乳酸菌DM9054與DM9057安全性多維度評(píng)估及應(yīng)用前景探究一、引言1.1乳酸菌的研究背景與意義乳酸菌（LacticAcidBacteria，LAB）是一類能利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱，其在自然界分布廣泛，具有豐富的物種多樣性，至少包含18個(gè)屬，共200多種。從分類學(xué)角度來看，乳酸菌涵蓋了乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬等多個(gè)屬。這些微生物在食品、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在食品領(lǐng)域，乳酸菌堪稱“發(fā)酵大師”。以酸奶的制作為例，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為經(jīng)典的乳酸菌組合，在發(fā)酵過程中，它們將牛奶中的乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸，不僅賦予了酸奶獨(dú)特的酸味和細(xì)膩的口感，還降低了酸奶的pH值，抑制了有害微生物的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了酸奶的保質(zhì)期。在泡菜的腌制過程中，植物乳桿菌等乳酸菌利用蔬菜中的糖類進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，使得泡菜具有酸爽可口的風(fēng)味，同時(shí)，乳酸菌還能合成維生素、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高了泡菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。此外，在發(fā)酵肉制品中，乳酸菌的產(chǎn)酸作用不僅可以抑制雜菌生長(zhǎng)，防止肉色變綠和脂肪氧化，還能將NO-2還原成NO，NO與肉中肌紅蛋白結(jié)合，賦予肉制品明亮的鮮紅色，如在傳統(tǒng)的意大利薩拉米香腸制作中，乳酸菌就發(fā)揮了重要作用。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，乳酸菌是人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的一部分，被譽(yù)為“腸道健康衛(wèi)士”。人體腸道內(nèi)存在著數(shù)量龐大、種類繁多的微生物群落，乳酸菌作為其中的有益菌，能夠通過多種機(jī)制維持腸道微生態(tài)平衡。乳酸菌可以產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素等物質(zhì)，抑制大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的生長(zhǎng)繁殖；乳酸菌還能通過與腸上皮細(xì)胞緊密結(jié)合，形成生物屏障，阻止有害菌的黏附和入侵；此外，乳酸菌還參與了腸道內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫球蛋白，增強(qiáng)腸道免疫力，預(yù)防和治療腸道感染、腹瀉等疾病。在臨床上，乳酸菌制劑常被用于治療腸道菌群失調(diào)引起的腹瀉、便秘等疾病，如雙歧桿菌四聯(lián)活菌片，它由嬰兒雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌和蠟樣芽孢桿菌組成，能夠有效調(diào)節(jié)腸道菌群，緩解腹瀉癥狀。盡管乳酸菌在各個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛且多數(shù)菌株被認(rèn)為安全可靠，但仍存在一定安全隱患。有研究從心內(nèi)膜炎患者、敗血癥患者、肝膿腫患者和尿路感染病人體內(nèi)分離出乳酸菌，這表明在特定條件下，乳酸菌可能會(huì)引發(fā)疾病，對(duì)人體健康造成威脅。一些乳酸菌菌株可能攜帶耐藥基因，這不僅會(huì)影響其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用效果，還可能導(dǎo)致耐藥基因在環(huán)境中的傳播，增加公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)；部分乳酸菌在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物，如D-乳酸等，若在體內(nèi)積累過多，可能會(huì)對(duì)人體造成不良影響。因此，對(duì)乳酸菌進(jìn)行全面、系統(tǒng)的安全性評(píng)價(jià)至關(guān)重要，這不僅關(guān)系到相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量和安全，也關(guān)系到消費(fèi)者的身體健康和公共衛(wèi)生安全。本研究聚焦于從泡菜中分離出的具有降膽固醇功能的乳酸菌DM9054和具有降血壓功能的乳酸菌DM9057，對(duì)其進(jìn)行深入的安全性評(píng)價(jià)，旨在為這兩株乳酸菌在食品藥品生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)、可靠的參考依據(jù)，推動(dòng)其在相關(guān)領(lǐng)域的安全、有效應(yīng)用。1.2乳酸菌DM9054和DM9057的特性及應(yīng)用潛力乳酸菌DM9054和DM9057分別從泡菜中脫穎而出，成為具有獨(dú)特功能的微生物菌株。泡菜作為一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，富含多種乳酸菌，為篩選具有特定功能的菌株提供了豐富的資源。在眾多乳酸菌中，DM9054和DM9057因其降膽固醇和降血壓的功能而備受關(guān)注。研究表明，乳酸菌DM9054在降膽固醇方面表現(xiàn)出顯著的能力。它能夠通過多種機(jī)制降低膽固醇水平，在模擬人體腸道環(huán)境的實(shí)驗(yàn)中，DM9054可以與膽固醇結(jié)合，減少膽固醇的吸收；還能通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，抑制有害菌的生長(zhǎng)，從而減少膽固醇的合成。在一項(xiàng)對(duì)高膽固醇血癥小鼠的實(shí)驗(yàn)中，灌胃乳酸菌DM9054后，小鼠血清中的總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇水平顯著降低，高密度脂蛋白膽固醇水平有所升高，這表明DM9054對(duì)改善血脂代謝具有積極作用，有望成為預(yù)防和治療心血管疾病的潛在益生菌。乳酸菌DM9057則在降血壓領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的功效。它主要通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的活性來降低血壓。ACE在人體血壓調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，它能夠?qū)⒀芫o張素I轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)烈收縮血管作用的血管緊張素II，從而升高血壓。DM9057產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物可以特異性地抑制ACE的活性，阻斷血管緊張素I向血管緊張素II的轉(zhuǎn)化，使血管舒張，進(jìn)而降低血壓。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給高血壓大鼠灌胃乳酸菌DM9057后，大鼠的血壓明顯下降，且對(duì)心率等生理指標(biāo)無明顯影響，顯示出良好的降血壓效果和安全性。這兩株乳酸菌在功能上表現(xiàn)出色，具有成為功能性食品或藥品原料的巨大潛力。在功能性食品方面，它們可以被添加到酸奶、發(fā)酵乳飲料、益生菌制劑等產(chǎn)品中，為消費(fèi)者提供具有降膽固醇和降血壓功能的健康食品選擇。在藥品領(lǐng)域，經(jīng)過進(jìn)一步的研究和開發(fā)，有望制成治療高膽固醇血癥和高血壓的生物制劑，為相關(guān)疾病的治療提供新的途徑和方法。然而，在將其應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)之前，全面且深入的安全性評(píng)價(jià)是不可或缺的重要環(huán)節(jié)。只有確保其安全性，才能放心地將這兩株乳酸菌推向市場(chǎng)，造福廣大消費(fèi)者。二、乳酸菌安全性評(píng)價(jià)的理論基礎(chǔ)2.1乳酸菌的生物學(xué)特性與分類乳酸菌在微生物世界中占據(jù)著獨(dú)特的地位，其生物學(xué)特性和分類體系是理解這一微生物類群的基礎(chǔ)。從形態(tài)學(xué)角度來看，乳酸菌呈現(xiàn)出多樣化的形態(tài)特征，主要包括球狀和桿狀。鏈球菌屬的乳酸菌細(xì)胞多呈球形或卵圓形，它們常常成對(duì)或成鏈狀排列，在顯微鏡下觀察，這些鏈狀排列的球菌宛如一串串微小的珍珠，這種排列方式與其生長(zhǎng)繁殖過程中的分裂方式密切相關(guān)。乳桿菌屬的乳酸菌則以桿狀形態(tài)為主，其細(xì)胞形態(tài)多樣，有長(zhǎng)桿狀、短桿狀以及棒桿狀等，這些桿狀細(xì)胞有的單獨(dú)存在，有的則成短鏈排列，猶如一根根微小的短棍相互連接。雙歧桿菌屬的乳酸菌細(xì)胞形態(tài)更為獨(dú)特，常呈現(xiàn)出Y字型、V字型、彎曲狀或勺型，典型的分叉桿菌形態(tài)使其在眾多乳酸菌中易于辨認(rèn)，這種獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)與其在人體腸道內(nèi)的定殖和功能發(fā)揮有著緊密的聯(lián)系。在代謝類型方面，乳酸菌主要為化能異養(yǎng)型微生物，這意味著它們需要從外界環(huán)境中攝取有機(jī)化合物來獲取能量和碳源。在碳源利用上，乳酸菌對(duì)糖類表現(xiàn)出較高的親和力和利用能力，它們能夠利用多種糖類進(jìn)行代謝活動(dòng)。不同乳酸菌對(duì)糖類的利用偏好存在差異，多數(shù)乳酸菌利用單糖的能力優(yōu)于雙糖，利用己糖的能力優(yōu)于戊糖，并且只有少數(shù)乳酸菌能夠利用淀粉。在氮源需求上，由于乳酸菌的蛋白酶活性相對(duì)較弱，它們主要依賴蛋白質(zhì)水解物，如游離氨基酸和多肽等作為氮源，因此在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)乳酸菌時(shí)，通常需要在培養(yǎng)基中添加富含肽類和氨基酸的物質(zhì)，如蛋白胨、酵母膏和牛肉膏等，以滿足其生長(zhǎng)繁殖的需求。在乳制品發(fā)酵過程中，乳酸菌能夠通過細(xì)胞膜上的絲氨酸蛋白酶將乳品中的酪蛋白水解成小肽，然后將這些小肽運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)一步由各種肽酶降解成游離氨基酸，為自身的生長(zhǎng)提供氮源。根據(jù)發(fā)酵類型的不同，乳酸菌可分為同型發(fā)酵乳酸菌和異型發(fā)酵乳酸菌。同型發(fā)酵乳酸菌在代謝過程中，通過糖酵解途徑將己糖（如葡萄糖）全部轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化下進(jìn)一步還原為乳酸，理論上1mol己糖可凈獲得2mol乳酸，德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌和卷曲乳桿菌等都屬于這一類型。異型發(fā)酵乳酸菌則通過6-磷酸葡萄糖酸/磷酸酮糖途徑代謝己糖或戊糖，生成乳酸、乙酸（或乙醇）和CO2，例如明串珠菌、魏斯氏菌和酒球菌等，它們?cè)谙?mol葡萄糖時(shí)，會(huì)產(chǎn)生1mol乳酸、1mol乙醇和1molCO2。乳酸菌的發(fā)酵類型并非絕對(duì)固定，在不同的環(huán)境條件下，其代謝途徑可能會(huì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致代謝終產(chǎn)物的變化，這也使得乳酸菌在不同的應(yīng)用場(chǎng)景中展現(xiàn)出多樣化的功能。在分類學(xué)上，乳酸菌的分類較為復(fù)雜且不斷發(fā)展。