二甲雙胍與糖基化終產(chǎn)物對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮合酶的交互影響探究一、引言1.1研究背景糖尿病作為一種常見(jiàn)的慢性代謝性疾病，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2021年全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)5.37億，預(yù)計(jì)到2045年將增至7.83億。糖尿病血管病變是糖尿病最主要的慢性并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后，是導(dǎo)致糖尿病患者致殘、致死的主要原因。糖尿病血管病變主要包括大血管病變和微血管病變，大血管病變?nèi)绻谛牟?、腦血管疾病和外周血管疾病等，微血管病變?nèi)缣悄虿∧I病、糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病神經(jīng)病變等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約70%-80%的糖尿病患者死于心血管疾病，糖尿病患者發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)比非糖尿病患者高2-4倍。血管內(nèi)皮細(xì)胞在維持血管穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用，它不僅作為血液與組織之間的物理屏障，還參與調(diào)節(jié)血管張力、血栓形成、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖等過(guò)程。一氧化氮（NO）是一種重要的血管活性物質(zhì)，由一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸生成。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）是血管內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生NO的主要亞型，其活性和表達(dá)的改變與血管功能障礙密切相關(guān)。正常情況下，eNOS持續(xù)產(chǎn)生NO，NO擴(kuò)散至血管平滑肌細(xì)胞，激活鳥苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，導(dǎo)致血管平滑肌舒張，維持血管的正常張力。同時(shí)，NO還具有抑制血小板聚集、白細(xì)胞黏附和血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用，從而保護(hù)血管內(nèi)皮功能，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。在糖尿病狀態(tài)下，長(zhǎng)期的高血糖環(huán)境會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng)，生成糖基化終產(chǎn)物（AGEs）。AGEs在體內(nèi)逐漸積累，可與多種細(xì)胞表面的受體結(jié)合，包括晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）等，從而激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加、炎癥反應(yīng)激活和細(xì)胞功能障礙。研究表明，AGEs對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有直接的損傷作用，可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，AGEs還可影響內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS的活性和表達(dá)，導(dǎo)致NO生成減少，血管舒張功能受損，促進(jìn)糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展。二甲雙胍作為臨床上廣泛應(yīng)用的一線降糖藥物，具有良好的降糖效果和心血管保護(hù)作用。大量的臨床研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明，二甲雙胍不僅能夠降低血糖水平，還能改善胰島素抵抗、減輕體重、降低血脂等代謝指標(biāo)，從而降低糖尿病患者心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。其心血管保護(hù)作用的機(jī)制可能涉及多個(gè)方面，包括抑制肝臟糖異生、增加外周組織對(duì)葡萄糖的攝取和利用、調(diào)節(jié)腸道菌群、激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路等。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍還可通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能，增加NO的生成和釋放，改善血管內(nèi)皮依賴性舒張功能，發(fā)揮對(duì)血管的保護(hù)作用。然而，二甲雙胍是否能夠?qū)笰GEs對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性和表達(dá)的抑制作用，目前尚未完全明確。綜上所述，深入研究AGEs和二甲雙胍對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性和表達(dá)的影響，對(duì)于揭示糖尿病血管病變的發(fā)病機(jī)制，以及探索有效的防治策略具有重要的理論和實(shí)際意義。1.2研究目的與意義本研究旨在明確糖基化終產(chǎn)物（AGEs）對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶（NOS）活性和表達(dá)的具體影響，以及二甲雙胍是否能夠?qū)笰GEs的這種不良作用，進(jìn)而深入探討二甲雙胍發(fā)揮心血管保護(hù)作用的潛在機(jī)制。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分別與不同濃度的AGEs和二甲雙胍進(jìn)行孵育，運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如硝酸還原酶法測(cè)定一氧化氮（NO）含量以反映NOS活性，蛋白免疫印跡法檢測(cè)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白表達(dá)水平等，從細(xì)胞和分子層面揭示三者之間的相互關(guān)系。本研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。從理論層面來(lái)看，有助于進(jìn)一步闡明糖尿病血管病變的發(fā)病機(jī)制。目前，雖然AGEs在糖尿病血管病變中的作用已得到一定程度的認(rèn)識(shí)，但AGEs影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性和表達(dá)的具體分子機(jī)制尚未完全明確。深入研究這一過(guò)程，能夠?yàn)槔斫馓悄虿⊙懿∽兊牟±砩磉^(guò)程提供更深入的視角，豐富糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制理論。同時(shí)，對(duì)于二甲雙胍作用機(jī)制的研究也具有重要意義，有助于進(jìn)一步揭示其心血管保護(hù)作用的多效性，為其在糖尿病治療中的廣泛應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。從實(shí)際應(yīng)用價(jià)值方面考慮，本研究結(jié)果可能為糖尿病血管病變的防治提供新的策略和靶點(diǎn)。如果能夠證實(shí)二甲雙胍可以有效對(duì)抗AGEs對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的抑制作用，那么在臨床實(shí)踐中，可以為糖尿病患者的治療提供更優(yōu)化的方案，在控制血糖的同時(shí)，更有效地預(yù)防和治療血管并發(fā)癥，從而降低糖尿病患者心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，改善患者的生活質(zhì)量和預(yù)后，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。此外，研究結(jié)果還可能為開發(fā)新型的抗糖尿病血管病變藥物提供思路和啟示，推動(dòng)相關(guān)藥物研發(fā)領(lǐng)域的發(fā)展。二、理論基礎(chǔ)2.1二甲雙胍概述二甲雙胍作為雙胍類降糖藥物中的經(jīng)典代表，自1957年在法國(guó)上市以來(lái)，在糖尿病治療領(lǐng)域已擁有長(zhǎng)達(dá)60多年的應(yīng)用歷史，憑借其卓越的降糖效果和良好的安全性，成為全球范圍內(nèi)治療2型糖尿病的一線首選藥物。從藥理特性來(lái)看，二甲雙胍主要通過(guò)多靶點(diǎn)作用機(jī)制發(fā)揮降糖效應(yīng)。它能夠抑制肝臟糖異生過(guò)程，減少肝臟葡萄糖的輸出。具體而言，二甲雙胍可抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）等糖異生關(guān)鍵酶的活性，降低肝臟將非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。在正常生理狀態(tài)下，肝臟通過(guò)糖異生維持血糖的穩(wěn)定，但在糖尿病患者中，肝臟糖異生過(guò)程往往過(guò)度活躍，導(dǎo)致血糖升高。二甲雙胍通過(guò)抑制這一過(guò)程，有效減少了血糖的來(lái)源，從而降低血糖水平。同時(shí)，二甲雙胍還能改善外周組織對(duì)胰島素的敏感性，增強(qiáng)肌肉、脂肪等組織對(duì)葡萄糖的攝取和利用。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)通路受阻，細(xì)胞對(duì)胰島素的反應(yīng)減弱，導(dǎo)致葡萄糖攝取減少。二甲雙胍可以激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路，調(diào)節(jié)下游一系列與代謝相關(guān)的蛋白表達(dá)和活性，增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位，促進(jìn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被利用，從而改善胰島素抵抗，提高機(jī)體對(duì)葡萄糖的代謝能力。二甲雙胍還具有抑制腸道對(duì)葡萄糖吸收的作用。它可能通過(guò)影響腸道內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的一些激素，如胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）等，間接調(diào)節(jié)腸道對(duì)葡萄糖的吸收，減緩碳水化合物在腸道的消化和吸收速度，避免餐后血糖的快速升高。在臨床應(yīng)用方面，二甲雙胍具有廣泛的適用性。對(duì)于新診斷的2型糖尿病患者，若無(wú)使用禁忌證，二甲雙胍通常作為初始治療的首選藥物。無(wú)論是肥胖還是非肥胖的2型糖尿病患者，二甲雙胍均能有效降低血糖水平，且不增加體重，甚至對(duì)超重或肥胖的患者還具有一定的減重作用。這一特性使得二甲雙胍在肥胖型2型糖尿病患者的治療中尤為突出，不僅能控制血糖，還能改善患者的代謝綜合征相關(guān)指標(biāo)，如降低血脂、血壓等，減少心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在糖尿病的長(zhǎng)期治療過(guò)程中，二甲雙胍也占據(jù)著重要地位。