選擇性必修三《生物技術(shù)與工程》第3章

基因工程

第2節(jié)

基因工程的基本操作程序1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟(jì)效益450億元。培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟?情境導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因抗蟲棉思考轉(zhuǎn)基因抗蟲棉目錄課堂小結(jié)探究新知04情境導(dǎo)入030201課堂練習(xí)一.目的基因的篩選與獲取二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建三.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四.目的基因的檢測與鑒定五.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定

從社會中來蘇云金桿菌

普通棉花（無抗蟲特性）

棉花細(xì)胞抗蟲棉提取表達(dá)Bt基因?qū)肱c載體拼接重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取（前提）2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（關(guān)鍵）4.目的基因的檢測與鑒定Bt基因培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程5在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)

產(chǎn)物等的基因。主要指的是編碼蛋白質(zhì)的基因。1.目的基因：一、目的基因的篩選和獲取如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因?？茖W(xué)家將“殺蟲基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。目的基因DNA片段

基因1基因2基因3補(bǔ)充知識：真核生物基因的結(jié)構(gòu)（基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子放大（1）非編碼區(qū)：位于編碼區(qū)上游與編碼區(qū)下游，不能轉(zhuǎn)錄

為相應(yīng)的mRNA,

不能編碼蛋白質(zhì)。（2）編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步編碼蛋白質(zhì)的合成。啟動子：RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄起始的信號。終止子：終止RNA的合成一、目的基因的篩選和獲取第一步：目的基因的篩選與獲取非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子內(nèi)含子外顯子轉(zhuǎn)錄前體mRNA成熟mRNA剪切、拼接不能編碼蛋白質(zhì)的序列=內(nèi)含子+非編碼區(qū)序列編碼序列=外顯子DNA片段基因1基因2基因3放大（1）外顯子：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。（2）內(nèi)含子：：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，但不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。一、目的基因的篩選和獲取補(bǔ)充知識：原核生物基因的結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子：RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)終止子：終止轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄mRNA原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是

的編碼區(qū)是間隔的、

的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的

和具有調(diào)控作用的

區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼一、目的基因的篩選和獲取901掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物--Bt抗蟲蛋白在起作用。用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑，廣泛用于防治棉花蟲害已有多年歷史。蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)2.目的基因的篩選(1)較為有效的方法：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選。一、目的基因的篩選和獲取01DNA測序儀

明確了目的基因后，該怎么獲得它?序列數(shù)據(jù)庫（如GenBank）核苷酸序列比對氨基酸序列比對序列比對工具（如BLAST）(2)認(rèn)識基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法：一、目的基因的篩選和獲取01（1）人工合成3.目的基因的獲取在我國首批具有較高抗蟲活性的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育過程中，科學(xué)家采用的是人工合成的方法。前提：方法：基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成DNA合成儀轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一、目的基因的篩選和獲取01蘇云金桿菌Bt基因？快速獲得大量Bt基因PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理：DNA半保留復(fù)制，即在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。提?。?）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎。一、目的基因的篩選和獲取【重溫】DNA體內(nèi)復(fù)制的過程及條件合成子鏈解旋形成新DNA條件在DNA復(fù)制中的作用DNA母鏈4種脫氧核苷酸解旋酶DNA聚合酶引物提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸一、目的基因的篩選和獲取

1.PCR的進(jìn)行需要的條件體內(nèi)DNA復(fù)制參與的組分PCR中參與的組分解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常為小的單鏈RNA）無需解旋酶，用高溫代替DNA（目的基因）模板4種脫氧核苷酸（dNTP)耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常為小的單鏈DNA至少需要2種引物）反應(yīng)還需要其它條件，如控溫系統(tǒng)、緩沖液（一般添加Mg2+）---能夠調(diào)節(jié)PH，激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶。一、目的基因的篩選和獲取ATCGAATCGGTT

TACCTTAGCCAADNA聚合酶引物3′3′5′5′2.DNA復(fù)制過程需要引物的原因：拓展：引物1.定義：引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸。（長度通常為20-30個核苷酸）。母鏈DNA子鏈DNA引物可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈·細(xì)胞內(nèi)通常以RNA單鏈為引物·細(xì)胞外（PCR）一般以DNA單鏈為引物①DNA聚合酶不能從頭合成子鏈。②使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸DNA復(fù)制時，子鏈延伸的方向是從5’→3’端。一、目的基因的篩選和獲取脫氧腺苷三磷酸（dATP）腺嘌呤脫氧核苷酸