依據(jù)2018年的資料數(shù)據(jù)，在國(guó)際公認(rèn)的伯杰氏系統(tǒng)中，已發(fā)現(xiàn)的乳酸菌涵蓋了43個(gè)屬，廣泛分布于細(xì)菌界的五個(gè)門，分別是熱孢菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和梭桿菌門。厚壁菌門包含了30個(gè)屬，是乳酸菌分布最為集中的門之一，其中乳桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬等都屬于厚壁菌門；放線菌門中有7個(gè)屬的乳酸菌，雙歧桿菌屬就隸屬于放線菌門。這些不同屬的乳酸菌在生物學(xué)特性、代謝途徑以及功能上都存在一定的差異，它們共同構(gòu)成了乳酸菌這一豐富多樣的微生物類群，在自然界的物質(zhì)循環(huán)和生態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用，也為其在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了廣闊的空間。2.2乳酸菌安全性問題的提出與研究現(xiàn)狀乳酸菌在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，使得其安全性問題逐漸成為研究焦點(diǎn)。雖然乳酸菌在多數(shù)情況下被認(rèn)為是安全的，但在一些特定病例中，乳酸菌的分離引發(fā)了人們對(duì)其安全性的關(guān)注。從心內(nèi)膜炎患者的血液樣本中，研究人員分離出了乳酸菌，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些乳酸菌能夠在心臟瓣膜上黏附并形成生物膜，導(dǎo)致心內(nèi)膜炎的發(fā)生。在敗血癥患者的血液以及肝膿腫患者的膿液中，也檢測(cè)到了乳酸菌的存在，這表明乳酸菌在一定條件下可能突破人體的免疫防線，引發(fā)全身性感染或局部膿腫。還有研究報(bào)道在尿路感染病人體內(nèi)分離出乳酸菌，雖然尿路感染通常由大腸桿菌等常見病原菌引起，但乳酸菌的出現(xiàn)提示了其在泌尿系統(tǒng)中也可能成為潛在的致病因素。這些病例的出現(xiàn)，打破了乳酸菌絕對(duì)安全的傳統(tǒng)認(rèn)知，促使科研人員對(duì)乳酸菌的安全性進(jìn)行更深入的研究。國(guó)際上針對(duì)乳酸菌安全性評(píng)價(jià)的研究不斷推進(jìn)，在耐藥性方面，大量研究聚焦于乳酸菌耐藥基因的檢測(cè)和分析。通過對(duì)不同來源乳酸菌的研究發(fā)現(xiàn)，一些乳酸菌攜帶耐藥基因，如紅霉素耐藥基因ermA、ermB和四環(huán)素耐藥基因tetM、tetK等。這些耐藥基因的存在不僅可能影響乳酸菌自身在治療感染性疾病時(shí)的療效，還存在耐藥基因轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，即通過水平基因轉(zhuǎn)移的方式，將耐藥基因傳遞給其他病原菌，使得原本對(duì)這些抗生素敏感的病原菌獲得耐藥性，從而增加了臨床治療的難度和公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。在食品發(fā)酵過程中，攜帶耐藥基因的乳酸菌可能會(huì)將耐藥基因傳遞給環(huán)境中的其他微生物，導(dǎo)致耐藥基因在食物鏈中的傳播。對(duì)于乳酸菌代謝產(chǎn)物安全性的研究也在逐步深入。乳酸菌在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，除了乳酸等常見產(chǎn)物外，還可能產(chǎn)生一些潛在有害的代謝產(chǎn)物，如D-乳酸。D-乳酸在人體內(nèi)的代謝途徑與L-乳酸不同，若大量積累，可能會(huì)導(dǎo)致代謝性酸中毒等健康問題。一些乳酸菌還可能產(chǎn)生生物胺，生物胺是一類具有生物活性的含氮有機(jī)化合物，適量的生物胺對(duì)人體生理功能有一定調(diào)節(jié)作用，但過量攝入則可能引發(fā)頭痛、心悸、血壓變化等不良反應(yīng)。酪胺是一種常見的生物胺，某些乳酸菌在發(fā)酵富含蛋白質(zhì)的食品時(shí)，會(huì)將酪氨酸脫羧形成酪胺，若食品中酪胺含量過高，食用后可能會(huì)對(duì)人體健康造成危害。國(guó)際上的這些研究進(jìn)展，為全面認(rèn)識(shí)乳酸菌的安全性提供了重要依據(jù)，也為后續(xù)的安全性評(píng)價(jià)工作指明了方向。二、乳酸菌安全性評(píng)價(jià)的理論基礎(chǔ)2.3乳酸菌安全性評(píng)價(jià)的指標(biāo)與方法體系構(gòu)建2.3.1毒理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)毒理學(xué)評(píng)價(jià)在乳酸菌安全性評(píng)估中占據(jù)著核心地位，它猶如一把精準(zhǔn)的“標(biāo)尺”，能夠深入衡量乳酸菌對(duì)生物體的潛在毒性影響。急性毒性試驗(yàn)作為毒理學(xué)評(píng)價(jià)的重要起點(diǎn)，通過一次性給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較大劑量的乳酸菌，來觀察動(dòng)物在短時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)過程中，研究人員會(huì)密切關(guān)注動(dòng)物的體重變化，若動(dòng)物體重在短期內(nèi)出現(xiàn)明顯下降，可能意味著乳酸菌對(duì)其生理機(jī)能產(chǎn)生了負(fù)面影響；同時(shí)，觀察動(dòng)物的行為表現(xiàn)也是關(guān)鍵，比如動(dòng)物是否出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、抽搐等異常行為，這些都可能是乳酸菌毒性作用的外在表現(xiàn)；對(duì)動(dòng)物進(jìn)食和飲水情況的監(jiān)測(cè)也不容忽視，若動(dòng)物食量和飲水量大幅減少，可能暗示乳酸菌對(duì)其消化系統(tǒng)或整體健康狀況造成了不良影響。通過急性毒性試驗(yàn)，能夠快速獲取乳酸菌在高劑量下對(duì)生物體的急性危害程度，為后續(xù)的安全性評(píng)價(jià)提供重要的初步依據(jù)。遺傳毒性試驗(yàn)則從基因?qū)用娼沂救樗峋鷮?duì)生物體遺傳物質(zhì)的潛在影響。Ames試驗(yàn)是遺傳毒性試驗(yàn)中的經(jīng)典方法之一，它利用鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，在含待檢測(cè)乳酸菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如果乳酸菌具有致突變性，就可能使沙門氏菌發(fā)生基因突變，恢復(fù)合成組氨酸的能力，從而在不含組氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。通過觀察培養(yǎng)基上菌落的生長(zhǎng)情況，就能判斷乳酸菌是否具有致突變作用。小鼠骨髓微核試驗(yàn)也是常用的遺傳毒性檢測(cè)方法，給小鼠灌胃乳酸菌后，取其骨髓細(xì)胞進(jìn)行涂片染色，在顯微鏡下觀察微核的形成情況。微核是染色體或染色單體的無著絲粒斷片在細(xì)胞分裂后期不能向兩極移動(dòng)，而滯留在細(xì)胞質(zhì)中形成的圓形或橢圓形小體，若微核數(shù)量增多，表明乳酸菌可能導(dǎo)致了染色體損傷，具有潛在的遺傳毒性。致畸試驗(yàn)聚焦于乳酸菌對(duì)胚胎發(fā)育的影響。在實(shí)驗(yàn)中，通常選用懷孕的大鼠或小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在其孕期給予不同劑量的乳酸菌。然后，在特定時(shí)間點(diǎn)解剖母鼠，觀察胎鼠的外觀、骨骼和內(nèi)臟發(fā)育情況。觀察胎鼠是否存在外觀畸形，如肢體殘缺、腭裂、脊柱裂等；對(duì)胎鼠進(jìn)行骨骼染色，檢查骨骼發(fā)育是否正常，有無骨骼畸形或發(fā)育不全；通過解剖觀察胎鼠的內(nèi)臟器官，如心臟、肝臟、腎臟等，判斷是否存在內(nèi)臟畸形或發(fā)育異常。若發(fā)現(xiàn)胎鼠出現(xiàn)這些異常情況，說明乳酸菌可能具有致畸性，會(huì)對(duì)胚胎的正常發(fā)育產(chǎn)生不良影響。這些毒理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)相互關(guān)聯(lián)、層層遞進(jìn)，從不同角度全面評(píng)估乳酸菌的安全性，為乳酸菌在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的安全保障。2.3.2耐藥性評(píng)價(jià)方法耐藥性評(píng)價(jià)是乳酸菌安全性評(píng)價(jià)的重要環(huán)節(jié)，它關(guān)乎乳酸菌在實(shí)際應(yīng)用中的有效性以及對(duì)公共衛(wèi)生安全的潛在影響。藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法，即K-B法，是耐藥性檢測(cè)的常用方法之一。其原理基于抗生素在培養(yǎng)基中的擴(kuò)散特性以及乳酸菌對(duì)不同抗生素的敏感性差異。在實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，首先將乳酸菌均勻涂布在M-H培養(yǎng)基表面，使其在培養(yǎng)基上均勻分布。然后，將含有不同種類和濃度抗生素的藥敏紙片放置在已接種乳酸菌的培養(yǎng)基上。在適宜的培養(yǎng)條件下，抗生素會(huì)從藥敏紙片向周圍培養(yǎng)基中擴(kuò)散，形成濃度梯度。如果乳酸菌對(duì)某種抗生素敏感，在藥敏紙片周圍就會(huì)形成一個(gè)透明的抑菌圈，抑菌圈的大小反映了乳酸菌對(duì)該抗生素的敏感程度。抑菌圈越大，說明乳酸菌對(duì)該抗生素越敏感，即該抗生素對(duì)乳酸菌的抑制作用越強(qiáng)；反之，若抑菌圈較小或不存在，表明乳酸菌對(duì)該抗生素具有耐藥性。對(duì)于可轉(zhuǎn)移耐藥質(zhì)粒的檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳法發(fā)揮著關(guān)鍵作用。質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA分子，可攜帶耐藥基因并在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移。在檢測(cè)過程中，首先采用堿裂解法提取乳酸菌中的質(zhì)粒DNA，該方法利用堿性條件使細(xì)菌細(xì)胞壁破裂，釋放出質(zhì)粒DNA。然后，將提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。在電場(chǎng)的作用下，DNA分子會(huì)向正極移動(dòng)，由于不同大小的DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速率不同，較小的DNA分子遷移速度較快，較大的DNA分子遷移速度較慢。通過與已知大小的DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量進(jìn)行對(duì)比，就可以確定提取的質(zhì)粒DNA的大小。為了進(jìn)一步確認(rèn)提取的質(zhì)粒是否攜帶耐藥基因，還需要進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)檢測(cè)，如PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析。通過設(shè)計(jì)針對(duì)特定耐藥基因的引物，對(duì)提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段，說明該質(zhì)?？赡軘y帶相應(yīng)的耐藥基因；再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，與已知耐藥基因序列進(jìn)行比對(duì)，即可準(zhǔn)確確定質(zhì)粒中攜帶的耐藥基因類型。這些耐藥性評(píng)價(jià)方法為深入了解乳酸菌的耐藥特性提供了有力的技術(shù)支持，有助于合理應(yīng)用乳酸菌并有效防控耐藥基因的傳播。