，其微粒型的HKⅠ占70%以上）；而在腫瘤組織中，微粒型己糖激酶（與線粒體結(jié)合的形式）的比率明顯增加。這種結(jié)合方式的改變使得己糖激酶能夠優(yōu)先利用線粒體生成的ATP，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖磷酸化，進(jìn)一步促進(jìn)了糖酵解的進(jìn)行。己糖激酶在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)和活性增強(qiáng)，以及與線粒體結(jié)合方式的改變，共同推動(dòng)了腫瘤細(xì)胞糖代謝的重編程，使其適應(yīng)了腫瘤快速生長(zhǎng)和增殖的需求。3.2己糖激酶在腫瘤糖代謝中的功能與機(jī)制己糖激酶在腫瘤糖代謝中起著至關(guān)重要的作用，其主要功能是通過催化葡萄糖磷酸化，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，從而啟動(dòng)糖酵解和磷酸戊糖途徑，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和存活提供能量和生物合成原料。從分子機(jī)制角度來看，己糖激酶對(duì)腫瘤細(xì)胞糖代謝的調(diào)控主要體現(xiàn)在多個(gè)關(guān)鍵步驟。己糖激酶能夠高效地催化葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，這是糖酵解途徑的起始步驟，也是限速步驟之一。在正常細(xì)胞中，己糖激酶的活性受到嚴(yán)格調(diào)控，以維持細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝的平衡。然而，在腫瘤細(xì)胞中，由于癌基因的激活和抑癌基因的失活等因素，己糖激酶的表達(dá)和活性顯著增加。在肝癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)癌基因Myc的高表達(dá)可以直接結(jié)合到己糖激酶2（HK2）基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而使HK2的表達(dá)水平大幅升高，增強(qiáng)了葡萄糖磷酸化的速率。這種異常的高表達(dá)使得腫瘤細(xì)胞能夠更快速地?cái)z取葡萄糖，并將其轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，為后續(xù)的糖酵解和其他代謝途徑提供充足的底物。生成的葡萄糖-6-磷酸可以進(jìn)一步進(jìn)入糖酵解途徑，在一系列酶的作用下，逐步分解為丙酮酸。腫瘤細(xì)胞中己糖激酶活性的增強(qiáng)，使得糖酵解途徑的通量顯著增加，丙酮酸的生成速度加快。丙酮酸在腫瘤細(xì)胞中有兩種主要的代謝去向，大部分丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下被還原為乳酸，并排出細(xì)胞外，這一過程不僅可以再生NAD+，維持糖酵解的持續(xù)進(jìn)行，還會(huì)導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境酸化。腫瘤微環(huán)境的酸化有利于腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，因?yàn)樗嵝原h(huán)境可以激活一些蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散提供便利；酸性環(huán)境還能抑制免疫細(xì)胞的活性，幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。少部分丙酮酸則進(jìn)入線粒體，參與三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）。雖然腫瘤細(xì)胞中糖酵解途徑增強(qiáng)，但TCA循環(huán)仍然是細(xì)胞獲取能量的重要途徑之一。腫瘤細(xì)胞通過調(diào)節(jié)丙酮酸進(jìn)入線粒體的速率以及TCA循環(huán)中關(guān)鍵酶的活性，來適應(yīng)其對(duì)能量和生物合成原料的需求。在一些腫瘤細(xì)胞中，丙酮酸脫氫酶激酶（PDK）的表達(dá)上調(diào)，PDK可以磷酸化丙酮酸脫氫酶（PDH），使其失活，從而抑制丙酮酸進(jìn)入線粒體參與TCA循環(huán)，促使丙酮酸更多地轉(zhuǎn)化為乳酸，增強(qiáng)糖酵解。葡萄糖-6-磷酸還可以進(jìn)入磷酸戊糖途徑。磷酸戊糖途徑對(duì)于腫瘤細(xì)胞具有重要意義，它可以產(chǎn)生NADPH和核糖-5-磷酸。NADPH是一種重要的還原當(dāng)量，參與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的多種生物合成反應(yīng)，如脂肪酸和膽固醇的合成，為腫瘤細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞膜和細(xì)胞器提供原料。核糖-5-磷酸則是核苷酸合成的重要前體物質(zhì)，對(duì)于腫瘤細(xì)胞的DNA和RNA合成至關(guān)重要，滿足了腫瘤細(xì)胞快速增殖對(duì)遺傳物質(zhì)合成的需求。在乳腺癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)己糖激酶活性的增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致葡萄糖-6-磷酸更多地進(jìn)入磷酸戊糖途徑，為腫瘤細(xì)胞的增殖提供了大量的NADPH和核糖-5-磷酸。己糖激酶對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活也具有重要影響。腫瘤細(xì)胞的快速增殖需要大量的能量和生物合成原料，己糖激酶通過促進(jìn)糖代謝，為腫瘤細(xì)胞提供了充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，抑制己糖激酶的活性會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降，糖酵解和磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物減少，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力。己糖激酶還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的存活。研究表明，己糖激酶Ⅱ（HKⅡ）可以與線粒體外膜上的電壓依賴性陰離子通道（VDAC）結(jié)合，抑制Bax等促凋亡蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞色素c釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡。在腫瘤細(xì)胞中，HKⅡ與VDAC的結(jié)合增強(qiáng)，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的抵抗能力增強(qiáng)，有利于腫瘤細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。3.3己糖激酶作為腫瘤治療靶點(diǎn)的研究進(jìn)展鑒于己糖激酶在腫瘤糖代謝中的關(guān)鍵作用，以己糖激酶為靶點(diǎn)開發(fā)新型腫瘤治療策略成為了當(dāng)前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。近年來，針對(duì)己糖激酶的抑制劑研發(fā)取得了一定的進(jìn)展，多種己糖激酶抑制劑被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行了深入研究。3-溴丙酮酸（3-bromopyruvate，3-BP）是一種較為經(jīng)典的己糖激酶抑制劑。它能夠與己糖激酶的活性位點(diǎn)緊密結(jié)合，通過共價(jià)修飾的方式不可逆地抑制己糖激酶的活性。3-BP對(duì)多種腫瘤細(xì)胞都具有顯著的抑制作用，在肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，3-BP能夠有效降低己糖激酶的活性，抑制葡萄糖的攝取和糖酵解過程，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)ATP水平急劇下降，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予荷瘤小鼠3-BP治療后，腫瘤的生長(zhǎng)明顯受到抑制，腫瘤體積顯著減小。3-BP也存在一些局限性，其對(duì)正常細(xì)胞也具有一定的毒性，在臨床應(yīng)用中需要嚴(yán)格控制劑量和給藥方式，以避免對(duì)正常組織造成過多的損傷。