丹參素與黃芪對大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義肝纖維化（hepaticfibrosis）是肝臟對各種慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在肝臟內(nèi)過度沉積。它并非一個獨立的疾病，而是許多慢性肝病如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病等共有的病理過程。肝纖維化若得不到有效控制，會逐漸發(fā)展為肝硬化，進(jìn)而引發(fā)肝功能衰竭、門靜脈高壓、肝癌等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計，全球約有10%-20%的慢性肝病患者會發(fā)展為肝硬化，而肝硬化患者發(fā)生肝癌的年發(fā)生率為3%-6%。在我國，由于乙肝病毒感染人數(shù)眾多，肝纖維化和肝硬化的防治形勢尤為嚴(yán)峻。目前，臨床上針對肝纖維化的治療主要包括針對病因的治療，如抗病毒、戒酒等，以及一些抗纖維化藥物的應(yīng)用。然而，現(xiàn)有的抗纖維化藥物存在療效有限、副作用大等問題，如秋水仙堿雖有一定抗纖維化作用，但可引起胃腸道不適、骨髓抑制等不良反應(yīng)，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，尋找安全有效的抗肝纖維化藥物具有重要的臨床意義和社會價值。中醫(yī)藥在治療肝纖維化方面具有獨特的優(yōu)勢和潛力。丹參和黃芪作為傳統(tǒng)的中藥材，在臨床上廣泛應(yīng)用于肝病的治療，并顯示出一定的抗肝纖維化效果。丹參，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛等功效。丹參素（Danshensu）是丹參的水溶性主要活性成分，現(xiàn)代研究表明，丹參素具有抗氧化、抗炎、抑制細(xì)胞凋亡等多種藥理作用。在抗肝纖維化方面，丹參素可通過抑制肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化和增殖，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。有研究發(fā)現(xiàn)，給予造模成功的肝纖維化大鼠丹參素后，大鼠肝組織的病理改變明顯減輕，炎癥因子TNF-α和TGF-β1、內(nèi)毒素均有不同程度的降低。黃芪，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫等功效。黃芪在肝纖維化治療中也發(fā)揮著重要作用，其有效成分能夠抑制肝星狀細(xì)胞的活化，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成，促進(jìn)肝細(xì)胞的再生和修復(fù)，還具有顯著的抗炎和抗氧化作用，能夠減輕肝臟的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷。肝星狀細(xì)胞（HSC）在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起著核心作用。正常情況下，HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)肝臟受到損傷時，HSC被激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，大量增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。HSC的活化和增殖受到多種信號通路的調(diào)控，如TGF-β1/TβR/Smads信號通路等。深入研究丹參素和黃芪對HSC-T6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，有助于揭示其抗肝纖維化的作用機(jī)制，為開發(fā)新的抗肝纖維化藥物和治療策略提供理論依據(jù)，具有重要的科學(xué)研究價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，國內(nèi)外學(xué)者圍繞丹參素和黃芪抗肝纖維化的作用及其對HSC-T6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響開展了大量研究。在丹參素抗肝纖維化研究方面，國外學(xué)者較早關(guān)注到丹參素對肝臟疾病的潛在治療作用。有研究發(fā)現(xiàn)，丹參素可通過抑制HSC的活化和增殖，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成，從而減輕實驗性肝纖維化的程度。在一項動物實驗中，給予肝纖維化模型小鼠丹參素后，小鼠肝臟組織中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和I型膠原的表達(dá)明顯降低，提示丹參素能夠抑制HSC向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。國內(nèi)研究則進(jìn)一步深入探討了丹參素抗肝纖維化的作用機(jī)制。鄭元義等學(xué)者通過實驗證實，丹參素對大鼠免疫性肝纖維化有明顯的防治作用，其主要機(jī)制為對HSC的增殖抑制作用。實驗中，丹參素干預(yù)組的透明質(zhì)酸水平明顯低于模型組，且肝纖維化程度明顯減輕。此外，國內(nèi)研究還發(fā)現(xiàn)，丹參素可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，降低炎癥因子如TNF-α和TGF-β1的表達(dá)，減輕肝臟炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制肝纖維化的發(fā)展。關(guān)于黃芪抗肝纖維化的研究，國外研究表明，黃芪中的有效成分能夠抑制HSC的活化，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。一項在體外細(xì)胞實驗中發(fā)現(xiàn)，黃芪提取物可顯著降低HSC中I型膠原和纖連蛋白的分泌，抑制HSC的活化。國內(nèi)對黃芪抗肝纖維化的研究更為廣泛和深入。馬紅等人的研究顯示，黃芪對免疫損傷性肝纖維化大鼠具有治療作用，能減輕肝組織纖維化程度及肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的病理改變，減少I、III型膠原在肝內(nèi)的沉積。此外，黃芪還具有抗炎、抗氧化作用，能夠減輕肝臟的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)肝細(xì)胞免受進(jìn)一步損傷。馮學(xué)欣等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，黃芪可調(diào)節(jié)肝纖維化大鼠核因子-κB（NF-κB）的表達(dá)，抑制炎癥信號通路的激活，從而減輕肝纖維化。在丹參素和黃芪對HSC-T6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響的研究方面，國內(nèi)外研究均取得了一定進(jìn)展。研究表明，TGF-β1/TβR/Smads信號通路在HSC的活化和肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。丹參素可能通過抑制TGF-β1與其受體的結(jié)合，阻斷Smads蛋白的磷酸化，從而抑制TGF-β1/TβR/Smads信號通路的激活，減少HSC的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。黃芪也可能通過調(diào)節(jié)該信號通路，抑制HSC的活化和增殖，發(fā)揮抗肝纖維化作用。然而，目前對于丹參素和黃芪在該信號通路上的具體作用靶點和分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。盡管國內(nèi)外在丹參素和黃芪抗肝纖維化以及它們對HSC-T6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響的研究取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。一方面，現(xiàn)有研究多集中在單一成分或單一信號通路的研究，對于丹參素和黃芪多成分、多靶點協(xié)同作用的研究較少；另一方面，大部分研究為基礎(chǔ)實驗研究，臨床研究相對較少，其在臨床應(yīng)用中的療效和安全性仍需進(jìn)一步驗證。因此，深入研究丹參素和黃芪對HSC-T6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響及其協(xié)同作用機(jī)制，開展更多的臨床研究，對于開發(fā)新的抗肝纖維化藥物和治療策略具有重要意義，這也將是本文的重點研究方向。1.3研究目的與方法本研究旨在深入揭示丹參素和黃芪對大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體作用及機(jī)制，為肝纖維化的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療策略。在實驗方法上，主要采用細(xì)胞實驗，選取大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）作為研究對象，將其置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。通過不同濃度的丹參素和黃芪對HSC-T6細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理，設(shè)置正常對照組、模型對照組以及不同藥物濃度的實驗組。例如，丹參素設(shè)置低、中、高三個濃度梯度，分別為50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L；黃芪也設(shè)置相應(yīng)的濃度梯度，以觀察不同濃度下藥物對細(xì)胞的作用差異。運(yùn)用分子生物學(xué)檢測方法來深入探究丹參素和黃芪對HSC-T6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測相關(guān)基因的表達(dá)水平，如TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad7等基因，以明確藥物對TGF-β1/TβR/Smads信號通路中關(guān)鍵基因表達(dá)的調(diào)控作用。使用Westernblot技術(shù)檢測相應(yīng)蛋白的表達(dá)量，進(jìn)一步從蛋白水平驗證基因表達(dá)的變化，同時還能檢測信號通路中蛋白的磷酸化水平，了解信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活或抑制狀態(tài)。