2.3.3機(jī)體指標(biāo)評(píng)價(jià)參數(shù)機(jī)體指標(biāo)評(píng)價(jià)參數(shù)能夠從整體上反映生物體對(duì)乳酸菌的反應(yīng)，為乳酸菌的安全性評(píng)價(jià)提供了多維度的信息。血清中丙二醛（MDA）濃度是衡量機(jī)體氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)。當(dāng)乳酸菌進(jìn)入機(jī)體后，若引發(fā)了氧化應(yīng)激反應(yīng)，就會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，MDA作為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其在血清中的濃度會(huì)相應(yīng)升高。在正常生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)存在著抗氧化防御系統(tǒng)，能夠維持氧化與抗氧化的平衡，使MDA濃度保持在相對(duì)穩(wěn)定的水平。當(dāng)乳酸菌對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良影響時(shí)，可能會(huì)破壞這種平衡，導(dǎo)致自由基產(chǎn)生過多，進(jìn)而引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使MDA濃度升高。通過檢測(cè)血清中MDA濃度的變化，就可以間接了解乳酸菌對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響，判斷其是否對(duì)機(jī)體造成了氧化損傷。血清淀粉樣蛋白A（SAA）作為一種急性時(shí)相蛋白，在機(jī)體受到炎癥刺激時(shí)會(huì)迅速升高。當(dāng)乳酸菌被機(jī)體吸收后，如果引起了炎癥反應(yīng)，免疫系統(tǒng)會(huì)被激活，促使肝臟合成和分泌SAA。在炎癥初期，SAA的濃度會(huì)急劇上升，其升高的幅度與炎癥的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。在輕度炎癥反應(yīng)中，SAA濃度可能會(huì)輕度升高；而在嚴(yán)重炎癥情況下，SAA濃度可能會(huì)大幅升高數(shù)倍甚至數(shù)十倍。通過監(jiān)測(cè)血清中SAA濃度的變化，能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)乳酸菌是否引發(fā)了機(jī)體的炎癥反應(yīng)，以及炎癥反應(yīng)的程度，為評(píng)估乳酸菌的安全性提供重要依據(jù)。肝臟中谷胱甘肽（GSH）濃度反映了機(jī)體的抗氧化能力。GSH是一種重要的抗氧化劑，在肝臟中含量豐富，它能夠參與體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，清除自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。當(dāng)乳酸菌對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良影響時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致肝臟中GSH的消耗增加，或者抑制GSH的合成，從而使肝臟中GSH濃度降低。在正常情況下，肝臟中的GSH能夠維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平，保證肝臟的正常功能。當(dāng)乳酸菌引發(fā)氧化應(yīng)激或其他不良效應(yīng)時(shí)，GSH的抗氧化作用被激活，其消耗增加，如果合成不能及時(shí)補(bǔ)充，就會(huì)導(dǎo)致GSH濃度下降。檢測(cè)肝臟中GSH濃度的變化，可以直觀地了解乳酸菌對(duì)機(jī)體抗氧化能力的影響，判斷其對(duì)肝臟健康的潛在威脅。這些機(jī)體指標(biāo)評(píng)價(jià)參數(shù)相互補(bǔ)充，從氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和抗氧化能力等多個(gè)方面全面評(píng)估乳酸菌對(duì)機(jī)體的影響，為乳酸菌的安全性評(píng)價(jià)提供了全面、準(zhǔn)確的依據(jù)。2.3.4有害代謝產(chǎn)物檢測(cè)要點(diǎn)有害代謝產(chǎn)物的檢測(cè)是乳酸菌安全性評(píng)價(jià)中不可或缺的部分，它直接關(guān)系到乳酸菌在實(shí)際應(yīng)用中的安全性。D-乳酸作為乳酸菌代謝的一種產(chǎn)物，在人體內(nèi)的代謝途徑與L-乳酸不同。正常情況下，人體主要代謝L-乳酸，而D-乳酸的代謝能力相對(duì)較弱。當(dāng)乳酸菌大量產(chǎn)生D-乳酸并被人體吸收后，由于人體缺乏有效的代謝途徑，D-乳酸可能會(huì)在體內(nèi)積累。隨著D-乳酸在體內(nèi)的積累，會(huì)導(dǎo)致血液中D-乳酸濃度升高，進(jìn)而引發(fā)代謝性酸中毒。代謝性酸中毒會(huì)影響人體的酸堿平衡，導(dǎo)致一系列生理功能紊亂，如呼吸加快、心律失常、中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制等，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)＜吧８咝б合嗌V法（HPLC）是檢測(cè)D-乳酸的常用方法之一，該方法利用D-乳酸與其他物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)D-乳酸的分離和定量檢測(cè)。通過將樣品注入HPLC系統(tǒng)，在特定的色譜條件下，D-乳酸會(huì)在色譜柱上與其他成分分離，然后通過檢測(cè)器檢測(cè)其濃度，從而準(zhǔn)確測(cè)定樣品中D-乳酸的含量。硝基還原酶和氨基脫羧酶是乳酸菌產(chǎn)生的另外兩種潛在有害酶類。硝基還原酶能夠催化硝基化合物還原，在這個(gè)過程中可能會(huì)產(chǎn)生一些具有致癌性的亞硝胺類物質(zhì)。亞硝胺類物質(zhì)是一類強(qiáng)致癌物質(zhì)，能夠與細(xì)胞內(nèi)的DNA等生物大分子結(jié)合，導(dǎo)致基因突變，增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。氨基脫羧酶則能催化氨基酸脫羧，生成生物胺。生物胺在適量情況下對(duì)人體生理功能有一定調(diào)節(jié)作用，但過量攝入會(huì)對(duì)人體健康造成危害。酪胺是一種常見的生物胺，當(dāng)乳酸菌在富含蛋白質(zhì)的環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，可能會(huì)利用其中的酪氨酸，通過氨基脫羧酶的作用生成酪胺。酪胺具有收縮血管、升高血壓的作用，對(duì)于一些高血壓患者或?qū)野访舾械娜巳簛碚f，過量攝入酪胺可能會(huì)引發(fā)頭痛、心悸、血壓升高等不良反應(yīng)。檢測(cè)硝基還原酶和氨基脫羧酶的活性，通常采用酶活性測(cè)定試劑盒，這些試劑盒利用特定的底物和反應(yīng)體系，通過檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的生成量來間接測(cè)定酶的活性。通過對(duì)這些有害代謝產(chǎn)物的檢測(cè)，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)乳酸菌在代謝過程中可能產(chǎn)生的有害物質(zhì)，評(píng)估其對(duì)人體健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)，為乳酸菌的安全應(yīng)用提供有力保障。2.3.5其他評(píng)價(jià)因素除了上述關(guān)鍵的評(píng)價(jià)指標(biāo)和方法外，還有一些其他因素在乳酸菌安全性評(píng)價(jià)中也具有重要意義。血平板培養(yǎng)基檢測(cè)溶血現(xiàn)象是評(píng)估乳酸菌安全性的直觀方法之一。將乳酸菌接種于血平板培養(yǎng)基上，在適宜的條件下培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察菌落周圍的溶血情況。根據(jù)溶血現(xiàn)象的不同，可以分為α-溶血、β-溶血和γ-溶血。α-溶血表現(xiàn)為菌落周圍出現(xiàn)草綠色溶血環(huán)，這是由于乳酸菌產(chǎn)生的過氧化氫等物質(zhì)使紅細(xì)胞部分溶解，血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，呈現(xiàn)出草綠色；β-溶血?jiǎng)t表現(xiàn)為菌落周圍出現(xiàn)透明的溶血環(huán)，這是因?yàn)槿樗峋a(chǎn)生的溶血素能夠完全破壞紅細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致紅細(xì)胞完全溶解；γ-溶血表示菌落周圍無溶血現(xiàn)象，說明乳酸菌不產(chǎn)生溶血素，對(duì)紅細(xì)胞無破壞作用。其中，β-溶血的乳酸菌可能具有較強(qiáng)的致病性，因?yàn)槠洚a(chǎn)生的溶血素能夠直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對(duì)機(jī)體組織造成損傷。通過血平板培養(yǎng)基檢測(cè)溶血現(xiàn)象，可以初步判斷乳酸菌的潛在致病性，為其安全性評(píng)價(jià)提供重要參考。細(xì)菌易位是指腸道內(nèi)的細(xì)菌通過腸黏膜屏障進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟等腸外組織的過程，檢測(cè)細(xì)菌易位情況對(duì)于評(píng)估乳酸菌的安全性同樣至關(guān)重要。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通常在給予動(dòng)物乳酸菌一段時(shí)間后，將其處死，采集腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟等組織。將這些組織制成勻漿液，然后進(jìn)行梯度稀釋，將不同稀釋度的勻漿液涂布在適宜的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)菌落數(shù)量。如果在腸外組織中檢測(cè)到大量的乳酸菌菌落，說明發(fā)生了細(xì)菌易位現(xiàn)象。細(xì)菌易位可能會(huì)引發(fā)全身性感染，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)發(fā)熱、炎癥反應(yīng)等癥狀，嚴(yán)重影響機(jī)體健康。通過檢測(cè)細(xì)菌易位情況，可以了解乳酸菌在體內(nèi)的分布和遷移情況，評(píng)估其對(duì)機(jī)體的潛在危害，為乳酸菌的安全性評(píng)價(jià)提供更全面的信息。這些其他評(píng)價(jià)因素與前面所述的毒理學(xué)評(píng)價(jià)、耐藥性評(píng)價(jià)、機(jī)體指標(biāo)評(píng)價(jià)以及有害代謝產(chǎn)物檢測(cè)等相互配合，共同構(gòu)成了一個(gè)完整的乳酸菌安全性評(píng)價(jià)體系，為乳酸菌在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的安全應(yīng)用提供了全方位的保障。三、乳酸菌DM9054和DM9057安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1實(shí)驗(yàn)材料與準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)選用的乳酸菌DM9054和DM9057均分離自泡菜，這兩株乳酸菌在前期研究中已被證實(shí)分別具有顯著的降膽固醇和降血壓功能。在實(shí)驗(yàn)前，將保存于甘油管中的乳酸菌菌株接種至MRS培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行活化培養(yǎng)，使其恢復(fù)活性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供充足的菌體。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康的昆明種小鼠，體重在18-22g之間，雌雄各半。