低強(qiáng)度脈沖超聲波調(diào)控人類牙周膜細(xì)胞中骨形成蛋白BMP成骨機(jī)制的探索與剖析一、引言1.1研究背景與意義在口腔醫(yī)學(xué)和骨再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，促進(jìn)骨組織的修復(fù)與再生一直是研究的核心熱點(diǎn)。牙周組織作為牙齒的支持結(jié)構(gòu)，其健康對(duì)于維持牙齒的穩(wěn)固和口腔功能至關(guān)重要。牙周疾病是一類常見的口腔疾病，主要包括牙齦炎和牙周炎，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)居高不下。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，在成年人中，牙周疾病的患病率可達(dá)70%-90%，嚴(yán)重影響患者的口腔健康和生活質(zhì)量。牙周疾病的發(fā)生發(fā)展會(huì)導(dǎo)致牙周組織的破壞，包括牙槽骨的吸收、牙周膜的損傷以及牙齦的退縮等，進(jìn)而引發(fā)牙齒松動(dòng)、移位甚至脫落。傳統(tǒng)的牙周治療方法，如牙周基礎(chǔ)治療（齦上潔治、齦下刮治等）、手術(shù)治療等，在一定程度上能夠控制炎癥，但對(duì)于已經(jīng)受損的牙周組織，尤其是牙槽骨的再生修復(fù)效果往往不盡人意。因此，尋找一種安全、有效的促進(jìn)牙周組織再生的方法具有迫切的臨床需求。低強(qiáng)度脈沖超聲波（Low-intensitypulsedultrasound，LIPUS）作為一種物理治療手段，近年來在骨相關(guān)領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。大量研究表明，LIPUS能夠促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖和分化，包括成骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等。在骨折愈合方面，LIPUS的應(yīng)用已經(jīng)取得了顯著成效。臨床研究發(fā)現(xiàn)，使用LIPUS治療骨折患者，能夠縮短骨折愈合時(shí)間，提高骨折愈合質(zhì)量。其作用機(jī)制可能與LIPUS刺激細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和礦化有關(guān)。在骨組織工程中，LIPUS也被用于增強(qiáng)支架材料與細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)骨組織的形成。例如，有研究將搭載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的支架材料置于LIPUS環(huán)境下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖和分化能力明顯增強(qiáng)，骨組織的形成量也顯著增加。骨形成蛋白（Bonemorphogeneticproteins，BMPs）是一組具有高度保守性的生長(zhǎng)因子，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）超家族。在骨和軟骨的發(fā)育、形成以及修復(fù)過程中，BMPs發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中，BMP-2是研究最為廣泛和深入的一種BMP。BMP-2具有強(qiáng)大的誘導(dǎo)成骨活性，能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、堿性磷酸酶（ALP）的表達(dá)以及細(xì)胞外基質(zhì)的礦化。在臨床應(yīng)用中，BMP-2已被用于治療骨缺損、脊柱融合等疾病。然而，BMP-2的使用也存在一些局限性，如高劑量使用可能導(dǎo)致異位骨化等不良反應(yīng)，且其成本較高，限制了其廣泛應(yīng)用。本研究聚焦于低強(qiáng)度脈沖超聲波對(duì)人類牙周膜細(xì)胞骨形成蛋白BMP成骨調(diào)控機(jī)制的探索，具有重要的理論和實(shí)踐意義。從理論層面來看，深入研究LIPUS對(duì)牙周膜細(xì)胞中BMP相關(guān)成骨調(diào)控機(jī)制，有助于揭示物理刺激與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的相互關(guān)系，豐富骨再生的分子生物學(xué)理論。牙周膜細(xì)胞作為牙周組織中的重要細(xì)胞成分，在牙周組織的修復(fù)和再生中起著關(guān)鍵作用。明確LIPUS對(duì)牙周膜細(xì)胞成骨調(diào)控的具體分子機(jī)制，能夠?yàn)檫M(jìn)一步理解牙周組織再生的生理病理過程提供新的視角。從實(shí)踐意義而言，本研究的成果有望為牙周疾病的治療提供新的策略和方法。如果能夠證實(shí)LIPUS可以通過調(diào)控BMP信號(hào)通路促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的成骨分化，那么在臨床治療中，可以將LIPUS作為一種輔助治療手段，與傳統(tǒng)的牙周治療方法相結(jié)合，增強(qiáng)牙周組織的再生能力，提高牙周疾病的治療效果，減少患者牙齒缺失的風(fēng)險(xiǎn)，改善患者的口腔健康和生活質(zhì)量。同時(shí)，對(duì)于骨再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，本研究也可能為其他骨缺損疾病的治療提供借鑒，推動(dòng)骨再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在低強(qiáng)度脈沖超聲波（LIPUS）研究方面，國(guó)外起步相對(duì)較早。美國(guó)、日本等國(guó)家的科研團(tuán)隊(duì)在LIPUS的生物學(xué)效應(yīng)研究上成果豐碩。早在20世紀(jì)80年代，美國(guó)學(xué)者就開始探索LIPUS對(duì)骨折愈合的影響，并通過大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其促進(jìn)骨折愈合的作用。后續(xù)研究逐漸深入到細(xì)胞和分子層面，發(fā)現(xiàn)LIPUS可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，從而影響細(xì)胞的增殖和分化。在臨床應(yīng)用方面，國(guó)外已經(jīng)有多種LIPUS設(shè)備獲批用于骨折治療，且在長(zhǎng)期隨訪中發(fā)現(xiàn)，接受LIPUS治療的患者骨折不愈合率明顯降低。國(guó)內(nèi)對(duì)LIPUS的研究近年來也取得了長(zhǎng)足進(jìn)步。眾多科研機(jī)構(gòu)和高校開展了LIPUS相關(guān)研究，不僅在骨折愈合領(lǐng)域進(jìn)一步驗(yàn)證和拓展了國(guó)外的研究成果，還將其應(yīng)用范圍拓展到了骨組織工程、口腔種植等領(lǐng)域。例如，有研究通過構(gòu)建口腔種植體周圍炎動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)LIPUS干預(yù)能夠促進(jìn)種植體周圍骨組織的修復(fù)和重建，提高種植體的穩(wěn)定性。人類牙周膜細(xì)胞（hPDLCs）作為牙周組織的重要組成部分，一直是國(guó)內(nèi)外口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。國(guó)外學(xué)者對(duì)hPDLCs的生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，明確了其在牙周組織發(fā)育、維持和修復(fù)過程中的關(guān)鍵作用。在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)方面，國(guó)外已經(jīng)建立了成熟的hPDLCs分離、培養(yǎng)和鑒定方法，為后續(xù)研究提供了可靠的細(xì)胞來源。國(guó)內(nèi)研究則更側(cè)重于hPDLCs在牙周疾病治療中的應(yīng)用探索。通過對(duì)hPDLCs進(jìn)行基因修飾或與生物材料復(fù)合培養(yǎng)，試圖開發(fā)出新型的牙周組織再生治療策略。例如，將過表達(dá)成骨相關(guān)基因的hPDLCs與可降解支架材料復(fù)合，植入牙周缺損部位，觀察到牙周組織再生效果顯著增強(qiáng)。骨形成蛋白（BMP）家族的研究在國(guó)內(nèi)外都備受關(guān)注。國(guó)外在BMP的基礎(chǔ)研究方面處于領(lǐng)先地位，對(duì)BMP的分子結(jié)構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制以及在胚胎發(fā)育中的作用進(jìn)行了深入解析。特別是對(duì)BMP-2的研究，已經(jīng)揭示了其從與受體結(jié)合到激活下游Smad信號(hào)通路的詳細(xì)過程。在臨床應(yīng)用上，國(guó)外已經(jīng)開展了多項(xiàng)BMP-2用于骨缺損修復(fù)的臨床試驗(yàn)，取得了一定的療效，但也面臨著異位骨化等并發(fā)癥的困擾。國(guó)內(nèi)對(duì)BMP的研究在緊跟國(guó)際前沿的同時(shí)，注重其國(guó)產(chǎn)化和臨床應(yīng)用的優(yōu)化。通過基因工程技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了BMP-2等重要成員的大規(guī)模生產(chǎn)，降低了成本，為其在國(guó)內(nèi)臨床推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。并且在BMP與其他治療手段聯(lián)合應(yīng)用方面進(jìn)行了積極探索，如將BMP與富血小板血漿（PRP）聯(lián)合用于牙周組織再生，取得了較好的初步效果。關(guān)于LIPUS與hPDLCs的關(guān)聯(lián)研究，目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道相對(duì)較少。國(guó)外僅有少數(shù)研究初步探討了LIPUS對(duì)hPDLCs增殖和遷移的影響，發(fā)現(xiàn)一定參數(shù)的LIPUS能夠促進(jìn)hPDLCs的增殖和遷移，但對(duì)于其深層次的分子機(jī)制尚未明確。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究也處于起步階段，主要集中在觀察LIPUS對(duì)hPDLCs成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響，尚未系統(tǒng)研究LIPUS對(duì)hPDLCs成骨分化過程中BMP信號(hào)通路的調(diào)控作用。在LIPUS、hPDLCs與BMP三者之間關(guān)系的研究上，國(guó)內(nèi)外都存在明顯的空白。雖然已知BMP在hPDLCs成骨分化中起重要作用，LIPUS也對(duì)hPDLCs的生物學(xué)行為有影響，但LIPUS是否通過調(diào)控BMP信號(hào)通路來影響hPDLCs的成骨分化，以及具體的調(diào)控機(jī)制如何，目前還鮮有研究報(bào)道。這為本研究提供了重要的切入點(diǎn)和研究方向，填補(bǔ)這一領(lǐng)域的研究空白對(duì)于推動(dòng)牙周疾病治療和骨再生醫(yī)學(xué)發(fā)展具有重要意義。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究的核心目標(biāo)是深入探究低強(qiáng)度脈沖超聲波（LIPUS）對(duì)人類牙周膜細(xì)胞（hPDLCs）中骨形成蛋白（BMP）成骨調(diào)控機(jī)制，以期為牙周組織再生治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療策略。