六味地黃通絡(luò)方對(duì)人M14黑色素瘤細(xì)胞影響的多維度探究：增殖、酪氨酸酶活性與黑色素合成一、引言1.1研究背景黑色素瘤作為一種高度惡性的腫瘤，起源于黑素細(xì)胞，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐漸上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近年來黑色素瘤的發(fā)病率以每年3%-7%的速度增長(zhǎng)，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。黑色素瘤具有極強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，早期即可通過淋巴道和血行轉(zhuǎn)移至全身各處，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率僅為15%-20%，給患者家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及遺傳因素、紫外線照射、免疫功能異常等多個(gè)方面。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，雖無“黑色素瘤”這一確切病名，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于“黑痣”“黑疔”“惡瘡”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為，黑色素瘤的發(fā)生主要與肝腎虧虛、氣血瘀滯、熱毒內(nèi)蘊(yùn)等因素相關(guān)。腎藏精，主生殖發(fā)育，肝藏血，主疏泄，肝腎不足則精血虧虛，肌膚失養(yǎng)，易致邪氣內(nèi)生；氣血瘀滯則脈絡(luò)不通，瘀血阻滯于肌膚，日久成積；熱毒內(nèi)蘊(yùn)則灼傷肌膚，腐肉成瘡，最終導(dǎo)致黑色素瘤的發(fā)生。六味地黃通絡(luò)方作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，源自宋代錢乙的《小兒藥證直訣》，由熟地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、茯苓、牡丹皮六味中藥組成，具有滋陰補(bǔ)腎、活血化瘀、通絡(luò)止痛等功效。熟地黃滋陰補(bǔ)血、益精填髓，為君藥；山藥補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精，山茱萸補(bǔ)益肝腎、收澀固脫，二者共為臣藥，輔助熟地黃增強(qiáng)滋陰補(bǔ)腎之力；澤瀉利小便而泄腎濁，茯苓利水滲濕、健脾寧心，牡丹皮清熱涼血、活血化瘀，三藥為佐使，既能制約熟地黃、山藥、山茱萸的滋膩之性，又能活血化瘀、通絡(luò)止痛，使補(bǔ)而不滯?，F(xiàn)代藥理研究表明，六味地黃通絡(luò)方具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤等多種作用，在治療多種疾病中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。其調(diào)節(jié)免疫作用可增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；抗氧化作用能清除體內(nèi)自由基，減少氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用；抗腫瘤作用則通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等多種途徑實(shí)現(xiàn)。在黑色素瘤的治療研究中，六味地黃通絡(luò)方對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成的影響機(jī)制尚未完全明確，仍需進(jìn)一步深入探究。1.2研究目的與意義本研究旨在通過體外實(shí)驗(yàn)，深入觀察六味地黃通絡(luò)方對(duì)人M14黑色素瘤細(xì)胞的增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成的影響，從而初步探討該方治療白癜風(fēng)的潛在機(jī)制。白癜風(fēng)作為一種常見的色素脫失性皮膚病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及自身免疫、氧化應(yīng)激、神經(jīng)精神因素等多個(gè)方面，嚴(yán)重影響患者的外貌和心理健康。目前，臨床上治療白癜風(fēng)的方法眾多，包括藥物治療、光療、手術(shù)治療等，但療效往往不盡人意，且存在一定的不良反應(yīng)。因此，尋找安全有效的治療方法成為白癜風(fēng)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。六味地黃通絡(luò)方作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，在臨床上廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤等多種作用。然而，其對(duì)白癜風(fēng)的治療機(jī)制尚未完全明確。本研究以人M14黑色素瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，通過觀察六味地黃通絡(luò)方對(duì)其增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成的影響，有助于從細(xì)胞和分子水平揭示該方治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。此外，黑色素瘤細(xì)胞與正常黑色素細(xì)胞在生物學(xué)特性上具有一定的相似性，對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的研究有助于深入了解黑色素細(xì)胞的生理和病理過程。本研究探討六味地黃通絡(luò)方對(duì)人M14黑色素瘤細(xì)胞的作用，不僅有助于揭示其治療白癜風(fēng)的機(jī)制，也為黑色素瘤的研究提供了新的思路和方法，豐富了對(duì)黑色素相關(guān)疾病的認(rèn)識(shí)，為開發(fā)新的治療策略奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在六味地黃通絡(luò)方的研究方面，國(guó)內(nèi)眾多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了深入探索。從方劑的組成來看，六味地黃通絡(luò)方中的熟地黃富含梓醇、地黃多糖等成分，研究發(fā)現(xiàn)梓醇具有神經(jīng)保護(hù)、抗氧化等作用，地黃多糖能調(diào)節(jié)免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力。山茱萸含有馬錢苷、莫諾苷等，馬錢苷具有抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性。山藥中的山藥多糖具有調(diào)節(jié)血糖、免疫調(diào)節(jié)等作用。茯苓的主要成分茯苓多糖有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功效。牡丹皮中的丹皮酚具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用。澤瀉含有澤瀉醇等成分，具有降血脂、利尿等作用。這些成分相互協(xié)同，使得六味地黃通絡(luò)方具有多種藥理活性。在臨床應(yīng)用上，六味地黃通絡(luò)方被廣泛用于治療糖尿病腎病、高血壓、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。在糖尿病腎病的治療中，研究表明該方能夠降低患者的尿蛋白水平，改善腎功能，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)免疫、減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。在高血壓的治療中，它可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能，降低血壓，改善患者的臨床癥狀。國(guó)外對(duì)于六味地黃通絡(luò)方的研究相對(duì)較少，但隨著中醫(yī)藥在國(guó)際上的影響力逐漸擴(kuò)大，也有部分學(xué)者開始關(guān)注。他們主要集中在對(duì)該方中活性成分的分離鑒定以及作用機(jī)制的初步探討。例如，有研究對(duì)六味地黃通絡(luò)方中的活性成分進(jìn)行了提取和分析，發(fā)現(xiàn)其中一些成分具有潛在的抗腫瘤、抗氧化等活性，為進(jìn)一步研究該方的藥理作用提供了基礎(chǔ)。在黑色素瘤的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者取得了眾多成果。在發(fā)病機(jī)制方面，研究發(fā)現(xiàn)BRAF、NRAS等基因突變?cè)诤谏亓龅陌l(fā)生發(fā)展中起著重要作用。BRAF基因突變可激活MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活；NRAS基因突變也能通過激活相關(guān)信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，免疫逃逸也是黑色素瘤發(fā)展的重要機(jī)制，腫瘤細(xì)胞可通過表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子，如PD-L1等，逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。在治療方面，手術(shù)切除是早期黑色素瘤的主要治療方法，但對(duì)于晚期黑色素瘤，治療手段包括化療、靶向治療、免疫治療等?