2-脫氧葡萄糖（2-deoxyglucose，2-DG）是葡萄糖的類似物，它能夠競(jìng)爭(zhēng)性地抑制己糖激酶的活性。2-DG進(jìn)入細(xì)胞后，同樣會(huì)被己糖激酶磷酸化生成2-脫氧葡萄糖-6-磷酸，但該產(chǎn)物不能進(jìn)一步參與糖酵解代謝，從而在細(xì)胞內(nèi)大量積累，反饋抑制己糖激酶的活性，阻斷糖酵解途徑。在乳腺癌細(xì)胞中，2-DG的處理可以顯著降低細(xì)胞的葡萄糖攝取量和乳酸生成量，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在臨床試驗(yàn)中，2-DG聯(lián)合放療或化療用于治療一些惡性腫瘤，取得了一定的療效，能夠提高患者的生存率和生活質(zhì)量。2-DG的療效相對(duì)有限，單獨(dú)使用時(shí)往往難以達(dá)到完全抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果，需要與其他治療方法聯(lián)合使用。Lonidamine（LND）是一種親脂性的小分子化合物，它可以抑制己糖激酶與線粒體的結(jié)合，從而間接抑制己糖激酶的活性。腫瘤細(xì)胞中，己糖激酶與線粒體的結(jié)合對(duì)于維持糖酵解的高效進(jìn)行至關(guān)重要，LND通過破壞這種結(jié)合，干擾了腫瘤細(xì)胞的能量代謝。研究表明，LND對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，在肺癌細(xì)胞中，LND能夠降低腫瘤細(xì)胞的糖酵解活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在一些臨床前研究中，LND與其他抗癌藥物聯(lián)合使用，顯示出協(xié)同增效的作用。然而，LND在臨床試驗(yàn)中的效果仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證，其副作用和耐藥性問題也需要進(jìn)一步研究解決。除了上述抑制劑外，還有一些其他類型的己糖激酶抑制劑正在研究中，如一些天然產(chǎn)物及其衍生物。黃連素是從黃連等植物中提取的一種生物堿，研究發(fā)現(xiàn)黃連素可以通過抑制己糖激酶2（HK2）的表達(dá)和活性，來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的糖代謝。在胃癌細(xì)胞中，黃連素能夠降低HK2的蛋白水平，減少葡萄糖的攝取和乳酸的生成，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。一些小分子干擾RNA（siRNA）和短發(fā)夾RNA（shRNA）也被用于靶向抑制己糖激酶的表達(dá)。通過將針對(duì)己糖激酶的siRNA或shRNA導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，可以特異性地降解己糖激酶的mRNA，從而降低其蛋白表達(dá)水平，抑制腫瘤細(xì)胞的糖代謝和生長(zhǎng)。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，利用shRNA沉默HK2基因后，腫瘤細(xì)胞的糖酵解活性顯著降低，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。盡管以己糖激酶為靶點(diǎn)的治療策略在臨床前研究中取得了一定的成果，但在臨床試驗(yàn)中仍面臨諸多挑戰(zhàn)。腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性是一個(gè)重要問題，不同患者的腫瘤細(xì)胞以及同一腫瘤內(nèi)部不同的細(xì)胞亞群，其己糖激酶的表達(dá)和活性可能存在差異，這導(dǎo)致對(duì)抑制劑的敏感性不同，使得治療效果難以預(yù)測(cè)。腫瘤細(xì)胞容易產(chǎn)生耐藥性，長(zhǎng)期使用己糖激酶抑制劑可能會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞通過上調(diào)其他糖代謝途徑或改變己糖激酶的結(jié)構(gòu)和功能等方式來逃避抑制，從而降低治療效果。抑制劑的毒副作用也是需要關(guān)注的問題，許多己糖激酶抑制劑在抑制腫瘤細(xì)胞糖代謝的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞的代謝產(chǎn)生一定的影響，導(dǎo)致一些不良反應(yīng)的發(fā)生，限制了其臨床應(yīng)用劑量和療程。如何提高抑制劑的特異性和靶向性，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷，以及克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性，是未來以己糖激酶為靶點(diǎn)的腫瘤治療研究需要重點(diǎn)解決的問題。四、miR-143靶向己糖激酶調(diào)控腫瘤糖代謝的作用機(jī)制4.1miR-143與己糖激酶的靶向關(guān)系驗(yàn)證在探究miR-143對(duì)己糖激酶的調(diào)控機(jī)制中，首先需明確兩者之間是否存在直接的靶向關(guān)系。生物信息學(xué)分析是篩選和預(yù)測(cè)miRNA潛在靶基因的重要手段之一。其中，TargetScan軟件被廣泛應(yīng)用于miRNA靶基因的預(yù)測(cè)，它主要基于miRNA種子序列與靶基因mRNA的3'-UTR互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行分析。通過TargetScan軟件對(duì)miR-143的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)己糖激酶基因的3'-UTR區(qū)域存在與miR-143種子序列互補(bǔ)配對(duì)的位點(diǎn)。在預(yù)測(cè)結(jié)果中，miR-143與己糖激酶2（HK2）的3'-UTR序列存在一段高度互補(bǔ)的區(qū)域，這一互補(bǔ)區(qū)域的存在暗示了miR-143可能通過與HK2的3'-UTR結(jié)合，對(duì)HK2的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。除了TargetScan軟件，還運(yùn)用了miRanda等其他生物信息學(xué)工具進(jìn)行輔助預(yù)測(cè)，這些工具從不同的算法和數(shù)據(jù)庫(kù)出發(fā)，對(duì)miR-143與己糖激酶的靶向關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示出一定的一致性，進(jìn)一步增強(qiáng)了預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。然而，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果僅為潛在的靶向關(guān)系，還需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)是驗(yàn)證miRNA與靶基因靶向關(guān)系的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法。該實(shí)驗(yàn)的原理是利用熒光素酶基因作為報(bào)告基因，將靶基因mRNA的3'-UTR區(qū)域克隆到熒光素酶基因的下游，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。當(dāng)該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中后，如果miRNA能夠與靶基因mRNA的3'-UTR結(jié)合，就會(huì)影響熒光素酶基因的表達(dá)，從而改變熒光素酶的活性。在本研究中，首先構(gòu)建了含有己糖激酶3'-UTR序列的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。具體步驟為，通過PCR技術(shù)從基因組DNA中擴(kuò)增出己糖激酶3'-UTR的目的片段，然后將其克隆到熒光素酶報(bào)告載體pGL3中，得到重組質(zhì)粒pGL3-HK-3'-UTR。將該重組質(zhì)粒與miR-143模擬物或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞中的熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染miR-143模擬物和pGL3-HK-3'-UTR重組質(zhì)粒的細(xì)胞中，熒光素酶活性顯著降低。這表明miR-143能夠與己糖激酶3'-UTR序列特異性結(jié)合，抑制熒光素酶基因的表達(dá)，從而證實(shí)了miR-143與己糖激酶之間存在直接的靶向關(guān)系。