當(dāng)二甲雙胍單藥治療血糖控制不佳時(shí)，可聯(lián)合其他各類降糖藥物，如磺脲類、格列奈類、噻唑烷二酮類、α-糖苷酶抑制劑、二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制劑、鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（SGLT2）抑制劑以及胰島素等，協(xié)同發(fā)揮降糖作用，進(jìn)一步提高血糖控制達(dá)標(biāo)率。而且，二甲雙胍與其他降糖藥物聯(lián)合使用時(shí)，安全性良好，較少發(fā)生低血糖等不良反應(yīng)，為糖尿病患者的長(zhǎng)期血糖管理提供了有力保障。值得一提的是，二甲雙胍不僅在降糖方面表現(xiàn)出色，還具有顯著的心血管保護(hù)作用。大量的臨床研究和薈萃分析表明，使用二甲雙胍治療的糖尿病患者，其心血管事件的發(fā)生率明顯低于未使用二甲雙胍的患者。這主要?dú)w因于二甲雙胍多方面的作用機(jī)制。除了改善糖代謝外，二甲雙胍還能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，降低血漿甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平，升高高密度脂蛋白膽固醇水平，減輕脂質(zhì)在血管壁的沉積，減少動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，二甲雙胍具有抗炎和抗氧化應(yīng)激作用，可抑制炎癥因子的釋放，減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物的生成，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷。在血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)方面，二甲雙胍發(fā)揮著關(guān)鍵作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞是維持血管正常功能的重要組成部分，其功能狀態(tài)直接影響著血管的舒張、收縮、凝血和抗凝血等生理過(guò)程。在糖尿病等病理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞易受到損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，進(jìn)而引發(fā)一系列心血管疾病。二甲雙胍可以通過(guò)多種途徑保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。一方面，二甲雙胍激活A(yù)MPK信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的磷酸化，增加eNOS的活性，從而使內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生更多的一氧化氮（NO）。NO作為一種重要的血管舒張因子，能夠擴(kuò)散至血管平滑肌細(xì)胞，激活鳥苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，導(dǎo)致血管平滑肌舒張，維持血管的正常張力。同時(shí)，NO還具有抑制血小板聚集、白細(xì)胞黏附和血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用，從而保護(hù)血管內(nèi)皮功能，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。另一方面，二甲雙胍通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，減少炎癥因子和氧化應(yīng)激產(chǎn)物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，維持內(nèi)皮細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。此外，二甲雙胍還可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群，間接影響血管內(nèi)皮功能，發(fā)揮心血管保護(hù)作用。2.2糖基化終產(chǎn)物糖基化終產(chǎn)物（AdvancedGlycationEndproducts，AGEs）是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子物質(zhì)在非酶促條件下，與葡萄糖或其他還原單糖發(fā)生一系列復(fù)雜反應(yīng)所生成的穩(wěn)定共價(jià)加成物。這一反應(yīng)過(guò)程起始于還原糖的羰基與蛋白質(zhì)等大分子的游離氨基發(fā)生親核加成反應(yīng)，形成不穩(wěn)定的席夫堿（Schiffbases）。席夫堿在數(shù)分鐘內(nèi)即可形成，且反應(yīng)可逆，其生成量與葡萄糖濃度密切相關(guān)。隨著時(shí)間推移，席夫堿發(fā)生分子內(nèi)重排，轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬?duì)穩(wěn)定的阿馬多里產(chǎn)物（Amadoriproducts），這一過(guò)程較為緩慢，但比逆反應(yīng)速度快，因此阿馬多里產(chǎn)物能夠在蛋白質(zhì)上逐漸積聚，并在數(shù)周內(nèi)達(dá)到平衡。阿馬多里產(chǎn)物進(jìn)一步經(jīng)過(guò)脫水、氧化、重排等一系列復(fù)雜反應(yīng)，生成具有高活性的二羰基化合物，如乙二醛、甲基乙二醛、3-脫氧葡萄糖醛酮等。這些活性二羰基化合物可與蛋白質(zhì)上的游離氨基再次發(fā)生反應(yīng)，最終生成穩(wěn)定且不可逆的AGEs。此外，抗壞血酸、甘油醛等物質(zhì)也參與AGEs的形成過(guò)程，如抗壞血酸氧化成L-阿蘇糖后，與賴氨酸殘基縮合、重排、氧化裂解可形成AGEs中的羧甲基賴氨酸（CML）。AGEs具有高度的化學(xué)穩(wěn)定性和不可逆性，一旦生成，很難被體內(nèi)的酶系統(tǒng)降解，從而在組織和器官中逐漸積累。它們的結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，不同的AGEs具有不同的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性。目前已發(fā)現(xiàn)40多種不同的AGEs，常見(jiàn)的包括CML、甲基乙二醛-賴氨酸二聚體（MOLD）、戊糖素等。AGEs可以以游離態(tài)或結(jié)合態(tài)的形式存在，游離態(tài)AGEs修飾在游離氨基酸殘基上，結(jié)合態(tài)AGEs則修飾在肽或蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上，結(jié)合態(tài)AGEs分子質(zhì)量大、結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，在體內(nèi)及熱加工食品中的含量通常高于游離態(tài)AGEs。在糖尿病患者體內(nèi)，由于長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)，蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)顯著增強(qiáng)，導(dǎo)致AGEs的生成量大幅增加。大量研究表明，AGEs在糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色。AGEs可與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）特異性結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路等。這些信號(hào)通路的激活會(huì)引發(fā)一系列病理生理變化，包括促進(jìn)炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的表達(dá)和釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加??；誘導(dǎo)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，引發(fā)氧化應(yīng)激，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞；抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力，影響血管內(nèi)皮的修復(fù)和再生。AGEs還可通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、纖連蛋白等成分交聯(lián)，改變細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，使其硬度增加、彈性降低。這種改變會(huì)影響血管的順應(yīng)性，導(dǎo)致血管壁僵硬，增加血流阻力，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。同時(shí)，AGEs交聯(lián)的細(xì)胞外基質(zhì)還會(huì)阻礙一氧化氮（NO）等血管活性物質(zhì)的擴(kuò)散，進(jìn)一步損害血管內(nèi)皮功能。此外，AGEs對(duì)血管平滑肌細(xì)胞也有影響，可促進(jìn)其增殖和遷移，導(dǎo)致血管壁增厚，管腔狹窄。在糖尿病腎病的微血管病變中，AGEs在腎小球系膜區(qū)和基底膜的沉積，可引起系膜細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)增多，導(dǎo)致腎小球硬化，最終影響腎功能。2.3人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與一氧化氮合酶人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）作為臍靜脈的重要結(jié)構(gòu)組成細(xì)胞，在機(jī)體正常生理過(guò)程中扮演著極為關(guān)鍵的角色。在胚胎發(fā)育早期，內(nèi)胚層中的內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞逐漸分化發(fā)育成人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，它們?cè)谘芟到y(tǒng)的構(gòu)建和功能維持中發(fā)揮著不可或缺的作用。從解剖學(xué)角度來(lái)看，人臍靜脈是連接胎兒和胎盤的重要結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)將氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從胎盤運(yùn)輸給胎兒。而人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞則緊密排列在臍靜脈血管的內(nèi)壁，形成一層連續(xù)的單細(xì)胞層，作為血液與血管壁之間的直接界面，不僅起到物理屏障的作用，分隔血液與周圍組織，防止血液成分滲出和血栓形成，還積極參與維持血管的完整性和正常生理功能。在血管生理方面，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有多種重要功能。它能合成和分泌一系列生物活性物質(zhì)，如一氧化氮（NO）、前列環(huán)素（PGI2）、內(nèi)皮素（ET）等，這些物質(zhì)在調(diào)節(jié)血管張力、維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中，NO作為一種重要的血管舒張因子，由內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生并釋放到血管平滑肌細(xì)胞，激活鳥苷酸環(huán)化酶，促使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，引起血管平滑肌舒張，從而降低血管阻力，維持正常的血壓和血液循環(huán)。