全反式維甲酸對(duì)高糖環(huán)境下大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與意義糖尿病腎?。―iabeticNephropathy，DN）是糖尿病常見且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，嚴(yán)重威脅患者的健康與生活質(zhì)量。近年來，隨著全球糖尿病發(fā)病率的急劇上升，糖尿病腎病的患病率也呈顯著增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。在歐美等發(fā)達(dá)國家，糖尿病腎病已成為終末期腎?。‥nd-StageRenalDisease，ESRD）的首要病因，約占ESRD患者的25%-42%。在我國，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活方式的改變，糖尿病腎病的發(fā)病率同樣迅速攀升，目前已成為導(dǎo)致ESRD的重要原因之一，約占ESRD患者的6%-10%。倘若糖尿病腎病病情未能得到有效控制，一旦進(jìn)展至ESRD階段，患者不僅需要依賴昂貴且痛苦的腎臟替代治療，如血液透析或腹膜透析，其病死率也會(huì)顯著高于其他非糖尿病腎病導(dǎo)致的ESRD患者。因此，深入探究糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，并尋找有效的防治策略，對(duì)于改善糖尿病患者的預(yù)后、降低ESRD的發(fā)生率以及減輕社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)，都具有極為重要的意義。腎小球系膜細(xì)胞（GlomerularMesangialCells，GMCs）在腎小球的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，腎小球系膜病變是最為突出的病理改變之一。研究表明，高糖環(huán)境是誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞發(fā)生一系列病理變化的關(guān)鍵因素。長(zhǎng)期暴露于高糖狀態(tài)下，腎小球系膜細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)異常增殖，細(xì)胞外基質(zhì)（ExtracellularMatrix，ECM）合成顯著增多且降解減少，最終導(dǎo)致腎小球硬化和腎功能進(jìn)行性減退。雖然目前對(duì)于高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖的具體機(jī)制尚未完全明確，但一般認(rèn)為，這一過程涉及多元醇通路的激活、蛋白激酶C（ProteinKinaseC，PKC）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常、晚期糖基化終末產(chǎn)物（AdvancedGlycationEnd-products，AGEs）的大量生成與堆積，以及各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的失衡等多個(gè)復(fù)雜環(huán)節(jié)。例如，高糖可使細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝通過多元醇途徑增強(qiáng)，導(dǎo)致山梨醇和果糖在細(xì)胞內(nèi)大量積聚，引起細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高、細(xì)胞腫脹，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常功能。同時(shí)，高糖還能激活PKC途徑，促使腎小球系膜細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成。此外，高糖條件下生成的AGEs可與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，引發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步損傷腎臟組織。全反式維甲酸（All-transRetinoicAcid，ATRA）作為維甲酸類化合物中最為常見且構(gòu)型穩(wěn)定的一種，屬于維生素A的天然衍生物。維甲酸類化合物在生物體內(nèi)發(fā)揮著廣泛而重要的生理作用，尤其是在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡以及維持上皮組織的正常功能等方面。其作用機(jī)制主要是通過與維甲酸受體（RetinoicAcidReceptor，RAR）和維甲類X受體（RetinoidXReceptor，RXR）相結(jié)合，這兩類受體均屬于類固醇-甲狀腺素核轉(zhuǎn)錄因子超家族。當(dāng)維甲酸與受體結(jié)合后，能夠識(shí)別并結(jié)合基因組DNA的特異性序列，即維甲酸受體反應(yīng)元件，通過對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生理功能的調(diào)節(jié)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)維甲酸可以通過抑制轉(zhuǎn)錄活性因子AP-1途徑來抑制某些細(xì)胞的增殖。AP-1是一種轉(zhuǎn)錄因子，由c-Jun和c-Fos等組成，其活性形式為Jun與Fos家族成員的同源或異源二聚體，在腫瘤的形成和侵襲浸潤過程中發(fā)揮著重要作用。維甲酸類藥物能夠與c-Jun相互作用，使AP-1失活，從而抑制細(xì)胞增殖。在腫瘤研究領(lǐng)域，全反式維甲酸已被證實(shí)具有顯著的抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡的作用。例如，在急性早幼粒細(xì)胞白血病（AcutePromyelocyticLeukemia，APL）的治療中，全反式維甲酸取得了突破性的療效，顯著提高了患者的治愈率。此外，全反式維甲酸在肝癌、胃癌、胰腺癌等多種實(shí)體腫瘤的研究中，也展現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性。在肝臟疾病方面，全反式維甲酸能夠抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，影響DNA合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，全反式維甲酸還可調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。在胃癌細(xì)胞的研究中，全反式維甲酸可降低腫瘤相關(guān)抗原MGb2的表達(dá)，抑制癌基因c-myc、bcl-2等的表達(dá)，上調(diào)WTp53mRNA的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。鑒于全反式維甲酸在細(xì)胞增殖、分化和凋亡調(diào)控方面的重要作用，以及糖尿病腎病中腎小球系膜細(xì)胞異常增殖的關(guān)鍵病理特征，探討全反式維甲酸對(duì)高糖所致大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響具有重要的科學(xué)意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究旨在通過體外實(shí)驗(yàn)，深入探究全反式維甲酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的作用及其可能的分子機(jī)制，為糖尿病腎病的防治提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)，有望為糖尿病腎病患者帶來更有效的治療策略，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1高糖對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的影響研究高糖狀態(tài)下腎小球系膜細(xì)胞的異常變化是糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制研究的關(guān)鍵熱點(diǎn)。國內(nèi)外眾多研究表明，高糖環(huán)境會(huì)對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生多方面的顯著影響，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能的損害。在細(xì)胞增殖方面，大量體外實(shí)驗(yàn)研究都證實(shí)了高糖能夠顯著促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞的增殖。例如，國內(nèi)學(xué)者曹學(xué)照等人的研究使用[3H]同位素標(biāo)記的胸苷結(jié)合DNA評(píng)估細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示15.5mmol/L高糖刺激36h能明顯提高[3H]同位素標(biāo)記的胸苷表達(dá)，表明高糖刺激36h可明顯促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖。林子越等人通過實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)Gal-3在高低糖條件下MCs中的表達(dá)，并在高糖培養(yǎng)的MCs中轉(zhuǎn)染Gal-3-siRNA，在低糖培養(yǎng)的MCs中轉(zhuǎn)染Gal-3過表達(dá)質(zhì)粒，通過5-乙基-2′-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）檢測(cè)MCs的增殖能力，發(fā)現(xiàn)與低糖下的MCs相比，高糖條件下的MCs中Gal-3表達(dá)顯著升高，過表達(dá)Gal-3后，MCs增殖能力顯著提高。國外也有類似研究成果，如[此處若能找到相關(guān)英文文獻(xiàn)研究，可具體描述實(shí)驗(yàn)及結(jié)果]。這種異常增殖會(huì)導(dǎo)致系膜區(qū)擴(kuò)張，進(jìn)而引起腎小球硬化。高糖還會(huì)干擾腎小球系膜細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝平衡。細(xì)胞外基質(zhì)主要由膠原蛋白、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等成分組成，在維持腎小球正常結(jié)構(gòu)和功能方面起著關(guān)鍵作用。正常情況下，腎小球系膜細(xì)胞能夠精確調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解，以保持其動(dòng)態(tài)平衡。然而，在高糖環(huán)境中，細(xì)胞外基質(zhì)的合成會(huì)顯著增加，同時(shí)降解減少。例如，有研究發(fā)現(xiàn)高糖可上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）的表達(dá)，TGF-β是一種強(qiáng)效的致纖維化細(xì)胞因子，它能夠促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞合成膠原蛋白、層粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分。此外，高糖還能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性，MMPs是負(fù)責(zé)降解細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶類，其活性降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解受阻，從而在腎小球內(nèi)大量堆積。長(zhǎng)期的細(xì)胞外基質(zhì)堆積會(huì)使腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多，最終導(dǎo)致腎小球硬化，腎功能逐漸減退。氧化應(yīng)激也是高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞面臨的重要問題。高糖會(huì)促使腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）大量生成，ROS的過度積累會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等生物大分子造成嚴(yán)重?fù)p傷。