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種靶向關(guān)系的特異性，構(gòu)建了突變型的己糖激酶3'-UTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。在突變型質(zhì)粒中，將miR-143與己糖激酶3'-UTR的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，使其不能與miR-143正常結(jié)合。將突變型質(zhì)粒與miR-143模擬物共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熒光素酶活性未受到明顯影響。這進(jìn)一步證明了miR-143對(duì)己糖激酶的靶向作用是通過其與己糖激酶3'-UTR的特定互補(bǔ)序列實(shí)現(xiàn)的。除了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，還可以通過RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證miR-143與己糖激酶的靶向關(guān)系。RIP實(shí)驗(yàn)是利用針對(duì)AGO蛋白的抗體，將與AGO蛋白結(jié)合的miRNA-mRNA復(fù)合物沉淀下來，然后通過qRT-PCR檢測(cè)其中是否存在己糖激酶mRNA。如果miR-143與己糖激酶存在靶向關(guān)系，那么在沉淀下來的復(fù)合物中應(yīng)該能夠檢測(cè)到己糖激酶mRNA。在實(shí)驗(yàn)中，將表達(dá)miR-143的細(xì)胞裂解后，加入抗AGO蛋白的抗體進(jìn)行免疫沉淀。經(jīng)過一系列洗滌和處理后，提取沉淀中的RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，在抗AGO蛋白抗體免疫沉淀的復(fù)合物中，能夠檢測(cè)到己糖激酶mRNA，而在對(duì)照組中則未檢測(cè)到明顯的信號(hào)。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-143與己糖激酶在細(xì)胞內(nèi)能夠形成復(fù)合物，從而證明了它們之間的靶向關(guān)系。通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和多種實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，明確了miR-143與己糖激酶之間存在直接的靶向關(guān)系，為后續(xù)深入研究miR-143通過靶向己糖激酶調(diào)控腫瘤糖代謝的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。4.2miR-143對(duì)己糖激酶表達(dá)和活性的影響在明確了miR-143與己糖激酶之間的靶向關(guān)系后，進(jìn)一步探究miR-143對(duì)己糖激酶表達(dá)和活性的具體影響，有助于深入理解其調(diào)控腫瘤糖代謝的分子機(jī)制。通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募?xì)胞實(shí)驗(yàn)，深入研究miR-143對(duì)己糖激酶表達(dá)的調(diào)控作用。在人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組分別轉(zhuǎn)染miR-143模擬物以提高miR-143的表達(dá)水平，或轉(zhuǎn)染miR-143抑制劑以降低miR-143的表達(dá)水平。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)己糖激酶mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染miR-143模擬物的A549和MCF-7細(xì)胞中，己糖激酶mRNA的表達(dá)量相較于對(duì)照組明顯降低；而在轉(zhuǎn)染miR-143抑制劑的細(xì)胞中，己糖激酶mRNA的表達(dá)量則顯著升高。這表明miR-143能夠在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)己糖激酶mRNA的表達(dá)產(chǎn)生影響，且這種影響呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)己糖激酶蛋白的表達(dá)水平，得到了與qRT-PCR結(jié)果一致的結(jié)論。轉(zhuǎn)染miR-143模擬物的細(xì)胞中，己糖激酶蛋白的表達(dá)量明顯下降；轉(zhuǎn)染miR-143抑制劑的細(xì)胞中，己糖激酶蛋白的表達(dá)量顯著增加。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-143對(duì)己糖激酶表達(dá)的抑制作用，不僅體現(xiàn)在mRNA水平，也在蛋白水平上得以體現(xiàn)。深入分析miR-143對(duì)己糖激酶表達(dá)的調(diào)控方式，發(fā)現(xiàn)其主要通過抑制翻譯和降解mRNA兩種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)。miR-143與己糖激酶mRNA的3'-UTR結(jié)合后，能夠招募相關(guān)的蛋白質(zhì)復(fù)合物，如AGO蛋白等，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。RISC中的核酸酶可以切割己糖激酶mRNA，導(dǎo)致其降解，從而減少己糖激酶mRNA的數(shù)量，降低其表達(dá)水平。miR-143與己糖激酶mRNA的結(jié)合還會(huì)阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，抑制翻譯起始過程，使得己糖激酶蛋白的合成受阻，最終導(dǎo)致己糖激酶蛋白的表達(dá)量下降。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-143對(duì)己糖激酶表達(dá)的調(diào)控存在一定的特異性。通過對(duì)不同細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-143對(duì)己糖激酶的調(diào)控作用在多種腫瘤細(xì)胞中普遍存在，但在正常細(xì)胞中，這種調(diào)控作用相對(duì)較弱。在正常的肺上皮細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-143模擬物或抑制劑后，己糖激酶的表達(dá)變化不如腫瘤細(xì)胞明顯。這可能與腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中miR-143的基礎(chǔ)表達(dá)水平以及其他相關(guān)調(diào)控因子的差異有關(guān)。除了對(duì)己糖激酶表達(dá)的影響，miR-143還對(duì)己糖激酶的活性產(chǎn)生重要作用。己糖激酶的活性與其催化葡萄糖磷酸化的能力密切相關(guān)，而這一過程對(duì)于腫瘤細(xì)胞的糖代謝至關(guān)重要。通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖-6-磷酸的生成量來間接反映己糖激酶的活性。在轉(zhuǎn)染miR-143模擬物的腫瘤細(xì)胞中，葡萄糖-6-磷酸的生成量明顯減少，表明己糖激酶的活性受到抑制；而在轉(zhuǎn)染miR-143抑制劑的細(xì)胞中，葡萄糖-6-磷酸的生成量顯著增加，說明己糖激酶的活性增強(qiáng)。這表明miR-143能夠通過調(diào)控己糖激酶的表達(dá)，進(jìn)而影響其活性，最終對(duì)腫瘤細(xì)胞的糖代謝過程產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)miR-143對(duì)己糖激酶活性的影響與相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān)。其中，PI3K/Akt信號(hào)通路在這一過程中發(fā)揮著重要作用。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K/Akt信號(hào)通路通常處于激活狀態(tài)，它可以通過調(diào)節(jié)多種下游分子的表達(dá)和活性，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、代謝等多個(gè)生物學(xué)過程。實(shí)驗(yàn)表明，miR-143可以通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，來間接影響己糖激酶的活性。