PGI2也具有強(qiáng)大的血管舒張作用，同時(shí)還能抑制血小板聚集，防止血栓形成。而ET則是一種強(qiáng)效的血管收縮因子，與NO和PGI2相互制衡，共同調(diào)節(jié)血管的收縮和舒張狀態(tài)，維持血管張力的動(dòng)態(tài)平衡。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞還參與炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)過(guò)程。當(dāng)血管受到損傷或炎癥刺激時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)迅速做出反應(yīng)，表達(dá)和釋放多種炎癥因子和細(xì)胞黏附分子，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）等。這些分子能夠招募和激活白細(xì)胞，使其黏附并穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層進(jìn)入炎癥部位，參與免疫防御和組織修復(fù)。然而，過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，引發(fā)一系列心血管疾病。在血管生成過(guò)程中，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞同樣發(fā)揮著核心作用。在胚胎發(fā)育、傷口愈合以及腫瘤生長(zhǎng)等生理和病理過(guò)程中，都需要新的血管生成來(lái)提供充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。內(nèi)皮細(xì)胞能夠感知周圍環(huán)境中的信號(hào)變化，如缺氧、生長(zhǎng)因子等，通過(guò)增殖、遷移和分化，形成新的血管網(wǎng)絡(luò)。它們還能與其他細(xì)胞類型，如平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等相互作用，共同構(gòu)建穩(wěn)定的血管結(jié)構(gòu)。一氧化氮合酶（NOS）是催化L-精氨酸與氧氣反應(yīng)生成NO和L-瓜氨酸的關(guān)鍵酶，在調(diào)節(jié)血管張力和內(nèi)皮功能中具有舉足輕重的作用。目前已發(fā)現(xiàn)三種NOS同工酶，分別為神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS或NOS1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS或NOS2）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS或NOS3）。其中，eNOS主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是血管內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生NO的主要亞型。eNOS在維持血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在正常生理?xiàng)l件下，eNOS持續(xù)活化，以較低的基礎(chǔ)速率產(chǎn)生NO。NO從內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)散至鄰近的血管平滑肌細(xì)胞，激活鳥苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高。cGMP作為第二信使，通過(guò)激活蛋白激酶G（PKG），引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞舒張，血管擴(kuò)張，從而調(diào)節(jié)血管張力，維持正常的血壓和血液循環(huán)。同時(shí)，NO還具有抑制血小板聚集、白細(xì)胞黏附和血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用。它可以抑制血小板內(nèi)血栓素A2（TXA2）的合成，降低血小板的聚集性，防止血栓形成；減少白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥反應(yīng)的發(fā)生；抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，防止血管壁增厚和管腔狹窄，維持血管的正常結(jié)構(gòu)和功能。eNOS的活性受到多種因素的精細(xì)調(diào)控。一方面，它可以通過(guò)翻譯后修飾進(jìn)行調(diào)節(jié)，如磷酸化、棕櫚酰化、亞硝基化等。其中，磷酸化是調(diào)節(jié)eNOS活性的重要方式之一。在多種細(xì)胞信號(hào)通路的作用下，eNOS的特定絲氨酸和蘇氨酸殘基可以被磷酸化，從而改變其活性。例如，當(dāng)細(xì)胞受到血流切應(yīng)力、乙酰膽堿等刺激時(shí)，通過(guò)激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路，使eNOS的絲氨酸1177位點(diǎn)磷酸化，增強(qiáng)eNOS的活性，促進(jìn)NO的生成。另一方面，eNOS的活性還受到其與伴侶蛋白和調(diào)節(jié)因子相互作用的影響。例如，熱休克蛋白90（Hsp90）可以與eNOS結(jié)合，穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其活性；而內(nèi)皮型一氧化氮合酶抑制因子（ADMA）則可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制eNOS與L-精氨酸的結(jié)合，從而抑制NO的生成。此外，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)、鈣離子濃度等也會(huì)對(duì)eNOS的活性產(chǎn)生影響。在氧化應(yīng)激條件下，活性氧（ROS）的生成增加，會(huì)導(dǎo)致eNOS解偶聯(lián)，使其產(chǎn)生超氧陰離子（O2?-）而非NO，從而損傷血管內(nèi)皮功能。三、研究設(shè)計(jì)3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備人臍帶：選取健康足月剖宮產(chǎn)新生兒的臍帶，由醫(yī)院產(chǎn)科提供。在新生兒出生后，立即在無(wú)菌條件下采集臍帶，長(zhǎng)度約為15-20cm，采集后迅速置于含有保鮮液（0.01%EDTA/DMEM，4℃儲(chǔ)藏）的廣口試劑瓶中，4℃保存，并在最短時(shí)間內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理，以確保臍帶的活性和細(xì)胞的質(zhì)量。主要試劑：二甲雙胍：購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，純度≥98%。用無(wú)菌PBS配制成100mmol/L的母液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后，分裝于無(wú)菌EP管中，-20℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需濃度，用細(xì)胞培養(yǎng)液將母液稀釋至相應(yīng)濃度。糖基化終產(chǎn)物（AGEs）：采用牛血清白蛋白（BSA）與葡萄糖在體外孵育的方法制備AGEs-BSA復(fù)合物。具體步驟如下：將BSA（Sigma-Aldrich公司）溶解于0.2mol/L的PBS（pH7.4）中，使其終濃度為50g/L，加入葡萄糖使其終濃度為0.5mol/L，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，僅加入等體積的PBS而不加葡萄糖。將上述溶液置于37℃恒溫?fù)u床中孵育8周，期間每隔2-3天更換一次溶液以維持葡萄糖的濃度。孵育結(jié)束后，將溶液裝入透析袋（截留分子量為3500Da）中，在4℃下用PBS透析3天，每天更換3-4次PBS，以去除未反應(yīng)的葡萄糖和其他小分子雜質(zhì)。通過(guò)高效液相色譜（HPLC）和熒光光譜法鑒定制備的AGEs-BSA復(fù)合物，其在激發(fā)波長(zhǎng)370nm和發(fā)射波長(zhǎng)440nm處具有特征熒光峰。將制備好的AGEs-BSA復(fù)合物用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液：M199培養(yǎng)基（Gibco公司）中添加20%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、1%青-鏈霉素雙抗（Gibco公司）、2mML-谷氨酰胺（Gibco公司）、10mg/100ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑（ECGS，Sigma-Aldrich公司）、4000U/100ml肝素（Sigma-Aldrich公司）、5μg/100ml胰島素（Sigma-Aldrich公司）。其他試劑：I型膠原酶（Sigma-Aldrich公司）、D-Hanks溶液（Gibco公司）、胰蛋白酶（Gibco公司）、RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司）、BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）、PVDF膜（Millipore公司）、5%脫脂奶粉（BD公司）、一抗（兔抗人eNOS多克隆抗體，Abcam公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體，CST公司）、二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG，中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（ThermoFisherScientific公司）、一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，硝酸還原酶法）。儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）：用于細(xì)胞培養(yǎng)和試劑配制等無(wú)菌操作。離心機(jī)（Eppendorf公司）：型號(hào)5810R，用于細(xì)胞離心和蛋白樣品制備等過(guò)程中的離心操作。水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）：用于酶消化、試劑預(yù)熱等。CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）：型號(hào)3111，提供細(xì)胞培養(yǎng)所需的37℃、5%CO?的恒溫恒濕環(huán)境。-80℃冰箱（ThermoFisherScientific公司）：用于保存試劑、細(xì)胞凍存管等。倒置顯微鏡（Olympus公司）：型號(hào)CKX41，用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)等。酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司）：型號(hào)MultiskanGO，用于檢測(cè)NO含量時(shí)測(cè)定吸光度。垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司）：用于SDS-PAGE凝膠電泳和蛋白轉(zhuǎn)膜。