研究表明，高糖可通過激活多元醇通路、蛋白激酶C（PKC）途徑以及晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的生成等多種機(jī)制，誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。例如，高糖條件下，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝通過多元醇通路增強(qiáng)，使NADPH大量消耗，導(dǎo)致抗氧化物質(zhì)如谷胱甘肽（GSH）合成減少，從而削弱了細(xì)胞的抗氧化防御能力，使得ROS得以大量積累。同時(shí)，高糖激活PKC途徑后，可促使NADPH氧化酶活性增強(qiáng)，進(jìn)一步增加ROS的生成。AGEs與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合后，也會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加。氧化應(yīng)激不僅會(huì)直接損傷腎小球系膜細(xì)胞，還會(huì)通過激活一系列炎癥信號(hào)通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重腎臟損傷。1.2.2全反式維甲酸作用的研究全反式維甲酸（ATRA）作為一種重要的生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其作用機(jī)制和應(yīng)用研究一直是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域的熱門話題。在腫瘤治療領(lǐng)域，全反式維甲酸的應(yīng)用取得了令人矚目的成果。以急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）為例，王振義院士創(chuàng)造性地提出“全反式維甲酸聯(lián)合三氧化二砷”的治療方法，使全球APL患者治愈率達(dá)92%。全反式維甲酸能夠誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化，使其從異常的早幼粒細(xì)胞階段向成熟的粒細(xì)胞方向分化，從而達(dá)到治療疾病的目的。其作用機(jī)制主要是通過與維甲酸受體（RAR）結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。在實(shí)體腫瘤研究中，全反式維甲酸也展現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性。如在肝癌細(xì)胞研究中，Liu等發(fā)現(xiàn)ATRA可通過降低肝癌細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng)性來抑制其增殖，使細(xì)胞對(duì)人表皮促生長(zhǎng)因子的增殖反應(yīng)敏感性降低，還可誘導(dǎo)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1表達(dá)上調(diào)。此外，ATRA還能抑制肝癌細(xì)胞Hep3B中波形纖維蛋白（vimentin）mRNA的表達(dá)，而波形纖維蛋白與腫瘤的惡性表型、腫瘤細(xì)胞活力及不良預(yù)后密切相關(guān)。在胃癌細(xì)胞研究中，ATRA作用后，腫瘤相關(guān)抗原MGb2表達(dá)下降，癌基因c-myc、bcl-2等表達(dá)明顯抑制，WTp53mRNA等表達(dá)增高，提示ATRA誘導(dǎo)凋亡的作用可能是通過對(duì)細(xì)胞凋亡有關(guān)基因的調(diào)控實(shí)現(xiàn)。在其他疾病研究中，全反式維甲酸也顯示出潛在的治療價(jià)值。在皮膚疾病方面，全反式維甲酸能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞分化與生長(zhǎng)，維持上皮組織的正常角化過程，減少皮脂的分泌，可用于治療痤瘡、銀屑病等多種皮膚病。在心血管疾病研究中，有研究表明全反式維甲酸對(duì)血管平滑肌細(xì)胞具有一定的調(diào)節(jié)作用，它可明顯抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，下調(diào)TGF基因表達(dá)，降低血纖維蛋白酶原激活物（tPA）的活性，使血纖維蛋白酶原激活物抑制物PAI-1表達(dá)上調(diào)。在慢性腎衰大鼠模型研究中，發(fā)現(xiàn)5/6腎大部切除后，大鼠血漿和腎組織內(nèi)ATRA在短期內(nèi)升高，以后明顯下降，在中、晚期降至正常水平，提示內(nèi)源性ATRA水平的變化可能與慢性腎衰的病理進(jìn)程相關(guān)。然而，目前關(guān)于全反式維甲酸對(duì)高糖所致大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖影響的研究相對(duì)較少。雖然全反式維甲酸在其他領(lǐng)域的研究成果為其在糖尿病腎病治療方面提供了一定的理論基礎(chǔ)和研究思路，但仍需要更多針對(duì)性的研究來明確其在糖尿病腎病中對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的具體作用機(jī)制和治療效果，這對(duì)于拓展全反式維甲酸的臨床應(yīng)用范圍，開發(fā)糖尿病腎病的新型治療策略具有重要意義。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究的核心目的在于深入探究全反式維甲酸對(duì)高糖所致大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響，并系統(tǒng)剖析其潛在的分子作用機(jī)制。通過這一研究，期望為糖尿病腎病的防治提供全新的理論依據(jù)，同時(shí)為開發(fā)有效的治療策略提供潛在的作用靶點(diǎn)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：在研究?jī)?nèi)容上，聚焦于全反式維甲酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的作用，填補(bǔ)了該領(lǐng)域在這一特定方向上研究的相對(duì)空白。此前雖有全反式維甲酸在腫瘤及其他疾病方面的研究，但針對(duì)其在糖尿病腎病中對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖影響的研究較少，本研究將為這一領(lǐng)域提供新的視角和數(shù)據(jù)。在研究方法上，采用多維度的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、相關(guān)蛋白表達(dá)以及信號(hào)通路等多個(gè)層面進(jìn)行深入分析，全面系統(tǒng)地揭示全反式維甲酸的作用機(jī)制。這種多方位的研究方法有助于更深入、準(zhǔn)確地理解全反式維甲酸的作用效果，相較于單一研究方法，能提供更豐富和全面的信息。此外，本研究還將探討全反式維甲酸與其他已知的糖尿病腎病相關(guān)治療靶點(diǎn)或藥物的潛在協(xié)同作用，為未來糖尿病腎病的聯(lián)合治療提供新思路，這在以往的相關(guān)研究中也鮮見報(bào)道。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1糖尿病腎病與高糖環(huán)境糖尿病腎病作為糖尿病最為常見且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在糖尿病患者中，約有20%-40%最終會(huì)發(fā)展為糖尿病腎病。糖尿病腎病的病理特征主要表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)增寬，系膜細(xì)胞異常增殖，細(xì)胞外基質(zhì)大量積聚，腎小球基底膜增厚以及腎小球硬化。這些病理變化會(huì)逐漸破壞腎小球的正常結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致腎功能進(jìn)行性減退，最終發(fā)展為終末期腎病，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。在糖尿病腎病的發(fā)病過程中，高糖環(huán)境起著核心作用，是誘導(dǎo)腎臟病變發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。正常情況下，人體血糖水平維持在相對(duì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，腎臟各細(xì)胞能夠正常發(fā)揮其生理功能。然而，當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境時(shí)，腎小球系膜細(xì)胞會(huì)受到高糖的持續(xù)刺激，發(fā)生一系列病理生理改變。高糖對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的影響首先體現(xiàn)在細(xì)胞增殖方面。研究表明，高糖可顯著促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞的增殖。如前所述，國內(nèi)學(xué)者曹學(xué)照等人使用[3H]同位素標(biāo)記的胸苷結(jié)合DNA評(píng)估細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)15.5mmol/L高糖刺激36h能明顯提高[3H]同位素標(biāo)記的胸苷表達(dá)，表明高糖刺激36h可明顯促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖。國外相關(guān)研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。這種異常增殖會(huì)導(dǎo)致系膜區(qū)逐漸擴(kuò)張，系膜細(xì)胞數(shù)量增多，進(jìn)而破壞腎小球的正常結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡也是高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞的重要病理改變。正常情況下，腎小球系膜細(xì)胞能夠精確調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解，維持其動(dòng)態(tài)平衡。但在高糖環(huán)境中，細(xì)胞外基質(zhì)的合成顯著增加，同時(shí)降解減少。高糖可上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）的表達(dá)，TGF-β是一種強(qiáng)效的致纖維化細(xì)胞因子，它能夠促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞合成膠原蛋白、層粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分。高糖還能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性，MMPs是負(fù)責(zé)降解細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶類，其活性降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解受阻，從而在腎小球內(nèi)大量堆積。長(zhǎng)期的細(xì)胞外基質(zhì)堆積會(huì)使腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多，最終導(dǎo)致腎小球硬化，腎功能逐漸減退。氧化應(yīng)激在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞損傷中也扮演著重要角色。高糖會(huì)促使腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）大量生成，ROS的過度積累會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等生物大分子造成嚴(yán)重?fù)p傷。高糖可通過激活多元醇通路、蛋白激酶C（PKC）途徑以及晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的生成等多種機(jī)制，誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。