當(dāng)miR-143表達(dá)水平升高時(shí)，它可以靶向抑制PI3K的表達(dá)，或抑制Akt的磷酸化，從而使PI3K/Akt信號(hào)通路的活性降低。而PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制會(huì)導(dǎo)致下游與己糖激酶活性相關(guān)的分子表達(dá)或活性發(fā)生改變，如減少己糖激酶與線粒體的結(jié)合，降低己糖激酶的穩(wěn)定性等，最終導(dǎo)致己糖激酶的活性下降。反之，當(dāng)miR-143表達(dá)水平降低時(shí)，PI3K/Akt信號(hào)通路的活性增強(qiáng)，己糖激酶的活性也隨之升高。另一條與miR-143調(diào)控己糖激酶活性相關(guān)的信號(hào)通路是MAPK/ERK信號(hào)通路。MAPK/ERK信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖等過程中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-143可以通過調(diào)控MAPK/ERK信號(hào)通路的激活狀態(tài)，來影響己糖激酶的活性。在轉(zhuǎn)染miR-143模擬物的腫瘤細(xì)胞中，MAPK/ERK信號(hào)通路的激活受到抑制，ERK的磷酸化水平降低。而MAPK/ERK信號(hào)通路的抑制會(huì)導(dǎo)致一系列與己糖激酶活性調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶的活性改變，從而影響己糖激酶的活性。具體來說，MAPK/ERK信號(hào)通路的抑制可能會(huì)減少對(duì)己糖激酶基因轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用，或降低己糖激酶蛋白的磷酸化修飾水平，進(jìn)而降低己糖激酶的活性。相反，當(dāng)miR-143表達(dá)水平降低時(shí)，MAPK/ERK信號(hào)通路被激活，己糖激酶的活性增強(qiáng)。miR-143通過抑制翻譯和降解mRNA等方式對(duì)己糖激酶的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響己糖激酶的活性。這種調(diào)控作用與PI3K/Akt、MAPK/ERK等信號(hào)通路密切相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解miR-143通過靶向己糖激酶調(diào)控腫瘤糖代謝的分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.3miR-143靶向己糖激酶對(duì)腫瘤細(xì)胞糖代謝關(guān)鍵指標(biāo)的影響為了深入揭示miR-143通過靶向己糖激酶對(duì)腫瘤細(xì)胞糖代謝的調(diào)控作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞糖代謝的關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行了系統(tǒng)檢測(cè)與分析，這些指標(biāo)包括葡萄糖攝取、乳酸產(chǎn)生以及ATP生成等，它們?cè)诜从衬[瘤細(xì)胞能量代謝狀態(tài)方面具有重要意義。葡萄糖攝取是腫瘤細(xì)胞糖代謝的起始環(huán)節(jié)，也是維持腫瘤細(xì)胞快速增殖的關(guān)鍵步驟。在實(shí)驗(yàn)中，采用2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）攝取實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取能力。2-DG是葡萄糖的類似物，能夠被腫瘤細(xì)胞攝取并磷酸化，但不能進(jìn)一步代謝，從而可以通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)2-DG-6-磷酸的含量來間接反映葡萄糖的攝取量。選取人肝癌細(xì)胞系HepG2和人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29作為研究對(duì)象，將細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-143模擬物轉(zhuǎn)染組和miR-143抑制劑轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，向各組細(xì)胞中加入含有2-DG的培養(yǎng)基，孵育一定時(shí)間后，收集細(xì)胞，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)2-DG-6-磷酸的含量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-143模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)2-DG-6-磷酸的含量顯著降低，表明腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取能力受到抑制；而在miR-143抑制劑轉(zhuǎn)染組中，2-DG-6-磷酸的含量明顯升高，說明腫瘤細(xì)胞的葡萄糖攝取能力增強(qiáng)。這一結(jié)果表明，miR-143可以通過靶向己糖激酶，抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，從而減少糖代謝的底物供應(yīng)，影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-143對(duì)葡萄糖攝取的影響與己糖激酶的表達(dá)水平密切相關(guān)。在miR-143模擬物轉(zhuǎn)染組中，己糖激酶的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致其催化葡萄糖磷酸化的能力下降，從而減少了葡萄糖的攝取；而在miR-143抑制劑轉(zhuǎn)染組中，己糖激酶表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)了葡萄糖的攝取。乳酸產(chǎn)生是腫瘤細(xì)胞糖酵解的重要產(chǎn)物，也是腫瘤細(xì)胞糖代謝異常的一個(gè)重要標(biāo)志。腫瘤細(xì)胞通過糖酵解產(chǎn)生大量乳酸，不僅會(huì)導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境酸化，影響腫瘤細(xì)胞的生存和轉(zhuǎn)移，還會(huì)消耗大量的葡萄糖，為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供能量。采用乳酸檢測(cè)試劑盒來測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中乳酸的含量。同樣以HepG2和HT29細(xì)胞為研究對(duì)象，在轉(zhuǎn)染miR-143模擬物或抑制劑48小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乳酸的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-143模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中的乳酸含量明顯低于對(duì)照組，而miR-143抑制劑轉(zhuǎn)染組的乳酸含量則顯著高于對(duì)照組。這表明miR-143可以抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解過程，減少乳酸的產(chǎn)生。這是因?yàn)閙iR-143靶向抑制己糖激酶的表達(dá)和活性，使得糖酵解途徑的起始步驟受到阻礙，葡萄糖向乳酸的轉(zhuǎn)化減少。乳酸產(chǎn)生的減少也意味著腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用效率降低，能量供應(yīng)減少，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。ATP作為細(xì)胞內(nèi)的主要能量貨幣，其生成量直接反映了細(xì)胞的能量代謝狀態(tài)。采用ATP檢測(cè)試劑盒，利用熒光素酶-熒光素系統(tǒng)來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP的含量。當(dāng)ATP存在時(shí)，熒光素酶可以催化熒光素氧化發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度與ATP含量成正比。