化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）：型號(hào)ChemiDocMP，用于檢測(cè)蛋白免疫印跡的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。3.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的分離：將采集的新鮮臍帶迅速置于超凈工作臺(tái)中，用預(yù)冷的D-Hanks溶液反復(fù)沖洗，以去除臍帶表面的血跡和雜質(zhì)。沖洗干凈后，用眼科剪將臍帶兩端修剪整齊，然后將靜脈插管插入臍靜脈中，并用絲線牢固結(jié)扎，防止酶液泄漏。用20ml注射器吸取37℃預(yù)熱的0.1%I型膠原酶溶液，緩慢注入臍靜脈中，直至臍靜脈充盈，注意排凈靜脈管中的空氣。將充滿酶液的臍帶放入盛有37℃溫水的玻璃燒杯中，在37℃水浴條件下消化15-20分鐘，期間每隔5分鐘用注射器輕柔抽吸、注入酶液1次，使酶液與內(nèi)皮細(xì)胞充分接觸，促進(jìn)消化。當(dāng)在顯微鏡下觀察到酶液變得混濁，且有大量游離細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)，將酶液在臍靜脈中反復(fù)抽吸沖打3次，以確保更多的內(nèi)皮細(xì)胞脫落。隨后，將消化后的酶液吸出，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。細(xì)胞培養(yǎng)：將含有內(nèi)皮細(xì)胞的酶液在350g條件下離心5分鐘，離心結(jié)束后，小心棄去上清液，加入適量D-Hanks溶液輕輕重懸細(xì)胞，再次以350g離心5分鐘，如此重復(fù)清洗2次，以去除殘留的膠原酶和雜質(zhì)。清洗完畢后，棄去上清液，將細(xì)胞重懸于預(yù)先配制好的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液為M199培養(yǎng)基，添加了20%胎牛血清（FBS），為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子；1%青-鏈霉素雙抗，防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌污染；2mML-谷氨酰胺，參與細(xì)胞的代謝過(guò)程，維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)；10mg/100ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑（ECGS），能特異性地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；4000U/100ml肝素，抑制細(xì)胞的凝集，保持細(xì)胞的分散狀態(tài)；5μg/100ml胰島素，調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用。將重懸后的細(xì)胞接種于預(yù)先包被2%明膠的T25培養(yǎng)瓶中，以利于細(xì)胞貼壁。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細(xì)胞。之后每2-3天更換一次培養(yǎng)液，密切觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)，即細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部約80%-90%時(shí)，進(jìn)行消化傳代。傳代時(shí)，先用D-Hanks溶液輕輕沖洗細(xì)胞2次，去除殘留的培養(yǎng)液，然后加入適量0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓、開始脫離瓶壁時(shí)，立即加入含血清的培養(yǎng)液終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，按1:2或1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞鑒定：采用免疫熒光染色法對(duì)培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%匯合時(shí)，取出蓋玻片。用PBS緩沖液輕輕沖洗蓋玻片3次，每次5分鐘，以去除細(xì)胞表面的培養(yǎng)液。然后將蓋玻片浸入4%多聚甲醛溶液中，室溫固定15-20分鐘，使細(xì)胞的蛋白質(zhì)等成分交聯(lián)固定。固定結(jié)束后，再次用PBS緩沖液沖洗蓋玻片3次。接著，用0.1%TritonX-100溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，室溫孵育10-15分鐘，以增加細(xì)胞膜的通透性，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合。通透處理后，用PBS緩沖液沖洗3次。隨后，用5%牛血清白蛋白（BSA）溶液封閉細(xì)胞，室溫孵育1-2小時(shí)，以減少非特異性抗體結(jié)合。封閉結(jié)束后，吸去封閉液，加入稀釋好的兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原多克隆抗體（1:100稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，取出蓋玻片，用PBS緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。然后加入熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:200稀釋），室溫避光孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗3次。最后，用DAPI染液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，室溫避光孵育5-10分鐘。染色結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗3次，將蓋玻片置于載玻片上，滴加適量抗熒光淬滅封片劑，封片后在熒光顯微鏡下觀察。若細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)特異性綠色熒光，表明細(xì)胞表達(dá)Ⅷ因子相關(guān)抗原，為內(nèi)皮細(xì)胞。同時(shí)，通過(guò)觀察細(xì)胞核的形態(tài)和數(shù)量，可判斷細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和純度。3.3實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置對(duì)照組：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板和6孔板中，每孔加入100μl和2ml內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間點(diǎn)，僅加入等體積的PBS，作為空白對(duì)照，用于評(píng)估細(xì)胞的基礎(chǔ)狀態(tài)和正常生長(zhǎng)情況下一氧化氮合酶（NOS）活性及表達(dá)水平。不同濃度糖基化終產(chǎn)物（AGEs）組：將AGEs-BSA復(fù)合物用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成不同濃度梯度，分別為50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml和800μg/ml。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板和6孔板后，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，吸去原培養(yǎng)液，分別加入含有上述不同濃度AGEs的培養(yǎng)液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，以探究不同濃度AGEs對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NOS活性和表達(dá)的影響。不同濃度二甲雙胍組：將二甲雙胍母液用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋為不同濃度，分別為0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L和8mmol/L。同樣將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板和6孔板，待細(xì)胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)液，加入含有不同濃度二甲雙胍的培養(yǎng)液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，以研究不同濃度二甲雙胍對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用。二者共同干預(yù)組：先將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板和6孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好后，分別加入含不同濃度AGEs（50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml和800μg/ml）的培養(yǎng)液，同時(shí)加入固定濃度（選擇前期實(shí)驗(yàn)中效果較好的二甲雙胍濃度，如2mmol/L）的二甲雙胍，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，觀察二甲雙胍在不同濃度AGEs環(huán)境下對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NOS活性和表達(dá)的影響，以明確二甲雙胍是否能夠?qū)笰GEs的不良作用。3.4指標(biāo)檢測(cè)方法細(xì)胞增殖活性檢測(cè)：采用CCK-8法檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性。CCK-8試劑（CellCountingKit-8）中含有水溶性的四唑鹽WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽），在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓（1-MethoxyPMS）的作用下，WST-8能被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。由于活細(xì)胞數(shù)量越多，線粒體中的脫氫酶活性越高，生成的甲瓚物數(shù)量就越多，所以可通過(guò)測(cè)定甲瓚物的吸光度（OD值）間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，從而評(píng)估細(xì)胞的增殖活性。具體操作步驟如下：在96孔板中接種細(xì)胞懸液，每孔約100μL，細(xì)胞數(shù)量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整，一般貼壁細(xì)胞為3000-7000個(gè)/孔，懸浮細(xì)胞可適當(dāng)增加。將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。按照實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置，向培養(yǎng)板中加入不同濃度的AGEs、二甲雙胍或二者共同作用的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10μLCCK-8溶液，注意避免產(chǎn)生氣泡。