具胃毒活性球孢白僵菌工程菌劑防治甘藍(lán)害蟲的效能與安全評估一、引言1.1研究背景甘藍(lán)（BrassicaoleraceaL.）作為十字花科蕓薹屬的重要蔬菜作物，在全球范圍內(nèi)廣泛種植。其富含多種維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維，深受消費(fèi)者喜愛，對保障蔬菜市場供應(yīng)和滿足人們營養(yǎng)需求具有重要意義。在中國，甘藍(lán)種植歷史悠久，地域分布廣泛，從北方的寒冷地區(qū)到南方的溫暖地帶，都有大面積的種植區(qū)域。隨著種植技術(shù)的不斷發(fā)展和市場需求的持續(xù)增長，甘藍(lán)的種植面積和產(chǎn)量呈逐年上升趨勢。然而，在甘藍(lán)的生長過程中，蟲害問題始終是制約其產(chǎn)量和品質(zhì)提升的關(guān)鍵因素之一。小菜蛾、菜青蟲、蚜蟲等害蟲種類繁多，它們通過取食甘藍(lán)葉片、吸食汁液等方式，對甘藍(lán)植株造成嚴(yán)重?fù)p害。小菜蛾的幼蟲會在葉片上形成透明的取食斑，隨著蟲齡的增長，葉片被啃食得千瘡百孔，嚴(yán)重影響光合作用；菜青蟲食量較大，會將葉片咬成大的孔洞或缺刻，甚至吃光葉片，導(dǎo)致甘藍(lán)生長受阻；蚜蟲則聚集在葉片背面和嫩莖上吸食汁液，使葉片卷曲、發(fā)黃，同時還會傳播病毒病，進(jìn)一步加重危害。據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計，在未采取有效防治措施的情況下，蟲害可導(dǎo)致甘藍(lán)減產(chǎn)30%-50%，嚴(yán)重時甚至絕收。為了控制甘藍(lán)蟲害，化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用?；瘜W(xué)農(nóng)藥具有高效、快速的特點(diǎn)，在短時間內(nèi)能夠有效降低害蟲種群數(shù)量，保障作物產(chǎn)量。然而，長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥也帶來了一系列嚴(yán)重的弊端。一方面，化學(xué)農(nóng)藥的殘留問題對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全構(gòu)成了巨大威脅。殘留的農(nóng)藥可能會在甘藍(lán)體內(nèi)積累，消費(fèi)者食用后，這些農(nóng)藥殘留會對人體健康產(chǎn)生潛在危害，如引發(fā)中毒、過敏反應(yīng)，長期積累還可能導(dǎo)致慢性疾病的發(fā)生。另一方面，化學(xué)農(nóng)藥的使用對生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重破壞。它會殺死害蟲的天敵，破壞生態(tài)平衡，導(dǎo)致次要害蟲的爆發(fā)；同時，農(nóng)藥還可能通過土壤、水體等途徑進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)，對非靶標(biāo)生物產(chǎn)生毒性影響，污染土壤和水源，影響整個生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性。隨著人們對食品安全和環(huán)境保護(hù)意識的不斷提高，綠色、可持續(xù)的農(nóng)業(yè)發(fā)展理念逐漸深入人心。在這樣的背景下，生物防治作為一種環(huán)境友好型的害蟲防治策略，受到了廣泛關(guān)注。球孢白僵菌（Beauveriabassiana）作為一種重要的昆蟲病原真菌，在生物防治領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。它具有殺蟲譜廣、致病性強(qiáng)、對環(huán)境和非靶標(biāo)生物安全等優(yōu)點(diǎn)，能夠侵染包括鱗翅目、雙翅目、同翅目等多個目的700多種昆蟲，對甘藍(lán)常見害蟲小菜蛾、菜青蟲等具有良好的防治效果。球孢白僵菌的殺蟲機(jī)制主要是通過分生孢子附著在害蟲體表，在適宜的條件下萌發(fā)并侵入蟲體，隨后在蟲體內(nèi)生長繁殖，分泌毒素，破壞害蟲的生理機(jī)能，最終導(dǎo)致害蟲死亡。