通過ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的含量，如TGF-β1、IL-6、TNF-α等，評估藥物對細(xì)胞炎癥反應(yīng)和纖維化相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響。利用免疫熒光染色技術(shù)觀察相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá)變化，直觀地展示藥物對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白的影響。通過上述研究方法，全面系統(tǒng)地分析丹參素和黃芪對HSC-T6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，有望為肝纖維化的治療提供新的靶點和理論支持，推動抗肝纖維化藥物的研發(fā)和臨床治療的發(fā)展。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）概述肝星狀細(xì)胞（HSC）是肝臟中的一類非實質(zhì)細(xì)胞，在維持肝臟正常生理功能和肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。HSC-T6是從大鼠肝星狀細(xì)胞中分離得來的穩(wěn)定細(xì)胞系，因其具有類似于原代肝星形細(xì)胞的特點，如表達(dá)肌動蛋白α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、膠原、TGF-β受體等，被廣泛應(yīng)用于肝纖維化相關(guān)機(jī)制和新藥篩選的研究。在正常肝臟中，HSC主要位于Disse間隙內(nèi)，緊貼著肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞，其形態(tài)不規(guī)則，胞體呈圓形或不規(guī)則形，常伸出數(shù)個星狀胞突包繞著肝血竇，還伸出胞突與肝細(xì)胞、鄰近的星狀細(xì)胞相接觸。正常情況下，HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，其胞質(zhì)內(nèi)含有1-14個直徑約1.0-2.0μm的富含維生素A和甘油三酯的脂滴，這些脂滴使其在顯微鏡下呈現(xiàn)出獨特的形態(tài)。靜止期HSC具有多種重要的生理功能：它能夠代謝和貯存維生素A，肝臟儲存了體內(nèi)約80%的維生素A，而HSC在其中起到了關(guān)鍵的儲存和代謝作用；還能儲存脂肪，為肝細(xì)胞提供能源；合成和分泌膠原及糖蛋白、蛋白多糖等基質(zhì)成分，是正常及纖維化肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)的主要合成細(xì)胞，正常肝臟中HSC合成的膠原以Ⅰ型、Ⅲ和Ⅳ型為主，其合成量是肝細(xì)胞的10倍、內(nèi)皮細(xì)胞的20倍以上；合成基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制劑，維持肝臟ECM的合成和分解的動態(tài)平衡；表達(dá)細(xì)胞因子及受體，參與肝細(xì)胞再生的調(diào)控，如分泌肝細(xì)胞生長因子（HGF），同時能表達(dá)少量的轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）、血小板衍生的生長因子（PDGF）和胰島素樣生長因子（IGF）等，以及TGF-β1的II、III型受體和PDGF受體的α亞單位等；參與肝竇血流調(diào)節(jié)，通過其纖長突起的收縮功能調(diào)節(jié)肝竇內(nèi)微循環(huán)，從而影響著肝臟的血流分布和門靜脈壓力。當(dāng)肝臟受到各種損傷，如病毒感染、酒精刺激、藥物損傷等，HSC會被激活，這一過程是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。激活后的HSC發(fā)生一系列表型轉(zhuǎn)化和功能改變，其形態(tài)逐漸變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞樣，細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)內(nèi)脂滴減少，α-SMA表達(dá)顯著增加，同時獲得較強(qiáng)的增殖、收縮、遷移和分泌能力。在增殖方面，激活的HSC大量增殖，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量迅速增加，為后續(xù)細(xì)胞外基質(zhì)的大量合成提供了細(xì)胞基礎(chǔ)。在收縮能力上，其收縮特性使得肝竇毛細(xì)血管化，影響肝臟的血液循環(huán)和物質(zhì)交換，進(jìn)一步加重肝臟損傷。在遷移能力方面，HSC能夠遷移到受損部位，參與炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)過程，但在病理情況下，過度遷移會導(dǎo)致纖維化區(qū)域擴(kuò)大。在分泌功能上，激活的HSC大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)，包括膠原蛋白（如Ⅰ型、Ⅲ型膠原）、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等，同時還分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如TGF-β1、PDGF、IL-6、TNF-α等。TGF-β1是一種關(guān)鍵的促纖維化細(xì)胞因子，它能夠進(jìn)一步激活HSC，形成正反饋調(diào)節(jié)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展；PDGF則是一種強(qiáng)有力的HSC促分裂原，能夠刺激HSC的增殖和遷移；IL-6和TNF-α等炎癥因子參與肝臟的炎癥反應(yīng)，加重肝臟損傷，間接促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。目前，關(guān)于HSC活化相關(guān)信號通路的研究已取得了顯著進(jìn)展。眾多信號通路參與了HSC的活化過程，其中TGF-β1/TβR/Smads信號通路是研究最為深入的關(guān)鍵通路之一。TGF-β1與其受體TβRⅠ和TβRⅡ結(jié)合后，使TβRⅠ磷酸化，進(jìn)而激活下游的Smads蛋白。Smad2和Smad3被磷酸化后，與Smad4形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)HSC的活化、增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成。此外，MAPK信號通路（包括ERK、JNK和p38MAPK）在HSC活化中也發(fā)揮重要作用。當(dāng)HSC受到刺激時，MAPK信號通路被激活，通過一系列的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)等過程，促進(jìn)HSC的活化和肝纖維化的發(fā)展。PI3K/Akt信號通路也參與了HSC的活化調(diào)節(jié)，該通路的激活可以抑制HSC的凋亡，促進(jìn)其存活和增殖，同時還能調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌。這些信號通路之間并非孤立存在，而是相互交織、相互影響，形成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控HSC的活化和肝纖維化的進(jìn)程。對這些信號通路的深入研究，有助于揭示肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，為尋找有效的抗肝纖維化治療靶點提供理論依據(jù)。2.2丹參素與黃芪的藥理特性丹參素，化學(xué)名為3,4-二羥基苯乳酸，是丹參水溶性提取物中的主要活性成分之一。丹參，作為唇形科植物丹參的干燥根和根莖，在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用歷史悠久，其味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰之功效?！侗静菥V目》中記載：“丹參，按《婦人明理論》云，四物湯治婦人病，不問產(chǎn)前產(chǎn)后，經(jīng)水多少，皆可通用，惟一味丹參散，主治與之相同。蓋丹參能破宿血，補(bǔ)新血，安生胎，落死胎，止崩中滯下，調(diào)經(jīng)脈。”現(xiàn)代研究表明，丹參中含有多種化學(xué)成分，主要包括脂溶性的丹參酮類和水溶性的酚酸類，丹參素就屬于酚酸類成分。在抗肝纖維化方面，丹參素展現(xiàn)出了顯著的作用。眾多研究表明，丹參素能夠抑制肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化和增殖。HSC是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵細(xì)胞，正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)肝臟受到損傷時，HSC被激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，大量增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。丹參素可通過多種途徑抑制HSC的活化，有研究發(fā)現(xiàn)，丹參素能夠降低HSC中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達(dá)，α-SMA是HSC活化的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)的降低意味著HSC活化程度的減弱。此外，丹參素還能減少HSC分泌細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、纖維連接蛋白等，從而減輕肝纖維化的程度。在一項體外細(xì)胞實驗中，用不同濃度的丹參素處理HSC-T6細(xì)胞，結(jié)果顯示，隨著丹參素濃度的增加，細(xì)胞外基質(zhì)中I型膠原和III型膠原的分泌量顯著減少。黃芪，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，味甘，性微溫，歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌等功效。黃芪的化學(xué)成分十分復(fù)雜，主要包括黃芪多糖、皂苷類、黃酮類化合物等。