在HepG2和HT29細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-143模擬物或抑制劑48小時(shí)后，裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)的ATP，按照ATP檢測(cè)試劑盒的操作流程進(jìn)行檢測(cè)，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ATP的含量。結(jié)果顯示，miR-143模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)ATP的含量顯著低于對(duì)照組，而miR-143抑制劑轉(zhuǎn)染組的ATP含量則明顯高于對(duì)照組。這說明miR-143通過靶向己糖激酶，抑制了腫瘤細(xì)胞的糖代謝過程，導(dǎo)致ATP生成減少。由于ATP是細(xì)胞進(jìn)行各種生命活動(dòng)的能量來源，ATP生成的減少會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為，從而抑制腫瘤的發(fā)展。通過對(duì)葡萄糖攝取、乳酸產(chǎn)生和ATP生成等腫瘤細(xì)胞糖代謝關(guān)鍵指標(biāo)的檢測(cè)與分析，明確了miR-143靶向己糖激酶對(duì)腫瘤細(xì)胞能量代謝具有顯著影響。miR-143可以通過抑制己糖激酶的表達(dá)和活性，減少腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，降低糖酵解過程中乳酸的產(chǎn)生，以及減少ATP的生成，從而改變腫瘤細(xì)胞的能量代謝模式，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。這些結(jié)果為進(jìn)一步理解miR-143在腫瘤糖代謝調(diào)控中的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為以miR-143和己糖激酶為靶點(diǎn)的腫瘤治療策略的開發(fā)提供了理論支持。4.4miR-143靶向己糖激酶調(diào)控腫瘤糖代謝的信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞中，miR-143靶向己糖激酶調(diào)控腫瘤糖代謝的過程涉及多條復(fù)雜的信號(hào)通路，這些信號(hào)通路相互交織，共同調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝和生物學(xué)行為，其中mTOR信號(hào)通路在這一調(diào)控過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇3激酶相關(guān)激酶家族，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、代謝和存活等多個(gè)生物學(xué)過程中起著核心調(diào)控作用。mTOR主要存在于兩種不同的蛋白質(zhì)復(fù)合物中，即mTORC1和mTORC2，它們各自具有獨(dú)特的組成和功能。mTORC1主要由mTOR、Raptor、mLST8等組成，對(duì)氨基酸、生長(zhǎng)因子、能量和氧等細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)敏感，能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)合成、自噬等過程。當(dāng)細(xì)胞外存在充足的生長(zhǎng)因子時(shí)，生長(zhǎng)因子與其受體結(jié)合，激活受體酪氨酸激酶，進(jìn)而激活PI3K/Akt信號(hào)通路。Akt可以直接磷酸化mTORC1復(fù)合物中的Raptor，從而激活mTORC1。mTORC1被激活后，會(huì)磷酸化其下游底物S6K1和4E-BP1，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。S6K1被磷酸化后，能夠激活核糖體蛋白S6，促進(jìn)核糖體的生物發(fā)生和蛋白質(zhì)翻譯的起始；4E-BP1被磷酸化后，會(huì)與真核起始因子4E（eIF4E）解離，使eIF4E能夠與其他起始因子結(jié)合，啟動(dòng)蛋白質(zhì)翻譯過程。mTORC1還可以通過調(diào)節(jié)脂肪酸合成酶（FASN）等脂質(zhì)合成相關(guān)酶的表達(dá)，促進(jìn)脂質(zhì)合成，為細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞處于營(yíng)養(yǎng)缺乏或能量不足的狀態(tài)時(shí)，mTORC1的活性會(huì)受到抑制，從而抑制蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)，啟動(dòng)自噬過程，以維持細(xì)胞的生存。在miR-143靶向己糖激酶調(diào)控腫瘤糖代謝的過程中，mTOR信號(hào)通路與miR-143和己糖激酶之間存在密切的相互作用。研究表明，mTOR信號(hào)通路的激活會(huì)導(dǎo)致miR-143表達(dá)下調(diào)。在乳腺癌細(xì)胞中，當(dāng)通過添加生長(zhǎng)因子或激活PI3K/Akt信號(hào)通路來激活mTOR時(shí)，miR-143的表達(dá)水平顯著降低。這可能是因?yàn)閙TOR激活后，通過一系列下游信號(hào)分子，影響了miR-143基因的轉(zhuǎn)錄或加工過程。mTOR可能通過調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，使其結(jié)合到miR-143基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制miR-143的轉(zhuǎn)錄；mTOR還可能影響miR-143前體的加工和成熟過程，導(dǎo)致成熟miR-143的生成減少。而miR-143表達(dá)下調(diào)會(huì)解除其對(duì)己糖激酶的抑制作用，使得己糖激酶的表達(dá)和活性升高。如前所述，己糖激酶是糖代謝的關(guān)鍵限速酶，其活性升高會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的糖酵解過程，增加葡萄糖的攝取和利用，為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供能量和生物合成原料。相反，當(dāng)miR-143表達(dá)上調(diào)時(shí)，它可以通過抑制己糖激酶的表達(dá)和活性，反饋抑制mTOR信號(hào)通路的激活。在肺癌細(xì)胞中，過表達(dá)miR-143會(huì)導(dǎo)致己糖激酶表達(dá)降低，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的糖代謝。糖代謝的改變會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)和代謝產(chǎn)物水平，這些變化會(huì)作為信號(hào)反饋調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路。當(dāng)腫瘤細(xì)胞的糖代謝受到抑制，細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降，AMP水平升高時(shí)，會(huì)激活A(yù)MP-活化蛋白激酶（AMPK）。AMPK是一種細(xì)胞能量感受器，當(dāng)細(xì)胞能量不足時(shí)被激活。激活的AMPK可以直接磷酸化mTORC1復(fù)合物中的Raptor，抑制mTORC1的活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和生長(zhǎng)。miR-143還可能通過其他間接途徑影響mTOR信號(hào)通路，如調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路中其他關(guān)鍵分子的表達(dá)或活性。除了mTOR信號(hào)通路，PI3K/Akt信號(hào)通路也在miR-143靶向己糖激酶調(diào)控腫瘤糖代謝中發(fā)揮重要作用。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，參與細(xì)胞增殖、存活、代謝等多種生物學(xué)過程。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K/Akt信號(hào)通路常常被異常激活。當(dāng)細(xì)胞表面的生長(zhǎng)因子受體與配體結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化并激活自身的酪氨酸激酶活性，使受體酪氨酸殘基磷酸化。這些磷酸化的酪氨酸殘基可以招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的PI3K，使其激活。