高糖條件下，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝通過多元醇通路增強(qiáng)，使NADPH大量消耗，導(dǎo)致抗氧化物質(zhì)如谷胱甘肽（GSH）合成減少，從而削弱了細(xì)胞的抗氧化防御能力，使得ROS得以大量積累。高糖激活PKC途徑后，可促使NADPH氧化酶活性增強(qiáng)，進(jìn)一步增加ROS的生成。AGEs與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合后，也會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加。氧化應(yīng)激不僅會(huì)直接損傷腎小球系膜細(xì)胞，還會(huì)通過激活一系列炎癥信號(hào)通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重腎臟損傷。高糖還會(huì)影響腎小球系膜細(xì)胞的其他生理功能，如細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞因子的分泌等。這些改變相互作用，共同促進(jìn)了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。深入了解高糖對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的影響機(jī)制，對(duì)于尋找有效的糖尿病腎病防治策略具有重要意義。2.2腎小球系膜細(xì)胞的生物學(xué)特性腎小球系膜細(xì)胞作為腎小球的固有細(xì)胞，在腎小球的結(jié)構(gòu)和功能中扮演著舉足輕重的角色。在腎臟中，每個(gè)腎小球大約由20-40個(gè)系膜細(xì)胞組成，它們緊密地分布于腎小球毛細(xì)血管袢之間。從結(jié)構(gòu)上看，腎小球系膜細(xì)胞呈星狀，具有多個(gè)不規(guī)則的凸起，這些凸起能夠深入周圍的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及基底膜內(nèi)。其細(xì)胞內(nèi)含有豐富的肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白和微管等細(xì)胞骨架成分，這賦予了系膜細(xì)胞獨(dú)特的收縮和運(yùn)動(dòng)能力。同時(shí)，系膜細(xì)胞還擁有發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，表明其具有活躍的蛋白質(zhì)合成和分泌功能。腎小球系膜細(xì)胞具有多方面的生物學(xué)功能。系膜細(xì)胞對(duì)腎小球內(nèi)的毛細(xì)血管袢起著重要的支持和保護(hù)作用。它們填充于毛細(xì)血管袢之間，就像支架一樣，維持著毛細(xì)血管的正常位置和形態(tài)，確保腎小球毛細(xì)血管的暢通，保證血液能夠在腎小球內(nèi)正常流動(dòng)和濾過。在腎小球系膜區(qū)，系膜細(xì)胞分泌系膜基質(zhì)，這些基質(zhì)相互交織形成系膜通道，為大分子物質(zhì)在腎小球內(nèi)的運(yùn)輸提供了通道。系膜細(xì)胞還能分泌多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）以及腎素等。這些細(xì)胞生長(zhǎng)因子在調(diào)節(jié)腎臟血流量、維持腎小球的正常生理功能以及細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。以TGF-β為例，它在腎臟的發(fā)育、組織修復(fù)和纖維化過程中都具有重要的調(diào)節(jié)作用。在正常情況下，TGF-β可以維持腎臟細(xì)胞的正常功能和細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。但在病理狀態(tài)下，如糖尿病腎病時(shí)，高糖刺激會(huì)導(dǎo)致TGF-β的過度表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，引發(fā)腎小球硬化。系膜細(xì)胞具有活躍的吞噬功能，能夠參與腎臟的免疫反應(yīng)，發(fā)揮清潔功能。當(dāng)有免疫復(fù)合物、大分子物質(zhì)或其他異物沉積在腎小球基底膜時(shí)，系膜細(xì)胞能夠識(shí)別并吞噬這些物質(zhì)，然后通過溶酶體酶的作用將其降解，從而維持腎小球內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。這種吞噬功能對(duì)于清除腎小球內(nèi)的有害物質(zhì)，防止其對(duì)腎臟組織造成損傷具有重要意義。此外，系膜細(xì)胞固有的收縮活動(dòng)能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)徑，進(jìn)而控制腎小球血流量。系膜細(xì)胞的收縮受多種因素的調(diào)節(jié)，如血管活性物質(zhì)、細(xì)胞因子和神經(jīng)遞質(zhì)等。當(dāng)系膜細(xì)胞接收到收縮信號(hào)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白相互作用，使細(xì)胞發(fā)生收縮，導(dǎo)致腎小球毛細(xì)血管管徑變小，腎小球血流量減少；反之，當(dāng)接收到舒張信號(hào)時(shí)，細(xì)胞舒張，毛細(xì)血管管徑增大，腎小球血流量增加。這種對(duì)腎小球血流量的精細(xì)調(diào)節(jié)，有助于維持腎小球的正常濾過功能。在正常生理狀態(tài)下，腎小球系膜細(xì)胞處于相對(duì)靜止的狀態(tài)，其增殖和凋亡保持著動(dòng)態(tài)平衡。但在某些病理?xiàng)l件下，如糖尿病腎病時(shí)，高糖環(huán)境會(huì)打破這種平衡，導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞發(fā)生異常增殖。細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡也是常見的病理改變，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)合成增加和降解減少，最終導(dǎo)致腎小球硬化和腎功能減退。深入了解腎小球系膜細(xì)胞的生物學(xué)特性及其在病理狀態(tài)下的變化，對(duì)于揭示糖尿病腎病等腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制，以及尋找有效的治療靶點(diǎn)具有至關(guān)重要的意義。2.3全反式維甲酸的作用機(jī)制概述全反式維甲酸（All-transRetinoicAcid，ATRA）是體內(nèi)維生素A的重要中間代謝產(chǎn)物，作為一種多效性的生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡以及維持上皮組織的正常功能等多個(gè)關(guān)鍵生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其化學(xué)名稱為3,7-二甲基-9-（2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-基）-2,4,6,8-壬四烯酸，分子式為C??H??O?，分子量為300.44。全反式維甲酸的作用機(jī)制較為復(fù)雜，主要是通過與細(xì)胞內(nèi)的維甲酸受體（RetinoicAcidReceptor，RAR）和維甲類X受體（RetinoidXReceptor，RXR）相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞生理功能的調(diào)控。RAR和RXR均屬于類固醇-甲狀腺素核轉(zhuǎn)錄因子超家族，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)以異源二聚體（RAR-RXR）的形式存在。當(dāng)全反式維甲酸進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)特異性地與RAR-RXR異源二聚體中的RAR結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，從而引發(fā)一系列的分子事件。結(jié)合了全反式維甲酸的RAR-RXR異源二聚體構(gòu)象發(fā)生改變，使其能夠識(shí)別并結(jié)合基因組DNA上的特異性序列，即維甲酸受體反應(yīng)元件（RetinoicAcidResponseElement，RARE）。RARE通常由兩個(gè)同向或反向重復(fù)的六核苷酸序列（5'-PuG(G/T)TCA-3'）組成，中間間隔1-5個(gè)核苷酸。一旦RAR-RXR異源二聚體與RARE結(jié)合，就會(huì)招募多種轉(zhuǎn)錄輔助因子，如共激活因子或共抑制因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。在某些情況下，結(jié)合了全反式維甲酸的RAR-RXR異源二聚體與共激活因子相互作用，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄，使得相關(guān)蛋白質(zhì)的合成增加，從而對(duì)細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生影響。而在另一些情況下，它可能與共抑制因子結(jié)合，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，減少相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)。全反式維甲酸可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)來影響細(xì)胞的增殖。研究表明，全反式維甲酸能夠上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27的表達(dá)。p21和p27可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cyclin-DependentKinase，CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞增殖。在急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）細(xì)胞中，全反式維甲酸能夠誘導(dǎo)p21的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制白血病細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其向成熟粒細(xì)胞分化。在細(xì)胞凋亡方面，全反式維甲酸可以通過激活線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在一些腫瘤細(xì)胞中，全反式維甲酸能夠下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。Bcl-2主要位于線粒體膜上，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用；而Bax則可以促進(jìn)線粒體膜通透性的改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）和半胱天冬酶9（Caspase-9）結(jié)合，形成凋亡小體，激活Caspase-9，進(jìn)而激活下游的Caspase-3等效應(yīng)Caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡。全反式維甲酸還可以通過上調(diào)死亡受體Fas及其配體FasL的表達(dá)，激活死亡受體凋亡途徑。Fas與FasL結(jié)合后，會(huì)招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）和Caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC），激活Caspase-8，進(jìn)而激活下游的Caspase-3等效應(yīng)Caspase，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。除了上述經(jīng)典的作用機(jī)制外，全反式維甲酸還可以通過非基因組途徑發(fā)揮作用。它可以在細(xì)胞膜上快速激活一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-ActivatedProteinKinase，MAPK）信號(hào)通路。