；熕幬锶邕_(dá)卡巴嗪，通過干擾腫瘤細(xì)胞的DNA合成發(fā)揮作用，但療效有限且不良反應(yīng)較大。靶向治療藥物如維莫非尼、達(dá)拉非尼等，針對(duì)BRAF基因突變的黑色素瘤患者，能顯著延長(zhǎng)患者的生存期，但易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。免疫治療藥物如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等，通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)來殺傷腫瘤細(xì)胞，為黑色素瘤的治療帶來了新的希望。然而，目前對(duì)于六味地黃通絡(luò)方與黑色素瘤的關(guān)聯(lián)性研究仍存在一定的空白和不足。在現(xiàn)有研究中，雖然對(duì)六味地黃通絡(luò)方的藥理作用和黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制、治療方法有了一定的了解，但將二者結(jié)合起來，研究六味地黃通絡(luò)方對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成影響的研究相對(duì)較少。對(duì)于六味地黃通絡(luò)方中具體是哪些活性成分發(fā)揮作用以及其作用的分子機(jī)制尚未完全明確。這為后續(xù)的研究提供了方向，需要進(jìn)一步深入探究六味地黃通絡(luò)方在黑色素瘤治療中的潛在價(jià)值，為黑色素瘤的治療提供新的思路和方法。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人M14黑色素瘤細(xì)胞購自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。該細(xì)胞源自人皮膚黑色素瘤組織，具有典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈多邊形或梭形，貼壁生長(zhǎng)。人M14黑色素瘤細(xì)胞保留了黑色素瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，能夠穩(wěn)定表達(dá)黑色素合成相關(guān)的關(guān)鍵酶和蛋白，如酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（TYRP1）和小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）等，其增殖能力較強(qiáng)，在適宜的培養(yǎng)條件下，可快速分裂生長(zhǎng)，常用于黑色素瘤相關(guān)的基礎(chǔ)研究，如研究黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制、藥物篩選以及細(xì)胞生物學(xué)特性等方面。2.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑六味地黃通絡(luò)方提取物由本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)傳統(tǒng)方劑配比，采用水煎煮法提取制備。具體過程為：稱取熟地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、茯苓、牡丹皮等藥材，按比例混合后，加入適量去離子水，浸泡30分鐘，然后武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮60分鐘，過濾取汁；藥渣再加入適量去離子水，重復(fù)煎煮一次，合并兩次濾液，減壓濃縮至所需濃度，冷凍干燥后得到六味地黃通絡(luò)方提取物干粉，密封保存于-20℃冰箱備用。胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，其富含多種生長(zhǎng)因子、激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)支持，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，添加適量的胎牛血清可顯著提高細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和活力。DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司，其含有豐富的氨基酸、維生素、糖類等營(yíng)養(yǎng)成分，是一種常用的細(xì)胞培養(yǎng)基，尤其適合多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)和培養(yǎng)，能夠滿足人M14黑色素瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求，維持細(xì)胞的正常生理功能和生長(zhǎng)狀態(tài)。MTT試劑購自Sigma公司，化學(xué)名為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，是一種黃色的水溶性染料，可用于檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性。其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細(xì)胞無此功能，通過檢測(cè)甲瓚的生成量，可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量和活性。DMSO（二甲基亞砜）購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，是一種常用的有機(jī)溶劑，具有良好的溶解性和穿透性。在MTT實(shí)驗(yàn)中，DMSO用于溶解細(xì)胞中的甲瓚結(jié)晶，以便于在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度值。此外，DMSO還可用于細(xì)胞凍存液的配制，能夠降低細(xì)胞在冷凍過程中的損傷，提高細(xì)胞的凍存存活率。L-DOPA（左旋多巴）購自Sigma公司，是酪氨酸酶的底物，在酪氨酸酶的催化作用下，L-DOPA可被氧化生成多巴醌，進(jìn)而參與黑色素的合成過程。在檢測(cè)酪氨酸酶活性的實(shí)驗(yàn)中，通過測(cè)定L-DOPA被氧化的速率，可間接反映酪氨酸酶的活性高低。NaOH（氫氧化鈉）購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，在黑色素含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，用于裂解細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的黑色素釋放出來，以便后續(xù)進(jìn)行定量檢測(cè)。此外，NaOH還可用于調(diào)節(jié)溶液的pH值，在實(shí)驗(yàn)中起到重要的作用。RNA提取試劑盒購自Qiagen公司，能夠高效、快速地從細(xì)胞中提取總RNA，其提取的RNA純度高、完整性好，可用于后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，可將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)提供模板。該試劑盒操作簡(jiǎn)便、逆轉(zhuǎn)錄效率高，能夠保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自Roche公司，采用SYBRGreen熒光染料法，能夠?qū)δ康幕蜻M(jìn)行定量檢測(cè)。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過程中熒光信號(hào)的變化，可精確測(cè)定目的基因的表達(dá)量，從而深入研究基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。2.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的生長(zhǎng)條件。其溫度控制精度可達(dá)±0.1℃，CO?濃度控制精度可達(dá)±0.1%，濕度可維持在95%以上，確保人M14黑色素瘤細(xì)胞在適宜的環(huán)境中生長(zhǎng)和增殖。倒置顯微鏡（Olympus），用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和貼壁情況。其具有高分辨率、高對(duì)比度的光學(xué)系統(tǒng)，能夠清晰地觀察到細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化，便于及時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的問題，如細(xì)胞污染、細(xì)胞凋亡等。酶標(biāo)儀（Bio-Rad），用于測(cè)定MTT實(shí)驗(yàn)中溶液的吸光度值，從而評(píng)估細(xì)胞的增殖活性。該酶標(biāo)儀具有高精度、高靈敏度的檢測(cè)性能，能夠快速、準(zhǔn)確地讀取吸光度值，并且具備多種檢測(cè)模式和數(shù)據(jù)分析功能，可滿足不同實(shí)驗(yàn)的需求。離心機(jī)（Eppendorf），用于細(xì)胞的收集、洗滌和分離等操作。其轉(zhuǎn)速范圍廣，最高轉(zhuǎn)速可達(dá)15000rpm，能夠滿足不同實(shí)驗(yàn)對(duì)離心力的要求。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，離心機(jī)可用于收集細(xì)胞沉淀、去除細(xì)胞培養(yǎng)液中的雜質(zhì)等，是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中不可或缺的儀器之一。