黃芪多糖是黃芪中含量較高的一類成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性；黃芪皂苷具有強(qiáng)心、降壓、抗炎等作用；黃酮類化合物則具有抗氧化、抗炎、抗菌等功效。在肝纖維化治療領(lǐng)域，黃芪同樣發(fā)揮著重要作用。黃芪能夠抑制HSC的活化和增殖，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)、抗氧化應(yīng)激等有關(guān)。黃芪中的有效成分可以降低HSC中TGF-β1的表達(dá)，TGF-β1是一種重要的促纖維化細(xì)胞因子，其表達(dá)的降低能夠抑制HSC的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。黃芪還具有抗氧化作用，能夠減輕肝臟的氧化應(yīng)激損傷。肝臟在受到損傷時，會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），ROS可損傷肝細(xì)胞，促進(jìn)HSC的活化，而黃芪中的黃酮類等成分具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能夠清除ROS，減少氧化應(yīng)激對肝臟的損傷，從而間接抑制肝纖維化的發(fā)展。有研究報道，給予肝纖維化模型大鼠黃芪提取物后，大鼠肝臟組織中的丙二醛（MDA）含量顯著降低，超氧化物歧化酶（SOD）活性明顯升高，表明黃芪能夠減輕肝臟的氧化應(yīng)激狀態(tài)。此外，黃芪還能促進(jìn)肝細(xì)胞的再生和修復(fù)，改善肝臟的功能，在肝纖維化的治療中具有重要的意義。2.3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)理論細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是指細(xì)胞通過細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)的受體，感受細(xì)胞外信號分子（如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子等）的刺激，將信號轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)的一系列化學(xué)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞生理功能改變的過程。這一過程對于維持細(xì)胞的正常生理功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡以及應(yīng)對外界環(huán)境變化等方面都具有至關(guān)重要的作用。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要分為三種類型：離子通道型受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和酶聯(lián)型受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。離子通道型受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是指當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)等信號分子與離子通道型受體結(jié)合后，可使離子通道開放或關(guān)閉，從而改變細(xì)胞膜對某些離子的通透性，引起細(xì)胞膜電位的變化，實現(xiàn)信號的快速傳遞，如乙酰膽堿與骨骼肌細(xì)胞膜上的N?型乙酰膽堿受體結(jié)合，使通道開放，Na?內(nèi)流，引起肌肉收縮。G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是最常見的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，該途徑涉及G蛋白、腺苷酸環(huán)化酶、蛋白激酶A等多種信號分子。當(dāng)信號分子與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合后，激活G蛋白，G蛋白再激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)的ATP轉(zhuǎn)化為cAMP，cAMP作為第二信使激活蛋白激酶A，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的多種生理過程，如腎上腺素與心肌細(xì)胞膜上的β?腎上腺素能受體結(jié)合，通過G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶，使cAMP水平升高，激活蛋白激酶A，導(dǎo)致心肌收縮力增強(qiáng)。酶聯(lián)型受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)則是受體本身具有酶活性，或者與酶結(jié)合形成復(fù)合物。當(dāng)信號分子與酶聯(lián)型受體結(jié)合后，可激活受體的酶活性，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，如胰島素與胰島素受體結(jié)合后，使受體的酪氨酸激酶活性激活，進(jìn)而激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）等信號分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和生長。在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，多種信號通路參與其中，TGF-β1/TβR/Smads信號通路是關(guān)鍵的促纖維化信號通路之一。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是一種多功能細(xì)胞因子，在肝纖維化過程中發(fā)揮著核心作用。正常情況下，肝臟中TGF-β1的表達(dá)水平較低，但當(dāng)肝臟受到損傷時，多種細(xì)胞如肝細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞等會分泌大量的TGF-β1。TGF-β1通過與細(xì)胞膜上的TβRⅠ和TβRⅡ結(jié)合，啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。TβRⅡ是一種組成性激活的絲氨酸/蘇氨酸激酶，當(dāng)TGF-β1與TβRⅡ結(jié)合后，招募并磷酸化TβRⅠ，使TβRⅠ激活。激活后的TβRⅠ進(jìn)而磷酸化下游的受體調(diào)節(jié)型Smads蛋白（R-Smads），主要是Smad2和Smad3。磷酸化的Smad2和Smad3與Smad4形成異源三聚體復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。這些靶基因包括編碼細(xì)胞外基質(zhì)成分（如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白等）的基因，以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）表達(dá)、促進(jìn)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）表達(dá)的基因。細(xì)胞外基質(zhì)成分的大量合成以及MMPs表達(dá)減少、TIMPs表達(dá)增加，共同導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。此外，TGF-β1/TβR/Smads信號通路還能促進(jìn)肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化、增殖和遷移，進(jìn)一步加重肝纖維化。研究表明，在肝纖維化模型中，阻斷TGF-β1/TβR/Smads信號通路可以顯著減輕肝臟的纖維化程度，這也進(jìn)一步證實了該信號通路在肝纖維化中的關(guān)鍵作用。除了TGF-β1/TβR/Smads信號通路外，還有其他一些信號通路也參與了肝纖維化的過程，如PDGF信號通路、MAPK信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等，它們與TGF-β1/TβR/Smads信號通路相互作用，共同調(diào)控肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。三、丹參素對大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響3.1實驗設(shè)計與材料方法實驗選取大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）作為研究對象，所有細(xì)胞均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。將HSC-T6細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每隔2-3天進(jìn)行一次傳代，傳代時使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化。實驗分組設(shè)置如下：正常對照組，該組細(xì)胞僅加入正常的培養(yǎng)基，不做任何藥物處理，作為實驗的基礎(chǔ)對照；模型對照組，加入含10ng/mLTGF-β1的培養(yǎng)基，以誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞活化，模擬肝纖維化的細(xì)胞模型；丹參素低劑量組，在加入10ng/mLTGF-β1的同時，加入濃度為50μmol/L的丹參素；丹參素中劑量組，加入10ng/mLTGF-β1和100μmol/L的丹參素；丹參素高劑量組，加入10ng/mLTGF-β1和200μmol/L的丹參素。每個組設(shè)置6個復(fù)孔，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。丹參素購自上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，用無菌PBS溶解配制成100mmol/L的母液，-20℃保存，使用時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。在細(xì)胞處理過程中，當(dāng)HSC-T6細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，將其接種于96孔板或6孔板中。