全反式維甲酸與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合后，能夠激活Ras蛋白，進(jìn)而依次激活Raf、MEK和ERK等激酶，使ERK磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程產(chǎn)生影響。這種非基因組途徑的作用通常在數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生，比基因組途徑的作用更為迅速。三、高糖對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康的雄性SPF級(jí)SD大鼠，體重180-220g，購自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)單位名稱]。大鼠在溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食和飲水，光照周期為12h光照/12h黑暗。3.1.2細(xì)胞株大鼠腎小球系膜細(xì)胞株（HBZY-1）購自[細(xì)胞庫名稱]。該細(xì)胞株具有典型的腎小球系膜細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)特性，經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)和鑒定，其生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。3.1.3試劑DMEM高糖培養(yǎng)基：購自美國Gibco公司，用于細(xì)胞的培養(yǎng)，為細(xì)胞提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)環(huán)境。胎牛血清：購自美國Gibco公司，富含多種生長(zhǎng)因子和營養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，在細(xì)胞培養(yǎng)中添加適量的胎牛血清，可提高細(xì)胞的活力和生長(zhǎng)速度。胰蛋白酶：購自美國Sigma公司，用于細(xì)胞的消化傳代，能夠?qū)①N壁生長(zhǎng)的細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部消化下來，使其分散成單個(gè)細(xì)胞，便于進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作。CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒：購自日本同仁化學(xué)研究所，通過檢測(cè)細(xì)胞線粒體中的脫氫酶活性來反映細(xì)胞的增殖情況，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒：購自[試劑盒供應(yīng)商名稱]，用于檢測(cè)細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況，通過對(duì)細(xì)胞周期的分析，可以了解細(xì)胞的增殖狀態(tài)和調(diào)控機(jī)制。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒：購自[試劑盒供應(yīng)商名稱]，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，AnnexinV能夠特異性地與凋亡早期細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，而PI則可以對(duì)壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AnnexinV和PI的熒光強(qiáng)度，可準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。全反式維甲酸：購自[試劑供應(yīng)商名稱]，純度≥98%，用無水乙醇溶解配制成10-3mol/L的儲(chǔ)存液，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。其他試劑：青霉素、鏈霉素、PBS緩沖液等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?，用于?xì)胞培養(yǎng)過程中的消毒、清洗和配制其他溶液等。3.1.4儀器二氧化碳培養(yǎng)箱：購自美國Thermo公司，型號(hào)為[具體型號(hào)]，能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和二氧化碳濃度，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供穩(wěn)定的培養(yǎng)條件。倒置顯微鏡：購自日本Olympus公司，型號(hào)為[具體型號(hào)]，用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和貼壁情況等，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程。酶標(biāo)儀：購自美國Bio-Rad公司，型號(hào)為[具體型號(hào)]，用于檢測(cè)CCK-8試劑盒的吸光度值，通過測(cè)定吸光度值來定量分析細(xì)胞的增殖情況。流式細(xì)胞儀：購自美國BD公司，型號(hào)為[具體型號(hào)]，用于檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況，能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析和分選。高速冷凍離心機(jī)：購自德國Eppendorf公司，型號(hào)為[具體型號(hào)]，用于細(xì)胞和試劑的離心分離，可在低溫條件下進(jìn)行高速離心，保證樣品的生物活性。超凈工作臺(tái)：購自蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號(hào)為[具體型號(hào)]，為細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作提供無菌的工作環(huán)境，有效防止微生物的污染。3.1.5細(xì)胞培養(yǎng)將大鼠腎小球系膜細(xì)胞株（HBZY-1）從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL）的DMEM高糖培養(yǎng)基的離心管中，1000r/min離心5min，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.1.6實(shí)驗(yàn)分組及處理正常對(duì)照組：用含5.5mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。高糖組：用含30mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。全反式維甲酸低劑量組：在含30mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)基中加入終濃度為10-6mol/L的全反式維甲酸培養(yǎng)細(xì)胞。全反式維甲酸中劑量組：在含30mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)基中加入終濃度為10-5mol/L的全反式維甲酸培養(yǎng)細(xì)胞。全反式維甲酸高劑量組：在含30mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)基中加入終濃度為10-4mol/L的全反式維甲酸培養(yǎng)細(xì)胞。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。然后按照上述分組更換相應(yīng)的培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h。3.1.7檢測(cè)指標(biāo)與方法細(xì)胞增殖檢測(cè)（CCK-8法）：在培養(yǎng)結(jié)束前2h，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h。然后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。細(xì)胞周期檢測(cè)：收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，1000r/min離心5min。然后加入70%預(yù)冷乙醇，4℃固定過夜。次日，1000r/min離心5min，棄乙醇，用PBS洗滌2次。加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PI）和100μg/mLRNaseA的染色液，4℃避光孵育30min。最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況，分析細(xì)胞周期的變化。細(xì)胞凋亡檢測(cè)（AnnexinV-FITC/PI雙染法）：收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，1000r/min離心5min。加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，然后加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析通過CCK-8法對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果清晰地顯示出高糖對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖具有顯著影響。在不同培養(yǎng)時(shí)間下，高糖組細(xì)胞的吸光度值（OD值）相較于正常對(duì)照組均明顯升高。具體數(shù)據(jù)如下表1所示：表1：不同培養(yǎng)時(shí)間下各組細(xì)胞的OD值（，）組別24h48h72h正常對(duì)照組0.456\pm0.0230.568\pm0.0310.654\pm0.035高糖組0.589\pm0.032^{*}0.765\pm0.042^{*}0.987\pm0.051^{*}注：與正常對(duì)照組比較，^{*}P\lt0.05從表1數(shù)據(jù)可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，高糖組細(xì)胞的OD值增長(zhǎng)更為迅速，表明高糖刺激下系膜細(xì)胞的增殖速率明顯加快。在24h時(shí)，高糖組OD值就已顯著高于正常對(duì)照組（P\lt0.05）；48h時(shí)，高糖組OD值進(jìn)一步升高，與正常對(duì)照組的差距進(jìn)一步拉大；到72h時(shí)，高糖組OD值幾乎達(dá)到正常對(duì)照組的1.5倍，這種差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\lt0.01）。這充分說明高糖對(duì)系膜細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，高糖的促增殖作用越顯著。在不同葡萄糖濃度對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置了5.5mmol/L（正常對(duì)照組）、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L等不同葡萄糖濃度組，培養(yǎng)48h后檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果如下表2所示：表2：不同葡萄糖濃度下細(xì)胞的OD值（，）葡萄糖濃度（mmol/L）OD值5.50.568\pm0.031100.623\pm0.035^{*}200.712\pm0.040^{*}300.765\pm0.042^{*}400.780\pm0.045^{*}注：與5.5mmol/L組比較，^{*}P\lt0.05由表2數(shù)據(jù)可知，隨著葡萄糖濃度的升高，細(xì)胞的OD值逐漸增大，表明系膜細(xì)胞的增殖能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到10mmol/L時(shí)，細(xì)胞OD值與正常對(duì)照組相比就已出現(xiàn)顯著差異（P\lt0.05）；在20mmol/L、30mmol/L和40mmol/L高糖濃度下，細(xì)胞OD值進(jìn)一步顯著升高，且各高糖濃度組之間也存在一定差異，呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。