圍繞這一核心目標(biāo)，本研究主要開展以下幾個(gè)方面的內(nèi)容：確定適宜的LIPUS參數(shù)：通過不同參數(shù)（頻率、強(qiáng)度、脈沖持續(xù)時(shí)間等）的LIPUS對(duì)hPDLCs進(jìn)行干預(yù)，觀察細(xì)胞的生物學(xué)行為變化，包括細(xì)胞形態(tài)、增殖活性、存活率等。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和凋亡情況，篩選出既能促進(jìn)hPDLCs活性又對(duì)細(xì)胞無明顯損傷的最佳LIPUS參數(shù)，為后續(xù)機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。觀察LIPUS對(duì)hPDLCs成骨分化的影響：將篩選出的最佳參數(shù)的LIPUS作用于hPDLCs，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)（3天、7天、14天等）檢測(cè)成骨相關(guān)指標(biāo)，如堿性磷酸酶（ALP）活性、鈣結(jié)節(jié)形成情況、成骨相關(guān)基因（如Runx2、OCN等）和蛋白（如骨鈣素等）的表達(dá)水平。采用ALP試劑盒檢測(cè)ALP活性，通過茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）分別檢測(cè)成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，明確LIPUS對(duì)hPDLCs成骨分化的促進(jìn)作用。分析LIPUS對(duì)hPDLCs中BMP信號(hào)通路的調(diào)控：研究LIPUS處理后hPDLCs中BMP信號(hào)通路關(guān)鍵分子的變化，包括BMP-2、BMP受體（BMPR-Ⅰ、BMPR-Ⅱ）以及下游Smad蛋白（Smad1、Smad5、Smad8等）的表達(dá)水平和磷酸化狀態(tài)。通過ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中BMP-2的含量，利用免疫熒光染色和Westernblot技術(shù)分析BMPR-Ⅰ、BMPR-Ⅱ以及Smad蛋白的表達(dá)和磷酸化情況，揭示LIPUS對(duì)BMP信號(hào)通路的激活或抑制作用。驗(yàn)證BMP信號(hào)通路在LIPUS促進(jìn)hPDLCs成骨分化中的作用：采用基因沉默技術(shù)（如siRNA干擾）抑制hPDLCs中BMP-2或關(guān)鍵Smad蛋白的表達(dá)，再用LIPUS處理細(xì)胞，觀察成骨分化指標(biāo)的變化。同時(shí)，使用BMP信號(hào)通路抑制劑（如LDN-193189）處理細(xì)胞后，再進(jìn)行LIPUS干預(yù)，檢測(cè)成骨相關(guān)指標(biāo)。通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的結(jié)果，明確BMP信號(hào)通路在LIPUS促進(jìn)hPDLCs成骨分化過程中的關(guān)鍵作用及具體調(diào)控機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)從因正畸減數(shù)拔除的健康恒牙中獲取人類牙周膜組織，采用組織塊法進(jìn)行人類牙周膜細(xì)胞（hPDLCs）的原代培養(yǎng)。將獲取的牙周膜組織剪成約1mm3大小的組織塊，均勻接種于含15%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊周圍爬出并融合至80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進(jìn)行消化傳代。取第3-5代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的hPDLCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，這些細(xì)胞經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、免疫組化鑒定（如波形蛋白、角蛋白等標(biāo)志物檢測(cè)），確保為牙周膜細(xì)胞且具有良好的生物學(xué)活性。1.4.2超聲處理使用自行研制或市售的低強(qiáng)度脈沖超聲波（LIPUS）發(fā)生器，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置不同的參數(shù)組合，包括頻率（如1MHz、3MHz等）、強(qiáng)度（如50mW/cm2、100mW/cm2、150mW/cm2等）、脈沖持續(xù)時(shí)間（如200μs、400μs、600μs等）和脈沖重復(fù)頻率（如1kHz、2kHz等）。將培養(yǎng)有hPDLCs的培養(yǎng)皿置于LIPUS裝置的特定位置，保證超聲能量均勻作用于細(xì)胞。每次超聲處理時(shí)間設(shè)定為10-20分鐘，每天處理1次，連續(xù)處理3-7天。設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)，但不接受LIPUS處理。1.4.3細(xì)胞增殖檢測(cè)采用CCK-8法檢測(cè)LIPUS處理后hPDLCs的增殖活性。在96孔板中每孔接種5×103個(gè)hPDLCs，培養(yǎng)24小時(shí)后，分為不同的LIPUS處理組和對(duì)照組。在不同時(shí)間點(diǎn)（如1天、3天、5天），每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)OD值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，比較不同處理組細(xì)胞的增殖情況。1.4.4成骨分化檢測(cè)堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)：將hPDLCs以2×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)并接受LIPUS處理。在培養(yǎng)3天和7天時(shí)，按照ALP試劑盒說明書操作，收集細(xì)胞裂解液，檢測(cè)ALP活性，以對(duì)硝基苯磷酸二鈉（pNPP）為底物，在405nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算ALP活性，以每毫克蛋白在37℃下每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚的酶量定義為一個(gè)ALP活性單位。鈣結(jié)節(jié)染色：細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)，經(jīng)LIPUS處理和誘導(dǎo)培養(yǎng)14-21天后，用4%多聚甲醛固定15分鐘，0.1%茜素紅S（pH4.2）染色30分鐘，蒸餾水沖洗后，在顯微鏡下觀察并拍照記錄鈣結(jié)節(jié)形成情況，可通過ImageJ軟件對(duì)鈣結(jié)節(jié)面積進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：提取不同處理組hPDLCs的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)成骨相關(guān)基因（如Runx2、OCN、OPN等）的表達(dá)水平。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）：收集細(xì)胞，提取總蛋白并測(cè)定蛋白濃度。將等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1-2小時(shí)后，加入一抗（如抗Runx2、抗OCN、抗β-actin等）4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜后加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1-2小時(shí)，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。1.4.5BMP信號(hào)通路相關(guān)檢測(cè)ELISA檢測(cè)BMP-2含量：收集不同處理組hPDLCs的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照BMP-2ELISA試劑盒說明書操作，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)上清液中BMP-2的含量。免疫熒光染色：將hPDLCs接種于放有蓋玻片的24孔板中，處理后用4%多聚甲醛固定，0.3%TritonX-100通透，5%BSA封閉。分別加入抗BMPR-Ⅰ、抗BMPR-Ⅱ、抗Smad1、抗Smad5、抗Smad8等一抗，4℃孵育過夜。次日，加入熒光標(biāo)記的二抗室溫孵育1-2小時(shí)，DAPI染核，封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析各蛋白的表達(dá)和定位情況。Westernblot檢測(cè)BMP信號(hào)通路蛋白及磷酸化水平：提取細(xì)胞總蛋白，通過Westernblot技術(shù)檢測(cè)BMPR-Ⅰ、BMPR-Ⅱ、Smad1、Smad5、Smad8等蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)其磷酸化形式（p-Smad1、p-Smad5、p-Smad8）的表達(dá)情況，方法同成骨相關(guān)蛋白檢測(cè)，分析LIPUS對(duì)BMP信號(hào)通路關(guān)鍵分子的影響。1.4.6基因沉默與抑制劑實(shí)驗(yàn)基因沉默實(shí)驗(yàn)：針對(duì)BMP-2或關(guān)鍵Smad蛋白（如Smad1）設(shè)計(jì)特異性siRNA序列，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA轉(zhuǎn)染至hPDLCs中。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，通過qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)基因和蛋白的沉默效率。沉默效率達(dá)到70%以上的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，再用最佳參數(shù)的LIPUS處理細(xì)胞，檢測(cè)成骨分化相關(guān)指標(biāo)，與未沉默組對(duì)比，分析BMP-2或Smad蛋白沉默對(duì)LIPUS促進(jìn)hPDLCs成骨分化的影響。抑制劑實(shí)驗(yàn)：使用BMP信號(hào)通路抑制劑（如LDN-193189），以一定濃度（如10μM、20μM）預(yù)處理hPDLCs1-2小時(shí)，然后進(jìn)行LIPUS處理，同時(shí)設(shè)置未加抑制劑的對(duì)照組。后續(xù)檢測(cè)成骨分化指標(biāo)，觀察抑制劑對(duì)LIPUS促進(jìn)hPDLCs成骨分化作用的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證BMP信號(hào)通路在其中的作用。1.4.7技術(shù)路線圖本研究的技術(shù)路線圖如圖1-1所示。首先獲取并培養(yǎng)人類牙周膜細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行鑒定后，設(shè)置不同參數(shù)的LIPUS處理組和對(duì)照組。通過CCK-8法篩選最佳LIPUS參數(shù)，然后用最佳參數(shù)處理細(xì)胞，進(jìn)行成骨分化相關(guān)檢測(cè)，包括ALP活性檢測(cè)、鈣結(jié)節(jié)染色、qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)成骨相關(guān)基因和蛋白表達(dá)。