在96孔板中每孔接種5×103個細(xì)胞，在6孔板中每孔接種2×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，按照上述分組進(jìn)行處理。各實驗組加入相應(yīng)濃度的丹參素和TGF-β1，正常對照組和模型對照組加入等體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h或72h，以觀察不同時間點丹參素對細(xì)胞的作用效果。檢測指標(biāo)及方法如下：細(xì)胞增殖檢測：采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前2h，向96孔板中每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育2h后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)OD值計算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。α-SMA表達(dá)檢測：采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測α-SMA的表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定15min，0.3%TritonX-100通透10min，5%BSA封閉30min，然后加入兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，PBS沖洗3次，每次5min，加入山羊抗兔IgG-FITC二抗（1:200稀釋），室溫孵育1h，PBS沖洗后，用DAPI染核5min，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，通過ImageJ軟件分析α-SMA陽性細(xì)胞的平均光密度值，以反映α-SMA的表達(dá)水平。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分檢測：采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中I型膠原和纖維連接蛋白的含量。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，首先將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入酶標(biāo)板中，37℃孵育2h，洗滌后加入生物素化的檢測抗體，37℃孵育1h，再次洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，37℃孵育30min，最后加入底物顯色，在酶標(biāo)儀上450nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中I型膠原和纖維連接蛋白的含量。TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)基因表達(dá)檢測：采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad7基因的mRNA表達(dá)水平。使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。引物序列根據(jù)GenBank中大鼠相應(yīng)基因序列設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成，具體引物序列如下：TGF-β1：上游引物5'-CCAGAGCAGTACAGCCAGAA-3'，下游引物5'-CTCGTAGGTGGAGGTGATGG-3'；TβRⅠ：上游引物5'-CGGAGAGTACCTGCTGACCT-3'，下游引物5'-GGCACAGTTCAGATGCTGTC-3'；TβRⅡ：上游引物5'-CCCAGTACAGCCACAGTCTT-3'，下游引物5'-CTCAGAGGGACAGGGAAGAC-3'；Smad2：上游引物5'-CCAGAGCAGTACAGCCAGAA-3'，下游引物5'-CTCGTAGGTGGAGGTGATGG-3'；Smad3：上游引物5'-GGGAGAGTACCTGCTGACCT-3'，下游引物5'-GGCACAGTTCAGATGCTGTC-3'；Smad7：上游引物5'-CCCAGTACAGCCACAGTCTT-3'，下游引物5'-CTCAGAGGGACAGGGAAGAC-3'；GAPDH：上游引物5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3'，下游引物5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測：采用Westernblot技術(shù)檢測TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad7蛋白以及p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達(dá)水平。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1h，加入相應(yīng)的一抗（兔抗大鼠TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad7、p-Smad2、p-Smad3抗體，均為1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌3次，每次10min，加入山羊抗兔IgG-HRP二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h，TBST洗滌后，采用化學(xué)發(fā)光法顯影，ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。3.2實驗結(jié)果分析在細(xì)胞增殖實驗中，CCK-8法檢測結(jié)果顯示（圖1），與正常對照組相比，模型對照組HSC-T6細(xì)胞的增殖明顯增強(qiáng)，OD值顯著升高（P<0.01），表明TGF-β1成功誘導(dǎo)了HSC-T6細(xì)胞的活化和增殖。而丹參素各劑量組的細(xì)胞增殖均受到不同程度的抑制，且隨著丹參素濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。丹參素低劑量組的OD值較模型對照組有所降低（P<0.05），中劑量組和高劑量組的OD值顯著低于模型對照組（P<0.01），呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。這表明丹參素能夠有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞增殖。[此處插入細(xì)胞增殖實驗結(jié)果的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組，縱坐標(biāo)為OD值][此處插入細(xì)胞增殖實驗結(jié)果的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組，縱坐標(biāo)為OD值]免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測α-SMA表達(dá)結(jié)果表明（圖2），正常對照組HSC-T6細(xì)胞中α-SMA表達(dá)較弱，陽性細(xì)胞的平均光密度值較低；模型對照組中α-SMA表達(dá)顯著增強(qiáng)，陽性細(xì)胞的平均光密度值明顯升高（P<0.01），說明TGF-β1刺激使HSC-T6細(xì)胞活化，α-SMA表達(dá)上調(diào)。丹參素各劑量組中α-SMA的表達(dá)均低于模型對照組，且丹參素中劑量組和高劑量組與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明丹參素能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)，從而抑制HSC的活化。[此處插入α-SMA表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖，包括正常對照組、模型對照組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組的細(xì)胞染色圖片，以及對應(yīng)的陽性細(xì)胞平均光密度值柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為平均光密度值][此處插入α-SMA表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖，包括正常對照組、模型對照組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組的細(xì)胞染色圖片，以及對應(yīng)的陽性細(xì)胞平均光密度值柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為平均光密度值]ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中I型膠原和纖維連接蛋白的含量結(jié)果顯示（圖3），模型對照組中I型膠原和纖維連接蛋白的含量顯著高于正常對照組（P<0.01），表明TGF-β1刺激促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌。丹參素各劑量組中I型膠原和纖維連接蛋白的含量均低于模型對照組，且隨著丹參素濃度的增加，含量逐漸降低。丹參素高劑量組中I型膠原和纖維連接蛋白的含量與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），說明丹參素能夠減少TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌。[此處插入I型膠原和纖維連接蛋白含量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組，縱坐標(biāo)分別為I型膠原含量和纖維連接蛋白含量][此處插入I型膠原和纖維連接蛋白含量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組，縱坐標(biāo)分別為I型膠原含量和纖維連接蛋白含量]實時熒光定量PCR檢測TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果表明（圖4），與正常對照組相比，模型對照組中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），Smad7基因的mRNA表達(dá)水平降低（P<0.01）。