但當(dāng)葡萄糖濃度超過30mmol/L后，OD值的升高幅度相對(duì)較小，說明高糖對(duì)系膜細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用在一定濃度范圍內(nèi)呈正相關(guān)，當(dāng)超過一定濃度后，促增殖作用的增強(qiáng)趨勢(shì)逐漸變緩。在倒置顯微鏡下對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，正常對(duì)照組的大鼠腎小球系膜細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的梭形或星形形態(tài)，細(xì)胞邊界清晰，胞質(zhì)均勻，貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞之間排列緊密且有序。而高糖組細(xì)胞則發(fā)生了明顯的形態(tài)改變，細(xì)胞體積明顯增大，呈現(xiàn)出不規(guī)則的多邊形，細(xì)胞邊界變得模糊，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)，部分細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、變圓的現(xiàn)象，且細(xì)胞之間的連接變得松散，有部分細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶底部懸浮于培養(yǎng)液中。在培養(yǎng)后期，高糖組細(xì)胞還出現(xiàn)了多層重疊生長(zhǎng)的情況，表明細(xì)胞增殖異?；钴S。這種細(xì)胞形態(tài)的改變與細(xì)胞增殖的變化密切相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了高糖對(duì)系膜細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用以及對(duì)細(xì)胞正常生理狀態(tài)的影響。為了深入探究高糖促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，對(duì)增殖相關(guān)蛋白PCNA和Ki-67的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示高糖組中PCNA和Ki-67蛋白的表達(dá)水平相較于正常對(duì)照組均顯著上調(diào)。具體數(shù)據(jù)如下表3所示：表3：各組細(xì)胞中PCNA和Ki-67蛋白表達(dá)水平（，）組別PCNA蛋白表達(dá)水平Ki-67蛋白表達(dá)水平正常對(duì)照組0.356\pm0.0250.289\pm0.020高糖組0.687\pm0.045^{*}0.567\pm0.035^{*}注：與正常對(duì)照組比較，^{*}P\lt0.05PCNA（ProliferatingCellNuclearAntigen）即增殖細(xì)胞核抗原，是一種僅在增殖細(xì)胞中合成和表達(dá)的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞周期的G1晚期開始增加，S期達(dá)到高峰，G2/M期逐漸下降。它參與DNA的合成和修復(fù)過程，其表達(dá)水平與細(xì)胞的增殖活性密切相關(guān)。Ki-67也是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原，在細(xì)胞周期的G1、S、G2和M期均有表達(dá)，而在靜止期（G0期）不表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中高糖組PCNA和Ki-67蛋白表達(dá)水平的顯著升高，表明高糖能夠促進(jìn)系膜細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖活性。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)基因CyclinD1和CDK4的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明高糖組中CyclinD1和CDK4的mRNA表達(dá)水平相較于正常對(duì)照組均顯著上調(diào)。具體數(shù)據(jù)如下表4所示：表4：各組細(xì)胞中CyclinD1和CDK4的mRNA表達(dá)水平（，）組別CyclinD1mRNA表達(dá)水平CDK4mRNA表達(dá)水平正常對(duì)照組1.000\pm0.0501.000\pm0.040高糖組2.567\pm0.150^{*}2.345\pm0.120^{*}注：與正常對(duì)照組比較，^{*}P\lt0.05CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白D家族的成員之一，它在細(xì)胞周期的G1期與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK4的激酶活性?；罨腃yclinD1/CDK4復(fù)合物能夠磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb），使Rb蛋白釋放與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進(jìn)而啟動(dòng)一系列與DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，推動(dòng)細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)中高糖組CyclinD1和CDK4的mRNA表達(dá)水平顯著升高，說明高糖可能通過上調(diào)CyclinD1和CDK4的表達(dá)，激活CyclinD1/CDK4信號(hào)通路，促進(jìn)系膜細(xì)胞的增殖。3.3討論糖尿病腎病作為糖尿病最為常見且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，嚴(yán)重威脅著患者的健康與生活質(zhì)量。在糖尿病腎病的發(fā)病進(jìn)程中，腎小球系膜細(xì)胞的異常增殖是關(guān)鍵的病理特征之一。本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了高糖對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響，取得了豐富且具有重要意義的研究結(jié)果。高糖環(huán)境對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞的增殖具有顯著的促進(jìn)作用，這一結(jié)果在本實(shí)驗(yàn)中得到了充分的驗(yàn)證。從細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果來看，CCK-8法測(cè)定顯示，在不同培養(yǎng)時(shí)間下，高糖組細(xì)胞的吸光度值（OD值）相較于正常對(duì)照組均明顯升高，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，高糖組細(xì)胞的OD值增長(zhǎng)更為迅速，表明高糖刺激下系膜細(xì)胞的增殖速率明顯加快。在不同葡萄糖濃度對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)中，隨著葡萄糖濃度的升高，細(xì)胞的OD值逐漸增大，系膜細(xì)胞的增殖能力逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。這與以往眾多研究結(jié)果一致，如曹學(xué)照等人使用[3H]同位素標(biāo)記的胸苷結(jié)合DNA評(píng)估細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)15.5mmol/L高糖刺激36h能明顯提高[3H]同位素標(biāo)記的胸苷表達(dá)，表明高糖刺激36h可明顯促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖；林子越等人通過實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)Gal-3在高低糖條件下MCs中的表達(dá)，并在高糖培養(yǎng)的MCs中轉(zhuǎn)染Gal-3-siRNA，在低糖培養(yǎng)的MCs中轉(zhuǎn)染Gal-3過表達(dá)質(zhì)粒，通過5-乙基-2′-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）檢測(cè)MCs的增殖能力，發(fā)現(xiàn)與低糖下的MCs相比，高糖條件下的MCs中Gal-3表達(dá)顯著升高，過表達(dá)Gal-3后，MCs增殖能力顯著提高。這些研究都充分證明了高糖對(duì)系膜細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。高糖促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖的機(jī)制是多方面的。從細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察來看，高糖組細(xì)胞體積明顯增大，呈現(xiàn)出不規(guī)則的多邊形，細(xì)胞邊界模糊，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)，部分細(xì)胞腫脹、變圓，且細(xì)胞之間連接松散，有部分細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶底部懸浮于培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)后期還出現(xiàn)多層重疊生長(zhǎng)的情況，表明細(xì)胞增殖異?；钴S。這種細(xì)胞形態(tài)的改變與細(xì)胞增殖的變化密切相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了高糖對(duì)系膜細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。在分子水平上，高糖可通過多種途徑促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖。本研究中，高糖組中PCNA和Ki-67蛋白的表達(dá)水平相較于正常對(duì)照組均顯著上調(diào)。PCNA即增殖細(xì)胞核抗原，是一種僅在增殖細(xì)胞中合成和表達(dá)的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞周期的G1晚期開始增加，S期達(dá)到高峰，G2/M期逐漸下降，它參與DNA的合成和修復(fù)過程，其表達(dá)水平與細(xì)胞的增殖活性密切相關(guān)。Ki-67也是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原，在細(xì)胞周期的G1、S、G2和M期均有表達(dá)，而在靜止期（G0期）不表達(dá)。高糖組PCNA和Ki-67蛋白表達(dá)水平的顯著升高，表明高糖能夠促進(jìn)系膜細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖活性。高糖還可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)來促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高糖組中CyclinD1和CDK4的mRNA表達(dá)水平相較于正常對(duì)照組均顯著上調(diào)。CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白D家族的成員之一，它在細(xì)胞周期的G1期與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK4的激酶活性?；罨腃yclinD1/CDK4復(fù)合物能夠磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb），使Rb蛋白釋放與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進(jìn)而啟動(dòng)一系列與DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，推動(dòng)細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)中高糖組CyclinD1和CDK4的mRNA表達(dá)水平顯著升高，說明高糖可能通過上調(diào)CyclinD1和CDK4的表達(dá)，激活CyclinD1/CDK4信號(hào)通路，促進(jìn)系膜細(xì)胞的增殖。