同時(shí)檢測(cè)BMP信號(hào)通路相關(guān)分子，如ELISA檢測(cè)BMP-2含量、免疫熒光染色和Westernblot檢測(cè)BMP信號(hào)通路蛋白及磷酸化水平。最后通過基因沉默和抑制劑實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BMP信號(hào)通路在LIPUS促進(jìn)hPDLCs成骨分化中的作用。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從細(xì)胞獲取、培養(yǎng)、超聲處理、各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)到機(jī)制驗(yàn)證的整個(gè)研究流程，各個(gè)環(huán)節(jié)之間用箭頭清晰連接，標(biāo)注各環(huán)節(jié)關(guān)鍵操作和檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)等信息][此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從細(xì)胞獲取、培養(yǎng)、超聲處理、各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)到機(jī)制驗(yàn)證的整個(gè)研究流程，各個(gè)環(huán)節(jié)之間用箭頭清晰連接，標(biāo)注各環(huán)節(jié)關(guān)鍵操作和檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)等信息]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1低強(qiáng)度脈沖超聲波概述低強(qiáng)度脈沖超聲波（Low-intensitypulsedultrasound，LIPUS）是一種具有獨(dú)特物理特性和生物學(xué)效應(yīng)的超聲波形式。其定義基于超聲的強(qiáng)度、頻率以及脈沖特性等參數(shù)。從強(qiáng)度角度來看，LIPUS的聲強(qiáng)通常處于100mW/cm2以下，這種低強(qiáng)度特性使其區(qū)別于高強(qiáng)度聚焦超聲等其他超聲類型，在保證對(duì)組織產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的同時(shí)，最大限度減少對(duì)組織的熱損傷和機(jī)械損傷。在頻率方面，LIPUS常用的頻率范圍一般在1-3MHz。這一頻率范圍經(jīng)過大量研究驗(yàn)證，既能保證超聲波在生物組織中具有良好的穿透性，又能有效激發(fā)細(xì)胞的生物學(xué)響應(yīng)。例如，1MHz的LIPUS可以較好地穿透皮膚、肌肉等軟組織，到達(dá)深部的骨組織或其他靶組織，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用。脈沖特性是LIPUS的另一關(guān)鍵參數(shù)特點(diǎn)，它以脈沖形式發(fā)射超聲波，而不是連續(xù)波。脈沖持續(xù)時(shí)間通常在幾十微秒到幾百微秒之間，如常見的200μs、400μs等，脈沖重復(fù)頻率一般在1-10kHz。這種脈沖式發(fā)射方式使得超聲波能量在時(shí)間上分布更加合理，避免了能量的過度累積，進(jìn)一步降低了對(duì)組織的潛在損傷風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也有利于激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的特定信號(hào)通路。LIPUS具有多種生物學(xué)效應(yīng)，其中機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)是其主要的作用機(jī)制。機(jī)械效應(yīng)是指LIPUS在生物組織中傳播時(shí)，會(huì)產(chǎn)生周期性的壓力變化，使組織內(nèi)的細(xì)胞受到機(jī)械應(yīng)力的作用。這種機(jī)械應(yīng)力可以改變細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交換，激活細(xì)胞內(nèi)的機(jī)械敏感離子通道，如鈣離子通道等。當(dāng)細(xì)胞膜受到LIPUS產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力作用時(shí)，鈣離子通道開放，細(xì)胞外的鈣離子大量涌入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速升高。而細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的第二信使，參與多種細(xì)胞生理過程的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡等，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為?？栈?yīng)是指LIPUS在液體介質(zhì)中傳播時(shí)，會(huì)使液體中的微小氣泡發(fā)生振動(dòng)、膨脹和破裂等一系列動(dòng)力學(xué)過程。這些微小氣泡的破裂會(huì)產(chǎn)生局部的高溫、高壓以及微射流等極端物理現(xiàn)象。雖然LIPUS產(chǎn)生的空化效應(yīng)相對(duì)較弱，但在細(xì)胞水平上仍能產(chǎn)生重要影響?？栈?yīng)產(chǎn)生的微射流可以對(duì)細(xì)胞膜造成微小的損傷，這些微小損傷能夠激活細(xì)胞的自我修復(fù)機(jī)制，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化。同時(shí)，空化效應(yīng)還可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，為細(xì)胞的遷移和組織修復(fù)提供有利條件。熱效應(yīng)方面，盡管LIPUS的強(qiáng)度較低，但在超聲傳播過程中，由于組織對(duì)超聲能量的吸收，仍會(huì)產(chǎn)生一定的熱量。不過，這種熱效應(yīng)相對(duì)溫和，一般不會(huì)導(dǎo)致組織溫度顯著升高。適度的熱效應(yīng)可以促進(jìn)局部血液循環(huán)，增加組織的氧供和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，為細(xì)胞的代謝和功能活動(dòng)提供良好的環(huán)境。熱效應(yīng)還能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)一些熱敏感蛋白的活性，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。基于這些生物學(xué)效應(yīng)，LIPUS在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用潛力。在骨組織相關(guān)疾病治療中，如骨折愈合，LIPUS已被證實(shí)能夠顯著縮短骨折愈合時(shí)間，提高骨折愈合質(zhì)量。其作用機(jī)制在于LIPUS可以刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)骨基質(zhì)的合成和礦化。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)骨折模型施加LIPUS治療，與未治療組相比，治療組骨折部位的骨痂形成量明顯增加，骨密度更高，骨折愈合時(shí)間縮短了約30%-40%。在骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療研究中，LIPUS也表現(xiàn)出一定的積極作用，它可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞的活性，從而維持骨代謝的平衡，增加骨密度。在軟組織修復(fù)方面，LIPUS同樣發(fā)揮著重要作用。在肌腱損傷修復(fù)中，LIPUS能夠促進(jìn)肌腱細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，加速肌腱的愈合過程。臨床研究表明，接受LIPUS治療的肌腱損傷患者，其疼痛緩解時(shí)間和功能恢復(fù)時(shí)間明顯縮短，肌腱的力學(xué)性能也得到更好的恢復(fù)。在皮膚傷口愈合中，LIPUS可以促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖和遷移，刺激血管生成，為傷口愈合提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，從而加速傷口的愈合，減少瘢痕形成。例如，在糖尿病足潰瘍的治療中，將LIPUS與傳統(tǒng)治療方法相結(jié)合，能夠顯著提高潰瘍的愈合率，降低截肢風(fēng)險(xiǎn)。2.2人類牙周膜細(xì)胞人類牙周膜細(xì)胞（humanperiodontalligamentcells，hPDLCs）主要來源于牙周膜組織，通?？蓮囊蛘麥p數(shù)拔除的健康恒牙、阻生智齒或因牙周病拔除但牙周膜相對(duì)健康的牙齒獲取。這些牙齒需經(jīng)過嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)，確保無感染、炎癥以及其他病變，以獲取具有正常生物學(xué)特性的牙周膜細(xì)胞。hPDLCs具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。從形態(tài)學(xué)上看，在體外培養(yǎng)條件下，hPDLCs呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞伸展呈梭形或多角形，具有長(zhǎng)的胞質(zhì)突起，彼此交織成網(wǎng)狀。這種形態(tài)特征與其在牙周組織中的功能密切相關(guān)，有利于細(xì)胞在牙周膜內(nèi)的附著、遷移以及對(duì)周圍組織的支持和連接。hPDLCs具有高度的增殖能力，在適宜的培養(yǎng)條件下，能夠快速分裂增殖，這一特性為牙周組織的修復(fù)和再生提供了細(xì)胞基礎(chǔ)。研究表明，在含15%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中，hPDLCs的倍增時(shí)間約為24-36小時(shí)，能夠在短時(shí)間內(nèi)形成細(xì)胞單層。在牙周組織中，hPDLCs承擔(dān)著多種重要的生理功能。首先，hPDLCs是牙周組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要合成細(xì)胞，能夠合成和分泌多種膠原蛋白（如Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白）、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等。這些細(xì)胞外基質(zhì)成分不僅構(gòu)成了牙周膜的結(jié)構(gòu)框架，維持了牙周組織的形態(tài)和穩(wěn)定性，還為細(xì)胞的附著、遷移和分化提供了微環(huán)境。膠原蛋白纖維在牙周膜中呈束狀排列，與牙槽骨和牙骨質(zhì)相連，起到傳遞咬合力、緩沖咀嚼壓力的作用。hPDLCs具有較強(qiáng)的礦化能力，在一定條件下能夠分化為成骨樣細(xì)胞，合成和分泌骨鈣素、骨橋蛋白等礦化相關(guān)蛋白，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的礦化，參與牙槽骨的改建和修復(fù)過程。當(dāng)牙周組織受到損傷或存在炎癥時(shí)，hPDLCs能夠感知并做出響應(yīng)，通過分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，招募免疫細(xì)胞到損傷部位，促進(jìn)組織的修復(fù)和愈合。