小鼠購(gòu)自正規(guī)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，在實(shí)驗(yàn)前，將小鼠置于溫度為22±2℃、相對(duì)濕度為50±10%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，給予充足的食物和水，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循相關(guān)的動(dòng)物倫理和福利準(zhǔn)則，確保實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物的健康和權(quán)益。實(shí)驗(yàn)所用的培養(yǎng)基主要為MRS培養(yǎng)基，其成分包括蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、K?HPO?2g、檸檬酸二銨2g、乙酸鈉5g、葡萄糖20g、吐溫801mL、MgSO??7H?O0.58g、MnSO??4H?O0.25g、瓊脂15-20g（固體培養(yǎng)基時(shí)添加），蒸餾水1000mL。MRS培養(yǎng)基為乳酸菌的生長(zhǎng)提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，滿足其生長(zhǎng)繁殖的需求。在制備培養(yǎng)基時(shí)，嚴(yán)格按照配方準(zhǔn)確稱量各成分，將其溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至6.2-6.6，然后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，冷卻后備用。主要試劑包括藥敏紙片，涵蓋青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素等多種常用抗生素，用于檢測(cè)乳酸菌對(duì)不同抗生素的敏感性；瓊脂糖用于瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)乳酸菌是否含有可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒；丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒、血清淀粉樣蛋白A（SAA）檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽（GSH）檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)動(dòng)物血清和肝臟中的相關(guān)指標(biāo)，評(píng)估乳酸菌對(duì)機(jī)體的影響；D-乳酸檢測(cè)試劑盒、硝基還原酶檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)乳酸菌培養(yǎng)后的菌液中是否含有這些有害代謝產(chǎn)物；此外，還有牛黃脫氧膽酸鈉鹽、BASM培養(yǎng)基等試劑和培養(yǎng)基，用于檢測(cè)乳酸菌是否產(chǎn)生膽鹽羥化酶和氨基脫羧酶。實(shí)驗(yàn)儀器配備了恒溫培養(yǎng)箱，為乳酸菌的培養(yǎng)提供適宜的溫度環(huán)境；超凈工作臺(tái)，保證實(shí)驗(yàn)操作過程中的無菌環(huán)境，防止雜菌污染；離心機(jī)，用于分離和沉淀菌體及其他生物樣品；酶標(biāo)儀，可精確測(cè)定各種生化指標(biāo)的含量，如MDA、SAA、GSH等；電泳儀和電泳槽，用于瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，分析乳酸菌的耐藥質(zhì)粒情況；電子天平，能夠準(zhǔn)確稱量各種試劑和培養(yǎng)基成分；高壓蒸汽滅菌鍋，對(duì)培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)器具等進(jìn)行滅菌處理，確保實(shí)驗(yàn)的無菌條件。這些實(shí)驗(yàn)材料和儀器的準(zhǔn)備，為乳酸菌DM9054和DM9057的安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)提供了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)保障。3.2急性毒性試驗(yàn)方案選取60只健康的昆明種小鼠，隨機(jī)分為3組，每組20只，分別為對(duì)照組、DM9054實(shí)驗(yàn)組和DM9057實(shí)驗(yàn)組。在實(shí)驗(yàn)前，小鼠需禁食不禁水12h，以便更好地觀察灌胃后小鼠的反應(yīng)。對(duì)照組小鼠灌胃等量的無菌生理鹽水，這是實(shí)驗(yàn)中的空白對(duì)照，用于對(duì)比實(shí)驗(yàn)組小鼠的反應(yīng)，排除其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。DM9054實(shí)驗(yàn)組小鼠一次性灌胃含乳酸菌DM9054的菌液，菌液濃度調(diào)整為1×10?CFU/mL，灌胃劑量為0.2mL/10g體重。DM9057實(shí)驗(yàn)組小鼠則一次性灌胃含乳酸菌DM9057的菌液，菌液濃度同樣為1×10?CFU/mL，灌胃劑量也為0.2mL/10g體重。如此高的灌胃劑量是為了在短時(shí)間內(nèi)給予小鼠較大劑量的乳酸菌，以充分觀察乳酸菌在高劑量下對(duì)小鼠是否產(chǎn)生急性毒性反應(yīng)。在灌胃后的14天觀察期內(nèi)，對(duì)小鼠進(jìn)行細(xì)致入微的觀察。每天定時(shí)觀察小鼠的活動(dòng)情況，記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)量、是否活躍、是否有異常的攀爬或跳躍行為等；密切關(guān)注小鼠的精神狀態(tài)，判斷小鼠是否精神萎靡、嗜睡，對(duì)外界刺激的反應(yīng)是否遲鈍等；仔細(xì)記錄小鼠的飲食和飲水情況，觀察小鼠的食量是否減少、飲水量是否變化，以及對(duì)食物和水的偏好是否改變。每天對(duì)小鼠進(jìn)行稱重，精確記錄體重變化，體重的變化可以反映小鼠的營(yíng)養(yǎng)狀況和身體機(jī)能是否受到影響。若小鼠體重持續(xù)下降，可能意味著乳酸菌對(duì)其消化系統(tǒng)或整體健康產(chǎn)生了負(fù)面影響；相反，若體重正常增長(zhǎng)或無明顯變化，則說明乳酸菌對(duì)小鼠的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)攝取未造成明顯干擾。在14天觀察期結(jié)束后，對(duì)所有小鼠進(jìn)行解剖檢查。將小鼠進(jìn)行安樂死后，迅速打開腹腔和胸腔，依次觀察肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺臟等主要內(nèi)臟器官的外觀。觀察肝臟的顏色是否正常，是否有腫大、淤血、變色或出現(xiàn)結(jié)節(jié)等異常情況；檢查脾臟的大小和質(zhì)地，判斷是否有腫大、質(zhì)地變硬或變軟等現(xiàn)象；查看腎臟的形態(tài)和顏色，觀察是否有腫脹、出血點(diǎn)或其他病變；檢查心臟的外觀，判斷心肌是否有肥厚、心臟腔室是否有異常擴(kuò)大等；觀察肺臟的顏色和質(zhì)地，查看是否有淤血、實(shí)變或其他病理變化。對(duì)內(nèi)臟器官進(jìn)行細(xì)致的觸診，感受其質(zhì)地和彈性，進(jìn)一步判斷是否發(fā)生器質(zhì)性病變。通過這些解剖檢查，能夠深入了解乳酸菌對(duì)小鼠內(nèi)臟器官的潛在影響，為評(píng)估其安全性提供直接的依據(jù)。3.3耐藥性評(píng)價(jià)試驗(yàn)流程耐藥性評(píng)價(jià)試驗(yàn)旨在全面檢測(cè)乳酸菌DM9054和DM9057對(duì)常見抗生素的敏感性以及是否攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒，為評(píng)估其在實(shí)際應(yīng)用中的安全性和有效性提供關(guān)鍵依據(jù)。藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法的操作需在超凈工作臺(tái)中嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)范進(jìn)行，以避免雜菌污染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。首先，用無菌移液管吸取0.1mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳酸菌菌液，均勻涂布于M-H培養(yǎng)基表面，確保菌液在培養(yǎng)基上均勻分布，形成一層薄薄的菌膜。接著，使用無菌鑷子將青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素等多種藥敏紙片小心放置在已接種乳酸菌的培養(yǎng)基表面，各藥敏紙片之間需保持適當(dāng)距離，以防止抑菌圈相互重疊影響結(jié)果判斷。將放置好藥敏紙片的培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)18-24h。在培養(yǎng)過程中，抗生素會(huì)從藥敏紙片向周圍培養(yǎng)基中擴(kuò)散，若乳酸菌對(duì)某種抗生素敏感，在藥敏紙片周圍就會(huì)形成一個(gè)透明的抑菌圈。培養(yǎng)結(jié)束后，用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量抑菌圈的直徑，根據(jù)CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）標(biāo)準(zhǔn)判斷乳酸菌對(duì)各抗生素的敏感程度。當(dāng)抑菌圈直徑大于或等于特定的敏感標(biāo)準(zhǔn)值時(shí)，判定乳酸菌對(duì)該抗生素敏感；當(dāng)抑菌圈直徑小于耐藥標(biāo)準(zhǔn)值時(shí)，判定為耐藥；若抑菌圈直徑介于敏感和耐藥標(biāo)準(zhǔn)值之間，則判定為中介。對(duì)于可轉(zhuǎn)移耐藥質(zhì)粒的檢測(cè)，采用瓊脂糖凝膠電泳法。首先，運(yùn)用堿裂解法提取乳酸菌中的質(zhì)粒DNA。將乳酸菌接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集菌體。向菌體沉淀中加入溶液I（50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris-HCl，pH8.0、10mmol/LEDTA），充分懸浮菌體，使細(xì)胞處于等滲環(huán)境，維持細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定；加入新鮮配制的溶液II（0.2mol/LNaOH、1%SDS），輕輕顛倒混勻，使細(xì)胞膜破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)，包括質(zhì)粒DNA和染色體DNA，同時(shí)SDS可使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離；再加入溶液III（3mol/L醋酸鉀，pH4.8），中和堿性環(huán)境，使質(zhì)粒DNA復(fù)性，而染色體DNA和蛋白質(zhì)則形成沉淀。通過離心去除沉淀，取上清液，用酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）抽提進(jìn)一步去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，然后用無水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，得到較為純凈的質(zhì)粒DNA提取物。將提取的質(zhì)粒DNA與上樣緩沖液混合，上樣至0.8%的瓊脂糖凝膠中。在電泳緩沖液（1×TAE或1×TBE）中，以100V的電壓進(jìn)行電泳，時(shí)間約為1-2h。在電場(chǎng)的作用下，DNA分子會(huì)向正極移動(dòng)，由于不同大小的DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速率不同，較小的DNA分子遷移速度較快，較大的DNA分子遷移速度較慢。