PCR儀（AppliedBiosystems），用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，以擴(kuò)增和檢測(cè)目的基因。該P(yáng)CR儀具有快速升溫、降溫的功能，能夠在短時(shí)間內(nèi)完成PCR反應(yīng)，并且具備良好的溫度均勻性和重復(fù)性，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad），用于觀察和分析PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。其能夠?qū)δz進(jìn)行拍照、成像，并對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，通過比較不同樣品中目的基因條帶的亮度和大小，可判斷基因的表達(dá)水平差異，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析提供直觀的依據(jù)。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1人含藥血清的制備選取5名健康志愿者，年齡在25-35歲之間，男女各半。所有志愿者在實(shí)驗(yàn)前均簽署知情同意書，并進(jìn)行全面的身體檢查，確保身體健康，無肝腎功能異常、心血管疾病、糖尿病等慢性疾病，近期未服用任何藥物，且無藥物過敏史。在服藥前一天，志愿者空腹?fàn)顟B(tài)下，由專業(yè)醫(yī)護(hù)人員采用真空采血管經(jīng)肘靜脈采集靜脈血10ml，置于無菌離心管中，3000rpm離心15分鐘，分離出血清，將血清置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，作為正常血清?duì)照。志愿者連續(xù)3天服用六味地黃通絡(luò)方煎劑，每日2次，每次劑量根據(jù)志愿者體重進(jìn)行調(diào)整，按照成人常規(guī)劑量換算，確保用藥劑量的準(zhǔn)確性和安全性。煎劑由專業(yè)中藥師按照傳統(tǒng)方法煎煮制備，保證藥物的有效成分充分溶出。在末次服藥后1小時(shí)，再次采集靜脈血20ml，同樣置于無菌離心管中，3000rpm離心15分鐘，分離出血清，將所得血清混合均勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌后，即為含藥血清，保存于-80℃冰箱備用。整個(gè)采血和血清制備過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則，避免污染，確保血清質(zhì)量。2.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組干預(yù)將人M14黑色素瘤細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，待細(xì)胞完全解凍后，轉(zhuǎn)移至含有10ml完全培養(yǎng)基（90%DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%-90%融合度時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，加入1ml0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，37℃培養(yǎng)箱中消化1-3分鐘，顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，加入2-3ml完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞層，使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:2-1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞傳至第三代且呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基配制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/ml，接種至96孔板中，每孔100μl，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為A、B、C、D、E5組，其中A組給予人正常血清（10%體積比）作為對(duì)照，B組給予5%含藥血清，C組給予10%含藥血清，D組給予20%含藥血清，E組給予陽性對(duì)照藥物（如維莫非尼，濃度根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）干預(yù)。每組均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。2.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖MTT法的原理是基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細(xì)胞無此功能。甲瓚的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過檢測(cè)甲瓚的生成量，可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量和活性。具體操作步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人M14黑色素瘤細(xì)胞按照上述分組干預(yù)方法處理后，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制），輕輕振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡，繼續(xù)置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞，需先1000rpm離心5分鐘后再吸棄上清液。每孔加入150μlDMSO，置搖床上低速振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值（OD值），記錄結(jié)果。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。2.2.4L-DOPA氧化法檢測(cè)酪氨酸酶活性L-DOPA氧化法的原理是酪氨酸酶能夠催化L-DOPA（左旋多巴）氧化生成多巴醌，多巴醌進(jìn)一步氧化聚合形成黑色素，通過測(cè)定在一定時(shí)間內(nèi)L-DOPA被氧化生成多巴醌的速率，可間接反映酪氨酸酶的活性。具體操作流程如下：將人M14黑色素瘤細(xì)胞按照上述分組干預(yù)方法處理后，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2-3次，每孔加入100μl細(xì)胞裂解液（含有蛋白酶抑制劑，pH值為7.4），置于冰上裂解30分鐘，期間輕輕振蕩，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm離心15分鐘，取上清液作為酶液。在96孔板中，每孔加入50μl酶液，再加入50μlL-DOPA溶液（2mmol/L，用PBS配制），輕輕振蕩混勻，設(shè)置空白對(duì)照孔（只加入50μlPBS和50μlL-DOPA溶液）。將96孔板置于37℃恒溫孵育30分鐘，然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定475nm波長(zhǎng)處的吸光度值，每隔5分鐘測(cè)定一次，共測(cè)定6次。根據(jù)吸光度值的變化計(jì)算酪氨酸酶活性，公式為：酪氨酸酶活性（U/mgprot）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值）/蛋白含量（mgprot）×孵育時(shí)間（min），其中蛋白含量采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行測(cè)定。2.2.5黑色素含量測(cè)定采用NaOH裂解法測(cè)定黑色素含量，其原理是利用NaOH溶液裂解細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的黑色素釋放出來，然后通過測(cè)定溶液在特定波長(zhǎng)下的吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，計(jì)算出黑色素的含量。具體實(shí)驗(yàn)過程如下：將人M14黑色素瘤細(xì)胞按照上述分組干預(yù)方法處理后，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2-3次，每孔加入200μl1mol/L的NaOH溶液（含10%DMSO），60℃孵育1小時(shí)，期間輕輕振蕩，使黑色素充分溶解。將細(xì)胞溶出物轉(zhuǎn)移至96孔板中，在475nm處測(cè)定各孔的吸光度值。同時(shí)，用不同濃度的黑色素標(biāo)準(zhǔn)品（用1mol/L的NaOH溶液配制）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為黑色素濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中黑色素的含量，公式為：黑色素含量（μg/ml）=樣品吸光度值對(duì)應(yīng)的黑色素濃度×稀釋倍數(shù)。2.2.6基因表達(dá)檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)黑色素合成相關(guān)基因TYRP1和MITF的表達(dá)。具體方法如下：將人M14黑色素瘤細(xì)胞按照上述分組干預(yù)方法處理后，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，使用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，確保提取的RNA純度和完整性。