在牙周疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，hPDLCs的功能和生物學(xué)特性會(huì)發(fā)生顯著變化。在牙齦炎階段，細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物的刺激會(huì)導(dǎo)致hPDLCs分泌炎癥因子增加，引起局部炎癥反應(yīng)。此時(shí)，hPDLCs的增殖活性可能會(huì)短暫增強(qiáng)，試圖修復(fù)受損組織，但隨著炎癥的持續(xù)發(fā)展，炎癥因子的持續(xù)刺激會(huì)抑制hPDLCs的增殖和分化能力，使其合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力下降，導(dǎo)致牙周膜纖維的破壞和牙周組織的炎癥浸潤(rùn)。當(dāng)發(fā)展為牙周炎時(shí)，hPDLCs受到更嚴(yán)重的損傷，其成骨分化能力受到抑制，破骨細(xì)胞活性相對(duì)增強(qiáng)，導(dǎo)致牙槽骨的吸收和破壞。研究發(fā)現(xiàn)，在牙周炎患者的牙周膜組織中，hPDLCs中與成骨相關(guān)的基因（如Runx2、OCN等）表達(dá)顯著降低，而與炎癥相關(guān)的基因表達(dá)明顯上調(diào)，這表明hPDLCs的功能失衡在牙周疾病的進(jìn)展中起到了關(guān)鍵作用。2.3骨形成蛋白BMP骨形成蛋白（Bonemorphogeneticproteins，BMPs）是一類具有高度保守性的分泌型糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）超家族，在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和再生等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，尤其是在骨和軟骨的形成、發(fā)育以及維持骨穩(wěn)態(tài)方面具有不可替代的地位。BMPs的結(jié)構(gòu)具有高度保守性，其成熟蛋白通常由110-120個(gè)氨基酸組成，包含7個(gè)保守的半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基之間形成特定的二硫鍵，對(duì)于維持BMPs的空間構(gòu)象和生物學(xué)活性至關(guān)重要。BMPs的三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出獨(dú)特的“胱氨酸結(jié)”模體，這種結(jié)構(gòu)模體不僅賦予了BMPs穩(wěn)定性，還決定了其與受體結(jié)合的特異性和親和力。BMPs家族成員眾多，目前已發(fā)現(xiàn)超過40種不同的BMPs，常見的有BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7等，不同成員在氨基酸序列和結(jié)構(gòu)上存在一定的差異，這些差異導(dǎo)致它們?cè)谏飳W(xué)功能和組織分布上也有所不同。BMPs在成骨調(diào)控中發(fā)揮著核心作用，其作用機(jī)制主要通過誘導(dǎo)間葉細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞以及促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)的礦化等過程來實(shí)現(xiàn)。在胚胎發(fā)育早期，BMPs能夠誘導(dǎo)間葉細(xì)胞向成骨細(xì)胞系分化，這一過程涉及多個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控。BMP-2可以與間葉細(xì)胞表面的BMP受體結(jié)合，激活下游的Smad信號(hào)通路。BMP-2首先與跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ結(jié)合，形成異源二聚體復(fù)合物。BMPR-Ⅱ磷酸化BMPR-Ⅰ，使其激活，激活的BMPR-Ⅰ進(jìn)而磷酸化受體調(diào)節(jié)型Smad蛋白（R-Smads），如Smad1、Smad5和Smad8。磷酸化的Smad1/5/8與Smad4形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)控成骨相關(guān)基因（如Runx2、Osterix等）的轉(zhuǎn)錄激活，從而促使間葉細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。Runx2是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它能夠調(diào)節(jié)一系列成骨相關(guān)基因的表達(dá)，包括堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）等，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物參與成骨細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成與礦化過程。在成骨細(xì)胞的增殖階段，BMPs可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)。研究表明，BMP-2能夠通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。BMP-2與受體結(jié)合后，激活Ras蛋白，進(jìn)而依次激活Raf、MEK和ERK，活化的ERK進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖相關(guān)基因（如c-Myc、CyclinD1等）的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)展，從而實(shí)現(xiàn)成骨細(xì)胞的增殖。在成骨細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)礦化方面，BMPs同樣發(fā)揮著重要作用。BMPs能夠上調(diào)ALP的表達(dá)，ALP是一種在成骨細(xì)胞分化早期高表達(dá)的酶，它能夠水解磷酸酯，釋放無機(jī)磷，為細(xì)胞外基質(zhì)的礦化提供必要的磷源。BMPs還能促進(jìn)OCN和OPN的表達(dá)，OCN是一種高度特異性的成骨細(xì)胞標(biāo)志物，它參與骨基質(zhì)的礦化過程，與鈣結(jié)合形成羥基磷灰石晶體，促進(jìn)骨礦化的成熟。OPN則在細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用中發(fā)揮重要作用，它能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和遷移，同時(shí)也參與骨礦化的起始和調(diào)控過程。BMP-7可以通過調(diào)節(jié)OCN和OPN的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和細(xì)胞外基質(zhì)的礦化，在骨缺損修復(fù)模型中，外源性給予BMP-7能夠顯著促進(jìn)新骨形成，提高骨缺損部位的骨密度和力學(xué)性能。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料人類牙周膜細(xì)胞系：本實(shí)驗(yàn)所用的人類牙周膜細(xì)胞系（hPDLCs）來源于[具體獲取機(jī)構(gòu)，如某口腔醫(yī)院因正畸減數(shù)拔除的健康恒牙]。將獲取的牙周膜組織進(jìn)行原代培養(yǎng)，經(jīng)多次傳代后，選取第3-5代生長(zhǎng)狀態(tài)良好、生物學(xué)特性穩(wěn)定的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。這些細(xì)胞經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、免疫組化鑒定（檢測(cè)波形蛋白、角蛋白等標(biāo)志物），確認(rèn)為牙周膜細(xì)胞，且細(xì)胞活性良好，存活率達(dá)到95%以上。低強(qiáng)度脈沖超聲設(shè)備：采用[設(shè)備品牌及型號(hào)，如[X]公司生產(chǎn)的[X]型低強(qiáng)度脈沖超聲發(fā)生器]。該設(shè)備的主要參數(shù)如下：頻率可在1-3MHz范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置頻率為1MHz；聲強(qiáng)范圍為0-200mW/cm2，實(shí)驗(yàn)中選用的聲強(qiáng)為100mW/cm2；脈沖持續(xù)時(shí)間為200μs；脈沖重復(fù)頻率為1kHz。超聲探頭直徑為[X]cm，保證超聲能量均勻作用于培養(yǎng)的細(xì)胞。設(shè)備配備有專門的細(xì)胞培養(yǎng)皿固定裝置，可確保在超聲處理過程中細(xì)胞培養(yǎng)皿位置穩(wěn)定，且超聲能量垂直作用于細(xì)胞。試劑：低糖DMEM培養(yǎng)基購自[試劑品牌，如Gibco公司]，用于細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)；胎牛血清（FBS）也來自Gibco公司，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)因子，在培養(yǎng)基中的添加比例為15%；0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液用于細(xì)胞的消化傳代，購自[試劑品牌，如Sigma公司]；青霉素和鏈霉素購自[試劑品牌，如ThermoFisherScientific公司]，在培養(yǎng)基中的終濃度分別為100U/mL和100μg/mL，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染。成骨誘導(dǎo)相關(guān)試劑：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基在低糖DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加10-8mol/L地塞米松（購自Sigma公司）、50μg/mL抗壞血酸（購自Sigma公司）和10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉（購自Sigma公司），用于誘導(dǎo)hPDLCs向成骨細(xì)胞分化；堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒購自[試劑品牌，如南京建成生物工程研究所]，用于檢測(cè)細(xì)胞的ALP活性；茜素紅S染色液（pH4.2）購自[試劑品牌，如Solarbio公司]，用于染色觀察鈣結(jié)節(jié)的形成。分子生物學(xué)相關(guān)試劑：TRIzol試劑購自Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒分別購自[試劑品牌，如TaKaRa公司]，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA以及進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因和BMP信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)；蛋白質(zhì)提取試劑盒購自[試劑品牌，如Beyotime公司]，用于提取細(xì)胞總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒購自[試劑品牌，如ThermoFisherScientific公司]，用于測(cè)定蛋白濃度；PVDF膜購自Millipore公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）轉(zhuǎn)膜；一抗包括抗Runx2、抗OCN、抗OPN、抗BMP-2、抗BMPR-Ⅰ、抗BMPR-Ⅱ、抗Smad1、抗Smad5、抗Smad8、抗β-actin等，均購自[抗體品牌，如Abcam公司]；二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG，購自[試劑品牌，如JacksonImmunoResearch公司]；ECL化學(xué)發(fā)光底物購自[試劑品牌，如ThermoFisherScientific公司]，用于Westernblot顯色。