將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率=[(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-空白孔OD值)]×100%。一氧化氮（NO）含量檢測(cè)：運(yùn)用硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的NO含量，以此間接反映一氧化氮合酶（NOS）的活性。NO在生物體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成NO??和NO??，該方法利用硝酸還原酶特異性將NO??還原為NO??，通過(guò)顯色深淺測(cè)定其濃度的高低，從而間接得到NO含量。具體步驟如下：將細(xì)胞培養(yǎng)上清液收集至離心管中，3500-4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清備用。按照NO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書配制試劑，包括將試劑一和試劑二按1:1混合配制成混合試劑，現(xiàn)用現(xiàn)配；將粉劑的試劑五用90℃-100℃熱雙蒸水充分溶解，避光保存；將粉劑的試劑六用雙蒸水溶解，避光冷藏保存。在96孔板中依次加入空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管所需的試劑，其中空白管加入相應(yīng)體積的蒸餾水，標(biāo)準(zhǔn)管加入不同濃度的NO標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定管加入處理后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。充分旋渦混勻30秒，室溫靜置40分鐘。然后在3500-4000轉(zhuǎn)/分條件下離心10分鐘，取上清進(jìn)行顯色。向各孔中加入顯色劑（試劑五、試劑六和試劑七按2.5:1:1配制），充分混勻，室溫避光反應(yīng)10-15分鐘。使用酶標(biāo)儀在540-570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的NO含量。一氧化氮合酶（NOS）活性檢測(cè)：采用分光光度法測(cè)定細(xì)胞裂解液中的NOS活性。NOS催化L-精氨酸與氧氣反應(yīng)生成NO和L-瓜氨酸，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中生成的NO或L-瓜氨酸的量，可間接反映NOS的活性。本實(shí)驗(yàn)利用NOS催化底物L(fēng)-精氨酸生成NO，NO與顯色劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定其吸光度來(lái)計(jì)算NOS活性。具體操作如下：將培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞用預(yù)冷的PBS沖洗2-3次后，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞充分裂解。然后將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000轉(zhuǎn)/分，4℃離心15分鐘，取上清即為細(xì)胞裂解液。按照NOS活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，在96孔板中依次加入空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管所需的試劑，空白管加入相應(yīng)體積的蒸餾水，標(biāo)準(zhǔn)管加入不同濃度的NO標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定管加入細(xì)胞裂解液。向各管中加入含有L-精氨酸、NADPH等底物和輔酶的反應(yīng)液，混勻后37℃孵育30-60分鐘。孵育結(jié)束后，加入顯色劑，充分混勻，室溫避光反應(yīng)10-15分鐘。使用酶標(biāo)儀在540-570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出細(xì)胞裂解液中的NOS活性，以單位時(shí)間內(nèi)單位蛋白生成NO的量表示（nmol/min/mgprotein）。蛋白免疫印跡法（WesternBlot）檢測(cè)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白表達(dá)：首先制備細(xì)胞總蛋白，將培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞用預(yù)冷的PBS沖洗2-3次后，加入適量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞充分裂解。然后將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000轉(zhuǎn)/分，4℃離心15分鐘，取上清即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書操作，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入96孔板中，再加入BCA工作液，37℃孵育30分鐘。使用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。根據(jù)蛋白濃度上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕法轉(zhuǎn)膜，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，200mA恒流轉(zhuǎn)膜1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性抗體結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入稀釋好的兔抗人eNOS多克隆抗體（1:1000-1:5000稀釋）中，4℃孵育過(guò)夜。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。然后將膜放入稀釋好的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000-1:10000稀釋）中，室溫孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。最后，將PVDF膜放入ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒的工作液中孵育1-2分鐘，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)eNOS蛋白條帶。以鼠抗人β-actin單克隆抗體（1:5000-1:10000稀釋）作為內(nèi)參，采用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)ImageJ軟件分析eNOS蛋白條帶的灰度值，與內(nèi)參β-actin蛋白條帶的灰度值進(jìn)行比較，計(jì)算eNOS蛋白的相對(duì)表達(dá)量。四、研究結(jié)果4.1對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的影響采用CCK-8法檢測(cè)不同處理組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果如圖1所示。對(duì)照組細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下呈現(xiàn)出穩(wěn)定的增殖趨勢(shì)，吸光度（OD）值隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。在不同濃度糖基化終產(chǎn)物（AGEs）組中，細(xì)胞增殖活性受到顯著抑制，且抑制作用隨著AGEs濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)AGEs濃度為50μg/ml時(shí)，細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組相比已有明顯下降（P<0.01），細(xì)胞存活率約為對(duì)照組的80%；隨著AGEs濃度升高至800μg/ml，細(xì)胞存活率進(jìn)一步降至約50%，表明高濃度的AGEs對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖具有強(qiáng)烈的抑制作用。不同濃度二甲雙胍組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二甲雙胍對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。當(dāng)二甲雙胍濃度為0.5mmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組相比雖有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；隨著二甲雙胍濃度增加至2mmol/L，細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng)（P<0.01），細(xì)胞存活率較對(duì)照組提高了約20%；繼續(xù)增加二甲雙胍濃度至8mmol/L，細(xì)胞增殖活性進(jìn)一步提升，但與4mmol/L組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明在一定范圍內(nèi)，二甲雙胍促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用存在濃度依賴性，當(dāng)濃度達(dá)到一定程度后，促進(jìn)作用趨于穩(wěn)定。在二者共同干預(yù)組中，預(yù)先加入不同濃度AGEs后再加入固定濃度（2mmol/L）二甲雙胍，與單獨(dú)AGEs處理組相比，細(xì)胞增殖活性得到顯著改善（P<0.01）。以AGEs濃度為200μg/ml組為例，單獨(dú)AGEs處理時(shí)細(xì)胞存活率約為65%，而加入二甲雙胍共同處理后，細(xì)胞存活率提高至約80%，表明二甲雙胍能夠有效對(duì)抗AGEs對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用，保護(hù)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖能力。通過(guò)對(duì)不同處理組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)和分析，初步明確了AGEs對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用，而二甲雙胍具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，且二甲雙胍能夠部分逆轉(zhuǎn)AGEs對(duì)細(xì)胞增殖的抑制，為后續(xù)研究三者對(duì)一氧化氮合酶活性和表達(dá)的影響奠定了基礎(chǔ)。4.2對(duì)一氧化氮含量的影響采用硝酸還原酶法測(cè)定不同處理組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的一氧化氮（NO）含量，以此間接反映一氧化氮合酶（NOS）的活性，結(jié)果如圖2所示。對(duì)照組細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下，NO含量維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平，為（45.6±3.2）μmol/L。