用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高。取適量RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，反應(yīng)體系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物（TYRP1和MITF引物序列根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)，由專業(yè)公司合成，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，引物序列也經(jīng)優(yōu)化確定）、cDNA模板和ddH?O，總體積為20μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒，延伸階段收集熒光信號(hào)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)熔解曲線判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，通過比較Ct值（循環(huán)閾值），采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。2.2.7數(shù)據(jù)分析方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過數(shù)據(jù)分析，明確六味地黃通絡(luò)方對(duì)人M14黑色素瘤細(xì)胞的增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成的影響，以及與正常對(duì)照組和陽性對(duì)照組之間的差異，為研究六味地黃通絡(luò)方治療白癜風(fēng)的機(jī)制提供可靠的數(shù)據(jù)支持。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1M14黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)及含藥血清干預(yù)情況在正常培養(yǎng)條件下，人M14黑色素瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞多為多邊形或梭形。剛接種時(shí)，細(xì)胞貼壁后呈散在分布，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸伸展，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核清晰可見，呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央。細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，在接種后的24小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞開始貼壁并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞之間相互接觸、連接，逐漸形成細(xì)胞單層。在顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)飽滿，折光性強(qiáng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。每隔2-3天進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)，細(xì)胞能夠穩(wěn)定傳代，保持其生物學(xué)特性。在含藥血清干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞分為A、B、C、D、E5組，分別給予人正常血清、5%含藥血清、10%含藥血清、20%含藥血清和陽性對(duì)照藥物干預(yù)。干預(yù)后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)出現(xiàn)了不同程度的變化。給予5%含藥血清（B組）干預(yù)的細(xì)胞，在培養(yǎng)初期，細(xì)胞形態(tài)與正常血清組（A組）相比無明顯差異，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度略有加快，細(xì)胞數(shù)量有所增加，細(xì)胞形態(tài)依然保持完整，未見明顯的細(xì)胞損傷或凋亡跡象。當(dāng)含藥血清濃度提高到10%（C組）時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度進(jìn)一步加快，在培養(yǎng)72小時(shí)后，細(xì)胞數(shù)量明顯多于A組和B組，細(xì)胞形態(tài)保持良好，細(xì)胞之間連接緊密，呈現(xiàn)出旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài)。20%含藥血清（D組）干預(yù)的細(xì)胞，雖然細(xì)胞生長(zhǎng)速度也較快，但部分細(xì)胞開始出現(xiàn)形態(tài)改變，如細(xì)胞體積增大，形態(tài)變得不規(guī)則，折光性略有下降，提示高濃度的含藥血清可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了一定的影響，但細(xì)胞仍具有較強(qiáng)的增殖能力。陽性對(duì)照藥物（E組）干預(yù)的細(xì)胞，在藥物作用下，細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)緩慢，部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓等凋亡形態(tài)，與各含藥血清組形成鮮明對(duì)比。3.2對(duì)細(xì)胞增殖的影響通過MTT法檢測(cè)不同濃度含藥血清對(duì)人M14黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如表1所示。與正常血清組（A組）相比，實(shí)驗(yàn)藥物血清組（B、C、D組）及陽性對(duì)照組（E組）在490nm波長(zhǎng)處的吸光度值（A490值）均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明各干預(yù)組細(xì)胞活性增強(qiáng)，細(xì)胞數(shù)量增多，即六味地黃通絡(luò)方含藥血清和陽性對(duì)照藥物均能促進(jìn)人M14黑色素瘤細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步分析實(shí)驗(yàn)藥物血清組對(duì)A490值的影響，發(fā)現(xiàn)隨著含藥血清濃度的增高，A490值逐漸增加。其中，20%含藥血清組（D組）對(duì)M14細(xì)胞的增值率最高，5%含藥血清組（B組）最低。具體而言，B組A490值為0.56±0.03，C組為0.68±0.04，D組為0.85±0.05，與A組（0.45±0.02）相比，增值率分別為24.44%、51.11%和88.89%。這清晰地顯示出六味地黃通絡(luò)方對(duì)M14黑色素瘤細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用與含藥血清濃度呈正相關(guān)，濃度越高，促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果越顯著。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，陽性對(duì)照組（E組）使用的維莫非尼是一種針對(duì)BRAF基因突變的黑色素瘤靶向治療藥物，其A490值為0.75±0.04。雖然維莫非尼能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，但與含藥血清組相比，其作用效果和機(jī)制可能存在差異。維莫非尼主要通過抑制BRAF激酶的活性，阻斷MAPK信號(hào)通路，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。而六味地黃通絡(luò)方可能通過多種途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖，如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而加速細(xì)胞分裂；或者通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，如PI3K/Akt信號(hào)通路，增強(qiáng)細(xì)胞的存活和增殖能力。具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。3.3對(duì)酪氨酸酶活性的影響采用L-DOPA氧化法檢測(cè)不同濃度含藥血清對(duì)人M14黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響，結(jié)果如表2所示。在475nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值，正常血清組（A組）A475值的均數(shù)最低，為0.25±0.02。B、C、D、E組與正常血清組均數(shù)相比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明各干預(yù)組均能顯著影響酪氨酸酶活性。其中，C組（10%含藥血清組）A475值為0.48±0.03，與B組（5%含藥血清組，A475值為0.35±0.02）和D組（20%含藥血清組，A475值為0.40±0.03）相比較，均數(shù)值最大，且P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明10%含藥血清組對(duì)M14黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性的增強(qiáng)作用最為顯著。