腺嘌呤脫氧核糖PPP~~OHH

在PCR過程中實(shí)際加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作原料，又能提供能量?！撗鹾塑杖姿嵋坏谝徊剑耗客卣梗篸NTP一、目的基因的篩選和獲取微量離心管緩沖液

PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行。真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2+。DNA模板四種脫氧核苷酸(dNTP)引物分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）一、目的基因的篩選和獲取2.PCR反應(yīng)過程：01耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）4種脫氧核苷酸（DNTP）引物待擴(kuò)增的DNA片段（模板）5’5’變性復(fù)性延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。溫度上升72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在TaqDNA聚合酶作用下合成新DNA鏈。注意：復(fù)性溫度過高會破壞引物與模板堿基互補(bǔ)配對。過低，會造成引物與模板結(jié)合位點(diǎn)增加，導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增加。復(fù)性溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān)，當(dāng)長度相同，但G-C含量高，需更高溫度。一、目的基因的篩選和獲取2.PCR反應(yīng)過程：思考:PCR技術(shù)獲取目的基因時至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因？5’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’經(jīng)過3次，可以產(chǎn)生兩條單鏈等長的目的基因片段。一、目的基因的篩選和獲取復(fù)制次數(shù)123nDNA分子數(shù)

含引物的DNA分子數(shù)

DNA鏈數(shù)目共消耗引物的個數(shù)

含脫氧核苷酸鏈等長的DNA分子數(shù)

22204460881422n2n2n+1-22n-2n48162n+1一PCR擴(kuò)增DNA規(guī)律一、目的基因的篩選和獲取引物小結(jié)1、PCR擴(kuò)增時至少需要______種引物.22、PCR擴(kuò)增的前提是：根據(jù)一段已知目的基因兩端的核苷酸序列合成引物3、設(shè)計引物時必須依據(jù)：目的基因兩端的核苷酸序列4、設(shè)計引物的要求：（或引物失效的原因）①同種引物之間不能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，原因是：______________________________②2種引物之間不能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，原因是：______________________________。防止引物自身折疊防止引物之間配對，導(dǎo)致引物不能與模板鏈結(jié)合可以在引物的5’端添加不同限制酶識別序列，保證目的基因與載體鏈接一、目的基因的篩選和獲取思考：1.用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。1.逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；3.以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA一、目的基因的篩選和獲取2301瓊脂糖凝膠電泳

DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就叫電泳。思考：2.如何對產(chǎn)物進(jìn)行鑒定？一、目的基因的篩選和獲取01（3）從基因文庫中獲取將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫?；蛭膸斓姆N類基因組文庫部分基因文庫含有一種生物所有基因的文庫只含有一種生物部分基因的文庫（如：cDNA文庫）互補(bǔ)DNA3.目的基因的獲取一、目的基因的篩選和獲取2502目的：確?；蛟谑荏w細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。

獲得了足量的Bt基因后，是否能直接將Bt基因?qū)朊藁?xì)胞呢？思考：各個元件有什么作用？二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心步驟)26目的基因：能控制表達(dá)所需要的特殊性狀啟動子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。復(fù)制原點(diǎn)：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)終止子：位置：基因的下游功能：終止轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因：便于重組DNA分子的篩選和鑒定。注意：啟動子≠密碼子目的基因插入到啟動子和終止子之間二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心步驟)啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比項(xiàng)目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能DNADNAmRNAmRNARNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(編碼氨基酸)翻譯的結(jié)束信號(不編碼氨基酸)二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心步驟)5‘3‘3‘5‘Bt基因（目的基因）PCR（設(shè)計引物時，在5’端加上酶切位點(diǎn)）Bt基因EcoRⅠ酶切位點(diǎn)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心步驟)質(zhì)粒EcoRⅠ酶切位點(diǎn)DNA連接酶二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心步驟)重組DNA分子3002①

用一定的限制酶切割載體，使其出現(xiàn)一個切口。②

用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③

將切下的Bt基因片段拼接到載體的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子。載體基因表達(dá)載體二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心步驟)（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體時，能否用

Sma

Ⅰ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？不能；因?yàn)?/p>

SmaⅠ切割會破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因（抗生素抗性基因是質(zhì)粒上的標(biāo)記基因，若被破壞，無法進(jìn)一步篩選重組DNA分子）。質(zhì)?？股乜剐曰騍maⅠBamH