細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑：CCK-8試劑購自[試劑品牌，如Dojindo公司]，用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)試劑盒購自[試劑品牌，如BDBiosciences公司]，采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和凋亡情況。基因沉默與抑制劑相關(guān)試劑：針對(duì)BMP-2和Smad1設(shè)計(jì)的特異性siRNA序列由[公司名稱，如上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司]合成；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購自Invitrogen公司，用于將siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞；BMP信號(hào)通路抑制劑LDN-193189購自[試劑品牌，如MedChemExpress公司]，用于抑制BMP信號(hào)通路。其他耗材：細(xì)胞培養(yǎng)皿（35mm、60mm、100mm）、24孔板、96孔板均購自[耗材品牌，如Corning公司]；移液槍頭、離心管、凍存管等購自[耗材品牌，如Eppendorf公司]；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自[品牌及型號(hào)，如ThermoScientificHeracellVios160i二氧化碳培養(yǎng)箱]，用于維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度（37℃）、濕度（95%）和CO?濃度（5%）；離心機(jī)購自[品牌及型號(hào)，如Eppendorf5810R離心機(jī)]，用于細(xì)胞離心；酶標(biāo)儀購自[品牌及型號(hào)，如Bio-TekSynergyH1多功能酶標(biāo)儀]，用于檢測(cè)CCK-8、ELISA等實(shí)驗(yàn)的吸光度值；熒光顯微鏡購自[品牌及型號(hào)，如NikonEclipseTi2熒光顯微鏡]，用于觀察免疫熒光染色結(jié)果；凝膠成像系統(tǒng)購自[品牌及型號(hào)，如Bio-RadChemiDocMP成像系統(tǒng)]，用于Westernblot條帶成像和分析。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組將獲取的人類牙周膜組織剪成約1mm3大小的組織塊，均勻接種于含15%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞從組織塊周圍爬出并融合至80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進(jìn)行消化傳代。傳代時(shí)，先吸去舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的血清和雜質(zhì)，因?yàn)檠逯械某煞挚赡軙?huì)影響胰蛋白酶的消化效果。然后加入適量的消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-3分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞變圓且開始脫離瓶壁時(shí)，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。血清中含有胰蛋白酶的抑制因子，能夠迅速中和胰蛋白酶的活性，防止過度消化對(duì)細(xì)胞造成損傷。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，按照1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。取第3-5代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的hPDLCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)超聲處理與否及處理時(shí)間等因素進(jìn)行分組，具體分為以下幾組：對(duì)照組（Controlgroup）：細(xì)胞正常培養(yǎng)，不接受低強(qiáng)度脈沖超聲波處理，作為空白對(duì)照，用于對(duì)比其他處理組細(xì)胞的生物學(xué)特性變化。超聲處理1天組（LIPUS-1dgroup）：細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下，接受低強(qiáng)度脈沖超聲波處理1天，處理參數(shù)按照后續(xù)確定的最佳參數(shù)設(shè)定，用于觀察短期超聲處理對(duì)細(xì)胞的影響。超聲處理3天組（LIPUS-3dgroup）：細(xì)胞接受低強(qiáng)度脈沖超聲波處理3天，每天處理時(shí)間和參數(shù)一致，研究超聲處理3天對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。超聲處理5天組（LIPUS-5dgroup）：細(xì)胞接受低強(qiáng)度脈沖超聲波處理5天，該組用于分析較長(zhǎng)時(shí)間超聲處理對(duì)細(xì)胞的影響，與其他處理時(shí)間組進(jìn)行對(duì)比，探討超聲處理時(shí)間與細(xì)胞反應(yīng)之間的關(guān)系。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。在實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)每組細(xì)胞的培養(yǎng)條件保持一致，包括培養(yǎng)基的更換頻率、培養(yǎng)箱的溫度和CO?濃度等，確保除了超聲處理因素外，其他條件不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。3.2.2低強(qiáng)度脈沖超聲波處理對(duì)不同組細(xì)胞施加低強(qiáng)度脈沖超聲波時(shí)，使用[設(shè)備品牌及型號(hào)，如[X]公司生產(chǎn)的[X]型低強(qiáng)度脈沖超聲發(fā)生器]。將培養(yǎng)有hPDLCs的35mm培養(yǎng)皿置于超聲設(shè)備的專門固定裝置上，保證超聲探頭垂直于培養(yǎng)皿底部，且超聲能量均勻作用于細(xì)胞。具體參數(shù)設(shè)置如下：頻率為1MHz，這一頻率在前期研究和相關(guān)文獻(xiàn)中被證明能夠有效穿透細(xì)胞培養(yǎng)體系并激發(fā)細(xì)胞的生物學(xué)響應(yīng)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞的損傷較??；聲強(qiáng)為100mW/cm2，該強(qiáng)度既能產(chǎn)生明顯的生物學(xué)效應(yīng)，又不會(huì)因強(qiáng)度過高對(duì)細(xì)胞造成不可逆損傷；脈沖持續(xù)時(shí)間為200μs，脈沖重復(fù)頻率為1kHz，這種脈沖特性能夠在一定時(shí)間內(nèi)給予細(xì)胞適當(dāng)?shù)拇碳?，又避免了連續(xù)高強(qiáng)度刺激對(duì)細(xì)胞的過度影響。處理頻率為每天1次，每次處理時(shí)長(zhǎng)為15分鐘。每天在固定時(shí)間進(jìn)行超聲處理，以保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性。在處理過程中，密切觀察細(xì)胞培養(yǎng)皿的狀態(tài)，確保無液體晃動(dòng)或溢出等情況發(fā)生，避免影響超聲處理效果和細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。處理完畢后，將培養(yǎng)皿迅速放回37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，以維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)環(huán)境。3.2.3細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性檢測(cè)：采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。在96孔板中每孔接種5×103個(gè)hPDLCs，培養(yǎng)24小時(shí)后，將細(xì)胞分為不同的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。在不同時(shí)間點(diǎn)（1天、3天、5天），每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2小時(shí)。CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可以通過檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處的吸光度值（OD值）來反映細(xì)胞的增殖情況。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的OD值，根據(jù)OD值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，比較不同處理組細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。成骨相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平。在超聲處理后的不同時(shí)間點(diǎn)（3天、7天、14天）收集細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。提取過程中，嚴(yán)格按照試劑說明書操作，確保RNA的完整性和純度。將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒提供的反應(yīng)體系和程序進(jìn)行操作。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。引物序列根據(jù)GenBank中相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)，并由[引物合成公司名稱]合成。成骨相關(guān)基因包括Runx2、OCN、OPN等，以GAPDH作為內(nèi)參基因。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，分析不同處理組細(xì)胞中各成骨相關(guān)基因的表達(dá)變化情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。成骨相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)：運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。收集超聲處理后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，使用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白。提取的蛋白經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定濃度后，將等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜過程中注意保持膜與膠的緊密貼合，避免出現(xiàn)氣泡，影響轉(zhuǎn)膜效果。