通過與已知大小的DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量進(jìn)行對(duì)比，就可以初步確定提取的質(zhì)粒DNA的大小。為了進(jìn)一步確認(rèn)提取的質(zhì)粒是否攜帶耐藥基因，還需進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)檢測(cè)。設(shè)計(jì)針對(duì)常見耐藥基因，如紅霉素耐藥基因ermA、ermB和四環(huán)素耐藥基因tetM、tetK等的引物，對(duì)提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段，說明該質(zhì)?？赡軘y帶相應(yīng)的耐藥基因；再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與已知耐藥基因序列進(jìn)行比對(duì)，即可準(zhǔn)確確定質(zhì)粒中攜帶的耐藥基因類型。3.4機(jī)體指標(biāo)評(píng)價(jià)試驗(yàn)實(shí)施將健康的昆明種小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、DM9054灌胃組、DM9054腹腔注射組、DM9057灌胃組和DM9057腹腔注射組，每組10只。在實(shí)驗(yàn)前，小鼠需禁食不禁水12h，以減少食物和水分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。灌胃操作時(shí)，將乳酸菌DM9054和DM9057的菌液濃度調(diào)整為1×10?CFU/mL，DM9054灌胃組和DM9057灌胃組小鼠分別按照0.2mL/10g體重的劑量進(jìn)行灌胃，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃7天。灌胃過程中，使用灌胃針將菌液緩慢注入小鼠食管，確保菌液準(zhǔn)確進(jìn)入小鼠體內(nèi)。灌胃針從小鼠的嘴角進(jìn)入，壓住舌頭，抵住上顎，輕輕向內(nèi)推進(jìn)，進(jìn)入食管后會(huì)有一個(gè)刺空感，此時(shí)再緩慢推注菌液。在灌胃過程中，要密切觀察小鼠的反應(yīng)，若小鼠出現(xiàn)掙扎、呼吸困難等異常情況，應(yīng)立即停止灌胃，并采取相應(yīng)的措施。腹腔注射時(shí)，DM9054腹腔注射組和DM9057腹腔注射組小鼠分別按照1×10?CFU/mL的菌液濃度，以0.1mL/10g體重的劑量進(jìn)行腹腔注射，每天注射一次，連續(xù)注射7天。腹腔注射時(shí)，右手持注射器，左手的小指和無名指抓住小鼠的尾巴，另外三個(gè)手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，這樣腹腔中的器官就會(huì)自然倒向胸部，可有效防止注射器刺入時(shí)損傷大腸、小腸等器官。進(jìn)針時(shí)，動(dòng)作要輕柔，從腹部一側(cè)進(jìn)針，穿過腹中線后在腹部的另一側(cè)進(jìn)入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。對(duì)照組小鼠則給予等量的無菌生理鹽水進(jìn)行灌胃和腹腔注射，操作方式與實(shí)驗(yàn)組相同。在最后一次灌胃或腹腔注射后的24h，將小鼠進(jìn)行安樂死，迅速采集血液樣本。使用離心機(jī)以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，分離出血清，將血清保存于-80℃冰箱中待測(cè)。采集血液樣本時(shí)，要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，防止樣本被污染。采血后，立即將血液轉(zhuǎn)移至離心管中，并盡快進(jìn)行離心操作，以保證血清的質(zhì)量。使用丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒、血清淀粉樣蛋白A（SAA）檢測(cè)試劑盒，按照試劑盒說明書的操作步驟，在酶標(biāo)儀上分別測(cè)定血清中MDA和SAA的濃度。在測(cè)定過程中，要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。將血清樣本與試劑盒中的試劑按照規(guī)定比例混合，在特定溫度下孵育一定時(shí)間，然后在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出MDA和SAA的濃度。迅速取出小鼠的肝臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)，用濾紙吸干水分后，稱取0.1g肝臟組織，加入1mL預(yù)冷的生理鹽水，使用組織勻漿器將肝臟組織勻漿，制成10%的肝臟勻漿。勻漿過程中，要保持低溫環(huán)境，防止肝臟組織中的酶活性受到影響。勻漿后，將勻漿液以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液，使用谷胱甘肽（GSH）檢測(cè)試劑盒測(cè)定肝臟勻漿上清液中GSH的濃度。同樣按照試劑盒說明書的操作步驟，在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出GSH的濃度。將兩株乳酸菌分別接種于添加了0.1%（w/v）牛黃脫氧膽酸鈉鹽的MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌液，按照膽鹽羥化酶檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)菌液中是否存在膽鹽羥化酶。若檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說明乳酸菌能夠產(chǎn)生膽鹽羥化酶，可能會(huì)對(duì)機(jī)體的膽汁代謝產(chǎn)生影響；若檢測(cè)結(jié)果為陰性，則表明乳酸菌不產(chǎn)生膽鹽羥化酶，對(duì)機(jī)體膽汁代謝的潛在風(fēng)險(xiǎn)較低。3.5有害代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)試驗(yàn)步驟有害代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)試驗(yàn)聚焦于檢測(cè)乳酸菌DM9054和DM9057在代謝過程中是否產(chǎn)生對(duì)人體有害的物質(zhì)，包括D-乳酸、硝基還原酶和氨基脫羧酶，這些物質(zhì)的產(chǎn)生可能會(huì)對(duì)人體健康造成潛在威脅。對(duì)于D-乳酸的檢測(cè)，選用相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行。取適量乳酸菌DM9054和DM9057培養(yǎng)24h后的菌液，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，小心收集上清液。將上清液與試劑盒中的檢測(cè)試劑按照規(guī)定比例在酶標(biāo)板中充分混合，輕輕振蕩酶標(biāo)板，使反應(yīng)體系均勻。將酶標(biāo)板置于37℃恒溫孵育箱中孵育30min，孵育過程中要確保酶標(biāo)板處于穩(wěn)定狀態(tài)，避免晃動(dòng)。孵育結(jié)束后，迅速將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確計(jì)算出菌液中D-乳酸的含量。在操作過程中，要注意避免試劑受到污染，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測(cè)硝基還原酶時(shí)，同樣使用檢測(cè)試劑盒。取培養(yǎng)24h后的菌液，用無菌生理鹽水進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使菌液濃度達(dá)到試劑盒要求的檢測(cè)范圍。按照試劑盒說明書，依次加入各種試劑，在試管中充分混合均勻。將試管置于37℃恒溫水浴鍋中，反應(yīng)1h，期間每隔15min輕輕振蕩試管，使反應(yīng)充分進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)試劑盒指示的檢測(cè)方法，觀察反應(yīng)液的顏色變化或測(cè)定吸光度值，判斷菌液中是否含有硝基還原酶。若反應(yīng)液顏色發(fā)生明顯變化或吸光度值超出正常范圍，則表明菌液中存在硝基還原酶。在檢測(cè)氨基脫羧酶時(shí)，將乳酸菌DM9054和DM9057分別接種于BASM培養(yǎng)基中，BASM培養(yǎng)基中富含氨基酸，為氨基脫羧酶的產(chǎn)生提供了底物。將接種后的培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h，讓乳酸菌充分生長(zhǎng)繁殖并進(jìn)行代謝活動(dòng)。培養(yǎng)結(jié)束后，仔細(xì)觀察培養(yǎng)基的顏色變化。若培養(yǎng)基顏色變?yōu)樽仙?，這是由于氨基脫羧酶催化氨基酸脫羧產(chǎn)生生物胺，生物胺與培養(yǎng)基中的指示劑發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致顏色改變，說明乳酸菌產(chǎn)生了氨基脫羧酶；若培養(yǎng)基顏色無明顯變化，仍保持原來的顏色，則表明乳酸菌未產(chǎn)生氨基脫羧酶。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，要嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件和操作步驟，確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，為評(píng)估乳酸菌的安全性提供準(zhǔn)確依據(jù)。3.6其他評(píng)價(jià)試驗(yàn)操作細(xì)節(jié)其他評(píng)價(jià)試驗(yàn)從血平板培養(yǎng)基檢測(cè)溶血現(xiàn)象和細(xì)菌易位檢測(cè)兩個(gè)方面，進(jìn)一步評(píng)估乳酸菌DM9054和DM9057的安全性，為其全面的安全性評(píng)價(jià)提供補(bǔ)充信息。血平板培養(yǎng)基檢測(cè)溶血現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)中，將乳酸菌DM9054和DM9057分別接種于血平板培養(yǎng)基上。血平板培養(yǎng)基通常由基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加適量的脫纖維羊血或兔血制成，為乳酸菌的生長(zhǎng)提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也為觀察溶血現(xiàn)象提供了良好的環(huán)境。接種時(shí)，使用無菌接種環(huán)挑取少量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳酸菌，在血平板上進(jìn)行分區(qū)劃線，使乳酸菌在培養(yǎng)基表面均勻分布。將接種后的血平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20h。在培養(yǎng)過程中，乳酸菌會(huì)在血平板上生長(zhǎng)繁殖，其代謝產(chǎn)物與紅細(xì)胞相互作用，從而產(chǎn)生不同的溶血現(xiàn)象。培養(yǎng)結(jié)束后，仔細(xì)觀察菌落周圍的溶血情況。若菌落周圍出現(xiàn)草綠色溶血環(huán)，這是由于乳酸菌產(chǎn)生的過氧化氫等物質(zhì)使紅細(xì)胞部分溶解，血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，呈現(xiàn)出草綠色，此為α-溶血；若菌落周圍出現(xiàn)透明的溶血環(huán)，表明乳酸菌產(chǎn)生的溶血素能夠完全破壞紅細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致紅細(xì)胞完全溶解，這是β-溶血；若菌落周圍無溶血現(xiàn)象，說明乳酸菌不產(chǎn)生溶血素，對(duì)紅細(xì)胞無破壞作用，即為γ-溶血。通過對(duì)溶血現(xiàn)象的觀察和判斷，可以初步評(píng)估乳酸菌的潛在致病性。