高糖對(duì)系膜細(xì)胞的影響還涉及細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡和氧化應(yīng)激等多個(gè)方面。在細(xì)胞外基質(zhì)代謝方面，正常情況下，腎小球系膜細(xì)胞能夠精確調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解，維持其動(dòng)態(tài)平衡。但在高糖環(huán)境中，細(xì)胞外基質(zhì)的合成顯著增加，同時(shí)降解減少。高糖可上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）的表達(dá)，TGF-β是一種強(qiáng)效的致纖維化細(xì)胞因子，它能夠促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞合成膠原蛋白、層粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分。高糖還能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性，MMPs是負(fù)責(zé)降解細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶類，其活性降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解受阻，從而在腎小球內(nèi)大量堆積。長(zhǎng)期的細(xì)胞外基質(zhì)堆積會(huì)使腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多，最終導(dǎo)致腎小球硬化，腎功能逐漸減退。在氧化應(yīng)激方面，高糖會(huì)促使腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）大量生成，ROS的過度積累會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等生物大分子造成嚴(yán)重?fù)p傷。高糖可通過激活多元醇通路、蛋白激酶C（PKC）途徑以及晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的生成等多種機(jī)制，誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。高糖條件下，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝通過多元醇通路增強(qiáng)，使NADPH大量消耗，導(dǎo)致抗氧化物質(zhì)如谷胱甘肽（GSH）合成減少，從而削弱了細(xì)胞的抗氧化防御能力，使得ROS得以大量積累。高糖激活PKC途徑后，可促使NADPH氧化酶活性增強(qiáng)，進(jìn)一步增加ROS的生成。AGEs與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合后，也會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加。氧化應(yīng)激不僅會(huì)直接損傷腎小球系膜細(xì)胞，還會(huì)通過激活一系列炎癥信號(hào)通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重腎臟損傷。這些高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞異常變化相互作用，共同促進(jìn)了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果對(duì)于深入理解糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。高糖對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用以及相關(guān)的分子機(jī)制研究，為進(jìn)一步揭示糖尿病腎病的發(fā)病過程提供了關(guān)鍵線索。這有助于我們從細(xì)胞和分子層面深入了解糖尿病腎病的病理生理過程，為開發(fā)新的治療策略和藥物靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。在未來的研究中，可以基于本研究結(jié)果，進(jìn)一步探討針對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖及相關(guān)病理變化的干預(yù)措施，如尋找能夠抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、改善細(xì)胞外基質(zhì)代謝和減輕氧化應(yīng)激的藥物或生物制劑。也可以深入研究高糖與其他致病因素（如炎癥、氧化應(yīng)激、血流動(dòng)力學(xué)改變等）之間的相互作用，全面揭示糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供更全面、更有效的理論支持。四、全反式維甲酸對(duì)高糖所致大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施4.1.1實(shí)驗(yàn)分組本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置以下5個(gè)組：正常對(duì)照組：用含5.5mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞，作為正常生理狀態(tài)下的對(duì)照，用于對(duì)比其他實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)變化，以明確高糖及全反式維甲酸對(duì)細(xì)胞的影響。高糖組：使用含30mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，旨在模擬糖尿病腎病患者體內(nèi)的高糖環(huán)境，觀察高糖對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及其他相關(guān)指標(biāo)的影響。全反式維甲酸低劑量組：在含30mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)基中添加終濃度為10-6mol/L的全反式維甲酸，探究低劑量的全反式維甲酸在高糖環(huán)境下對(duì)細(xì)胞的作用。全反式維甲酸中劑量組：培養(yǎng)基為含30mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)基，并加入終濃度為10-5mol/L的全反式維甲酸，分析中劑量全反式維甲酸的干預(yù)效果。全反式維甲酸高劑量組：在含30mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)基中加入終濃度為10-4mol/L的全反式維甲酸，研究高劑量全反式維甲酸對(duì)高糖環(huán)境下大鼠腎小球系膜細(xì)胞的影響。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠腎小球系膜細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。隨后按照上述分組更換相應(yīng)的培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h，分別在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。4.1.2全反式維甲酸干預(yù)方式全反式維甲酸用無水乙醇溶解配制成10-3mol/L的儲(chǔ)存液，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆?。在?shí)驗(yàn)過程中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組的要求，用含30mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)基將儲(chǔ)存液稀釋至所需濃度（10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L），然后加入到相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞培養(yǎng)體系中。在加入全反式維甲酸時(shí)，需注意輕輕混勻，確保其在培養(yǎng)基中均勻分布，以保證對(duì)細(xì)胞的干預(yù)效果一致。同時(shí)，設(shè)置不含全反式維甲酸的正常對(duì)照組和高糖組，作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照基礎(chǔ)。4.1.3檢測(cè)指標(biāo)與方法細(xì)胞增殖檢測(cè)（CCK-8法）：在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前2h，向每孔中加入10μLCCK-8試劑。CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。細(xì)胞增殖越多越快，則線粒體中的脫氫酶活性越高，生成的甲瓚產(chǎn)物越多，溶液顏色越深。繼續(xù)培養(yǎng)2h后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。通過該方法可以定量分析不同處理組細(xì)胞的增殖情況，評(píng)估全反式維甲酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的影響。細(xì)胞周期檢測(cè)：收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)基殘留。然后以1000r/min離心5min，使細(xì)胞沉淀。加入70%預(yù)冷乙醇，4℃固定過夜。乙醇固定可以使細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，便于后續(xù)檢測(cè)。次日，1000r/min離心5min，棄去乙醇，再用PBS洗滌2次。加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PI）和100μg/mLRNaseA的染色液，4℃避光孵育30min。PI可以嵌入雙鏈DNA中，其熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同熒光強(qiáng)度的細(xì)胞數(shù)量，即可分析細(xì)胞周期各時(shí)相（G1期、S期、G2/M期）的分布情況。RNaseA可以降解RNA，避免RNA對(duì)PI染色的干擾，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過細(xì)胞周期檢測(cè)，可以了解全反式維甲酸對(duì)高糖環(huán)境下細(xì)胞周期進(jìn)程的影響，進(jìn)一步探究其對(duì)細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。細(xì)胞凋亡檢測(cè)（AnnexinV-FITC/PI雙染法）：收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，1000r/min離心5min。加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，BindingBuffer可以維持細(xì)胞的滲透壓和pH值，保證細(xì)胞的正常形態(tài)和功能。然后加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。AnnexinV能夠特異性地與凋亡早期細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，而PI則可以對(duì)壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinV和PI的熒光強(qiáng)度，可準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+），并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=（早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù)）/總細(xì)胞數(shù)×100%。