激活的PI3K將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3可以招募Akt到細(xì)胞膜上，并在磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）和mTORC2的作用下，使Akt的Thr308和Ser473位點(diǎn)磷酸化，從而激活A(yù)kt。激活的Akt可以磷酸化下游的多種底物，如GSK-3β、FoxO等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和生物學(xué)行為。在miR-143調(diào)控腫瘤糖代謝的過程中，PI3K/Akt信號(hào)通路與miR-143和己糖激酶之間存在相互調(diào)控關(guān)系。一方面，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)己糖激酶的表達(dá)和活性。在肝癌細(xì)胞中，激活PI3K/Akt信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致己糖激酶2（HK2）的表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的糖酵解能力。這可能是因?yàn)锳kt可以磷酸化某些轉(zhuǎn)錄因子，使其結(jié)合到HK2基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)HK2的轉(zhuǎn)錄。另一方面，miR-143可以通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，間接抑制己糖激酶的表達(dá)和活性。研究發(fā)現(xiàn)，miR-143可以靶向抑制PI3K的表達(dá)，或抑制Akt的磷酸化，從而使PI3K/Akt信號(hào)通路的活性降低。當(dāng)PI3K/Akt信號(hào)通路被抑制時(shí)，HK2的表達(dá)和活性也會(huì)隨之下降，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的糖代謝。MAPK/ERK信號(hào)通路同樣參與了miR-143靶向己糖激酶調(diào)控腫瘤糖代謝的過程。MAPK/ERK信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖等過程中起著關(guān)鍵作用。其主要由Ras、Raf、MEK和ERK等組成。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等刺激時(shí)，細(xì)胞表面的受體被激活，通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，激活Ras蛋白。激活的Ras可以招募Raf蛋白到細(xì)胞膜上，使Raf激活。激活的Raf可以磷酸化MEK，使其激活。激活的MEK再磷酸化ERK，使其激活。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Myc等，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞中，MAPK/ERK信號(hào)通路的激活與腫瘤細(xì)胞的增殖和糖代謝密切相關(guān)。研究表明，MAPK/ERK信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)己糖激酶的表達(dá)和活性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的糖酵解能力。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，激活MAPK/ERK信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致己糖激酶的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)葡萄糖的攝取和利用。miR-143可以通過調(diào)控MAPK/ERK信號(hào)通路的激活狀態(tài)，來影響己糖激酶的表達(dá)和活性。在肺癌細(xì)胞中，過表達(dá)miR-143會(huì)抑制MAPK/ERK信號(hào)通路的激活，導(dǎo)致ERK的磷酸化水平降低。MAPK/ERK信號(hào)通路的抑制會(huì)減少對(duì)己糖激酶基因轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用，或降低己糖激酶蛋白的磷酸化修飾水平，進(jìn)而降低己糖激酶的活性，抑制腫瘤細(xì)胞的糖代謝。miR-143靶向己糖激酶調(diào)控腫瘤糖代謝的過程涉及mTOR、PI3K/Akt和MAPK/ERK等多條信號(hào)通路。這些信號(hào)通路之間相互作用、相互影響，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的糖代謝和生物學(xué)行為。深入研究這些信號(hào)通路的作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示miR-143在腫瘤糖代謝調(diào)控中的作用，為腫瘤的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。五、基于miR-143-己糖激酶軸的腫瘤治療潛在策略5.1調(diào)控miR-143表達(dá)的治療策略鑒于miR-143在靶向己糖激酶調(diào)控腫瘤糖代謝中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，通過調(diào)控miR-143的表達(dá)來干預(yù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展成為一種極具潛力的治療策略，目前主要聚焦于基因編輯技術(shù)和小分子化合物兩個(gè)方向。基因編輯技術(shù)在調(diào)控miR-143表達(dá)方面展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和巨大的潛力。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為當(dāng)前最為前沿和高效的基因編輯工具，能夠?qū)蚪M進(jìn)行精準(zhǔn)的修飾。其作用原理是利用向?qū)NA（gRNA）與目標(biāo)DNA序列的互補(bǔ)配對(duì)，引導(dǎo)Cas9核酸酶在特定位置切割DNA雙鏈，從而實(shí)現(xiàn)基因的敲除、插入或替換。在調(diào)控miR-143表達(dá)的研究中，通過設(shè)計(jì)針對(duì)miR-143基因啟動(dòng)子區(qū)域或編碼序列的gRNA，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)miR-143基因的精準(zhǔn)編輯。在腫瘤細(xì)胞系中，利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除miR-143基因的抑制性調(diào)控元件，能夠顯著上調(diào)miR-143的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞中，通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯，去除miR-143基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化修飾位點(diǎn)，使得miR-143基因的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，miR-143的表達(dá)量顯著升高。這一上調(diào)作用進(jìn)一步抑制了己糖激酶的表達(dá)和活性，降低了腫瘤細(xì)胞的糖代謝水平，有效抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力。CRISPR/Cas9技術(shù)還可以用于構(gòu)建miR-143過表達(dá)的細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，為深入研究miR-143的功能和作用機(jī)制提供了有力的工具。除了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALENs）也是較早開發(fā)的基因編輯技術(shù)。ZFNs由鋅指蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸酶結(jié)構(gòu)域組成，鋅指蛋白可以特異性地識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列，核酸酶則負(fù)責(zé)切割DNA雙鏈。