細(xì)菌易位檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，選取健康的昆明種小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、DM9054實(shí)驗(yàn)組和DM9057實(shí)驗(yàn)組，每組10只。實(shí)驗(yàn)前，小鼠需禁食不禁水12h，以減少食物和水分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。DM9054實(shí)驗(yàn)組和DM9057實(shí)驗(yàn)組小鼠分別按照1×10?CFU/mL的菌液濃度，以0.2mL/10g體重的劑量進(jìn)行連續(xù)灌胃，每天灌胃一次，持續(xù)灌胃20天。對(duì)照組小鼠則給予等量的無菌生理鹽水進(jìn)行灌胃，操作方式與實(shí)驗(yàn)組相同。在灌胃過程中，要密切觀察小鼠的反應(yīng)，確保灌胃操作的準(zhǔn)確性和安全性。在灌胃20天后，將小鼠進(jìn)行安樂死。迅速采集小鼠的腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟等組織，將這些組織放入無菌的勻漿器中，加入適量的無菌生理鹽水，使用組織勻漿器將組織充分勻漿，制成臟器勻漿液。勻漿過程中，要注意保持低溫環(huán)境，防止細(xì)菌在勻漿過程中受到損傷或死亡。將制備好的臟器勻漿液進(jìn)行梯度稀釋，分別取10?1、10?2、10?3三個(gè)稀釋度的勻漿液各0.1mL，均勻涂布于MRS培養(yǎng)基平板上。將涂布后的平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)24-48h。在培養(yǎng)過程中，若組織勻漿液中存在細(xì)菌，它們會(huì)在MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖，形成肉眼可見的菌落。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察平板上是否有菌落生長(zhǎng)，并對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)和鑒定。若在實(shí)驗(yàn)組小鼠的臟器勻漿液平板上檢測(cè)到大量的乳酸菌菌落，且數(shù)量明顯多于對(duì)照組，說明發(fā)生了細(xì)菌易位現(xiàn)象，乳酸菌從腸道轉(zhuǎn)移到了腸外組織，這可能會(huì)對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生潛在威脅；若平板上菌落數(shù)量極少或無菌落生長(zhǎng)，則表明未發(fā)生明顯的細(xì)菌易位現(xiàn)象，乳酸菌在體內(nèi)的分布較為局限，對(duì)機(jī)體的潛在危害較小。四、乳酸菌DM9054和DM9057安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1急性毒性試驗(yàn)結(jié)果在急性毒性試驗(yàn)中，對(duì)照組小鼠在灌胃無菌生理鹽水后，活動(dòng)表現(xiàn)正常，精神狀態(tài)良好，對(duì)周圍環(huán)境的刺激反應(yīng)敏捷，進(jìn)食和飲水情況穩(wěn)定，體重呈現(xiàn)穩(wěn)步增長(zhǎng)的趨勢(shì)。在觀察期內(nèi)，對(duì)照組小鼠的毛色順滑有光澤，眼睛明亮，無任何異常行為或體征。DM9054實(shí)驗(yàn)組小鼠在一次性灌胃含乳酸菌DM9054的菌液后，未出現(xiàn)任何異常行為和精神狀態(tài)改變。小鼠依然活潑好動(dòng)，主動(dòng)探索周圍環(huán)境，對(duì)外界刺激的反應(yīng)與對(duì)照組小鼠無異。在進(jìn)食和飲水方面，實(shí)驗(yàn)組小鼠的食量和飲水量與對(duì)照組相比，無明顯差異，這表明乳酸菌DM9054對(duì)小鼠的消化系統(tǒng)未產(chǎn)生不良影響。在體重變化方面，實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重增長(zhǎng)趨勢(shì)與對(duì)照組相似，未出現(xiàn)體重下降或異常波動(dòng)的情況，說明乳酸菌DM9054未對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育造成阻礙。同樣，DM9057實(shí)驗(yàn)組小鼠在灌胃含乳酸菌DM9057的菌液后，活動(dòng)、精神、飲食和飲水等方面也均無異常。小鼠的行為表現(xiàn)正常，能夠正常進(jìn)行日?；顒?dòng)，如奔跑、跳躍、梳理毛發(fā)等。精神狀態(tài)良好，眼神明亮，反應(yīng)靈敏。飲食和飲水規(guī)律穩(wěn)定，體重增長(zhǎng)平穩(wěn)，與對(duì)照組小鼠的體重變化曲線基本重合，這充分說明乳酸菌DM9057對(duì)小鼠的身體健康也未產(chǎn)生明顯的負(fù)面影響。在14天觀察期結(jié)束后，對(duì)三組小鼠進(jìn)行解剖檢查。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的肝臟色澤紅潤(rùn)，質(zhì)地柔軟，表面光滑，無任何腫大、淤血或結(jié)節(jié)等異?，F(xiàn)象；脾臟大小正常，質(zhì)地均勻，顏色暗紅，無腫大或萎縮的跡象；腎臟表面光滑，顏色呈暗紅色，皮質(zhì)和髓質(zhì)分界清晰，無腫脹、出血點(diǎn)或其他病變；心臟外觀正常，心肌色澤正常，無肥厚或擴(kuò)張的現(xiàn)象；肺臟顏色粉紅，質(zhì)地柔軟，無淤血、實(shí)變或其他病理變化。DM9054實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟、脾臟、腎臟、心臟和肺臟等主要內(nèi)臟器官的外觀和質(zhì)地與對(duì)照組小鼠相似，均未發(fā)現(xiàn)任何器質(zhì)性病變。肝臟的大小、顏色和質(zhì)地均正常，未出現(xiàn)任何異常變化；脾臟的形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，無腫大或其他異常情況；腎臟的外觀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)正常，無任何病理改變；心臟的形態(tài)和功能正常，心肌無異常變化；肺臟的外觀和質(zhì)地正常，無淤血或其他病變。DM9057實(shí)驗(yàn)組小鼠的內(nèi)臟器官同樣未出現(xiàn)任何異常情況。肝臟、脾臟、腎臟、心臟和肺臟的外觀和質(zhì)地均正常，與對(duì)照組小鼠相比，無明顯差異。肝臟色澤正常，質(zhì)地柔軟，無病變跡象；脾臟大小和質(zhì)地正常，無異常表現(xiàn)；腎臟外觀正常，無腫脹或其他病變；心臟功能正常，心肌無異常變化；肺臟質(zhì)地和顏色正常，無淤血或其他病理改變。綜上所述，在急性毒性試驗(yàn)中，乳酸菌DM9054和DM9057一次性大劑量灌胃后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重、行為、精神等體征指標(biāo)均無異常，主要內(nèi)臟器官也未發(fā)生器質(zhì)性變化，這初步表明乳酸菌DM9054和DM9057在急性毒性方面表現(xiàn)良好，對(duì)小鼠無明顯的急性毒性作用。4.2耐藥性評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果耐藥性評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果顯示，乳酸菌DM9054和DM9057對(duì)不同抗生素呈現(xiàn)出不同的敏感程度。在藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)中，兩株乳酸菌對(duì)青霉素均表現(xiàn)出敏感，在含有青霉素的藥敏紙片周圍形成了明顯的抑菌圈，抑菌圈直徑大于CLSI標(biāo)準(zhǔn)中敏感范圍的下限，表明青霉素能夠有效抑制這兩株乳酸菌的生長(zhǎng)。對(duì)于鏈霉素，乳酸菌DM9054表現(xiàn)為敏感，其抑菌圈直徑符合敏感標(biāo)準(zhǔn)；而乳酸菌DM9057對(duì)鏈霉素則表現(xiàn)出耐藥性，在含有鏈霉素的藥敏紙片周圍未觀察到明顯的抑菌圈，說明鏈霉素對(duì)乳酸菌DM9057的生長(zhǎng)抑制作用較弱。在四環(huán)素的檢測(cè)中，乳酸菌DM9054和DM9057均表現(xiàn)出耐藥性，四環(huán)素藥敏紙片周圍的抑菌圈直徑小于CLSI標(biāo)準(zhǔn)中耐藥范圍的上限，表明這兩株乳酸菌對(duì)四環(huán)素具有一定的抗性，四環(huán)素難以抑制它們的生長(zhǎng)。對(duì)于紅霉素，乳酸菌DM9054表現(xiàn)為耐藥，而乳酸菌DM9057對(duì)紅霉素的敏感性則處于中介水平，其抑菌圈直徑介于敏感和耐藥標(biāo)準(zhǔn)值之間，說明紅霉素對(duì)乳酸菌DM9057的抑制效果不穩(wěn)定，可能會(huì)受到多種因素的影響。通過瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)兩株乳酸菌是否含有可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在電泳圖譜中，均未檢測(cè)到明顯的質(zhì)粒條帶。這表明乳酸菌DM9054和DM9057不攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒，降低了耐藥基因在環(huán)境中傳播的風(fēng)險(xiǎn)。耐藥基因的傳播可能會(huì)導(dǎo)致其他病原菌獲得耐藥性，從而增加臨床治療的難度和公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。乳酸菌不攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒，意味著在實(shí)際應(yīng)用中，它們不會(huì)將耐藥基因傳遞給其他微生物，減少了耐藥基因在食物鏈或生態(tài)系統(tǒng)中擴(kuò)散的可能性，為其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的安全應(yīng)用提供了有利條件。雖然兩株乳酸菌對(duì)部分抗生素具有抗性，但由于不攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒，其潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低。在實(shí)際應(yīng)用中，仍需密切關(guān)注乳酸菌的耐藥情況，避免因長(zhǎng)期使用或不合理使用抗生素導(dǎo)致乳酸菌耐藥性的改變，以確保其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用的安全性和有效性。4.3機(jī)體指標(biāo)評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果機(jī)體指標(biāo)評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠在給予無菌生理鹽水后，血清中丙二醛（MDA）濃度處于正常生理水平，反映出機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)穩(wěn)定，體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度較低，抗氧化防御系統(tǒng)能夠有效維持機(jī)體的氧化還原平衡。血清淀粉樣蛋白A（SAA）濃度也保持在較低水平，表明機(jī)體未受到明顯的炎癥刺激，免疫系統(tǒng)處于正常的靜息狀態(tài)。肝臟中谷胱甘肽（GSH）濃度正常，說明肝臟的抗氧化能力正常，能夠有效清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，保護(hù)肝臟細(xì)胞免受氧化損傷。DM9054灌胃組小鼠在連續(xù)灌胃乳酸菌DM9054的菌液后，血清中MDA濃度與對(duì)照組相比，無顯著差異。這表明乳酸菌DM9054灌胃并未引發(fā)小鼠機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，不會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，對(duì)小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)無明顯影響。