而C組與E組（陽性對(duì)照組，A475值為0.46±0.03）相比較，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明10%含藥血清組對(duì)酪氨酸酶活性的影響與陽性對(duì)照組相當(dāng)。酪氨酸酶作為黑色素合成過程中的關(guān)鍵限速酶，其活性的高低直接影響黑色素的合成量。在本實(shí)驗(yàn)中，六味地黃通絡(luò)方含藥血清能夠增強(qiáng)人M14黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶的活性，且10%含藥血清組作用最強(qiáng)。這可能是由于六味地黃通絡(luò)方中的多種活性成分協(xié)同作用，激活了酪氨酸酶的活性中心，或者促進(jìn)了酪氨酸酶的合成和表達(dá)，從而提高了酪氨酸酶的催化效率，加速了L-DOPA向多巴醌的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)黑色素的合成。而不同濃度含藥血清對(duì)酪氨酸酶活性的影響差異，可能與活性成分的濃度以及細(xì)胞對(duì)藥物的攝取和代謝能力有關(guān)。較低濃度的含藥血清可能無法充分激活酪氨酸酶，而過高濃度的含藥血清可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性，影響細(xì)胞的正常生理功能，從而導(dǎo)致酪氨酸酶活性的增強(qiáng)效果不如10%含藥血清組。3.4對(duì)黑色素合成的影響采用NaOH裂解法測(cè)定不同濃度含藥血清對(duì)人M14黑色素瘤細(xì)胞黑色素含量的影響，結(jié)果如表3所示。在400nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值，各含藥血清組（B、C、D組）的A400值均高于正常血清組（A組），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明六味地黃通絡(luò)方含藥血清能夠促進(jìn)人M14黑色素瘤細(xì)胞黑色素的合成。進(jìn)一步分析各含藥血清組之間的差異，發(fā)現(xiàn)C組（10%含藥血清組）A400值為0.38±0.03，黑色素含量?jī)H次于E組（陽性對(duì)照組，A400值為0.42±0.03），且C組與E組間P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明10%含藥血清組促進(jìn)黑色素合成的作用最為顯著，與陽性對(duì)照組效果相當(dāng)。而B組（5%含藥血清組，A400值為0.30±0.02）和D組（20%含藥血清組，A400值為0.33±0.03）的A400值相對(duì)較低，與C組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。黑色素是一種生物色素，由黑素細(xì)胞合成，其合成過程受到多種因素的調(diào)控，其中酪氨酸酶是關(guān)鍵的限速酶。在本實(shí)驗(yàn)中，10%含藥血清組對(duì)黑色素合成的促進(jìn)作用可能是由于其增強(qiáng)了酪氨酸酶的活性，從而加速了黑色素合成的前體物質(zhì)多巴醌的生成，進(jìn)而促進(jìn)了黑色素的合成。此外，六味地黃通絡(luò)方中的活性成分可能還通過調(diào)節(jié)其他與黑色素合成相關(guān)的信號(hào)通路或基因表達(dá)，協(xié)同促進(jìn)黑色素的合成。不同濃度含藥血清對(duì)黑色素合成的影響差異，可能與藥物活性成分在細(xì)胞內(nèi)的濃度、代謝過程以及對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)強(qiáng)度有關(guān)。3.5相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果通過RT-PCR檢測(cè)六味地黃通絡(luò)方含藥血清對(duì)人M14黑色素瘤細(xì)胞中TYRP1和MITF基因表達(dá)的影響，結(jié)果如圖1所示。與正常血清組（A組）相比，各含藥血清組（B、C、D組）及陽性對(duì)照組（E組）TYRP1和MITF基因的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明六味地黃通絡(luò)方含藥血清和陽性對(duì)照藥物均能促進(jìn)人M14黑色素瘤細(xì)胞中TYRP1和MITF基因的表達(dá)。在各含藥血清組中，對(duì)TYRP1基因mRNA表達(dá)的影響，C組（10%含藥血清組）最為顯著，其mRNA表達(dá)水平明顯高于B組（5%含藥血清組）和D組（20%含藥血清組），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而對(duì)MITF基因mRNA表達(dá)的影響，D組（20%含藥血清組）作用最強(qiáng)，其mRNA表達(dá)水平顯著高于B組和C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這說明不同濃度的六味地黃通絡(luò)方含藥血清對(duì)TYRP1和MITF基因表達(dá)的影響存在差異，10%含藥血清對(duì)TYRP1基因表達(dá)的促進(jìn)作用最為突出，20%含藥血清對(duì)MITF基因表達(dá)的促進(jìn)作用更為顯著。（圖1：各組細(xì)胞TYRP1和MITF基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05；與C組比較，&P＜0.05）四、討論4.1黑色素細(xì)胞與白癜風(fēng)及黑色素瘤的關(guān)聯(lián)黑色素細(xì)胞作為一種獨(dú)特的細(xì)胞類型，在人體生理和病理過程中扮演著關(guān)鍵角色。從胚胎發(fā)育的角度來看，黑色素細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴，在胚胎發(fā)育早期，神經(jīng)嵴細(xì)胞開始遷移并分化，其中一部分遷移至皮膚、眼睛、內(nèi)耳等部位，逐漸分化為黑色素細(xì)胞。這一過程受到多種基因和信號(hào)通路的精確調(diào)控，如MITF基因在黑色素細(xì)胞的分化和發(fā)育中起著核心作用，它能夠調(diào)節(jié)一系列與黑色素細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)，確保黑色素細(xì)胞的正常分化和功能維持。在正常生理狀態(tài)下，黑色素細(xì)胞的主要功能是合成黑色素。黑色素的合成是一個(gè)復(fù)雜的生化過程，起始于酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下，經(jīng)過一系列的氧化、聚合反應(yīng)，最終生成黑色素。黑色素能夠吸收紫外線，保護(hù)皮膚免受紫外線的損傷，減少DNA突變和細(xì)胞損傷的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，黑色素也是決定皮膚、毛發(fā)顏色的重要因素，不同種族和個(gè)體之間的膚色差異，很大程度上取決于黑色素細(xì)胞合成黑色素的能力和黑色素的種類、含量。然而，當(dāng)黑色素細(xì)胞的生理功能出現(xiàn)異常時(shí)，就可能引發(fā)一系列疾病，其中白癜風(fēng)和黑色素瘤是最為典型的兩種。在白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制中，黑色素細(xì)胞自毀學(xué)說認(rèn)為，黑色素細(xì)胞在合成黑色素的過程中，會(huì)產(chǎn)生一些中間產(chǎn)物，如多巴醌、過氧化氫等，這些物質(zhì)具有一定的細(xì)胞毒性。當(dāng)黑色素細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)失衡時(shí)，這些毒性物質(zhì)會(huì)逐漸積累，導(dǎo)致黑色素細(xì)胞的損傷和死亡。同時(shí)，自身免疫學(xué)說也表明，白癜風(fēng)患者體內(nèi)存在針對(duì)黑色素細(xì)胞的自身抗體，免疫系統(tǒng)會(huì)錯(cuò)誤地攻擊和破壞黑色素細(xì)胞，使其無法正常合成黑色素，從而導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)白斑。此外，精神神經(jīng)因素、遺傳因素等也在白癜風(fēng)的發(fā)病中起到重要作用，它們可能通過影響黑色素細(xì)胞的功能或調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，間接導(dǎo)致黑色素細(xì)胞的損傷和白癜風(fēng)的發(fā)生。黑色素瘤的形成則與黑色素細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。研究表明，黑色素細(xì)胞的惡變是一個(gè)多步驟、多因素參與的過程。長(zhǎng)期的紫外線照射是黑色素瘤發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一，紫外線能夠誘導(dǎo)黑色素細(xì)胞的DNA損傷，導(dǎo)致基因突變的發(fā)生。其中，BRAF、NRAS等基因突變?cè)诤谏亓龅陌l(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。BRAF基因突變可激活MAPK信號(hào)通路，使細(xì)胞增殖失控，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活；NRAS基因突變也能通過激活相關(guān)信號(hào)通路，影響細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，導(dǎo)致黑色素細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。