TALENs的工作原理與之類似，通過人工設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子（TALE）來識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)DNA序列，再利用核酸酶進(jìn)行切割。這兩種技術(shù)在調(diào)控miR-143表達(dá)方面也有一定的應(yīng)用，在某些腫瘤細(xì)胞中，利用ZFNs或TALENs技術(shù)對(duì)miR-143基因進(jìn)行編輯，成功實(shí)現(xiàn)了miR-143表達(dá)水平的改變。然而，這兩種技術(shù)也存在一些局限性，如設(shè)計(jì)和構(gòu)建過程較為復(fù)雜、脫靶效應(yīng)相對(duì)較高等，在一定程度上限制了它們的廣泛應(yīng)用。相比之下，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為目前調(diào)控miR-143表達(dá)的主要基因編輯技術(shù)。盡管基因編輯技術(shù)在調(diào)控miR-143表達(dá)方面取得了一定的進(jìn)展，但在臨床應(yīng)用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)。基因編輯的安全性是首要關(guān)注的問題，脫靶效應(yīng)可能導(dǎo)致非預(yù)期的基因突變，引發(fā)潛在的不良反應(yīng)，如腫瘤的發(fā)生或其他遺傳疾病的出現(xiàn)。基因編輯載體的遞送效率和靶向性也是亟待解決的難題。如何將基因編輯工具高效地遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)避免對(duì)正常細(xì)胞的影響，是實(shí)現(xiàn)基因編輯技術(shù)臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。目前常用的遞送載體包括病毒載體和非病毒載體。病毒載體如慢病毒、腺病毒等具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但存在免疫原性、插入突變等風(fēng)險(xiǎn)；非病毒載體如脂質(zhì)體、納米顆粒等雖然安全性較高，但轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低。因此，開發(fā)安全、高效、靶向性強(qiáng)的基因編輯載體遞送系統(tǒng)是未來研究的重點(diǎn)方向之一。小分子化合物作為一種相對(duì)傳統(tǒng)但仍具潛力的調(diào)控手段，在調(diào)節(jié)miR-143表達(dá)方面也有相關(guān)研究。一些天然產(chǎn)物及其衍生物被發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)miR-143的表達(dá)。黃連素是從黃連等植物中提取的一種生物堿，研究表明黃連素可以通過調(diào)節(jié)miR-143的表達(dá)來影響腫瘤細(xì)胞的糖代謝。在胃癌細(xì)胞中，黃連素能夠上調(diào)miR-143的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制己糖激酶的表達(dá)和活性，降低腫瘤細(xì)胞的葡萄糖攝取和乳酸產(chǎn)生，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。其作用機(jī)制可能與黃連素調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路有關(guān)，黃連素可以抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，減少NF-κB與miR-143基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，從而解除對(duì)miR-143基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用。一些合成的小分子化合物也被用于miR-143表達(dá)的調(diào)控研究。通過高通量篩選技術(shù)，研究人員從大量的小分子化合物庫(kù)中篩選出能夠調(diào)節(jié)miR-143表達(dá)的化合物。這些化合物可以通過與細(xì)胞內(nèi)的特定靶點(diǎn)結(jié)合，間接影響miR-143基因的轉(zhuǎn)錄、加工或穩(wěn)定性。某些小分子化合物可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，使其與miR-143基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合發(fā)生改變，從而影響miR-143的表達(dá)。小分子化合物還可以通過影響miR-143前體的加工過程，調(diào)節(jié)成熟miR-143的生成量。小分子化合物在調(diào)控miR-143表達(dá)方面也面臨一些問題。小分子化合物的作用機(jī)制往往較為復(fù)雜，需要深入研究其與細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)的相互作用以及對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響，以明確其調(diào)控miR-143表達(dá)的具體機(jī)制。小分子化合物的特異性和選擇性有待提高，一些小分子化合物可能會(huì)對(duì)其他基因或信號(hào)通路產(chǎn)生非特異性的影響，導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。小分子化合物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)也是需要考慮的因素，包括藥物的吸收、分布、代謝和排泄等過程，需要優(yōu)化小分子化合物的結(jié)構(gòu)和劑型，以提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和生物利用度。5.2針對(duì)miR-143-己糖激酶軸的聯(lián)合治療策略將針對(duì)miR-143-己糖激酶軸的治療策略與傳統(tǒng)的化療、放療和免疫治療等方法相結(jié)合，展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)和協(xié)同作用潛力，為腫瘤治療開辟了新的道路。在聯(lián)合化療方面，化療是目前腫瘤治療的主要手段之一，通過使用化學(xué)藥物來殺死腫瘤細(xì)胞。然而，化療藥物往往存在耐藥性和毒副作用等問題，限制了其療效和臨床應(yīng)用。將針對(duì)miR-143-己糖激酶軸的治療與化療聯(lián)合，可以發(fā)揮協(xié)同增效的作用。在乳腺癌的治療中，化療藥物多柔比星可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的DNA損傷來發(fā)揮抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)聯(lián)合使用miR-143模擬物時(shí)，miR-143可以通過靶向抑制己糖激酶的表達(dá)和活性，降低腫瘤細(xì)胞的糖代謝水平，使腫瘤細(xì)胞對(duì)多柔比星更加敏感。這是因?yàn)樘谴x的改變會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)和修復(fù)能力，使得腫瘤細(xì)胞在受到化療藥物的攻擊時(shí)，更難以維持自身的生存和增殖，從而增強(qiáng)了化療藥物的療效。在結(jié)直腸癌的治療中，氟尿嘧啶是常用的化療藥物，它可以干擾腫瘤細(xì)胞的DNA和RNA合成。聯(lián)合靶向miR-143-己糖激酶軸，通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的糖代謝，能夠增加氟尿嘧啶對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。具體來說，抑制己糖激酶的活性可以減少腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，降低細(xì)胞內(nèi)ATP水平，影響腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制，使氟尿嘧啶更容易發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用。在聯(lián)合放療方面，放療是利用高能射線照射腫瘤組織，通過破壞腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)來達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。放療同樣面臨著腫瘤細(xì)胞對(duì)射線的抵抗以及正常組織受輻射損傷等問題。聯(lián)合靶向miR-143-己糖激酶軸可以顯著提高放療的效果。