血清中SAA濃度同樣與對(duì)照組無明顯差異，說明乳酸菌DM9054灌胃未引起小鼠機(jī)體的炎癥反應(yīng)，不會(huì)激活免疫系統(tǒng)，對(duì)小鼠的免疫狀態(tài)較為溫和。肝臟中GSH濃度也基本維持在正常水平，顯示出乳酸菌DM9054對(duì)小鼠肝臟的抗氧化能力無明顯破壞作用，肝臟能夠正常發(fā)揮其抗氧化功能。DM9054腹腔注射組小鼠在腹腔注射乳酸菌DM9054的菌液后，血清中MDA濃度略有升高，但仍在正常范圍內(nèi)波動(dòng)。這可能是由于腹腔注射這一給藥方式對(duì)機(jī)體產(chǎn)生了一定的刺激，導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平稍有上升，但乳酸菌DM9054本身并未對(duì)機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)產(chǎn)生顯著的不良影響。血清中SAA濃度也稍有升高，同樣在正常范圍內(nèi)，提示腹腔注射乳酸菌DM9054可能引發(fā)了機(jī)體輕微的炎癥反應(yīng)，但程度較輕，在機(jī)體的自我調(diào)節(jié)范圍內(nèi)。肝臟中GSH濃度與對(duì)照組相比，無明顯變化，表明乳酸菌DM9054腹腔注射對(duì)小鼠肝臟的抗氧化能力影響不大，肝臟的抗氧化防御系統(tǒng)能夠應(yīng)對(duì)這種刺激。DM9057灌胃組小鼠在灌胃乳酸菌DM9057的菌液后，血清中MDA、SAA濃度及肝臟中GSH濃度與對(duì)照組相比，均無明顯差異。這充分說明乳酸菌DM9057灌胃對(duì)小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)、炎癥反應(yīng)以及肝臟抗氧化能力均無顯著影響，在灌胃過程中，小鼠的機(jī)體指標(biāo)保持穩(wěn)定，未受到乳酸菌DM9057的干擾。DM9057腹腔注射組小鼠在腹腔注射乳酸菌DM9057的菌液后，血清中MDA、SAA濃度稍有升高，肝臟中GSH濃度無明顯變化。這表明腹腔注射乳酸菌DM9057對(duì)小鼠機(jī)體產(chǎn)生了一定的刺激，導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng)稍有增強(qiáng)，但肝臟的抗氧化能力依然維持正常。與DM9054腹腔注射組類似，這種變化在正常范圍內(nèi)，說明乳酸菌DM9057腹腔注射對(duì)小鼠機(jī)體的影響較小，機(jī)體能夠通過自身的調(diào)節(jié)機(jī)制維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。兩株乳酸菌在加入牛黃脫氧膽酸鈉鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，檢測(cè)結(jié)果均顯示不產(chǎn)生膽鹽羥化酶。膽鹽羥化酶能夠催化膽鹽的代謝，改變膽汁的組成和功能。乳酸菌不產(chǎn)生膽鹽羥化酶，意味著它們不會(huì)對(duì)機(jī)體的膽汁代謝產(chǎn)生影響，不會(huì)干擾膽汁在脂肪消化和吸收過程中的正常作用，減少了因膽汁代謝異常而引發(fā)相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。4.4有害代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果在有害代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，使用相應(yīng)檢測(cè)試劑盒對(duì)乳酸菌DM9054和DM9057培養(yǎng)24h后的菌液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，兩株乳酸菌的菌液中均檢測(cè)到了D-乳酸的存在。通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比計(jì)算，確定了菌液中D-乳酸的含量，雖然具體含量數(shù)值處于一定范圍內(nèi)，但D-乳酸的產(chǎn)生仍需引起關(guān)注。由于人體對(duì)D-乳酸的代謝能力相對(duì)較弱，若大量攝入含有較高D-乳酸的乳酸菌產(chǎn)品，可能會(huì)導(dǎo)致D-乳酸在體內(nèi)積累，進(jìn)而引發(fā)代謝性酸中毒等健康問題。在檢測(cè)硝基還原酶時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸菌DM9054和DM9057培養(yǎng)后的菌液中均未檢測(cè)到硝基還原酶。這意味著這兩株乳酸菌在代謝過程中不會(huì)催化硝基化合物還原，從而不會(huì)產(chǎn)生具有潛在致癌性的亞硝胺類物質(zhì)，降低了因食用含有這兩株乳酸菌的產(chǎn)品而引發(fā)癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。將兩株乳酸菌分別接種于BASM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后，觀察培養(yǎng)基顏色變化，以此判斷是否產(chǎn)生氨基脫羧酶。結(jié)果顯示，培養(yǎng)基顏色無明顯變化，仍保持原來的顏色，說明乳酸菌DM9054和DM9057均未產(chǎn)生氨基脫羧酶。氨基脫羧酶能夠催化氨基酸脫羧生成生物胺，若乳酸菌產(chǎn)生氨基脫羧酶，可能會(huì)導(dǎo)致食品中生物胺含量增加，對(duì)人體健康造成危害，如引發(fā)頭痛、心悸、血壓變化等不良反應(yīng)。乳酸菌不產(chǎn)生氨基脫羧酶，表明它們?cè)诖x過程中不會(huì)導(dǎo)致生物胺的生成，進(jìn)一步保障了其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用的安全性。4.5其他評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果在血平板培養(yǎng)基檢測(cè)溶血現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)中，將乳酸菌DM9054和DM9057分別接種于血平板培養(yǎng)基上，經(jīng)過37℃恒溫培養(yǎng)20h后，仔細(xì)觀察菌落周圍的情況。結(jié)果顯示，兩株乳酸菌菌落周圍均無溶血現(xiàn)象，即屬于γ-溶血。這表明乳酸菌DM9054和DM9057不產(chǎn)生溶血素，對(duì)紅細(xì)胞無破壞作用，從溶血特性角度初步判斷這兩株乳酸菌的潛在致病性較低。溶血素能夠破壞紅細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，具有溶血作用的乳酸菌可能會(huì)對(duì)機(jī)體組織造成損傷，引發(fā)炎癥等不良反應(yīng)。乳酸菌DM9054和DM9057無溶血作用，說明它們?cè)谶M(jìn)入機(jī)體后，不會(huì)對(duì)血液系統(tǒng)中的紅細(xì)胞產(chǎn)生不良影響，減少了因溶血而引發(fā)相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。在細(xì)菌易位檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠連續(xù)灌胃含乳酸菌DM9054和DM9057的菌液20天后，采集腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟等臟器勻漿液，并在MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果顯示，在DM9054實(shí)驗(yàn)組和DM9057實(shí)驗(yàn)組小鼠的臟器勻漿液平板上，均未檢測(cè)到乳酸菌菌落生長(zhǎng)。而對(duì)照組小鼠給予無菌生理鹽水灌胃后，同樣在臟器勻漿液平板上未檢測(cè)到乳酸菌菌落。這充分說明乳酸菌DM9054和DM9057在連續(xù)灌胃20天后，未發(fā)生細(xì)菌易位現(xiàn)象，即乳酸菌未從腸道轉(zhuǎn)移到腸外組織。細(xì)菌易位可能會(huì)導(dǎo)致全身性感染，引發(fā)機(jī)體發(fā)熱、炎癥反應(yīng)等癥狀，嚴(yán)重威脅機(jī)體健康。乳酸菌DM9054和DM9057未發(fā)生細(xì)菌易位，表明它們?cè)谀c道內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，不會(huì)輕易突破腸道黏膜屏障進(jìn)入其他組織，進(jìn)一步證明了這兩株乳酸菌在體內(nèi)的安全性較高。五、乳酸菌DM9054和DM9057安全性綜合分析與討論5.1各評(píng)價(jià)指標(biāo)結(jié)果的綜合分析通過一系列全面且嚴(yán)謹(jǐn)?shù)陌踩栽u(píng)價(jià)試驗(yàn)，對(duì)乳酸菌DM9054和DM9057的安全性有了較為清晰的認(rèn)識(shí)。在急性毒性試驗(yàn)中，一次性大劑量灌胃后，小鼠的體重、行為、精神等體征指標(biāo)均無異常，主要內(nèi)臟器官也未發(fā)生器質(zhì)性變化。這一結(jié)果為兩株乳酸菌的安全性奠定了重要基礎(chǔ)，表明在高劑量短時(shí)間暴露的情況下，它們對(duì)機(jī)體不會(huì)產(chǎn)生明顯的急性毒性反應(yīng)，不會(huì)對(duì)機(jī)體的正常生理功能造成嚴(yán)重干擾。耐藥性評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩株乳酸菌對(duì)部分抗生素具有抗性，但令人欣慰的是，它們均不攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒。雖然對(duì)部分抗生素的抗性可能會(huì)影響其在某些治療場(chǎng)景中的應(yīng)用，但不攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒大大降低了耐藥基因在環(huán)境中傳播的風(fēng)險(xiǎn)。耐藥基因的傳播可能會(huì)導(dǎo)致其他病原菌獲得耐藥性，從而增加臨床治療的難度和公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。乳酸菌不攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒，意味著在實(shí)際應(yīng)用中，它們不會(huì)將耐藥基因傳遞給其他微生物，減少了耐藥基因在食物鏈或生態(tài)系統(tǒng)中擴(kuò)散的可能性。機(jī)體指標(biāo)評(píng)價(jià)試驗(yàn)表明，無論是灌胃還是腹腔注射，乳酸菌DM9054和DM9057對(duì)小鼠血清中丙二醛（MDA）、血清淀粉樣蛋白A（SAA）濃度及肝臟中谷胱甘肽（GSH）濃度的影響均較小。這說明兩株乳酸菌對(duì)小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)、炎癥反應(yīng)以及肝臟抗氧化能力均無顯著影響，在進(jìn)入機(jī)體后，不會(huì)引發(fā)明顯的氧化損傷和炎癥反應(yīng)，肝臟的抗氧化防御系統(tǒng)也能夠正常發(fā)揮作用。兩株乳酸菌在加入牛黃脫氧膽酸鈉鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，均不產(chǎn)生膽鹽羥化酶。膽鹽羥化酶能夠催化膽鹽的代謝，改變膽汁的組成和功能。乳酸菌不產(chǎn)生膽鹽羥化酶，意味著它們不會(huì)對(duì)機(jī)體的膽汁代謝產(chǎn)生影響，不會(huì)干擾膽汁在脂肪消化和吸收過程中的正常作用，減少了因膽汁代謝異常而引發(fā)相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。有害代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)試驗(yàn)檢測(cè)出兩株乳酸菌均產(chǎn)生D-乳酸，但不產(chǎn)生硝基還原酶和氨基脫羧酶。D-乳酸的產(chǎn)生雖需關(guān)注，但只要在合理范圍內(nèi)，通過人體自身的代謝調(diào)節(jié)，其潛在風(fēng)險(xiǎn)可得到一定程度的控制。