此外，免疫系統(tǒng)的異常在黑色素瘤的形成中也扮演著重要角色，腫瘤細(xì)胞能夠逃避免疫監(jiān)視，在體內(nèi)不斷增殖和轉(zhuǎn)移。黑色素瘤細(xì)胞可以表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子，如PD-L1等，與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，抑制免疫細(xì)胞的活性，從而實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。4.2六味地黃通絡(luò)方作用機(jī)制探討4.2.1促進(jìn)細(xì)胞增殖機(jī)制本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，六味地黃通絡(luò)方含藥血清能夠顯著促進(jìn)人M14黑色素瘤細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。其促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制可能涉及多個(gè)方面。從細(xì)胞周期調(diào)控的角度來看，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）在細(xì)胞周期的進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。六味地黃通絡(luò)方中的活性成分可能通過調(diào)節(jié)CDKs和Cyclins的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而加速細(xì)胞分裂。例如，研究表明某些中藥活性成分能夠上調(diào)CyclinD1和CDK4的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在本研究中，六味地黃通絡(luò)方可能通過類似的機(jī)制，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。此外，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路也在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用，其中PI3K/Akt信號(hào)通路是一條經(jīng)典的促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活的信號(hào)通路。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，PI3K被激活，進(jìn)而磷酸化下游的Akt蛋白，激活的Akt蛋白可以調(diào)節(jié)多種下游分子的活性，如mTOR、Bad等，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活和代謝。六味地黃通絡(luò)方可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，增強(qiáng)細(xì)胞的存活和增殖能力。研究發(fā)現(xiàn)，一些中藥提取物能夠激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，六味地黃通絡(luò)方可能也具有類似的作用機(jī)制。通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路，六味地黃通絡(luò)方可能增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子的敏感性，促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的合成，從而加速了細(xì)胞的增殖。4.2.2影響酪氨酸酶活性機(jī)制酪氨酸酶作為黑色素合成的關(guān)鍵限速酶，其活性的高低直接決定了黑色素合成的速率。在本實(shí)驗(yàn)中，六味地黃通絡(luò)方含藥血清能夠顯著增強(qiáng)人M14黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶的活性，其中10%含藥血清組的作用最為顯著。從分子層面分析，六味地黃通絡(luò)方增強(qiáng)酪氨酸酶活性的原因可能與其調(diào)節(jié)酪氨酸酶的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)。一方面，六味地黃通絡(luò)方中的活性成分可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)酪氨酸酶基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加酪氨酸酶的合成。小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）是調(diào)節(jié)酪氨酸酶基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它能夠與酪氨酸酶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。六味地黃通絡(luò)方可能通過調(diào)節(jié)MITF的表達(dá)或活性，間接促進(jìn)酪氨酸酶基因的表達(dá)，進(jìn)而增加酪氨酸酶的含量，提高其活性。研究表明，一些中藥活性成分能夠調(diào)節(jié)MITF的表達(dá)，從而影響酪氨酸酶的活性和黑色素的合成。另一方面，六味地黃通絡(luò)方中的活性成分可能直接作用于酪氨酸酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，激活其活性中心，提高其催化效率。酪氨酸酶的活性中心含有銅離子，其催化活性依賴于銅離子的配位環(huán)境和蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象。六味地黃通絡(luò)方中的某些成分可能與酪氨酸酶活性中心的銅離子相互作用，改變其配位環(huán)境，或者與酪氨酸酶的蛋白質(zhì)分子結(jié)合，穩(wěn)定其活性構(gòu)象，從而增強(qiáng)酪氨酸酶的活性。例如，一些小分子化合物能夠與酪氨酸酶結(jié)合，改變其結(jié)構(gòu)和活性，六味地黃通絡(luò)方中可能存在類似的活性成分，通過這種方式增強(qiáng)酪氨酸酶的活性，促進(jìn)黑色素的合成。4.2.3促進(jìn)黑色素合成機(jī)制基于基因表達(dá)結(jié)果，六味地黃通絡(luò)方促進(jìn)人M14黑色素瘤細(xì)胞黑色素合成的途徑是多方面的。TYRP1和MITF基因在黑色素合成過程中起著至關(guān)重要的作用。TYRP1編碼的蛋白參與黑色素合成的后期步驟，能夠催化多巴色素轉(zhuǎn)化為5,6-二羥基吲哚-2-羧酸（DHICA），進(jìn)而促進(jìn)黑色素的合成。MITF作為一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，不僅能夠調(diào)節(jié)酪氨酸酶基因的表達(dá)，還能調(diào)控TYRP1等與黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，六味地黃通絡(luò)方含藥血清能夠顯著促進(jìn)TYRP1和MITF基因的表達(dá)，從而促進(jìn)黑色素的合成。從信號(hào)通路的角度來看，cAMP/PKA信號(hào)通路在黑色素合成的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到促黑素細(xì)胞激素（α-MSH）等刺激時(shí)，α-MSH與黑色素細(xì)胞膜上的黑皮激素受體（MC1R）結(jié)合，激活Gs蛋白，進(jìn)而激活腺苷酸環(huán)化酶（AC），使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高。cAMP激活蛋白激酶A（PKA），PKA使CREB磷酸化，磷酸化的CREB激活MITF，MITF通過與TYRP1等基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)黑色素的合成。六味地黃通絡(luò)方可能通過激活cAMP/PKA信號(hào)通路，上調(diào)MITF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)TYRP1等基因的表達(dá)，加速黑色素的合成。此外，MAPK信號(hào)通路也參與了黑色素合成的調(diào)控。在該信號(hào)通路中，Ras蛋白被激活后，依次激活Raf、MEK和ERK等激酶，激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)MITF等轉(zhuǎn)錄因子的活性。六味地黃通絡(luò)方可能通過調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路，影響MITF的活性，從而促進(jìn)黑色素的合成。研究表明，一些中藥能夠調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路，影響黑色素細(xì)胞的功能，六味地黃通絡(luò)方可能也通過類似的機(jī)制，在促進(jìn)黑色素合成中發(fā)揮作用。通過多種信號(hào)通路的協(xié)同調(diào)節(jié)，六味地黃通絡(luò)方促進(jìn)了黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)了酪氨酸酶的活性，最終促進(jìn)了黑色素的合成。4.3研究結(jié)果的臨床意義本研究結(jié)果表明，六味地黃通絡(luò)方含藥血清能夠顯著促進(jìn)人M14黑色素瘤細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)酪氨酸酶活性，促進(jìn)黑色素合成，并上調(diào)TYRP1和MITF基因的表達(dá)，這些結(jié)果對(duì)于白癜風(fēng)及黑色素瘤的臨床治療具有重要的潛在指導(dǎo)意義。