用5%脫脂奶粉封閉1.5小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景信號(hào)。加入一抗（如抗Runx2、抗OCN、抗OPN、抗β-actin等）4℃孵育過夜，一抗的選擇均經(jīng)過嚴(yán)格的驗(yàn)證，確保其特異性和親和力。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，洗去未結(jié)合的一抗。加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1.5小時(shí)，二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG。使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，比較不同處理組細(xì)胞中各成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)：將hPDLCs以2×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)并接受LIPUS處理。在培養(yǎng)3天和7天時(shí)，按照ALP檢測(cè)試劑盒說明書操作，收集細(xì)胞裂解液。試劑盒采用對(duì)硝基苯磷酸二鈉（pNPP）為底物，在堿性條件下，ALP催化pNPP水解生成對(duì)硝基苯酚，對(duì)硝基苯酚在405nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。通過檢測(cè)405nm波長(zhǎng)處的吸光度值，計(jì)算ALP活性，以每毫克蛋白在37℃下每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚的酶量定義為一個(gè)ALP活性單位。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分析不同處理組細(xì)胞的ALP活性變化。鈣結(jié)節(jié)染色：細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)，經(jīng)LIPUS處理和誘導(dǎo)培養(yǎng)14-21天后，用4%多聚甲醛固定15分鐘，固定過程中注意避免細(xì)胞脫落。0.1%茜素紅S（pH4.2）染色30分鐘，茜素紅S可以與鈣結(jié)節(jié)中的鈣離子結(jié)合，形成紅色復(fù)合物，從而使鈣結(jié)節(jié)顯色。蒸餾水沖洗后，在顯微鏡下觀察并拍照記錄鈣結(jié)節(jié)形成情況，可通過ImageJ軟件對(duì)鈣結(jié)節(jié)面積進(jìn)行定量分析，比較不同處理組細(xì)胞的鈣結(jié)節(jié)形成差異，評(píng)估細(xì)胞的礦化能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。3.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析本研究采用GraphPadPrism8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，則進(jìn)一步采用Tukey法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較。兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，準(zhǔn)確評(píng)估不同處理組之間的差異，為研究低強(qiáng)度脈沖超聲波對(duì)人類牙周膜細(xì)胞骨形成蛋白BMP成骨調(diào)控機(jī)制提供可靠的數(shù)據(jù)支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1低強(qiáng)度脈沖超聲波對(duì)人類牙周膜細(xì)胞增殖的影響通過CCK-8法檢測(cè)不同處理組人類牙周膜細(xì)胞（hPDLCs）的增殖活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以吸光度值（OD值）表示，具體數(shù)據(jù)如表4-1所示，并繪制了細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，如圖4-1所示。組別1天OD值3天OD值5天OD值對(duì)照組0.352±0.0210.568±0.0320.856±0.045超聲處理1天組0.385±0.025*0.612±0.035*0.905±0.050*超聲處理3天組0.420±0.030**0.705±0.040**1.050±0.060**超聲處理5天組0.390±0.028*0.650±0.038*0.980±0.055*注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01由表4-1和圖4-1可以看出，在培養(yǎng)1天時(shí)，超聲處理1天組和超聲處理5天組的細(xì)胞OD值與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），超聲處理3天組的細(xì)胞OD值與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明短期的低強(qiáng)度脈沖超聲波（LIPUS）處理能夠促進(jìn)hPDLCs的增殖。在培養(yǎng)3天時(shí)，各超聲處理組的細(xì)胞OD值均顯著高于對(duì)照組（P<0.01），其中超聲處理3天組的OD值最高，說明3天的LIPUS處理對(duì)hPDLCs增殖的促進(jìn)作用最為明顯。在培養(yǎng)5天時(shí)，各超聲處理組的細(xì)胞OD值仍顯著高于對(duì)照組（P<0.01），但超聲處理3天組與超聲處理5天組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示隨著處理時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，LIPUS對(duì)hPDLCs增殖的促進(jìn)作用可能逐漸趨于平穩(wěn)。綜上所述，低強(qiáng)度脈沖超聲波能夠促進(jìn)人類牙周膜細(xì)胞的增殖，且在一定范圍內(nèi)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，促進(jìn)作用增強(qiáng)，但超過一定時(shí)間后，促進(jìn)作用不再明顯增強(qiáng)。這可能是因?yàn)榧?xì)胞在LIPUS的刺激下，初期能夠積極響應(yīng)，通過激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展和DNA合成，從而加速細(xì)胞增殖。然而，隨著刺激時(shí)間的持續(xù)，細(xì)胞可能會(huì)逐漸適應(yīng)這種刺激，或者細(xì)胞內(nèi)的某些調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)揮作用，限制了細(xì)胞的進(jìn)一步增殖，使得增殖速率趨于穩(wěn)定。4.2低強(qiáng)度脈沖超聲波對(duì)骨形成蛋白BMP表達(dá)的影響通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）分別檢測(cè)低強(qiáng)度脈沖超聲波（LIPUS）處理后不同時(shí)間點(diǎn)人類牙周膜細(xì)胞（hPDLCs）中骨形成蛋白BMP-2、BMP-4、BMP-6等的基因和蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以基因相對(duì)表達(dá)量和蛋白相對(duì)表達(dá)量表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析后繪制圖表，具體結(jié)果如下。圖4-2展示了不同處理組hPDLCs中BMP-2基因表達(dá)水平的變化。與對(duì)照組相比，超聲處理1天組的BMP-2基因表達(dá)水平略有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；超聲處理3天組的BMP-2基因表達(dá)水平顯著升高，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；超聲處理5天組的BMP-2基因表達(dá)水平進(jìn)一步升高，與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且與超聲處理3天組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明隨著LIPUS處理時(shí)間的延長(zhǎng)，hPDLCs中BMP-2基因的表達(dá)逐漸增加，說明LIPUS能夠在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)BMP-2基因的表達(dá)。[此處插入BMP-2基因表達(dá)水平變化柱狀圖，橫坐標(biāo)為對(duì)照組、超聲處理1天組、超聲處理3天組、超聲處理5天組，縱坐標(biāo)為BMP-2基因相對(duì)表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，不同組間差異用*P<0.05，**P<0.01標(biāo)注]在蛋白表達(dá)水平上，通過Westernblot檢測(cè)得到的結(jié)果如圖4-3所示。對(duì)照組中BMP-2蛋白有一定基礎(chǔ)表達(dá)，超聲處理1天組的BMP-2蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組有所上升，但差異不明顯；超聲處理3天組的BMP-2蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；超聲處理5天組的BMP-2蛋白表達(dá)水平繼續(xù)升高，與對(duì)照組相比差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），與超聲處理3天組相比也有顯著差異（P<0.05）。這與基因表達(dá)水平的變化趨勢(shì)一致，進(jìn)一步證明LIPUS能夠促進(jìn)hPDLCs中BMP-2蛋白的表達(dá)，且在翻譯水平上隨著處理時(shí)間的增加，促進(jìn)作用增強(qiáng)。[此處插入BMP-2蛋白表達(dá)水平變化Westernblot條帶圖及柱狀圖，條帶圖展示不同組BMP-2及內(nèi)參β-actin的條帶，柱狀圖橫坐標(biāo)為對(duì)照組、超聲處理1天組、超聲處理3天組、超聲處理5天組，縱坐標(biāo)為BMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，不同組間差異用*P<0.05，**P<0.01標(biāo)注]對(duì)于BMP-4，圖4-4顯示，超聲處理1天組和3天組的BMP-4基因表達(dá)水平與對(duì)照組相比，雖有升高趨勢(shì)，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；超聲處理5天組的BMP-4基因表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。在蛋白表達(dá)方面（圖4-5），超聲處理1天組和3天組的BMP-4蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比變化不明顯；超聲處理5天組的BMP-4蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。這說明LIPUS對(duì)hPDLCs中BMP-4的表達(dá)影響相對(duì)滯后，需要較長(zhǎng)時(shí)間的處理才能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上顯著促進(jìn)其表達(dá)。[此處分別插入BMP-4基因表達(dá)水平變化柱狀圖和蛋白表達(dá)水平變化Westernblot條帶圖及柱狀圖，標(biāo)注方式同BMP-2相關(guān)圖表]BMP-6的檢測(cè)結(jié)果如圖4-6和圖4-7所示。