丹參素各劑量組中，TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3基因的mRNA表達(dá)水平均低于模型對照組，且隨著丹參素濃度的增加，降低趨勢更加明顯。丹參素高劑量組中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3基因的mRNA表達(dá)水平與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。同時，丹參素各劑量組中Smad7基因的mRNA表達(dá)水平均高于模型對照組，丹參素高劑量組中Smad7基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于模型對照組（P<0.01）。這表明丹參素能夠調(diào)節(jié)TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)基因的表達(dá)，抑制TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3基因的表達(dá)，上調(diào)Smad7基因的表達(dá)。[此處插入TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組，縱坐標(biāo)為各基因的相對表達(dá)量，每個基因?qū)?yīng)一個柱狀圖][此處插入TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組，縱坐標(biāo)為各基因的相對表達(dá)量，每個基因?qū)?yīng)一個柱狀圖]Westernblot檢測TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示（圖5），模型對照組中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達(dá)水平顯著高于正常對照組（P<0.01），Smad7蛋白的表達(dá)水平低于正常對照組（P<0.01）。丹參素各劑量組中，TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達(dá)水平均低于模型對照組，且隨著丹參素濃度的增加，降低程度更加明顯。丹參素高劑量組中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達(dá)水平與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。同時，丹參素各劑量組中Smad7蛋白的表達(dá)水平均高于模型對照組，丹參素高劑量組中Smad7蛋白的表達(dá)水平顯著高于模型對照組（P<0.01）。這進(jìn)一步從蛋白水平證實了丹參素能夠抑制TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，上調(diào)Smad7蛋白的表達(dá)，抑制Smad2、Smad3的磷酸化，從而阻斷該信號通路的激活。[此處插入Westernblot檢測結(jié)果的蛋白條帶圖，以及對應(yīng)的蛋白相對表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組，縱坐標(biāo)為各蛋白的相對表達(dá)量，每個蛋白對應(yīng)一個柱狀圖][此處插入Westernblot檢測結(jié)果的蛋白條帶圖，以及對應(yīng)的蛋白相對表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組，縱坐標(biāo)為各蛋白的相對表達(dá)量，每個蛋白對應(yīng)一個柱狀圖]綜合以上實驗結(jié)果，丹參素能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞的增殖、活化以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)有關(guān)。丹參素通過下調(diào)TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3的表達(dá)，上調(diào)Smad7的表達(dá)，抑制Smad2、Smad3的磷酸化，從而阻斷TGF-β1/TβR/Smads信號通路的激活，發(fā)揮抗肝纖維化作用。3.3作用機(jī)制探討細(xì)胞膜受體是細(xì)胞感受外界信號的關(guān)鍵部位，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要的介導(dǎo)作用。對于丹參素抑制HSC-T6活化增殖的機(jī)制研究，從細(xì)胞膜受體層面來看，TGF-β1受體（TβR）是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。TGF-β1需與細(xì)胞膜上的TβRⅠ和TβRⅡ結(jié)合，才能啟動下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)HSC的活化和增殖。本實驗結(jié)果顯示，丹參素能夠顯著下調(diào)TβRⅠ和TβRⅡ的表達(dá)，這可能是其抑制HSC-T6活化增殖的重要機(jī)制之一。當(dāng)TβRⅠ和TβRⅡ表達(dá)降低時，TGF-β1與受體的結(jié)合機(jī)會減少，信號無法正常傳遞，從而阻斷了TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6活化和增殖過程。相關(guān)研究也表明，在其他細(xì)胞模型中，某些藥物通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜受體的表達(dá)，能夠有效抑制細(xì)胞的異常增殖和活化，這與本實驗中丹參素對TβR的調(diào)節(jié)作用具有相似性，進(jìn)一步支持了丹參素通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜受體抑制HSC-T6活化增殖的觀點。在分子機(jī)制方面，TGF-β1/TβR/Smads信號通路在肝纖維化過程中起著核心作用，而丹參素對該信號通路的調(diào)節(jié)是其抗肝纖維化的關(guān)鍵機(jī)制。在正常生理狀態(tài)下，TGF-β1/TβR/Smads信號通路處于相對平衡的狀態(tài)，維持著肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的正常合成和降解。當(dāng)肝臟受到損傷時，TGF-β1大量表達(dá)，與TβRⅠ和TβRⅡ結(jié)合，激活下游的Smad2和Smad3蛋白。磷酸化的Smad2和Smad3與Smad4形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)，這些基因包括編碼細(xì)胞外基質(zhì)成分（如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原等）的基因，以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）表達(dá)、促進(jìn)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）表達(dá)的基因，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，引發(fā)肝纖維化。本研究中，丹參素能夠下調(diào)TGF-β1、Smad2和Smad3的表達(dá)，同時上調(diào)Smad7的表達(dá)，抑制Smad2、Smad3的磷酸化，從而阻斷TGF-β1/TβR/Smads信號通路的激活。Smad7是TGF-β1/Smads信號通路的抑制性調(diào)節(jié)因子，它可以與TβRⅠ結(jié)合，阻止Smad2和Smad3的磷酸化，從而抑制信號通路的傳導(dǎo)。丹參素上調(diào)Smad7的表達(dá)，增強(qiáng)了對TGF-β1/Smads信號通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，抑制了HSC的活化和增殖，減少了細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌。此外，丹參素下調(diào)TGF-β1、Smad2和Smad3的表達(dá)，從上游和中游環(huán)節(jié)阻斷了信號通路的激活，使得信號無法順利傳遞到細(xì)胞核，進(jìn)而抑制了相關(guān)基因的表達(dá)，減少了細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。這一系列作用機(jī)制表明，丹參素通過多靶點調(diào)節(jié)TGF-β1/TβR/Smads信號通路，發(fā)揮了顯著的抗肝纖維化作用。四、黃芪對大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響4.1實驗設(shè)計與材料方法黃芪提取物的制備采用水提醇沉法。選取優(yōu)質(zhì)黃芪藥材，洗凈后粉碎，加入10倍量的蒸餾水，浸泡30分鐘，然后加熱回流提取3次，每次2小時。合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮至相對密度為1.20（60℃）的浸膏。向浸膏中加入4倍量的95%乙醇，攪拌均勻，靜置過夜，使多糖等雜質(zhì)沉淀。次日，過濾，收集上清液，減壓回收乙醇，得到黃芪提取物，將其冷凍干燥成粉末狀，-20℃保存?zhèn)溆?。實驗分組設(shè)置如下：正常對照組，該組細(xì)胞加入正常的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，不做任何藥物處理，作為正常生長狀態(tài)的對照；模型對照組，加入含10ng/mLTGF-β1的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞活化，模擬肝纖維化的細(xì)胞模型；黃芪低劑量組，在加入10ng/mLTGF-β1的同時，加入濃度為25μg/mL的黃芪提取物；黃芪中劑量組，加入10ng/mLTGF-β1和50μg/mL的黃芪提取物；黃芪高劑量組，加入10ng/mLTGF-β1和100μg/mL的黃芪提取物。每個組設(shè)置6個復(fù)孔，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。將處于對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞接種于96孔板或6孔板中。在96孔板中每孔接種5×103個細(xì)胞，在6孔板中每孔接種2×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，按照上述分組進(jìn)行處理。