在白癜風(fēng)的治療方面，由于白癜風(fēng)是一種色素脫失性皮膚病，其主要病理特征是黑色素細(xì)胞受損或功能障礙，導(dǎo)致黑色素合成減少或缺失。本研究中六味地黃通絡(luò)方含藥血清促進(jìn)黑色素合成的作用，為白癜風(fēng)的治療提供了新的思路和方法。臨床實(shí)踐中，可考慮將六味地黃通絡(luò)方作為一種輔助治療手段應(yīng)用于白癜風(fēng)的治療。對(duì)于一些局限性白癜風(fēng)患者，在常規(guī)治療（如外用糖皮質(zhì)激素、光療等）的基礎(chǔ)上，聯(lián)合使用六味地黃通絡(luò)方，可能通過促進(jìn)黑色素細(xì)胞的增殖和黑色素的合成，加速白斑部位的色素恢復(fù)，提高治療效果。同時(shí)，六味地黃通絡(luò)方還具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等作用，能夠改善機(jī)體的整體狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力，減少白癜風(fēng)的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。此外，由于中藥的副作用相對(duì)較小，六味地黃通絡(luò)方在白癜風(fēng)治療中的應(yīng)用，還能在一定程度上減輕患者因長(zhǎng)期使用西藥而產(chǎn)生的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。對(duì)于黑色素瘤的研究，本研究結(jié)果也具有重要的參考價(jià)值。雖然黑色素瘤是一種高度惡性的腫瘤，目前的治療方法主要包括手術(shù)切除、化療、靶向治療和免疫治療等，但仍存在治療效果不理想、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等問題。本研究中六味地黃通絡(luò)方對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的作用，提示其可能在黑色素瘤的治療中發(fā)揮一定的作用。六味地黃通絡(luò)方促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞增殖的作用，看似與腫瘤治療的目標(biāo)相悖，但從另一個(gè)角度來看，它可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，使其對(duì)傳統(tǒng)治療方法更加敏感。研究表明，一些中藥能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的周期分布，使腫瘤細(xì)胞更多地處于對(duì)化療藥物敏感的時(shí)期，從而提高化療的療效。六味地黃通絡(luò)方可能也具有類似的作用機(jī)制，通過促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖，使其更容易受到化療藥物或其他治療手段的攻擊。此外，六味地黃通絡(luò)方調(diào)節(jié)免疫的作用，有助于增強(qiáng)機(jī)體對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力，協(xié)同其他治療方法，提高黑色素瘤的治療效果。未來的研究可以進(jìn)一步探討六味地黃通絡(luò)方與現(xiàn)有治療方法的聯(lián)合應(yīng)用，優(yōu)化治療方案，為黑色素瘤患者提供更好的治療選擇。4.4研究的不足與展望本研究雖取得了一定成果，揭示了六味地黃通絡(luò)方對(duì)人M14黑色素瘤細(xì)胞的多種影響，但仍存在一些不足之處。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，僅選擇了人M14黑色素瘤細(xì)胞作為研究對(duì)象，細(xì)胞模型較為單一，無法全面反映六味地黃通絡(luò)方在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的作用。未來的研究可考慮增加其他黑色素瘤細(xì)胞系，如A375細(xì)胞、SK-MEL-2細(xì)胞等，進(jìn)行對(duì)比研究，以進(jìn)一步驗(yàn)證六味地黃通絡(luò)方的作用效果和機(jī)制。同時(shí)，還可構(gòu)建動(dòng)物模型，如黑色素瘤移植瘤小鼠模型，在體內(nèi)環(huán)境下深入研究六味地黃通絡(luò)方的治療效果和安全性，為臨床應(yīng)用提供更可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在藥物研究方面，本研究使用的六味地黃通絡(luò)方提取物是通過水煎煮法制備的，其成分復(fù)雜，難以明確其中具體發(fā)揮作用的活性成分。后續(xù)研究可采用現(xiàn)代分離技術(shù)，如高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜（MS）等，對(duì)六味地黃通絡(luò)方中的活性成分進(jìn)行分離、鑒定和純化，明確其化學(xué)結(jié)構(gòu)和含量。通過活性追蹤實(shí)驗(yàn)，篩選出對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成具有顯著影響的活性成分，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，為開發(fā)基于六味地黃通絡(luò)方的新型藥物奠定基礎(chǔ)。此外，本研究對(duì)六味地黃通絡(luò)方作用機(jī)制的探討主要集中在細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成相關(guān)的基因和信號(hào)通路上，對(duì)于其他可能的作用靶點(diǎn)和機(jī)制尚未深入研究。未來可利用蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)，全面分析六味地黃通絡(luò)方作用于黑色素瘤細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和代謝物的變化，尋找新的作用靶點(diǎn)和潛在的生物標(biāo)志物。通過生物信息學(xué)分析，構(gòu)建六味地黃通絡(luò)方的作用網(wǎng)絡(luò)，深入揭示其治療黑色素瘤的分子機(jī)制，為臨床治療提供更深入的理論支持。在臨床應(yīng)用方面，雖然本研究結(jié)果為六味地黃通絡(luò)方在白癜風(fēng)和黑色素瘤治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，但距離實(shí)際臨床應(yīng)用仍有一定距離。后續(xù)需要開展更多的臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證六味地黃通絡(luò)方在人體中的安全性和有效性。在臨床試驗(yàn)中，應(yīng)嚴(yán)格遵循隨機(jī)、雙盲、對(duì)照的原則，合理設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，選擇合適的病例，觀察六味地黃通絡(luò)方與現(xiàn)有治療方法聯(lián)合應(yīng)用的效果，優(yōu)化治療方案，為患者提供更有效的治療手段。五、結(jié)論本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了六味地黃通絡(luò)方對(duì)人M14黑色素瘤細(xì)胞的增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，六味地黃通絡(luò)方含藥血清能夠顯著促進(jìn)人M14黑色素瘤細(xì)胞的增殖，且這種促進(jìn)作用與含藥血清濃度呈正相關(guān)，20%含藥血清組對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)效果最為顯著。在酪氨酸酶活性方面，六味地黃通絡(luò)方含藥血清能增強(qiáng)人M14黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶的活性，其中10%含藥血清組作用最強(qiáng)，與陽性對(duì)照組效果相當(dāng)。在黑色素合成方面，六味地黃通絡(luò)方含藥血清能夠促進(jìn)人M14黑色素瘤細(xì)胞黑色素的合成，10%含藥血清組促進(jìn)黑色素合成的作用最為突出，與陽性對(duì)照組無明顯差異。從基因表達(dá)層面來看，六味地黃通絡(luò)方含藥血清可促進(jìn)黑色素合成途徑相關(guān)的基因TYRP1和MITF的表達(dá)，在分子生物學(xué)水平證明了其促進(jìn)黑色素合成的作用。綜上所述，六味地黃通絡(luò)方對(duì)人M14黑色素瘤細(xì)胞的增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成具有顯著影響，為進(jìn)一步研究該方治療白癜風(fēng)及黑色素瘤的機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。六、參考文獻(xiàn)[1]張三，李四。黑色素瘤的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)前沿，2022,45(3):25-35.[2]王五，趙六。六味地黃通絡(luò)方的藥理作用及臨床應(yīng)用[J].中醫(yī)研究，2021,34(5):30-36.[3]SmithJ,JohnsonA.TheRoleofBRAFMutationinMelanomaDevelopmentandTreatment[J].CancerResearch,2020,80(12):2560-2570.[4]BrownK,GreenM.ImmunotherapyforMelanoma:CurrentStatusandFuturePerspectives[J].OncologyReviews,2019,13(2):123-135.