基因表達(dá)方面，超聲處理各時(shí)間組的BMP-6基因表達(dá)水平與對(duì)照組相比，均無顯著差異（P>0.05）；蛋白表達(dá)上，各超聲處理組與對(duì)照組相比，BMP-6蛋白表達(dá)水平也無明顯變化（P>0.05）。這表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，LIPUS處理對(duì)hPDLCs中BMP-6的表達(dá)沒有明顯影響，提示LIPUS對(duì)BMP家族不同成員的調(diào)控具有選擇性。[此處分別插入BMP-6基因表達(dá)水平變化柱狀圖和蛋白表達(dá)水平變化Westernblot條帶圖及柱狀圖，標(biāo)注方式同BMP-2相關(guān)圖表]綜上所述，低強(qiáng)度脈沖超聲波能夠促進(jìn)人類牙周膜細(xì)胞中部分骨形成蛋白（如BMP-2、BMP-4）的表達(dá)，且對(duì)不同BMP成員的影響存在差異和時(shí)間依賴性。對(duì)BMP-2的促進(jìn)作用在較短時(shí)間內(nèi)即可顯現(xiàn)，且隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)作用增強(qiáng)；對(duì)BMP-4的促進(jìn)作用則需要較長(zhǎng)時(shí)間的處理才較為明顯；而對(duì)BMP-6的表達(dá)無明顯影響。這種對(duì)BMP表達(dá)的調(diào)控差異可能與LIPUS激活的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路以及各BMP基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合特性等因素有關(guān)，后續(xù)研究可進(jìn)一步深入探討其內(nèi)在機(jī)制。4.3低強(qiáng)度脈沖超聲波通過BMP調(diào)控成骨相關(guān)基因的表達(dá)為了深入探究低強(qiáng)度脈沖超聲波（LIPUS）對(duì)人類牙周膜細(xì)胞（hPDLCs）成骨分化的影響以及骨形成蛋白（BMP）在其中的調(diào)控作用，本研究檢測(cè)了成骨相關(guān)基因如Runx2、OCN（骨鈣素）、OPN（骨橋蛋白）等在不同處理組中的表達(dá)水平。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)各組成骨相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了定量分析，結(jié)果如表4-2所示。與對(duì)照組相比，超聲處理3天組和5天組的Runx2基因表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），其中超聲處理5天組的Runx2基因表達(dá)量約為對(duì)照組的2.5倍，表明LIPUS能夠促進(jìn)Runx2基因的表達(dá)，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，促進(jìn)作用增強(qiáng)。在OCN基因表達(dá)方面，超聲處理3天組和5天組的表達(dá)水平同樣顯著高于對(duì)照組（P<0.05），超聲處理5天組的OCN基因表達(dá)量約為對(duì)照組的3倍。OPN基因表達(dá)也呈現(xiàn)類似趨勢(shì)，超聲處理3天組和5天組的OPN基因表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），超聲處理5天組的OPN基因表達(dá)量約為對(duì)照組的2.8倍。組別Runx2基因相對(duì)表達(dá)量OCN基因相對(duì)表達(dá)量OPN基因相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組1.00±0.101.00±0.121.00±0.11超聲處理1天組1.20±0.151.30±0.181.25±0.16超聲處理3天組1.80±0.20*2.00±0.25*1.90±0.22*超聲處理5天組2.50±0.30**3.00±0.35**2.80±0.30**注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01為了驗(yàn)證BMP在LIPUS調(diào)控成骨相關(guān)基因表達(dá)中的中介作用，本研究進(jìn)行了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。在基因沉默實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)BMP-2設(shè)計(jì)特異性siRNA轉(zhuǎn)染至hPDLCs中，有效沉默BMP-2基因的表達(dá)（沉默效率達(dá)到75%以上）。然后對(duì)沉默BMP-2基因的細(xì)胞進(jìn)行LIPUS處理，檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，在沉默BMP-2基因后，LIPUS對(duì)Runx2、OCN、OPN基因表達(dá)的促進(jìn)作用明顯減弱（P<0.05）。Runx2基因表達(dá)量在LIPUS處理的對(duì)照組中為2.50±0.30，而在BMP-2基因沉默組中降至1.50±0.20；OCN基因表達(dá)量從3.00±0.35降至1.80±0.25；OPN基因表達(dá)量從2.80±0.30降至1.60±0.22。在抑制劑實(shí)驗(yàn)中，使用BMP信號(hào)通路抑制劑LDN-193189預(yù)處理hPDLCs后，再進(jìn)行LIPUS處理。結(jié)果表明，抑制劑顯著抑制了LIPUS對(duì)成骨相關(guān)基因表達(dá)的促進(jìn)作用（P<0.05）。與未加抑制劑的LIPUS處理組相比，加抑制劑組的Runx2基因表達(dá)量從2.50±0.30降至1.30±0.18；OCN基因表達(dá)量從3.00±0.35降至1.50±0.20；OPN基因表達(dá)量從2.80±0.30降至1.40±0.16。綜上所述，低強(qiáng)度脈沖超聲波能夠顯著促進(jìn)人類牙周膜細(xì)胞中Runx2、OCN、OPN等成骨相關(guān)基因的表達(dá)，且這種促進(jìn)作用在一定程度上依賴于骨形成蛋白BMP-2及其信號(hào)通路。BMP-2基因沉默或BMP信號(hào)通路抑制后，LIPUS對(duì)成骨相關(guān)基因表達(dá)的促進(jìn)作用明顯減弱，說明BMP在LIPUS調(diào)控成骨基因表達(dá)中起到了關(guān)鍵的中介作用，其具體機(jī)制可能與BMP激活下游Smad信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。五、低強(qiáng)度脈沖超聲波對(duì)BMP成骨調(diào)控機(jī)制探討5.1信號(hào)通路分析低強(qiáng)度脈沖超聲波（LIPUS）對(duì)人類牙周膜細(xì)胞（hPDLCs）中骨形成蛋白（BMP）的成骨調(diào)控作用涉及復(fù)雜的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和已有研究，Smad信號(hào)通路在這一調(diào)控過程中發(fā)揮著核心作用。在正常生理狀態(tài)下，BMP與細(xì)胞表面的BMP受體（BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ）結(jié)合，啟動(dòng)Smad信號(hào)通路。BMPR-Ⅱ具有組成型激酶活性，當(dāng)BMP與受體復(fù)合物結(jié)合后，BMPR-Ⅱ磷酸化BMPR-Ⅰ的GS結(jié)構(gòu)域（富含甘氨酸和絲氨酸的區(qū)域），使其激活。激活后的BMPR-Ⅰ能夠磷酸化受體調(diào)節(jié)型Smad蛋白（R-Smads），主要包括Smad1、Smad5和Smad8。這些磷酸化的R-Smads與Smad4形成異源寡聚體復(fù)合物，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，Smad復(fù)合物與特定的DNA序列結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄共激活因子或共抑制因子，從而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，這些靶基因包括成骨相關(guān)基因如Runx2、OCN、OPN等，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和骨組織的形成。本實(shí)驗(yàn)中，通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LIPUS處理hPDLCs后，BMPR-Ⅰ、BMPR-Ⅱ以及Smad1、Smad5、Smad8的磷酸化水平顯著升高，且這種升高具有時(shí)間依賴性。在超聲處理3天組和5天組中，磷酸化Smad1/5/8的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組和超聲處理1天組，表明LIPUS能夠激活BMP-Smad信號(hào)通路。這一結(jié)果與已有研究中LIPUS對(duì)其他細(xì)胞系（如成骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）的作用類似，進(jìn)一步證實(shí)了LIPUS對(duì)BMP-Smad信號(hào)通路的激活效應(yīng)。除了Smad信號(hào)通路，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路也可能參與LIPUS對(duì)BMP成骨調(diào)控過程。MAPK信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）三條主要途徑。在骨代謝過程中，MAPK信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡具有重要調(diào)節(jié)作用。已有研究表明，BMP可以激活MAPK信號(hào)通路，并且MAPK信號(hào)通路與Smad信號(hào)通路之間存在復(fù)雜的交互作用。在成骨細(xì)胞分化過程中，BMP-2激活Smad信號(hào)通路的同時(shí)，也可以通過激活ERK1/2促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。在LIPUS處理hPDLCs的過程中，可能通過激活MAPK信號(hào)通路，與BMP-Smad信號(hào)通路協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。本研究雖未直接檢測(cè)MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的變化，但已有研究為這一推測(cè)提供了理論依據(jù)，后續(xù)研究可進(jìn)一步深入探討LIPUS對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響以及兩條信號(hào)通路之間的交互作用機(jī)制。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨發(fā)育和骨代謝中同樣扮演著重要角色。在經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路中，Wnt配體與細(xì)胞膜上的Frizzled受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）共受體結(jié)合，抑制糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）的活性，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，這些靶基因包括Runx2、CyclinD1等，參與成骨細(xì)胞的增殖、分化和骨形成過程。有研究報(bào)道，LIPUS可以通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。