各實驗組加入相應(yīng)濃度的黃芪提取物和TGF-β1，正常對照組和模型對照組加入等體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h或72h，以觀察不同時間點黃芪對細(xì)胞的作用效果。檢測指標(biāo)及方法如下：細(xì)胞增殖檢測：運(yùn)用CCK-8法來檢測細(xì)胞增殖情況。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前2h，向96孔板中每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育2h后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)OD值計算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。α-SMA表達(dá)檢測：采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法來檢測α-SMA的表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定15min，0.3%TritonX-100通透10min，5%BSA封閉30min，然后加入兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，PBS沖洗3次，每次5min，加入山羊抗兔IgG-FITC二抗（1:200稀釋），室溫孵育1h，PBS沖洗后，用DAPI染核5min，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，通過ImageJ軟件分析α-SMA陽性細(xì)胞的平均光密度值，以此反映α-SMA的表達(dá)水平。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分檢測：通過ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中I型膠原和纖維連接蛋白的含量。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，首先將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入酶標(biāo)板中，37℃孵育2h，洗滌后加入生物素化的檢測抗體，37℃孵育1h，再次洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，37℃孵育30min，最后加入底物顯色，在酶標(biāo)儀上450nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中I型膠原和纖維連接蛋白的含量。TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)基因表達(dá)檢測：利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad7基因的mRNA表達(dá)水平。使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。引物序列根據(jù)GenBank中大鼠相應(yīng)基因序列設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成，具體引物序列如下：TGF-β1：上游引物5'-CCAGAGCAGTACAGCCAGAA-3'，下游引物5'-CTCGTAGGTGGAGGTGATGG-3'；TβRⅠ：上游引物5'-CGGAGAGTACCTGCTGACCT-3'，下游引物5'-GGCACAGTTCAGATGCTGTC-3'；TβRⅡ：上游引物5'-CCCAGTACAGCCACAGTCTT-3'，下游引物5'-CTCAGAGGGACAGGGAAGAC-3'；Smad2：上游引物5'-CCAGAGCAGTACAGCCAGAA-3'，下游引物5'-CTCGTAGGTGGAGGTGATGG-3'；Smad3：上游引物5'-GGGAGAGTACCTGCTGACCT-3'，下游引物5'-GGCACAGTTCAGATGCTGTC-3'；Smad7：上游引物5'-CCCAGTACAGCCACAGTCTT-3'，下游引物5'-CTCAGAGGGACAGGGAAGAC-3'；GAPDH：上游引物5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3'，下游引物5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測：采用Westernblot技術(shù)檢測TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad7蛋白以及p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達(dá)水平。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1h，加入相應(yīng)的一抗（兔抗大鼠TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad7、p-Smad2、p-Smad3抗體，均為1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌3次，每次10min，加入山羊抗兔IgG-HRP二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h，TBST洗滌后，采用化學(xué)發(fā)光法顯影，ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。4.2實驗結(jié)果分析在細(xì)胞增殖實驗中，CCK-8檢測結(jié)果如圖6所示。正常對照組HSC-T6細(xì)胞正常生長，其OD值較為穩(wěn)定。模型對照組中，由于TGF-β1的刺激，細(xì)胞增殖顯著增強(qiáng)，OD值明顯高于正常對照組（P<0.01），這表明TGF-β1成功誘導(dǎo)了細(xì)胞的活化與增殖。而黃芪各劑量組細(xì)胞的增殖均受到不同程度的抑制，與模型對照組相比，黃芪低劑量組OD值有所降低（P<0.05），中劑量組和高劑量組的OD值顯著降低（P<0.01），且隨著黃芪濃度的增加，抑制作用愈發(fā)明顯，呈現(xiàn)出良好的劑量依賴性。這清晰地表明黃芪能夠有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞增殖。[此處插入細(xì)胞增殖實驗結(jié)果的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、黃芪低劑量組、黃芪中劑量組、黃芪高劑量組，縱坐標(biāo)為OD值][此處插入細(xì)胞增殖實驗結(jié)果的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、黃芪低劑量組、黃芪中劑量組、黃芪高劑量組，縱坐標(biāo)為OD值]免疫細(xì)胞化學(xué)染色法用于檢測α-SMA的表達(dá)，結(jié)果如圖7所示。正常對照組細(xì)胞中α-SMA表達(dá)微弱，陽性細(xì)胞平均光密度值較低；模型對照組中α-SMA表達(dá)顯著上調(diào)，陽性細(xì)胞平均光密度值大幅升高（P<0.01），說明TGF-β1刺激導(dǎo)致HSC-T6細(xì)胞活化，α-SMA表達(dá)增加。黃芪各劑量組中α-SMA的表達(dá)均低于模型對照組，其中黃芪中劑量組和高劑量組與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明黃芪能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)，進(jìn)而抑制HSC的活化。[此處插入α-SMA表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖，包括正常對照組、模型對照組、黃芪低劑量組、黃芪中劑量組、黃芪高劑量組的細(xì)胞染色圖片，以及對應(yīng)的陽性細(xì)胞平均光密度值柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為平均光密度值][此處插入α-SMA表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖，包括正常對照組、模型對照組、黃芪低劑量組、黃芪中劑量組、黃芪高劑量組的細(xì)胞染色圖片，以及對應(yīng)的陽性細(xì)胞平均光密度值柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為平均光密度值]通過ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中I型膠原和纖維連接蛋白的含量，結(jié)果如圖8所示。模型對照組中I型膠原和纖維連接蛋白的含量顯著高于正常對照組（P<0.01），表明TGF-β1刺激促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌。黃芪各劑量組中I型膠原和纖維連接蛋白的含量均低于模型對照組，且隨著黃芪濃度的升高，含量逐漸降低。黃芪高劑量組中I型膠原和纖維連接蛋白的含量與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），說明黃芪能夠減少TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌。[此處插入I型膠原和纖維連接蛋白含量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、黃芪低劑量組、黃芪中劑量組、黃芪高劑量組，縱坐標(biāo)分別為I型膠原含量和纖維連接蛋白含量][此處插入I型膠原和纖維連接蛋白含量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、黃芪低劑量組、黃芪中劑量組、黃芪高劑量組，縱坐標(biāo)分別為I型膠原含量和纖維連接蛋白含量]實時熒光定量PCR用于檢測TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果如圖9所示。與正常對照組相比，模型對照組中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），Smad7基因的mRNA表達(dá)水平降低（P<0.01）。黃芪各劑量組中，TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3基因的mRNA表達(dá)水平均低于模型對照組，且隨著黃芪濃度的增加，降低趨勢更為明顯。