在肺癌的放療研究中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的糖代謝狀態(tài)與放療敏感性密切相關(guān)。高糖代謝的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的DNA修復(fù)能力和抗凋亡能力，從而對(duì)放療產(chǎn)生抵抗。通過上調(diào)miR-143的表達(dá)，抑制己糖激酶的活性，降低腫瘤細(xì)胞的糖代謝水平，可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。低代謝狀態(tài)下的腫瘤細(xì)胞，其DNA修復(fù)能力下降，在受到射線照射后，更難以修復(fù)受損的DNA，從而更容易發(fā)生凋亡。在頭頸部腫瘤的放療中，聯(lián)合使用miR-143模擬物和放療，可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，提高腫瘤的局部控制率。這是因?yàn)閙iR-143通過調(diào)控己糖激酶，改變了腫瘤細(xì)胞的能量代謝和信號(hào)通路，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的反應(yīng)性增強(qiáng)，同時(shí)減少了正常組織的輻射損傷。在聯(lián)合免疫治療方面，免疫治療是近年來腫瘤治療領(lǐng)域的重大突破，它通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。免疫治療包括免疫檢查點(diǎn)抑制劑、過繼性細(xì)胞免疫治療等多種方式。腫瘤細(xì)胞的糖代謝異常會(huì)影響腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，導(dǎo)致免疫逃逸。聯(lián)合靶向miR-143-己糖激酶軸可以改善腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)免疫治療的效果。在黑色素瘤的免疫治療中，免疫檢查點(diǎn)抑制劑如抗PD-1抗體可以阻斷PD-1與PD-L1的結(jié)合，激活T細(xì)胞的抗腫瘤活性。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)聯(lián)合使用miR-143模擬物時(shí)，miR-143通過抑制己糖激酶的活性，降低腫瘤細(xì)胞的糖酵解水平，減少乳酸的產(chǎn)生，從而改善腫瘤微環(huán)境的酸性，增強(qiáng)T細(xì)胞的浸潤(rùn)和活性。酸性腫瘤微環(huán)境會(huì)抑制T細(xì)胞的功能，而降低乳酸水平可以解除這種抑制，使T細(xì)胞更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。在肝癌的過繼性細(xì)胞免疫治療中，將靶向miR-143-己糖激酶軸與CAR-T細(xì)胞治療相結(jié)合，可以提高CAR-T細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)和殺傷能力。通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的糖代謝，減少腫瘤細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)，為CAR-T細(xì)胞提供更好的生存和發(fā)揮功能的環(huán)境，從而增強(qiáng)免疫治療的效果。針對(duì)miR-143-己糖激酶軸的聯(lián)合治療策略在腫瘤治療中具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。通過與化療、放療和免疫治療等傳統(tǒng)治療方法相結(jié)合，可以充分發(fā)揮各治療方法的優(yōu)勢(shì)，克服單一治療的局限性，提高腫瘤治療的療效，為腫瘤患者帶來更好的生存希望。未來，需要進(jìn)一步深入研究聯(lián)合治療的最佳方案和作用機(jī)制，優(yōu)化治療策略，以實(shí)現(xiàn)腫瘤的精準(zhǔn)治療和個(gè)體化治療。5.3基于miR-143-己糖激酶軸的藥物研發(fā)前景以miR-143-己糖激酶軸為靶點(diǎn)開發(fā)新型抗癌藥物具有廣闊的前景，但在藥物設(shè)計(jì)、靶點(diǎn)驗(yàn)證和臨床試驗(yàn)等多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)中，也面臨著諸多挑戰(zhàn)。在藥物設(shè)計(jì)方面，基于對(duì)miR-143-己糖激酶軸作用機(jī)制的深入理解，為藥物設(shè)計(jì)提供了明確的方向。可以設(shè)計(jì)能夠上調(diào)miR-143表達(dá)的小分子化合物，這類化合物可以通過與miR-143基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而增加miR-143的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制己糖激酶的表達(dá)和活性?？梢蚤_發(fā)能夠模擬miR-143功能的核酸類藥物，如miR-143模擬物，它們具有與天然miR-143相似的序列和結(jié)構(gòu)，能夠與己糖激酶mRNA的3'-UTR結(jié)合，阻斷其翻譯過程，達(dá)到抑制己糖激酶表達(dá)的目的。也可以設(shè)計(jì)針對(duì)己糖激酶活性位點(diǎn)的小分子抑制劑，這些抑制劑能夠特異性地與己糖激酶的活性中心結(jié)合，抑制其催化葡萄糖磷酸化的活性，從而阻斷腫瘤細(xì)胞的糖代謝途徑。在實(shí)際的藥物設(shè)計(jì)過程中，面臨著巨大的挑戰(zhàn)。藥物分子需要具備良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，包括在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄等過程，以確保藥物能夠有效地到達(dá)腫瘤組織并發(fā)揮作用。藥物分子還需要具有高度的特異性，避免對(duì)正常細(xì)胞的糖代謝產(chǎn)生不良影響。由于miR-143和己糖激酶在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，與其他基因和信號(hào)通路存在廣泛的相互作用，如何設(shè)計(jì)出只針對(duì)miR-143-己糖激酶軸，而不影響其他正常生理過程的藥物，是藥物設(shè)計(jì)中的難點(diǎn)之一。靶點(diǎn)驗(yàn)證是藥物研發(fā)過程中的關(guān)鍵步驟，對(duì)于基于miR-143-己糖激酶軸的藥物研發(fā)同樣重要。在細(xì)胞水平上，可以利用多種腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行靶點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和肝癌細(xì)胞系HepG2中，通過轉(zhuǎn)染miR-143模擬物或抑制劑，觀察己糖激酶的表達(dá)和活性變化，以及腫瘤細(xì)胞糖代謝相關(guān)指標(biāo)的改變，如葡萄糖攝取、乳酸產(chǎn)生和ATP生成等。還可以通過基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，敲除或過表達(dá)miR-143和己糖激酶基因，進(jìn)一步驗(yàn)證它們之間的靶向關(guān)系和對(duì)腫瘤細(xì)胞糖代謝的影響。在動(dòng)物水平上，構(gòu)建荷瘤小鼠模型，將攜帶miR-143-己糖激酶軸相關(guān)基因修飾的腫瘤細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)，然后給予相應(yīng)的藥物干預(yù)。觀察腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移情況，以及小鼠的生存時(shí)間和生存率等指標(biāo)，以評(píng)估藥物對(duì)miR-143-己糖激酶軸的作用效果。通過免疫組化、Westernblot等技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中miR-143和己糖激酶的表達(dá)水平，以及相關(guān)信號(hào)通路分子的活性變化，進(jìn)一步驗(yàn)證靶點(diǎn)的有效性。在靶點(diǎn)驗(yàn)證過程中，存在一些問題需要解決。腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性是一個(gè)重要因素，不同患者的腫瘤細(xì)胞以及同一腫瘤內(nèi)部不同的細(xì)胞亞群，其miR-143和己糖激酶的表達(dá)和活性可能存在差異，這會(huì)影響靶點(diǎn)驗(yàn)證的準(zhǔn)確性和可靠性。動(dòng)物模型與人類腫瘤之間存在一定的差