ⅠHind

ⅢEcoR

Ⅰ圖1EcoR

ⅠEcoR

Ⅰ目的基因BamH

ⅠHind

Ⅲ外源DNA圖2二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心步驟)（2）若只用

EcoRⅠ限制酶切質(zhì)粒和外源DNA，則構(gòu)建基因表達(dá)載體時會出現(xiàn)哪些結(jié)果？質(zhì)粒自身環(huán)化正向連接反向連接目的基因多拷貝與質(zhì)粒連接質(zhì)粒抗生素抗性基因SmaⅠBamH

ⅠHind

ⅢEcoR

Ⅰ圖1EcoR

ⅠEcoR

Ⅰ目的基因BamH

ⅠHind

Ⅲ外源DNA圖2二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心步驟)（3）為避免出現(xiàn)上述情況可以選擇什么限制酶對質(zhì)粒和外源DNA進(jìn)行切割？使用

BamHⅠ和

HindⅢ兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA。質(zhì)?？股乜剐曰騍maⅠBamH

ⅠHind

ⅢEcoR

Ⅰ圖1EcoR

ⅠEcoR

Ⅰ目的基因BamH

ⅠHind

Ⅲ外源DNA圖2優(yōu)點(diǎn)：①避免質(zhì)粒自身環(huán)化；②有利于載體與目的基因正向連接，避免反向連接。雙酶切法二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心步驟)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法，因?yàn)槭荏w細(xì)胞的不同而有所區(qū)別。

導(dǎo)入方法：導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞顯微注射法Ca2+處理法三.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞花粉管通道法（我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）3503（1）花粉管通道法（我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）②在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。目的基因目的基因適用生物：開花植物1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞三.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞3603（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞

轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。

實(shí)質(zhì)是基因重組。轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。（可轉(zhuǎn)移的DNA）三.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞3703（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法目的基因Ti質(zhì)粒表達(dá)載體農(nóng)桿菌植物細(xì)胞植物細(xì)胞染色體DNA新性狀植株構(gòu)建轉(zhuǎn)入導(dǎo)入插入表達(dá)1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞三.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞032.目的基因?qū)雱游锛?xì)胞（1）常用方法：（2）受體細(xì)胞:顯微注射法受精卵①體積大，易操作。②易表現(xiàn)出全能性。（3)過程：構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動物三.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）常用方法：原核細(xì)胞（常選擇大腸桿菌）可使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。（2）受體細(xì)胞：繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對較少，易于培養(yǎng)。3.目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞03Ca2+感受態(tài)細(xì)胞吸收Ca2+處理大腸桿菌Ca2+表達(dá)載體▲

Ca2+處理法示意圖三.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要進(jìn)一步加工。04思考：結(jié)合基因表達(dá)的過程，推測可以從哪些方面進(jìn)行檢測與鑒定？Bt基因mRNABt抗蟲蛋白抗蟲棉PCR等技術(shù)檢測抗原—抗體雜交技術(shù)分子水平抗蟲鑒定（個體水平）四.目的基因的檢測與鑒定1.分子水平的檢測（1）檢測目的基因是否導(dǎo)入——

通過PCR等技術(shù)檢測如：檢測棉花的染色體DNA上是否插入了

Bt

基因提取DNA轉(zhuǎn)基因棉花PCR是否擴(kuò)增出目的基因利用

Bt基因的核苷酸序列設(shè)計引物M：marker1-6：轉(zhuǎn)基因棉花7：非轉(zhuǎn)基因棉花8：陰性對照電泳四.目的基因的檢測與鑒定1.分子水平的檢測（2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄——通過PCR等技術(shù)檢測如：檢測

Bt

基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA提取棉花細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA用以

Bt

基因序列設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增電泳檢測BtM3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010個PCR陽性棉花植株中，有四株

Bt基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄四.目的基因的檢測與鑒定43041.原因：帶標(biāo)記的基因探針，與目的基因DNA單鏈在一定條件互補(bǔ)配對，結(jié)合成雙鏈，從而出現(xiàn)雜交帶。利用基因探針來檢測目的基因是否導(dǎo)入或者轉(zhuǎn)錄DNA分子雜交技術(shù)四.目的基因的檢測與鑒定2.原理：堿基互補(bǔ)配對原則1.分子水平的檢測（3）檢測目的基因是否翻譯——通過抗原-抗體雜交檢測如：檢測