黃芪高劑量組中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3基因的mRNA表達(dá)水平與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。同時，黃芪各劑量組中Smad7基因的mRNA表達(dá)水平均高于模型對照組，黃芪高劑量組中Smad7基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于模型對照組（P<0.01）。這表明黃芪能夠調(diào)節(jié)TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)基因的表達(dá)，抑制TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3基因的表達(dá)，上調(diào)Smad7基因的表達(dá)。[此處插入TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、黃芪低劑量組、黃芪中劑量組、黃芪高劑量組，縱坐標(biāo)為各基因的相對表達(dá)量，每個基因?qū)?yīng)一個柱狀圖][此處插入TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、黃芪低劑量組、黃芪中劑量組、黃芪高劑量組，縱坐標(biāo)為各基因的相對表達(dá)量，每個基因?qū)?yīng)一個柱狀圖]利用Westernblot檢測TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖10所示。模型對照組中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達(dá)水平顯著高于正常對照組（P<0.01），Smad7蛋白的表達(dá)水平低于正常對照組（P<0.01）。黃芪各劑量組中，TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達(dá)水平均低于模型對照組，且隨著黃芪濃度的增加，降低程度更加明顯。黃芪高劑量組中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達(dá)水平與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。同時，黃芪各劑量組中Smad7蛋白的表達(dá)水平均高于模型對照組，黃芪高劑量組中Smad7蛋白的表達(dá)水平顯著高于模型對照組（P<0.01）。這進(jìn)一步從蛋白水平證實了黃芪能夠抑制TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，上調(diào)Smad7蛋白的表達(dá)，抑制Smad2、Smad3的磷酸化，從而阻斷該信號通路的激活。[此處插入Westernblot檢測結(jié)果的蛋白條帶圖，以及對應(yīng)的蛋白相對表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、黃芪低劑量組、黃芪中劑量組、黃芪高劑量組，縱坐標(biāo)為各蛋白的相對表達(dá)量，每個蛋白對應(yīng)一個柱狀圖][此處插入Westernblot檢測結(jié)果的蛋白條帶圖，以及對應(yīng)的蛋白相對表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、黃芪低劑量組、黃芪中劑量組、黃芪高劑量組，縱坐標(biāo)為各蛋白的相對表達(dá)量，每個蛋白對應(yīng)一個柱狀圖]綜合以上實驗結(jié)果，黃芪能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞的增殖、活化以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)有關(guān)。黃芪通過下調(diào)TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3的表達(dá)，上調(diào)Smad7的表達(dá)，抑制Smad2、Smad3的磷酸化，從而阻斷TGF-β1/TβR/Smads信號通路的激活，發(fā)揮抗肝纖維化作用。4.3作用機(jī)制探討黃芪抗肝纖維化的作用機(jī)制涉及多個層面，從細(xì)胞膜受體角度來看，TGF-β1受體（TβR）是其重要作用靶點之一。TβR分為TβRⅠ和TβRⅡ，在肝纖維化過程中，TGF-β1與TβRⅠ和TβRⅡ結(jié)合，激活下游信號通路，促使HSC活化和增殖。本實驗中，黃芪能夠顯著下調(diào)TβRⅠ和TβRⅡ的表達(dá)，這一作用減少了TGF-β1與受體的結(jié)合機(jī)會，從而抑制了TGF-β1信號的傳遞，有效阻斷了HSC-T6細(xì)胞的活化和增殖過程。有研究表明，在其他細(xì)胞模型中，調(diào)節(jié)TβR的表達(dá)能夠影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，這與本實驗中黃芪對TβR的調(diào)節(jié)作用相呼應(yīng)，進(jìn)一步支持了黃芪通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜受體發(fā)揮抗肝纖維化作用的觀點。在分子機(jī)制層面，黃芪對TGF-β1/TβR/Smads信號通路的調(diào)節(jié)是其抗肝纖維化的關(guān)鍵。正常肝臟中，TGF-β1/TβR/Smads信號通路維持著動態(tài)平衡，保證肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的正常代謝。當(dāng)肝臟受損時，TGF-β1大量表達(dá)，與TβRⅠ和TβRⅡ結(jié)合，激活Smad2和Smad3蛋白，使其磷酸化后與Smad4形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，導(dǎo)致肝纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪能夠下調(diào)TGF-β1、Smad2和Smad3的表達(dá)，同時上調(diào)Smad7的表達(dá)，抑制Smad2、Smad3的磷酸化，從而阻斷TGF-β1/TβR/Smads信號通路的激活。Smad7作為TGF-β1/Smads信號通路的抑制性調(diào)節(jié)因子，可與TβRⅠ結(jié)合，阻止Smad2和Smad3的磷酸化，抑制信號傳導(dǎo)。黃芪上調(diào)Smad7的表達(dá)，增強(qiáng)了對TGF-β1/Smads信號通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，抑制了HSC的活化和增殖，減少了細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌。此外，黃芪下調(diào)TGF-β1、Smad2和Smad3的表達(dá)，從信號通路的上游和中游環(huán)節(jié)進(jìn)行阻斷，使信號無法順利傳遞到細(xì)胞核，抑制了相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而減少了細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。這一系列作用表明，黃芪通過多靶點調(diào)節(jié)TGF-β1/TβR/Smads信號通路，有效發(fā)揮了抗肝纖維化作用。除了TGF-β1/TβR/Smads信號通路，黃芪還可能通過調(diào)節(jié)其他信號通路來發(fā)揮抗肝纖維化作用。有研究表明，黃芪可以調(diào)節(jié)p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號通路。p38MAPK信號通路在HSC的活化和肝纖維化進(jìn)程中起著重要作用，HSC活化程度越高，p38MAPK磷酸化程度越高。黃芪中的有效成分，如黃芪甲苷，可通過誘導(dǎo)Nrf2的表達(dá)增加GSH含量，抑制氧化應(yīng)激，并參與p38MAPK磷酸化抑制，從而抑制HSC激活。黃芪還可通過內(nèi)源性機(jī)制激發(fā)p38MAPK信號表達(dá)，競爭性抑制Smad2/3向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，阻斷TGF-β1信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，使I和III型膠原的表達(dá)減少，發(fā)揮抗纖維化作用。這表明黃芪通過調(diào)節(jié)p38MAPK信號通路，抑制氧化應(yīng)激、抑制膠原合成、抑制HSC活化，進(jìn)一步增強(qiáng)了其抗肝纖維化的效果。綜上所述，黃芪抗肝纖維化的作用機(jī)制是多靶點、多通路協(xié)同作用的結(jié)果。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜受體表達(dá)，多靶點調(diào)控TGF-β1/TβR/Smads信號通路，以及調(diào)節(jié)p38MAPK等其他相關(guān)信號通路，黃芪有效抑制了HSC的活化、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，從而發(fā)揮顯著的抗肝纖維化作用。五、丹參素與黃芪聯(lián)合對大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響5.1聯(lián)合實驗設(shè)計與方法為深入探究丹參素與黃芪聯(lián)合使用對大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，本實驗進(jìn)行了如下設(shè)計：實驗分組：將實驗分為正常對照組、模型對照組、丹參素單藥組、黃芪單藥組以及丹參素與黃芪聯(lián)合用藥組。其中，丹參素單藥組又分為低、中、高三個劑量組，分別加入濃度為50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的丹參素；黃芪單藥組同樣設(shè)置低、中、高三個劑量組，加入濃度為25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的黃芪提取物；聯(lián)合用藥組則是在丹參素和黃芪各自低、中、高劑量的基礎(chǔ)上進(jìn)行組合，例如丹參素低劑量（50μmol/L）與黃芪低劑量（25μg/mL）聯(lián)合，以此類推，共九個聯(lián)合用藥亞組。每個組設(shè)置6個復(fù)孔，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。細(xì)胞培養(yǎng)與處理：選取處于對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞，以5×103個細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，或以2×10?