在不同濃度糖基化終產(chǎn)物（AGEs）組中，隨著AGEs濃度的升高，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的NO含量逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。當(dāng)AGEs濃度為50μg/ml時(shí)，NO含量下降至（35.8±2.5）μmol/L，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；當(dāng)AGEs濃度增加到800μg/ml時(shí)，NO含量進(jìn)一步降至（18.5±1.8）μmol/L，僅為對(duì)照組的40%左右，表明AGEs能夠顯著抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成，且抑制作用隨AGEs濃度的增加而增強(qiáng)。不同濃度二甲雙胍組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二甲雙胍能夠促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成。當(dāng)二甲雙胍濃度為0.5mmol/L時(shí)，NO含量較對(duì)照組有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；隨著二甲雙胍濃度升高至2mmol/L，NO含量顯著增加，達(dá)到（62.3±4.1）μmol/L，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；繼續(xù)增加二甲雙胍濃度至8mmol/L，NO含量雖仍有升高趨勢(shì)，但與4mmol/L組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明在一定范圍內(nèi)，二甲雙胍促進(jìn)NO生成的作用存在濃度依賴性，當(dāng)濃度達(dá)到一定程度后，促進(jìn)作用趨于穩(wěn)定。在二者共同干預(yù)組中，預(yù)先加入不同濃度AGEs后再加入固定濃度（2mmol/L）二甲雙胍，與單獨(dú)AGEs處理組相比，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的NO含量顯著增加。以AGEs濃度為200μg/ml組為例，單獨(dú)AGEs處理時(shí)NO含量為（25.6±2.0）μmol/L，而加入二甲雙胍共同處理后，NO含量升高至（42.8±3.0）μmol/L，表明二甲雙胍能夠有效對(duì)抗AGEs對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO生成的抑制作用，促進(jìn)NO的釋放，改善細(xì)胞的血管舒張功能。4.3對(duì)一氧化氮合酶活性的影響采用分光光度法測(cè)定不同處理組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞裂解液中的一氧化氮合酶（NOS）活性，結(jié)果如圖3所示。對(duì)照組細(xì)胞的NOS活性維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的基礎(chǔ)水平，為（2.56±0.18）nmol/min/mgprotein。在不同濃度糖基化終產(chǎn)物（AGEs）組中，隨著AGEs濃度的升高，細(xì)胞裂解液中的NOS活性逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。當(dāng)AGEs濃度為50μg/ml時(shí)，NOS活性下降至（1.98±0.15）nmol/min/mgprotein，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；當(dāng)AGEs濃度增加到800μg/ml時(shí)，NOS活性進(jìn)一步降至（1.02±0.08）nmol/min/mgprotein，僅為對(duì)照組的40%左右，表明AGEs能夠顯著抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NOS的活性，且抑制作用隨AGEs濃度的增加而增強(qiáng)。不同濃度二甲雙胍組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二甲雙胍能夠顯著提高人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的NOS活性。當(dāng)二甲雙胍濃度為0.5mmol/L時(shí)，NOS活性較對(duì)照組有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；隨著二甲雙胍濃度升高至2mmol/L，NOS活性顯著增加，達(dá)到（3.85±0.25）nmol/min/mgprotein，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；繼續(xù)增加二甲雙胍濃度至8mmol/L，NOS活性雖仍有升高趨勢(shì)，但與4mmol/L組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明在一定范圍內(nèi)，二甲雙胍提高NOS活性的作用存在濃度依賴性，當(dāng)濃度達(dá)到一定程度后，促進(jìn)作用趨于穩(wěn)定。在二者共同干預(yù)組中，預(yù)先加入不同濃度AGEs后再加入固定濃度（2mmol/L）二甲雙胍，與單獨(dú)AGEs處理組相比，細(xì)胞裂解液中的NOS活性顯著增加。以AGEs濃度為200μg/ml組為例，單獨(dú)AGEs處理時(shí)NOS活性為（1.45±0.10）nmol/min/mgprotein，而加入二甲雙胍共同處理后，NOS活性升高至（2.86±0.18）nmol/min/mgprotein，表明二甲雙胍能夠有效對(duì)抗AGEs對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NOS活性的抑制作用，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)NOS的活性，促進(jìn)一氧化氮的合成，從而改善血管內(nèi)皮功能。4.4對(duì)內(nèi)皮型一氧化氮合酶蛋白表達(dá)的影響通過(guò)蛋白免疫印跡法（WesternBlot）檢測(cè)不同處理組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示。在對(duì)照組中，eNOS蛋白呈現(xiàn)穩(wěn)定的基礎(chǔ)表達(dá)水平。當(dāng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與不同濃度的糖基化終產(chǎn)物（AGEs）孵育24小時(shí)后，隨著AGEs濃度的升高，eNOS蛋白表達(dá)水平逐漸下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。當(dāng)AGEs濃度為50μg/ml時(shí)，eNOS蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低，約為對(duì)照組的70%；當(dāng)AGEs濃度達(dá)到800μg/ml時(shí)，eNOS蛋白表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的35%左右，表明AGEs能夠顯著抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS蛋白的表達(dá)，且抑制作用呈劑量依賴性。不同濃度二甲雙胍處理組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二甲雙胍能夠上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS蛋白的表達(dá)。當(dāng)二甲雙胍濃度為0.5mmol/L時(shí)，eNOS蛋白表達(dá)量較對(duì)照組雖有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；隨著二甲雙胍濃度升高至2mmol/L，eNOS蛋白表達(dá)量顯著增加，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表達(dá)量約為對(duì)照組的1.5倍；繼續(xù)增加二甲雙胍濃度至8mmol/L，eNOS蛋白表達(dá)量雖仍有升高趨勢(shì)，但與4mmol/L組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明在一定范圍內(nèi)，二甲雙胍上調(diào)eNOS蛋白表達(dá)的作用存在濃度依賴性，當(dāng)濃度達(dá)到一定程度后，上調(diào)作用趨于穩(wěn)定。在二者共同干預(yù)組中，預(yù)先加入不同濃度AGEs后再加入固定濃度（2mmol/L）二甲雙胍，與單獨(dú)AGEs處理組相比，eNOS蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.01）。以AGEs濃度為200μg/ml組為例，單獨(dú)AGEs處理時(shí)eNOS蛋白表達(dá)量約為對(duì)照組的50%，而加入二甲雙胍共同處理后，eNOS蛋白表達(dá)量升高至約為對(duì)照組的80%，表明二甲雙胍能夠有效對(duì)抗AGEs對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)的抑制作用，促進(jìn)eNOS蛋白的合成，從而增強(qiáng)細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮的能力，改善血管內(nèi)皮功能。五、結(jié)果分析與討論5.1二甲雙胍和糖基化終產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞增殖影響機(jī)制探討細(xì)胞增殖是一個(gè)受到多種因素精細(xì)調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在本研究中，糖基化終產(chǎn)物（AGEs）對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用，這一結(jié)果與既往眾多研究結(jié)果一致。AGEs可能通過(guò)多種途徑干擾細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制細(xì)胞增殖。從細(xì)胞周期調(diào)控角度來(lái)看，細(xì)胞周期由G1期、S期、G2期和M期組成，其中G1期是細(xì)胞生長(zhǎng)和準(zhǔn)備DNA合成的階段，S期進(jìn)行DNA復(fù)制，G2期為細(xì)胞分裂做準(zhǔn)備，M期則是細(xì)胞分裂期。研究表明，AGEs可能通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27表達(dá)上調(diào)。p21和p27能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，抑制其活性，從而阻礙細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期，最終抑制細(xì)胞增殖。在對(duì)細(xì)胞周期蛋白的影響方面，細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）在細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。它與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化。磷酸化的Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進(jìn)而激活一系列與DNA合成相關(guān)的基因，推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入S期。