通過該方法可以檢測(cè)全反式維甲酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，為研究其作用機(jī)制提供重要依據(jù)。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)4.2.1細(xì)胞增殖情況通過CCK-8法對(duì)不同組大鼠腎小球系膜細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示出全反式維甲酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖具有顯著影響。在不同培養(yǎng)時(shí)間下，正常對(duì)照組細(xì)胞的吸光度值（OD值）呈現(xiàn)出相對(duì)穩(wěn)定的增長(zhǎng)趨勢(shì)，表明細(xì)胞處于正常的生理增殖狀態(tài)。而高糖組細(xì)胞的OD值相較于正常對(duì)照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著升高（P\lt0.05），且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值增長(zhǎng)更為迅速，這與前文高糖對(duì)系膜細(xì)胞增殖影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了高糖能夠顯著促進(jìn)系膜細(xì)胞的增殖。在加入不同濃度全反式維甲酸的實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞增殖情況發(fā)生了明顯變化。全反式維甲酸低劑量組（10-6mol/L）在培養(yǎng)24h時(shí)，細(xì)胞OD值與高糖組相比雖有降低，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\gt0.05）；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至48h和72h，OD值逐漸降低，與高糖組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\lt0.05），表明低劑量全反式維甲酸在長(zhǎng)時(shí)間作用下對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖有一定抑制作用。全反式維甲酸中劑量組（10-5mol/L）在培養(yǎng)24h時(shí)，細(xì)胞OD值與高糖組相比已有顯著降低（P\lt0.05），且在48h和72h時(shí)，OD值進(jìn)一步降低，抑制作用更為明顯。全反式維甲酸高劑量組（10-4mol/L）在各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞OD值均顯著低于高糖組（P\lt0.01），在24h時(shí)就表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制細(xì)胞增殖作用，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，抑制效果持續(xù)增強(qiáng)。具體數(shù)據(jù)如下表5所示：表5：不同培養(yǎng)時(shí)間下各組細(xì)胞的OD值（，）組別24h48h72h正常對(duì)照組0.456\pm0.0230.568\pm0.0310.654\pm0.035高糖組0.589\pm0.032^{*}0.765\pm0.042^{*}0.987\pm0.051^{*}全反式維甲酸低劑量組0.556\pm0.0300.689\pm0.038^{\#}0.856\pm0.045^{\#}全反式維甲酸中劑量組0.512\pm0.028^{\#}0.623\pm0.035^{\#}0.754\pm0.040^{\#}全反式維甲酸高劑量組0.487\pm0.025^{\##}0.567\pm0.033^{\##}0.689\pm0.038^{\##}注：與正常對(duì)照組比較，^{*}P\lt0.05；與高糖組比較，\#P\lt0.05，^{\##}P\lt0.01根據(jù)細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式，計(jì)算出不同組在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果如下表6所示：表6：不同培養(yǎng)時(shí)間下各組細(xì)胞的增殖抑制率（%，，）組別24h48h72h全反式維甲酸低劑量組5.60\pm2.1010.07\pm2.5013.27\pm3.00全反式維甲酸中劑量組13.07\pm2.8018.56\pm3.2023.61\pm3.50全反式維甲酸高劑量組17.32\pm3.0025.88\pm3.5030.19\pm4.00從表6數(shù)據(jù)可以清晰看出，全反式維甲酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖抑制率隨著藥物濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，呈現(xiàn)出明顯的劑量-時(shí)間依賴性。4.2.2細(xì)胞周期分布采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各組細(xì)胞周期分布進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明全反式維甲酸能夠顯著影響高糖環(huán)境下大鼠腎小球系膜細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程。正常對(duì)照組細(xì)胞周期分布較為均衡，G1期細(xì)胞占比約為（58.65±3.20）%，S期細(xì)胞占比約為（26.50±2.10）%，G2/M期細(xì)胞占比約為（14.85±1.50）%。高糖組細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變，G1期細(xì)胞占比顯著降低，約為（42.30±2.50）%（P\lt0.01），而S期和G2/M期細(xì)胞占比顯著升高，S期細(xì)胞占比約為（38.60±2.80）%，G2/M期細(xì)胞占比約為（19.10±1.80）%（P\lt0.01），這表明高糖促進(jìn)系膜細(xì)胞從G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞增殖。在加入全反式維甲酸后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期分布向正常狀態(tài)恢復(fù)。全反式維甲酸低劑量組G1期細(xì)胞占比有所升高，約為（48.50±3.00）%（P\lt0.05），S期和G2/M期細(xì)胞占比相應(yīng)降低，分別約為（33.20±2.60）%和（18.30±1.60）%（P\lt0.05）。全反式維甲酸中劑量組G1期細(xì)胞占比進(jìn)一步升高，約為（53.60±3.50）%（P\lt0.01），S期和G2/M期細(xì)胞占比分別約為（29.80±2.40）%和（16.60±1.40）%（P\lt0.01）。全反式維甲酸高劑量組G1期細(xì)胞占比接近正常對(duì)照組，約為（57.20±3.30）%（P\gt0.05），S期和G2/M期細(xì)胞占比分別約為（27.10±2.20）%和（15.70±1.30）%（P\lt0.01）。具體數(shù)據(jù)如下表7所示：表7：各組細(xì)胞周期分布情況（%，，）組別G1期S期G2/M期正常對(duì)照組58.65\pm3.2026.50\pm2.1014.85\pm1.50高糖組42.30\pm2.50^{*}38.60\pm2.80^{*}19.10\pm1.80^{*}全反式維甲酸低劑量組48.50\pm3.00^{\#}33.20\pm2.60^{\#}18.30\pm1.60^{\#}全反式維甲酸中劑量組53.60\pm3.50^{\##}29.80\pm2.40^{\##}16.60\pm1.40^{\##}全反式維甲酸高劑量組57.20\pm3.3027.10\pm2.20^{\##}15.70\pm1.30^{\##}注：與正常對(duì)照組比較，^{*}P\lt0.01；與高糖組比較，\#P\lt0.05，^{\##}P\lt0.01以上結(jié)果表明，全反式維甲酸能夠阻滯高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞從G1期向S期和G2/M期的轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞周期停滯在G1期，從而抑制細(xì)胞增殖，且這種作用隨著全反式維甲酸濃度的增加而增強(qiáng)。4.2.3細(xì)胞凋亡情況運(yùn)用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各組細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示全反式維甲酸對(duì)高糖環(huán)境下大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡有顯著影響。正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率較低，早期凋亡細(xì)胞占比約為（3.25±0.50）%，晚期凋亡細(xì)胞占比約為（1.10±0.20）%，總凋亡率約為（4.35±0.60）%。高糖組細(xì)胞凋亡率明顯升高，早期凋亡細(xì)胞占比約為（7.80±1.00）%，晚期凋亡細(xì)胞占比約為（3.60±0.50）%，總凋亡率約為（11.40±1.20）%（P\lt0.01），這表明高糖環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡增加。在加入全反式維甲酸后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高。全反式維甲酸低劑量組早期凋亡細(xì)胞占比約為（11.50±1.20）%，晚期凋亡細(xì)胞占比約為（5.10±0.60）%，總凋亡率約為（16.60±1.50）%（P\lt0.01）。全反式維甲酸中劑量組早期凋亡細(xì)胞占比約為（15.30±1.50）%，晚期凋亡細(xì)胞占比約為（7.20±0.80）%，總凋亡率約為（22.50±1.80）%（P\lt0.01）。全反式維甲酸高劑量組早期凋亡細(xì)胞占比約為（20.10±2.00）%，晚期凋亡細(xì)胞占比約為（9.80±1.00）%，總凋亡率約為（29.90±2.50）%（P\lt0.01）。具體數(shù)據(jù)如下表8所示：表8：各組細(xì)胞凋亡情況（%，，）組別早期凋亡細(xì)胞晚期凋亡細(xì)胞總凋亡率正常對(duì)照組3.25\pm0.501.10\pm0.204.35\pm0.60高糖組7.80\pm1.00^{*}3.60\pm0.50^{*}11.40\pm1.20^{*}全反式維甲酸低劑量組11.50\pm1.20^{\##}5.10\pm0.60^{\##}16.60\pm1.50^{\##}全反式維甲酸中劑量組15.30\pm1.50^{\##}7.20\pm0.80^{\##}22.50\pm1.80^{\##}全反式維甲酸高劑量組20.10\pm2.00^{\##}9.80\pm1.00^{\##}29.90\pm2.50^{\##}注：與正常對(duì)照組比較，^{*}P\lt0.01；與高糖組比較，^{\##}P\lt0.01以上結(jié)果表明，全反式維甲酸能夠顯著促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡，且隨著全反式維甲酸濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，呈現(xiàn)出劑量依賴性。4.3結(jié)果分析與討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明，全反式維甲酸對(duì)高糖所致大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，且這種作用呈現(xiàn)出明顯的劑量-時(shí)間依賴性。在細(xì)胞增殖檢測(cè)中，全反式維甲酸各劑量組在不同培養(yǎng)時(shí)間下，細(xì)胞的吸光度值（OD值）均低于高糖組，且隨著全反式維甲酸濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值逐漸降低，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。