個細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，置于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組處理。正常對照組加入正常培養(yǎng)基，模型對照組加入含10ng/mLTGF-β1的培養(yǎng)基，以誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞活化，模擬肝纖維化的細(xì)胞模型。丹參素單藥組、黃芪單藥組以及聯(lián)合用藥組在加入10ng/mLTGF-β1的同時，分別加入相應(yīng)濃度的丹參素、黃芪提取物或兩者的組合，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h或72h。檢測指標(biāo)與方法：細(xì)胞增殖檢測：采用CCK-8法。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前2h，向96孔板中每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育2h后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)OD值計算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。α-SMA表達(dá)檢測：運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定15min，0.3%TritonX-100通透10min，5%BSA封閉30min，然后加入兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，PBS沖洗3次，每次5min，加入山羊抗兔IgG-FITC二抗（1:200稀釋），室溫孵育1h，PBS沖洗后，用DAPI染核5min，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，通過ImageJ軟件分析α-SMA陽性細(xì)胞的平均光密度值，以此反映α-SMA的表達(dá)水平。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分檢測：通過ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中I型膠原和纖維連接蛋白的含量。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，首先將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入酶標(biāo)板中，37℃孵育2h，洗滌后加入生物素化的檢測抗體，37℃孵育1h，再次洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，37℃孵育30min，最后加入底物顯色，在酶標(biāo)儀上450nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中I型膠原和纖維連接蛋白的含量。TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)基因表達(dá)檢測：利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad7基因的mRNA表達(dá)水平。使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。引物序列根據(jù)GenBank中大鼠相應(yīng)基因序列設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成，具體引物序列如下：TGF-β1：上游引物5'-CCAGAGCAGTACAGCCAGAA-3'，下游引物5'-CTCGTAGGTGGAGGTGATGG-3'；TβRⅠ：上游引物5'-CGGAGAGTACCTGCTGACCT-3'，下游引物5'-GGCACAGTTCAGATGCTGTC-3'；TβRⅡ：上游引物5'-CCCAGTACAGCCACAGTCTT-3'，下游引物5'-CTCAGAGGGACAGGGAAGAC-3'；Smad2：上游引物5'-CCAGAGCAGTACAGCCAGAA-3'，下游引物5'-CTCGTAGGTGGAGGTGATGG-3'；Smad3：上游引物5'-GGGAGAGTACCTGCTGACCT-3'，下游引物5'-GGCACAGTTCAGATGCTGTC-3'；Smad7：上游引物5'-CCCAGTACAGCCACAGTCTT-3'，下游引物5'-CTCAGAGGGACAGGGAAGAC-3'；GAPDH：上游引物5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3'，下游引物5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。TGF-β1/TβR/Smads信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測：采用Westernblot技術(shù)檢測TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad7蛋白以及p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達(dá)水平。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1h，加入相應(yīng)的一抗（兔抗大鼠TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad7、p-Smad2、p-Smad3抗體，均為1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌3次，每次10min，加入山羊抗兔IgG-HRP二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h，TBST洗滌后，采用化學(xué)發(fā)光法顯影，ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。5.2聯(lián)合作用結(jié)果分析在細(xì)胞增殖實驗中，CCK-8法檢測結(jié)果顯示（圖11），模型對照組HSC-T6細(xì)胞在TGF-β1刺激下增殖活躍，OD值顯著高于正常對照組（P<0.01）。丹參素單藥組和黃芪單藥組均能不同程度抑制細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴性。聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制效果更為顯著，其中丹參素高劑量與黃芪高劑量聯(lián)合組的OD值顯著低于丹參素單藥高劑量組和黃芪單藥高劑量組（P<0.01），說明丹參素與黃芪聯(lián)合使用對HSC-T6細(xì)胞增殖的抑制具有協(xié)同作用。[此處插入細(xì)胞增殖實驗結(jié)果的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組、黃芪低劑量組、黃芪中劑量組、黃芪高劑量組、丹參素與黃芪低低聯(lián)合組、丹參素與黃芪中中聯(lián)合組、丹參素與黃芪高高聯(lián)合組等，縱坐標(biāo)為OD值][此處插入細(xì)胞增殖實驗結(jié)果的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組、黃芪低劑量組、黃芪中劑量組、黃芪高劑量組、丹參素與黃芪低低聯(lián)合組、丹參素與黃芪中中聯(lián)合組、丹參素與黃芪高高聯(lián)合組等，縱坐標(biāo)為OD值]免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測α-SMA表達(dá)結(jié)果表明（圖12），模型對照組中α-SMA表達(dá)顯著上調(diào)，陽性細(xì)胞平均光密度值明顯升高（P<0.01），提示HSC-T6細(xì)胞活化程度高。丹參素單藥組和黃芪單藥組均能抑制α-SMA表達(dá)，聯(lián)合用藥組的抑制效果更優(yōu)。例如，丹參素中劑量與黃芪中劑量聯(lián)合組的α-SMA陽性細(xì)胞平均光密度值顯著低于丹參素單藥中劑量組和黃芪單藥中劑量組（P<0.01），表明聯(lián)合使用能更有效地抑制HSC-T6細(xì)胞的活化。[此處插入α-SMA表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖，包括正常對照組、模型對照組、丹參素各劑量組、黃芪各劑量組、各聯(lián)合用藥組的細(xì)胞染色圖片，以及對應(yīng)的陽性細(xì)胞平均光密度值柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為平均光密度值][此處插入α-SMA表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖，包括正常對照組、模型對照組、丹參素各劑量組、黃芪各劑量組、各聯(lián)合用藥組的細(xì)胞染色圖片，以及對應(yīng)的陽性細(xì)胞平均光密度值柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為平均光密度值]ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中I型膠原和纖維連接蛋白含量結(jié)果顯示（圖13），模型對照組中I型膠原和纖維連接蛋白含量顯著高于正常對照組（P<0.01），說明TGF-β1刺激促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌。丹參素單藥組和黃芪單藥組均能降低I型膠原和纖維連接蛋白含量，聯(lián)合用藥組降低作用更明顯。以丹參素高劑量與黃芪高劑量聯(lián)合組為例，其I型膠原和纖維連接蛋白含量顯著低于丹參素單藥高劑量組和黃芪單藥高劑量組（P<0.01），表明聯(lián)合用藥能更顯著地減少HSC-T6細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌。[此處插入I型膠原和纖維連接蛋白含量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模型對照組、丹參素各劑量組、黃芪各劑量組、各聯(lián)合用藥組，縱坐標(biāo)分別為I型膠原含量和纖維連接蛋白含量][此處插入I型膠原和纖維連接蛋白含量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，包括正常對照組、模