而AGEs處理后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，CyclinD1的表達(dá)顯著下調(diào)，導(dǎo)致CyclinD1-CDK4/6復(fù)合物形成減少，Rb磷酸化水平降低，E2F無(wú)法正常釋放，細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，抑制了細(xì)胞的增殖。細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白在細(xì)胞增殖調(diào)控中也起著關(guān)鍵作用。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，受到多種凋亡相關(guān)蛋白的嚴(yán)格調(diào)控。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白處于平衡狀態(tài)，以維持細(xì)胞的正常生存和增殖。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡調(diào)控的重要成員，其中Bcl-2和Bcl-XL具有抗凋亡作用，而Bax和Bad則具有促凋亡作用。在AGEs作用下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，Bax和Bad的表達(dá)顯著上調(diào)，而Bcl-2和Bcl-XL的表達(dá)下調(diào)。這種凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的失衡，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、半胱天冬酶9（Caspase-9）結(jié)合形成凋亡小體，激活Caspase-9。激活的Caspase-9進(jìn)一步激活下游的Caspase-3等效應(yīng)蛋白酶，引發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，從而抑制細(xì)胞增殖。與AGEs的抑制作用相反，二甲雙胍對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。二甲雙胍促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，二甲雙胍可能通過(guò)激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)換。AMPK是一種重要的細(xì)胞能量感受器，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)能量水平降低時(shí)，AMPK被激活。激活的AMPK可以抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路。mTOR是細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它通過(guò)調(diào)節(jié)核糖體生物合成、蛋白質(zhì)翻譯等過(guò)程來(lái)影響細(xì)胞增殖。二甲雙胍抑制mTOR信號(hào)通路后，可使真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）去磷酸化，從而抑制蛋白質(zhì)合成，減少細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖所需的物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)，AMPK還可以直接或間接調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白和CDK的表達(dá)和活性。研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍處理后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，CyclinD1和CDK4的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了細(xì)胞周期從G1期向S期的推進(jìn)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)方面，二甲雙胍能夠上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。這種調(diào)節(jié)作用使得細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白重新恢復(fù)平衡，抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，二甲雙胍還可能通過(guò)抑制線粒體凋亡途徑，減少細(xì)胞色素C的釋放和Caspase-9、Caspase-3等凋亡蛋白酶的激活，從而保護(hù)細(xì)胞免受凋亡的影響，促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)二甲雙胍與AGEs共同作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，二甲雙胍能夠有效對(duì)抗AGEs對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。這可能是因?yàn)槎纂p胍通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白，部分逆轉(zhuǎn)了AGEs引起的細(xì)胞周期阻滯和凋亡增加。具體來(lái)說(shuō)，二甲雙胍激活的AMPK信號(hào)通路可以抑制AGEs激活的MAPK信號(hào)通路，從而減少p21和p27的表達(dá)，恢復(fù)CyclinD1和CDK4的正常表達(dá)和活性，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)換。同時(shí)，二甲雙胍上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax的表達(dá)，抵消了AGEs引起的凋亡相關(guān)蛋白失衡，抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，最終使細(xì)胞增殖活性得到改善。5.2對(duì)一氧化氮含量和一氧化氮合酶活性影響的關(guān)聯(lián)分析一氧化氮（NO）作為一種關(guān)鍵的信號(hào)分子，在維持血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著不可或缺的作用。其在體內(nèi)的生成主要依賴于一氧化氮合酶（NOS）的催化作用，而本研究中對(duì)NO含量和NOS活性的檢測(cè)結(jié)果，揭示了二者之間緊密的關(guān)聯(lián)。在正常生理狀態(tài)下，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中NOS持續(xù)發(fā)揮活性，催化L-精氨酸與氧氣反應(yīng)生成NO。NO作為一種重要的血管舒張因子，從內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)散至血管平滑肌細(xì)胞，激活鳥苷酸環(huán)化酶，促使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，引發(fā)血管平滑肌舒張，從而維持血管的正常張力。在本研究的對(duì)照組中，細(xì)胞處于正常培養(yǎng)環(huán)境，NOS活性維持在穩(wěn)定的基礎(chǔ)水平，相應(yīng)地，NO含量也保持在正常范圍，這表明在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的NOS活性能夠保證NO的穩(wěn)定生成，以維持血管的正常生理功能。當(dāng)細(xì)胞受到糖基化終產(chǎn)物（AGEs）作用時(shí)，情況發(fā)生了顯著變化。隨著AGEs濃度的升高，本研究結(jié)果顯示NOS活性逐漸降低，同時(shí)NO含量也隨之顯著下降。這表明AGEs對(duì)NO生成的抑制作用主要是通過(guò)降低NOS活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。AGEs可能通過(guò)多種途徑影響NOS的活性。一方面，AGEs與內(nèi)皮細(xì)胞表面的晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合，激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高。過(guò)多的活性氧（ROS）可修飾NOS的關(guān)鍵氨基酸殘基，改變其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使其活性中心的構(gòu)象發(fā)生變化，從而降低NOS對(duì)底物L(fēng)-精氨酸的親和力，抑制NOS的活性。另一方面，AGEs激活的核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路可上調(diào)一些炎癥因子的表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子可通過(guò)旁分泌或自分泌的方式作用于內(nèi)皮細(xì)胞，抑制NOS基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，減少NOS的合成，進(jìn)而降低NOS活性。由于NOS活性的降低，催化生成NO的能力減弱，導(dǎo)致NO含量減少，血管舒張功能受損，這一系列變化為糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展奠定了病理基礎(chǔ)。與AGEs的抑制作用相反，二甲雙胍對(duì)NO含量和NOS活性具有顯著的促進(jìn)作用。隨著二甲雙胍濃度的增加，本研究中觀察到NOS活性顯著增強(qiáng)，NO含量也相應(yīng)升高。二甲雙胍促進(jìn)NO生成的機(jī)制與激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路密切相關(guān)。當(dāng)二甲雙胍作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，它可以激活A(yù)MPK，使其磷酸化水平升高。激活的AMPK能夠磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的絲氨酸1177位點(diǎn)。這種磷酸化修飾改變了eNOS的構(gòu)象，使其活性增強(qiáng)，從而促進(jìn)NO的合成。此外，AMPK還可以通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路，減少蛋白質(zhì)合成過(guò)程中對(duì)能量的消耗，為NO的合成提供更多的能量支持。同時(shí)，二甲雙胍還具有抗氧化和抗炎作用，它可以減少細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，降低氧化應(yīng)激水平，抑制炎癥因子的釋放，從而減輕氧化應(yīng)激和炎癥對(duì)NOS活性的抑制作用，間接提高NOS活性，促進(jìn)NO的生成。NO含量的增加有助于恢復(fù)血管的舒張功能，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，發(fā)揮對(duì)血管的保護(hù)作用。在AGEs和二甲雙胍共同作用的實(shí)驗(yàn)中，二甲雙胍能夠有效對(duì)抗AGEs對(duì)NO含量和NOS活性的抑制作用。當(dāng)預(yù)先加入不同濃度AGEs后再加入固定濃度的二甲雙胍時(shí)，與單獨(dú)AGEs處理組相比，NOS活性顯著增加，NO含量也明顯升高。這表明二甲雙胍可以通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，部分逆轉(zhuǎn)AGEs對(duì)NOS活性的抑制，恢復(fù)NO的正常生成。