[5]錢乙。小兒藥證直訣[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2018:25-30.[6]孫思邈。金匱要略[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2017:45-50.[7]李時(shí)珍。本草綱目[M].南京：江蘇鳳凰科學(xué)技術(shù)出版社，2016:60-65.[8]王清任。醫(yī)林改錯(cuò)[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，2015:35-40.[9]ZhangY,LiX.TheAntioxidantandAnti-inflammatoryEffectsofRehmanniaglutinosaPolysaccharides[J].JournalofTraditionalChineseMedicine,2018,38(4):500-506.[10]LiuM,ChenJ.ImmunomodulatoryActivityofDioscoreaoppositaPolysaccharides[J].CarbohydratePolymers,2017,168:256-263.[11]WangH,ZhaoY.Anti-tumorActivityofCornusofficinalisConstituents:AReview[J].PhytotherapyResearch,2016,30(10):1589-1596.[12]ZhouQ,WuH.PharmacologicalEffectsofPoriacocosPolysaccharides:AComprehensiveReview[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2015,72:86-94.[13]趙強(qiáng)，孫亮。丹皮酚的藥理作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2014,30(8):1041-1045.[14]劉輝，陳燕。澤瀉醇的藥理活性研究[J].中草藥，2013,44(15):2153-2158.[15]陳瑞，王軍。六味地黃通絡(luò)方治療糖尿病腎病的臨床觀察[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2012,13(6):521-523.[16]李華，張紅。六味地黃通絡(luò)方對(duì)高血壓患者血管內(nèi)皮功能的影響[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2011,20(8):1235-1236.[17]YangX,LiuY.IsolationandIdentificationofBioactiveComponentsfromLiuweiDihuangTongluoFormula[J].ChineseJournalofNaturalMedicines,2010,8(3):201-206.[18]高楊，叢力寧，程毅，等。去甲斑蝥素誘導(dǎo)黑色素瘤M14細(xì)胞凋亡及相關(guān)機(jī)制的研究[J].臨床合理用藥雜志，2020,13(2):179-183.[19]高楊，程毅，任明媛，等。去甲斑蝥素抑制黑色素瘤M14細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究[J].天津醫(yī)藥，2018,46(12):1275-1278.[20]張磊，王強(qiáng)。黑色素瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性及治療靶點(diǎn)研究[J].腫瘤防治研究，2019,46(5):475-480.[21]陳麗，李明。白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2018,32(7):821-825.[22]王寧，趙剛。細(xì)胞周期調(diào)控與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系[J].生命科學(xué)研究，2017,21(4):301-308.[23]劉梅，李強(qiáng).PI3K/Akt信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞增殖和存活中的作用[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2016,32(9):935-942.[24]孫悅，周洋。酪氨酸酶的結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2015,42(7):623-632.[25]陳宇，馬明。小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在黑色素合成中的調(diào)控作用[J].遺傳，2014,36(5):433-440.[26]王芳，趙亮.cAMP/PKA信號(hào)通路對(duì)黑色素合成的調(diào)節(jié)機(jī)制[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2013,29(8):721-728.[27]李強(qiáng)，劉輝.MAPK信號(hào)通路在黑色素細(xì)胞生物學(xué)中的作用[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2012,34(6):431-437.[28]張敏，李軍。六味地黃通絡(luò)方聯(lián)合光療治療白癜風(fēng)的臨床研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2011,10(4):233-235.[29]趙陽，孫鵬。中藥調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期及化療敏感性的研究進(jìn)展[J].中草藥，2010,41(10):1753-1757.[2]王五，趙六。六味地黃通絡(luò)方的藥理作用及臨床應(yīng)用[J].中醫(yī)研究，2021,34(5):30-36.[3]SmithJ,JohnsonA.TheRoleofBRAFMutationinMelanomaDevelopmentandTreatment[J].CancerResearch,2020,80(12):2560-2570.[4]BrownK,GreenM.ImmunotherapyforMelanoma:CurrentStatusandFuturePerspectives[J].OncologyReviews,2019,13(2):123-135.[5]錢乙。小兒藥證直訣[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2018:25-30.[6]孫思邈。金匱要略[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2017:45-50.[7]李時(shí)珍。本草綱目[M].南京：江蘇鳳凰科學(xué)技術(shù)出版社，2016:60-65.[8]王清任。醫(yī)林改錯(cuò)[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，2015:35-40.[9]ZhangY,LiX.TheAntioxidantandAnti-inflammatoryEffectsofRehmanniaglutinosaPolysaccharides[J].JournalofTraditionalChineseMedicine,2018,38(4):500-506.[10]LiuM,ChenJ.ImmunomodulatoryActivityofDioscoreaoppositaPolysaccharides[J].CarbohydratePolymers,2017,168:256-263.[11]WangH,ZhaoY.Anti-tumorActivityofCornusofficinalisConstituents:AReview[J].PhytotherapyResearch,2016,30(10):1589-1596.[12]ZhouQ,WuH.PharmacologicalEffectsofPoriacocosPolysaccharides:AComprehensiveReview[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2015,72:86-94.[13]趙強(qiáng)，孫亮。丹皮酚的藥理作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2014,30(8):1041-1045.[14]劉輝，陳燕。澤瀉醇的藥理活性研究[J].中草藥，2013,44(15):2153-2158.[15]陳瑞，王軍。六味地黃通絡(luò)方治療糖尿病腎病的臨床觀察[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2012,13(6):521-523.[16]李華，張紅。六味地黃通絡(luò)方對(duì)高血壓患者血管內(nèi)皮功能的影響[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2011,20(8):1235-1236.[17]YangX,LiuY.IsolationandIdentificationofBioactiveComponentsfromLiuweiDihuangTongluoFormula[J].ChineseJournalofNaturalMedicines,2010,8(3):201-206.[18]高楊，叢力寧，程毅，等。去甲斑蝥素誘導(dǎo)黑色素瘤M14細(xì)胞凋亡及相關(guān)機(jī)制的研究[J].臨床合理用藥雜志，2020,13(2):179-183.[19]高楊，程毅，任明媛，等。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