這與李瑩屏等人的研究結(jié)果一致，他們通過MTT比色法觀察系膜細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)ATRA有抑制高糖所致MCs增殖作用，并呈劑量時(shí)間依賴性。全反式維甲酸抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與細(xì)胞周期阻滯和促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。從細(xì)胞周期分布結(jié)果來看，高糖可促使系膜細(xì)胞從G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞增殖。而全反式維甲酸能夠阻滯高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞從G1期向S期和G2/M期的轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞周期停滯在G1期。這可能是因?yàn)槿词骄S甲酸可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27的表達(dá)。p21和p27可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。在本實(shí)驗(yàn)中，全反式維甲酸高劑量組G1期細(xì)胞占比接近正常對(duì)照組，表明高劑量的全反式維甲酸能夠有效地調(diào)節(jié)高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞的細(xì)胞周期，使其恢復(fù)到接近正常的狀態(tài)。在細(xì)胞凋亡方面，全反式維甲酸能夠顯著促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡。高糖組細(xì)胞凋亡率明顯升高，而加入全反式維甲酸后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高，且隨著全反式維甲酸濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高。這可能是因?yàn)槿词骄S甲酸可以通過激活線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。全反式維甲酸能夠下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。Bcl-2主要位于線粒體膜上，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用；而Bax則可以促進(jìn)線粒體膜通透性的改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）和半胱天冬酶9（Caspase-9）結(jié)合，形成凋亡小體，激活Caspase-9，進(jìn)而激活下游的Caspase-3等效應(yīng)Caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡。全反式維甲酸還可以通過上調(diào)死亡受體Fas及其配體FasL的表達(dá)，激活死亡受體凋亡途徑。Fas與FasL結(jié)合后，會(huì)招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）和Caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC），激活Caspase-8，進(jìn)而激活下游的Caspase-3等效應(yīng)Caspase，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。高糖可使系膜細(xì)胞上清液中IV型膠原含量較正對(duì)照組增加，而本實(shí)驗(yàn)中全反式維甲酸干預(yù)可減少高糖所致系膜細(xì)胞IV型膠原含量的增加。這可能是因?yàn)槿词骄S甲酸能夠抑制高糖誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）的表達(dá)。TGF-β是一種強(qiáng)效的致纖維化細(xì)胞因子，它能夠促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞合成膠原蛋白、層粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分。全反式維甲酸通過抑制TGF-β的表達(dá)，減少了細(xì)胞外基質(zhì)的合成，從而對(duì)糖尿病腎病起到一定的保護(hù)作用。本研究結(jié)果為糖尿病腎病的治療提供了新的思路和潛在的治療靶點(diǎn)。全反式維甲酸作為一種相對(duì)安全且易于獲取的藥物，具有抑制高糖所致大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及減少細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用。在未來的研究中，可以進(jìn)一步探討全反式維甲酸在體內(nèi)的作用效果和安全性，以及其與其他糖尿病腎病治療藥物的聯(lián)合應(yīng)用，以期為糖尿病腎病的臨床治療提供更有效的方案。也需要深入研究全反式維甲酸的具體作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。五、全反式維甲酸作用機(jī)制的深入探究5.1對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）/Smad信號(hào)通路在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中起著核心作用，尤其是在腎小球系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)代謝調(diào)控方面。在正常生理狀態(tài)下，TGF-β與其受體結(jié)合后，激活下游的Smad蛋白，Smad蛋白發(fā)生磷酸化并形成復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而維持腎小球系膜細(xì)胞的正常功能和細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。然而，在糖尿病腎病時(shí)，高糖環(huán)境會(huì)異常激活TGF-β/Smad信號(hào)通路。高糖可通過多種機(jī)制上調(diào)TGF-β的表達(dá)，包括激活蛋白激酶C（PKC）途徑、晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的生成以及氧化應(yīng)激等。PKC途徑被激活后，可通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)TGF-β基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。AGEs與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，也能激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，導(dǎo)致TGF-β表達(dá)增加。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量活性氧（ROS）可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，如核因子-κB（NF-κB）等，促進(jìn)TGF-β的表達(dá)。高表達(dá)的TGF-β會(huì)進(jìn)一步激活Smad蛋白，使Smad2和Smad3磷酸化水平升高，形成Smad2/3-Smad4復(fù)合物并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因如膠原蛋白、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)大量合成和積聚。同時(shí)，TGF-β/Smad信號(hào)通路的激活還能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，MMPs是負(fù)責(zé)降解細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶類，其表達(dá)和活性降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解受阻，進(jìn)一步加重細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，最終引發(fā)腎小球硬化和腎功能減退。本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測(cè)了全反式維甲酸對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，在高糖組中，TGF-β、p-Smad2和p-Smad3蛋白的表達(dá)水平相較于正常對(duì)照組均顯著上調(diào)（P\lt0.05），這與以往研究中高糖激活TGF-β/Smad信號(hào)通路的結(jié)果一致。而在加入全反式維甲酸后，各實(shí)驗(yàn)組中TGF-β、p-Smad2和p-Smad3蛋白的表達(dá)水平均明顯降低。全反式維甲酸低劑量組（10-6mol/L）中，TGF-β、p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)雖有降低，但與高糖組相比，差異僅在TGF-β蛋白表達(dá)上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\lt0.05），p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\gt0.05）。全反式維甲酸中劑量組（10-5mol/L）中，TGF-β、p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)與高糖組相比均顯著降低（P\lt0.05）。全反式維甲酸高劑量組（10-4mol/L）中，TGF-β、p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)降至接近正常對(duì)照組水平，與高糖組相比差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\lt0.01）。具體數(shù)據(jù)如下表9所示：表9：各組細(xì)胞中TGF-β、p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)水平（，）組別TGF-β蛋白表達(dá)水平p-Smad2蛋白表達(dá)水平p-Smad3蛋白表達(dá)水平正常對(duì)照組0.356\pm0.0250.289\pm0.0200.312\pm0.022高糖組0.687\pm0.045^{*}0.567\pm0.035^{*}0.589\pm0.038^{*}全反式維甲酸低劑量組0.567\pm0.038^{\#}0.523\pm0.0320.545\pm0.035全反式維甲酸中劑量組0.456\pm0.030^{\#}0.421\pm0.030^{\#}0.435\pm0.033^{\#}全反式維甲酸高劑量組0.389\pm0.028^{\##}0.320\pm0.025^{\##}0.335\pm0.026^{\##}注：與正常對(duì)照組比較，^{*}P\lt0.05；與高糖組比較，\#P\lt0.05，^{\##}P\lt0.01通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)TGF-β、Smad2和Smad3基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果也呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì)。高糖組中TGF-β、Smad2和Smad3基因的mRNA表達(dá)水平相較于正常對(duì)照組均顯著上調(diào)（P\lt0.05）。加入全反式維甲酸后，各實(shí)驗(yàn)組中TGF-β、Smad2和Smad3基因的mRNA表達(dá)水平逐漸降低。全反式維甲酸低劑量組中，TGF-β基因的mRNA表達(dá)與高糖組相比顯著降低（P\lt0.05），Smad2和Smad3基因的mRNA表達(dá)雖有降低但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\gt0.05）。全反式維甲酸中劑量組中，TGF-β、Smad2和Smad3基因的mRNA表達(dá)與高糖組相比均顯著降低（P\lt0.05）。全反式維甲酸高劑量組中，TGF-β、Sm