Bt

基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白蘇云金桿菌提取Bt毒蛋白注射抗體標(biāo)記抗體轉(zhuǎn)基因棉花提取蛋白電泳分離抗原-抗體雜交四.目的基因的檢測與鑒定1.實(shí)驗(yàn)原理：（1）DNA片段的擴(kuò)增PCR利用了

DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。一次PCR一般要經(jīng)歷

30次循環(huán)。（2）DNA片段的電泳鑒定DNA在一定的pH下會帶上電荷，帶電的DNA會在電場的作用下向所帶電荷相反的電極移動，即電泳。PCR產(chǎn)物一般用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其在凝膠中的遷移速率與凝膠濃度、DNA分子大小和構(gòu)象（如鏈狀和環(huán)狀）等有關(guān)。凝膠中的DNA通過染色，可在

300nm紫外燈下被檢測出來。五.DNA片段的擴(kuò)增及電泳（1）儀器（2）材料PCR儀、微量離心管、微量移液器、一次性吸液槍頭、電泳裝置（包括電泳儀電泳槽等）4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物、DNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等PCR儀微量離心管微量移液器電泳裝置2.材料用具五.DNA片段的擴(kuò)增及電泳PCR反應(yīng)體系的配方10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5ul20mmol/l的4種脫氧核苷酸的等量混合液1ul20umol/l的引物I2.5ul20umol/l的引物II2.5ulH2O28-33ul1-5U/ul的TaqDNA聚合酶1-2U模板DNA5-10ul總體積50ul2.材料用具五.DNA片段的擴(kuò)增及電泳3.實(shí)驗(yàn)步驟（PCR）用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量移液管中依次加入各組分。待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部。參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。移液離心擴(kuò)增五.DNA片段的擴(kuò)增及電泳Ⅰ.預(yù)變性的目的？Ⅱ.最后一個循環(huán)結(jié)束后通常還需在72℃維持幾分鐘，目的是？使子鏈充分延伸使模板DNA充分變性4、實(shí)驗(yàn)步驟（電泳鑒定）根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。配制瓊脂糖溶液制備凝膠五.DNA片段的擴(kuò)增及電泳將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）。加樣電泳、觀察接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。4、實(shí)驗(yàn)步驟（電泳鑒定）五.DNA片段的擴(kuò)增及電泳1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進(jìn)行操作時，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。五.DNA片段的擴(kuò)增及電泳注意：5.結(jié)果分析與評價：（1）你是否成功擴(kuò)增出DNA片段的斷依據(jù)是什么？在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及粗細(xì)程度（條帶的分布代表擴(kuò)增產(chǎn)物的類型；條帶的粗細(xì)代表擴(kuò)增產(chǎn)物量的多少）。（2）通過電泳條帶能否確定擴(kuò)增產(chǎn)物一定是所需的DNA片段？為什么不能；因?yàn)殡娪緱l帶僅能顯示擴(kuò)增片段的大致長度，不能顯示精準(zhǔn)的DNA堿基數(shù)量，也不能呈現(xiàn)堿基序列。五.DNA片段的擴(kuò)增及電泳

（1）未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的主要原因①TaqDNA聚合酶失活。②引物出現(xiàn)質(zhì)量問題。③Mg2＋濃度過低。④變性時的溫度低，變性時間短。（2）出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶的主要原因①模板DNA出現(xiàn)污染。②引物特異性不強(qiáng)或形成引物二聚體。③Mg2＋濃度過高。

④復(fù)性時的溫度過低等。五.DNA片段的擴(kuò)增及電泳關(guān)鍵點(diǎn)撥：課堂小結(jié)1.基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建，下列關(guān)于基因表達(dá)載體的敘述，正確的是(

)A．基因表達(dá)載體上需要有啟動子，啟動子就是轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)B．終止子位于RNA上，是轉(zhuǎn)錄結(jié)束的信號C．切割目的基因和載體的酶必須是同一種限制酶D．一般還需要對重組成功的DNA分子進(jìn)行篩選A

課堂練習(xí)A

DNA切割目的基因和載體的酶可以是不同的限制酶，但是要產(chǎn)生相同的黏性末端一般不需要對重組成功的DNA分子進(jìn)行篩選，而是將重組成功的DNA分