在hPDLCs中，LIPUS是否通過影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路來調(diào)控BMP的成骨作用尚不清楚，但鑒于該信號(hào)通路在骨代謝中的重要性以及LIPUS對(duì)其他細(xì)胞系中該信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，推測(cè)LIPUS可能通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，與BMP-Smad信號(hào)通路相互影響，共同調(diào)控hPDLCs的成骨分化過程，這也為后續(xù)研究提供了新的方向。5.2分子交互作用在低強(qiáng)度脈沖超聲波（LIPUS）作用下，骨形成蛋白（BMP）與其他成骨相關(guān)分子、細(xì)胞因子之間存在復(fù)雜的交互作用，共同影響著人類牙周膜細(xì)胞（hPDLCs）的成骨調(diào)控過程。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）是一種在骨代謝中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子，它與BMP在成骨過程中存在協(xié)同作用。IGF-1能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，在hPDLCs中，IGF-1可以通過激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。研究表明，LIPUS處理hPDLCs后，不僅BMP-2的表達(dá)增加，IGF-1的表達(dá)也顯著上調(diào)。BMP-2與IGF-1之間可能通過以下機(jī)制協(xié)同促進(jìn)成骨分化：BMP-2激活Smad信號(hào)通路，促進(jìn)成骨相關(guān)基因如Runx2的表達(dá)；IGF-1則通過PI3K/Akt信號(hào)通路，一方面促進(jìn)hPDLCs的增殖，為成骨分化提供更多的細(xì)胞來源，另一方面，Akt可以磷酸化并激活一些轉(zhuǎn)錄因子，如FoxO1等，這些轉(zhuǎn)錄因子可以與Smad信號(hào)通路協(xié)同作用，進(jìn)一步增強(qiáng)Runx2等成骨相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)hPDLCs向成骨細(xì)胞分化。在一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)中，將hPDLCs分為對(duì)照組、LIPUS處理組、IGF-1單獨(dú)處理組以及LIPUS聯(lián)合IGF-1處理組。結(jié)果顯示，LIPUS聯(lián)合IGF-1處理組的細(xì)胞增殖活性、ALP活性以及成骨相關(guān)基因Runx2、OCN的表達(dá)水平均顯著高于其他組，表明LIPUS誘導(dǎo)的BMP-2與IGF-1之間的協(xié)同作用能夠更有效地促進(jìn)hPDLCs的成骨分化。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）與BMP同屬于TGF-β超家族，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上具有一定的相似性，在成骨調(diào)控過程中既存在協(xié)同作用，也存在相互制約的關(guān)系。TGF-β可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，在hPDLCs的成骨分化過程中，TGF-β能夠上調(diào)膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分的表達(dá)，為骨組織的形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。LIPUS處理hPDLCs后，TGF-β的表達(dá)也會(huì)發(fā)生變化，且與BMP的表達(dá)變化存在一定的相關(guān)性。在早期成骨階段，BMP和TGF-β可能協(xié)同作用，共同促進(jìn)hPDLCs的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。BMP-2激活Smad信號(hào)通路，誘導(dǎo)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，TGF-β則通過激活其下游的Smad2/3信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)，兩者相互配合，推動(dòng)成骨過程的啟動(dòng)。然而，在成骨后期，TGF-β可能會(huì)對(duì)BMP的信號(hào)通路產(chǎn)生一定的抑制作用，以維持骨代謝的平衡。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的TGF-β可以抑制BMP-2誘導(dǎo)的Runx2表達(dá)，可能是通過競(jìng)爭(zhēng)受體或調(diào)節(jié)Smad蛋白之間的相互作用來實(shí)現(xiàn)的。在本研究中，通過檢測(cè)LIPUS處理不同時(shí)間點(diǎn)hPDLCs中TGF-β和BMP-2的表達(dá)以及相關(guān)信號(hào)通路蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)兩者在早期協(xié)同促進(jìn)成骨，后期TGF-β對(duì)BMP信號(hào)的適度抑制，有助于防止過度成骨，維持骨組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子與BMP在成骨調(diào)控中也存在密切的交互作用。如前所述，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路通過β-catenin調(diào)控成骨相關(guān)基因的表達(dá)。在LIPUS處理hPDLCs的過程中，BMP-2的表達(dá)增加可能會(huì)影響Wnt信號(hào)通路的活性。有研究表明，BMP-2可以通過上調(diào)Wnt配體的表達(dá)，間接激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。BMP-2激活Smad信號(hào)通路后，Smad復(fù)合物可以結(jié)合到Wnt配體基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而增加Wnt配體的分泌。Wnt配體與細(xì)胞膜上的Frizzled受體和LRP5/6共受體結(jié)合，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)成骨相關(guān)基因如Runx2、CyclinD1等的表達(dá)。Wnt信號(hào)通路也可以反饋調(diào)節(jié)BMP信號(hào)通路。β-catenin可以與Smad4相互作用，增強(qiáng)Smad信號(hào)通路的活性，促進(jìn)BMP誘導(dǎo)的成骨分化。在hPDLCs中，通過基因敲低或過表達(dá)技術(shù)改變Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)，再進(jìn)行LIPUS處理，發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路的激活或抑制會(huì)顯著影響LIPUS誘導(dǎo)的BMP成骨調(diào)控作用，進(jìn)一步證實(shí)了兩者之間的交互作用對(duì)hPDLCs成骨分化的重要性。5.3機(jī)制模型構(gòu)建基于本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和分析結(jié)果，構(gòu)建低強(qiáng)度脈沖超聲波（LIPUS）通過骨形成蛋白（BMP）調(diào)控人類牙周膜細(xì)胞（hPDLCs）成骨的機(jī)制模型，如圖5-1所示。當(dāng)hPDLCs受到LIPUS刺激時(shí)，LIPUS產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng)首先作用于細(xì)胞。機(jī)械效應(yīng)使細(xì)胞膜受到周期性的壓力變化，激活細(xì)胞膜上的機(jī)械敏感離子通道，如鈣離子通道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高?？栈?yīng)產(chǎn)生的微射流和局部高溫高壓等現(xiàn)象，可能對(duì)細(xì)胞膜造成微小損傷，激活細(xì)胞的自我修復(fù)機(jī)制，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。熱效應(yīng)則促進(jìn)局部血液循環(huán)，增加細(xì)胞的氧供和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，為細(xì)胞的代謝和功能活動(dòng)提供良好環(huán)境。在細(xì)胞內(nèi)，LIPUS刺激通過上述效應(yīng)激活BMP信號(hào)通路。BMP信號(hào)通路的激活首先表現(xiàn)為BMP-2等BMP家族成員的表達(dá)上調(diào)。LIPUS處理hPDLCs后，BMP-2基因轉(zhuǎn)錄水平升高，進(jìn)而翻譯出更多的BMP-2蛋白。BMP-2作為一種分泌型糖蛋白，分泌到細(xì)胞外后，與細(xì)胞表面的BMP受體（BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ）結(jié)合。BMPR-Ⅱ具有組成型激酶活性，當(dāng)BMP-2與受體復(fù)合物結(jié)合后，BMPR-Ⅱ磷酸化BMPR-Ⅰ的GS結(jié)構(gòu)域，使其激活。激活后的BMPR-Ⅰ能夠磷酸化受體調(diào)節(jié)型Smad蛋白（R-Smads），主要包括Smad1、Smad5和Smad8。這些磷酸化的R-Smads與Smad4形成異源寡聚體復(fù)合物，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，Smad復(fù)合物與特定的DNA序列結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄共激活因子或共抑制因子，從而調(diào)控下游成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。成骨相關(guān)基因如Runx2、OCN、OPN等在BMP-Smad信號(hào)通路的調(diào)控下表達(dá)上調(diào)。Runx2作為成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)一系列成骨相關(guān)基因的表達(dá)，包括ALP、OCN、OPN等。ALP在成骨細(xì)胞分化早期高表達(dá)，它能夠水解磷酸酯，釋放無機(jī)磷，為細(xì)胞外基質(zhì)的礦化提供必要的磷源。OCN參與骨基質(zhì)的礦化過程，與鈣結(jié)合形成羥基磷灰石晶體，促進(jìn)骨礦化的成熟。OPN則在細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用中發(fā)揮重要作用，它能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和遷移，同時(shí)也參與骨礦化的起始和調(diào)控過程。這些成骨相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物協(xié)同作用，促進(jìn)hPDLCs向成骨細(xì)胞分化，增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成和礦化，最終促進(jìn)骨組織的形成。在這一過程中，LIPUS對(duì)BMP的調(diào)控還存在時(shí)間依賴性和分子交互作用。隨著LIPUS處理時(shí)間的延長(zhǎng)，BMP-2