而不產(chǎn)生硝基還原酶和氨基脫羧酶，避免了因這些酶的作用而產(chǎn)生具有潛在致癌性的亞硝胺類物質(zhì)和可能導(dǎo)致食品中生物胺含量增加的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步保障了其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用的安全性。在其他評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，血平板培養(yǎng)基檢測(cè)顯示兩株乳酸菌均無溶血現(xiàn)象，這表明它們不產(chǎn)生溶血素，對(duì)紅細(xì)胞無破壞作用，從溶血特性角度初步判斷這兩株乳酸菌的潛在致病性較低。細(xì)菌易位檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)期灌胃后未發(fā)生細(xì)菌易位現(xiàn)象，即乳酸菌未從腸道轉(zhuǎn)移到腸外組織。細(xì)菌易位可能會(huì)導(dǎo)致全身性感染，引發(fā)機(jī)體發(fā)熱、炎癥反應(yīng)等癥狀，嚴(yán)重威脅機(jī)體健康。乳酸菌未發(fā)生細(xì)菌易位，表明它們?cè)谀c道內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，不會(huì)輕易突破腸道黏膜屏障進(jìn)入其他組織，進(jìn)一步證明了這兩株乳酸菌在體內(nèi)的安全性較高。5.2與其他乳酸菌安全性研究結(jié)果的對(duì)比分析與其他乳酸菌安全性研究結(jié)果相比，乳酸菌DM9054和DM9057在多個(gè)方面展現(xiàn)出相似性與獨(dú)特性。在急性毒性方面，諸多研究表明多數(shù)乳酸菌對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無明顯急性毒性。一項(xiàng)對(duì)植物乳桿菌的急性毒性研究中，以高劑量灌胃小鼠后，小鼠的體重、行為等指標(biāo)均未出現(xiàn)異常，與本研究中乳酸菌DM9054和DM9057的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果一致。這說明這兩株乳酸菌在急性毒性表現(xiàn)上與常見的乳酸菌相似，在高劑量短時(shí)間暴露下，不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的急性毒性反應(yīng)，具有良好的急性安全性。耐藥性方面，不同乳酸菌對(duì)各類抗生素的耐藥情況存在差異。有研究報(bào)道某些乳酸菌對(duì)四環(huán)素、紅霉素等抗生素具有較高的耐藥性，這與本研究中乳酸菌DM9054和DM9057對(duì)四環(huán)素耐藥、DM9054對(duì)紅霉素耐藥的結(jié)果相符。然而，本研究中兩株乳酸菌不攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒，這一特性在乳酸菌耐藥性研究中具有重要意義。在其他乳酸菌研究中，部分菌株攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒，這增加了耐藥基因在環(huán)境中傳播的風(fēng)險(xiǎn)。乳酸菌DM9054和DM9057不攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒，大大降低了這種風(fēng)險(xiǎn)，使其在實(shí)際應(yīng)用中更為安全可靠。機(jī)體指標(biāo)評(píng)價(jià)方面，多數(shù)乳酸菌在進(jìn)入機(jī)體后，對(duì)機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)、炎癥反應(yīng)和抗氧化能力影響較小。對(duì)嗜酸乳桿菌的研究發(fā)現(xiàn)，其灌胃或腹腔注射后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中的MDA、SAA濃度及肝臟中的GSH濃度變化不明顯，與本研究中乳酸菌DM9054和DM9057對(duì)小鼠機(jī)體指標(biāo)的影響類似。這表明這兩株乳酸菌在對(duì)機(jī)體整體健康影響方面，與其他乳酸菌具有相似的安全性表現(xiàn)，不會(huì)引發(fā)明顯的氧化損傷和炎癥反應(yīng)，能夠維持機(jī)體的正常生理功能。有害代謝產(chǎn)物方面，一些乳酸菌會(huì)產(chǎn)生D-乳酸，這是較為常見的現(xiàn)象。但不同乳酸菌產(chǎn)生D-乳酸的量有所不同，本研究中乳酸菌DM9054和DM9057產(chǎn)生D-乳酸的情況與部分研究結(jié)果相近。多數(shù)乳酸菌不產(chǎn)生硝基還原酶和氨基脫羧酶，本研究中的兩株乳酸菌同樣如此，這進(jìn)一步驗(yàn)證了它們?cè)谟泻Υx產(chǎn)物產(chǎn)生方面的安全性，減少了因產(chǎn)生這些有害酶類而帶來的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)。血平板培養(yǎng)基檢測(cè)溶血現(xiàn)象和細(xì)菌易位檢測(cè)方面，大多數(shù)乳酸菌在血平板上無溶血現(xiàn)象，且不會(huì)發(fā)生細(xì)菌易位。本研究中乳酸菌DM9054和DM9057在這兩方面的結(jié)果與其他乳酸菌的研究結(jié)果一致。這表明這兩株乳酸菌在潛在致病性和體內(nèi)分布穩(wěn)定性方面，與其他乳酸菌具有相似的安全性特征，不會(huì)對(duì)血液系統(tǒng)造成損傷，也不會(huì)輕易突破腸道黏膜屏障進(jìn)入其他組織，保障了其在體內(nèi)的安全性。5.3安全性評(píng)價(jià)結(jié)果的應(yīng)用與潛在風(fēng)險(xiǎn)探討基于上述全面的安全性評(píng)價(jià)結(jié)果，乳酸菌DM9054和DM9057在食品和藥品生產(chǎn)中展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。在食品生產(chǎn)領(lǐng)域，由于其具有降膽固醇和降血壓的功能，可將這兩株乳酸菌應(yīng)用于功能性食品的開發(fā)。將它們添加到酸奶、發(fā)酵乳飲料中，不僅能夠賦予產(chǎn)品獨(dú)特的功能特性，滿足消費(fèi)者對(duì)健康食品的需求，還能利用乳酸菌本身的發(fā)酵特性，改善產(chǎn)品的口感和質(zhì)地。在藥品生產(chǎn)方面，經(jīng)過進(jìn)一步的研究和開發(fā)，有望將這兩株乳酸菌制成治療高膽固醇血癥和高血壓的生物制劑。它們作為天然的微生物制劑，相較于傳統(tǒng)的化學(xué)藥物，可能具有更低的副作用和更好的生物相容性，為相關(guān)疾病的治療提供新的選擇。然而，在應(yīng)用過程中，仍需充分認(rèn)識(shí)到潛在風(fēng)險(xiǎn)。盡管兩株乳酸菌在本次研究中表現(xiàn)出總體安全性，但D-乳酸的產(chǎn)生仍不容忽視。在食品加工過程中，若乳酸菌代謝產(chǎn)生過多的D-乳酸，可能會(huì)影響食品的品質(zhì)和安全性。D-乳酸含量過高會(huì)導(dǎo)致食品的酸度增加，影響口感；若長(zhǎng)期大量食用含有高濃度D-乳酸的食品，可能會(huì)對(duì)人體健康造成潛在威脅，如引發(fā)代謝性酸中毒等疾病。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，需要嚴(yán)格控制發(fā)酵條件，優(yōu)化發(fā)酵工藝，降低D-乳酸的產(chǎn)生量。通過調(diào)整發(fā)酵溫度、pH值、碳氮源比例等因素，篩選出最適合乳酸菌生長(zhǎng)且能減少D-乳酸產(chǎn)生的發(fā)酵條件；還可以通過基因工程技術(shù)，對(duì)乳酸菌的代謝途徑進(jìn)行調(diào)控，降低D-乳酸合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而減少D-乳酸的生成。兩株乳酸菌對(duì)部分抗生素具有抗性，雖然不攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒，但在食品生產(chǎn)過程中，若與其他微生物混合使用，仍存在耐藥基因通過其他方式轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。在發(fā)酵乳制品生產(chǎn)中，若乳酸菌與其他可能攜帶耐藥基因的微生物共存，可能會(huì)發(fā)生耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其他微生物獲得耐藥性，這不僅會(huì)影響發(fā)酵過程的正常進(jìn)行，還可能對(duì)公共衛(wèi)生安全造成潛在威脅。為了降低這種風(fēng)險(xiǎn)，在食品生產(chǎn)中，應(yīng)嚴(yán)格控制原料和生產(chǎn)環(huán)境的微生物污染，確保生產(chǎn)過程的衛(wèi)生安全；對(duì)與乳酸菌共同使用的其他微生物進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，避免耐藥基因的傳播；加強(qiáng)對(duì)食品生產(chǎn)過程的監(jiān)控，定期檢測(cè)產(chǎn)品中的微生物耐藥情況，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理潛在的問題。只有充分認(rèn)識(shí)到這些潛在風(fēng)險(xiǎn)，并采取有效的防控措施，才能確保乳酸菌DM9054和DM9057在食品和藥品生產(chǎn)中的安全應(yīng)用，為消費(fèi)者的健康提供保障。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過一系列全面且嚴(yán)謹(jǐn)?shù)陌踩栽u(píng)價(jià)試驗(yàn)，對(duì)乳酸菌DM9054和DM9057的安全性進(jìn)行了深入探究。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，一次性大劑量灌胃后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重、行為、精神等體征指標(biāo)均無異常，主要內(nèi)臟器官也未發(fā)生器質(zhì)性變化，這表明兩株乳酸菌在高劑量短時(shí)間暴露下，不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生明顯的急性毒性反應(yīng)，為其安全性提供了初步保障。耐藥性評(píng)價(jià)試驗(yàn)表明，兩株乳酸菌對(duì)部分抗生素具有抗性，但令人欣慰的是，它們均不攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒。這一特性在乳酸菌耐藥性研究中具有重要意義，大大降低了耐藥基因在環(huán)境中傳播的風(fēng)險(xiǎn)，減少了因耐藥基因傳播導(dǎo)致其他病原菌獲得耐藥性，進(jìn)而增加臨床治療難度和公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)的可能性。機(jī)體指標(biāo)評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果顯示，無論是灌胃還是腹腔注射，乳酸菌DM9054和DM9057對(duì)小鼠血清中丙二醛（MDA）、血清淀粉樣蛋白A（SAA）濃度及肝臟中谷胱甘肽（GSH）濃度的影響均較小。這說明兩株乳酸菌對(duì)小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)、炎癥反應(yīng)以及肝臟抗氧化能力均無顯著影響，在進(jìn)入機(jī)體后，不會(huì)引發(fā)明顯的氧化損傷和炎癥反應(yīng)，肝臟的抗氧化防御系統(tǒng)也能夠正常發(fā)揮作用。兩株乳酸菌在加入牛黃脫氧膽酸鈉鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，均不產(chǎn)生膽鹽羥化酶。膽鹽羥化酶能夠催化膽鹽的代謝，改變膽汁的組成和功能。乳酸菌不產(chǎn)生膽鹽羥化酶，意味著它們不會(huì)對(duì)機(jī)體的膽汁代謝產(chǎn)生影響，不會(huì)干擾膽汁在脂肪消化和吸收過程中的正常作用，減少了因膽汁代謝異常而引發(fā)相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。有害代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)試驗(yàn)檢測(cè)出兩株乳酸菌均產(chǎn)生D-