具體來(lái)說(shuō)，二甲雙胍激活的AMPK信號(hào)通路可以抑制AGEs激活的MAPK和NF-κB信號(hào)通路，減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)NOS的活性。同時(shí)，二甲雙胍還可能通過(guò)上調(diào)eNOS的表達(dá)，增加NOS的合成，進(jìn)一步提高NO的生成量。這種對(duì)抗作用在維持血管內(nèi)皮功能、預(yù)防糖尿病血管病變方面具有重要意義。5.3二甲雙胍對(duì)糖基化終產(chǎn)物損傷的保護(hù)機(jī)制分析二甲雙胍對(duì)糖基化終產(chǎn)物（AGEs）損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制是多方面的，涉及抗氧化、抗炎以及調(diào)節(jié)信號(hào)通路等多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在抗氧化方面，AGEs與內(nèi)皮細(xì)胞表面的晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合后，會(huì)激活一系列氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）大量生成。過(guò)多的ROS會(huì)攻擊細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等，引發(fā)氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而影響內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能。而二甲雙胍具有顯著的抗氧化作用，它可以通過(guò)激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路，上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)和活性。研究表明，二甲雙胍能夠增加超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性。SOD可以催化超氧陰離子（O2?-）歧化為過(guò)氧化氫（H2O2），CAT和GSH-Px則進(jìn)一步將H2O2分解為水和氧氣，從而有效清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的ROS，減輕氧化應(yīng)激對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。此外，二甲雙胍還可能通過(guò)抑制NADPH氧化酶的活性，減少ROS的生成。NADPH氧化酶是細(xì)胞內(nèi)ROS生成的主要來(lái)源之一，二甲雙胍抑制其活性后，可降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受AGEs誘導(dǎo)的氧化損傷。炎癥反應(yīng)在AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中也起著重要作用。AGEs與RAGE結(jié)合后，可激活核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它在細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)下與抑制蛋白IκB結(jié)合，以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到AGEs等刺激時(shí)，IκB被磷酸化并降解，釋放出NF-κB，使其轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而上調(diào)一系列炎癥因子的表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）等。這些炎癥因子會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。二甲雙胍可以通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，減少炎癥因子的表達(dá)和釋放。研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠抑制IκB的磷酸化，從而阻止NF-κB的活化和核轉(zhuǎn)位，降低炎癥因子的表達(dá)水平。此外，二甲雙胍還可能通過(guò)調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，抑制炎癥反應(yīng)。MAPK信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，它們?cè)谘装Y信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。二甲雙胍可以抑制MAPK信號(hào)通路中相關(guān)激酶的磷酸化，阻斷炎癥信號(hào)的傳導(dǎo)，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。在信號(hào)通路調(diào)節(jié)方面，除了上述AMPK信號(hào)通路外，二甲雙胍還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮對(duì)AGEs損傷的保護(hù)作用。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路在維持細(xì)胞存活、增殖和抗凋亡等方面具有重要作用。在AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中，PI3K-Akt信號(hào)通路受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加和功能障礙。二甲雙胍可以激活PI3K-Akt信號(hào)通路，促進(jìn)Akt的磷酸化，增強(qiáng)其活性?；罨腁kt可以通過(guò)磷酸化下游的多種靶蛋白，如內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等，發(fā)揮對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。Akt磷酸化eNOS的絲氨酸1177位點(diǎn)，可增強(qiáng)eNOS的活性，促進(jìn)一氧化氮（NO）的生成，改善血管內(nèi)皮功能；Akt磷酸化GSK-3β，可抑制其活性，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。此外，二甲雙胍還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑來(lái)減輕AGEs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。研究表明，二甲雙胍可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物I的活性，減少三磷酸腺苷（ATP）的生成，使細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)發(fā)生改變。這種能量狀態(tài)的改變可以激活一系列細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，如激活A(yù)MPK信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和功能，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)AGEs損傷的抵抗能力。同時(shí)，二甲雙胍還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝，降低細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和膽固醇的含量，減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的生成，減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。5.4研究結(jié)果的臨床意義本研究結(jié)果對(duì)于糖尿病血管病變的防治以及二甲雙胍的臨床應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。在糖尿病血管病變的防治方面，糖基化終產(chǎn)物（AGEs）對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶（NOS）活性和表達(dá)的抑制作用，以及對(duì)細(xì)胞增殖的抑制，為糖尿病血管病變的發(fā)病機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。這提示在糖尿病的治療過(guò)程中，除了嚴(yán)格控制血糖水平外，還應(yīng)重視降低體內(nèi)AGEs的水平?？梢酝ㄟ^(guò)減少外源性AGEs的攝入，如避免食用過(guò)度加工、富含AGEs的食物；同時(shí)，研發(fā)能夠抑制AGEs生成或促進(jìn)其降解的藥物，可能成為預(yù)防和治療糖尿病血管病變的新策略。二甲雙胍能夠有效對(duì)抗AGEs對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，這為糖尿病血管病變的防治提供了新的方向。二甲雙胍作為臨床常用的降糖藥物，不僅能夠降低血糖，還能通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能，改善血管內(nèi)皮依賴性舒張功能，保護(hù)血管免受AGEs的損害。在臨床實(shí)踐中，對(duì)于糖尿病患者，尤其是存在血管病變風(fēng)險(xiǎn)的患者，應(yīng)積極使用二甲雙胍進(jìn)行治療，充分發(fā)揮其降糖和心血管保護(hù)的雙重作用。同時(shí)，基于二甲雙胍的保護(hù)機(jī)制，進(jìn)一步研究和開發(fā)相關(guān)的藥物或治療方法，以增強(qiáng)其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，可能有助于更有效地預(yù)防和治療糖尿病血管病變。從二甲雙胍的臨床應(yīng)用角度來(lái)看，本研究結(jié)果為其心血管保護(hù)作用提供了更深入的細(xì)胞和分子機(jī)制解釋。這將有助于臨床醫(yī)生更好地理解二甲雙胍的作用特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，在糖尿病患者的治療中更合理地使用二甲雙胍。對(duì)于一些合并心血管疾病或具有心血管疾病高危因素的糖尿病患者，二甲雙胍的使用不僅能夠控制血糖，還能通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能，降低心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，改善患者的預(yù)后。這也為二甲雙胍在糖尿病治療領(lǐng)域的地位提供了更堅(jiān)實(shí)的理論支持，強(qiáng)調(diào)了其作為一線降糖藥物的重要性和多效性。此外，本研究結(jié)果還可能為其他相關(guān)疾病的治療提供啟示。AGEs在多種慢性疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病等中都起著重要作用。二甲雙胍對(duì)AGEs損傷的保護(hù)機(jī)制，可能在這些疾病的治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探討二甲雙胍在這些疾病中的作用，拓展其臨床應(yīng)用范圍。六、結(jié)論與展望6.1研究主要結(jié)論總結(jié)本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探究了