與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相比，球孢白僵菌不僅能夠有效控制害蟲，還能減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，降低農(nóng)藥殘留，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。同時，球孢白僵菌在自然界中廣泛存在，易于培養(yǎng)和生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。為了進(jìn)一步提高球孢白僵菌的殺蟲活性和防治效果，利用現(xiàn)代生物技術(shù)構(gòu)建具胃毒殺蟲活性的球孢白僵菌工程菌劑成為研究熱點(diǎn)。通過基因工程手段，將具有胃毒活性的基因?qū)肭蜴甙捉┚?，使其在害蟲體內(nèi)產(chǎn)生更強(qiáng)的毒性作用，從而增強(qiáng)對害蟲的防治效果。這種新型的工程菌劑在室內(nèi)試驗中已表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢，然而，其在田間實際應(yīng)用中的整季防效和安全性仍有待深入研究和驗證。因此，開展具胃毒殺蟲活性的球孢白僵菌工程菌劑對甘藍(lán)害蟲的整季田間防效和安全性評價研究具有重要的理論和實踐意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1球孢白僵菌研究進(jìn)展球孢白僵菌作為一種重要的昆蟲病原真菌，在國內(nèi)外均受到廣泛關(guān)注。國外對球孢白僵菌的研究起步較早，在其生物學(xué)特性、致病機(jī)理等方面取得了諸多成果。研究明確了球孢白僵菌侵染寄主昆蟲的過程，從分生孢子附著在昆蟲體表，到萌發(fā)形成芽管穿透體壁，再到在蟲體內(nèi)生長繁殖并產(chǎn)生毒素，最終導(dǎo)致昆蟲死亡。例如，在對蝗蟲的研究中發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌能夠在蝗蟲體表迅速萌發(fā)，通過分泌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等降解蝗蟲的表皮，進(jìn)而侵入體內(nèi)，破壞其生理機(jī)能。在對球孢白僵菌的分子生物學(xué)研究方面，國外也有深入的探索，克隆出了多個與致病相關(guān)的基因，如編碼毒素的基因等，為進(jìn)一步了解其致病機(jī)制提供了分子層面的依據(jù)。國內(nèi)對球孢白僵菌的研究也在不斷深入和拓展。在菌種篩選方面，科研人員從不同生態(tài)環(huán)境中分離篩選出了大量的球孢白僵菌菌株，并對其生物學(xué)特性、毒力等進(jìn)行了詳細(xì)測定，篩選出了一些對特定害蟲具有高毒力的優(yōu)良菌株。在制劑研發(fā)方面，國內(nèi)也取得了一定的進(jìn)展，開發(fā)出了多種劑型的球孢白僵菌制劑，如粉劑、可濕性粉劑、油劑等，以滿足不同的應(yīng)用場景和需求。例如，有研究將球孢白僵菌制成油劑，提高了其在田間的穩(wěn)定性和持效性，增強(qiáng)了對害蟲的防治效果。同時，國內(nèi)還開展了球孢白僵菌與其他生物防治因子的協(xié)同作用研究，探索將其與天敵昆蟲、其他微生物等聯(lián)合使用，以提高整體的防治效果。1.2.2球孢白僵菌工程菌劑研究現(xiàn)狀隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建具胃毒殺蟲活性的球孢白僵菌工程菌劑成為研究熱點(diǎn)。國外在這方面的研究處于領(lǐng)先地位，已經(jīng)成功將多種具有胃毒活性的基因?qū)肭蜴甙捉┚?，如蘇云金芽孢桿菌的殺蟲晶體蛋白基因（Bt基因）等。通過導(dǎo)入這些基因，球孢白僵菌工程菌劑在室內(nèi)試驗中對害蟲的殺蟲活性得到了顯著提高，能夠更有效地控制害蟲種群數(shù)量。在對小菜蛾的室內(nèi)試驗中，導(dǎo)入Bt基因的球孢白僵菌工程菌劑的殺蟲效果比野生型球孢白僵菌提高了30%-50%。此外，國外還對球孢白僵菌工程菌劑的安全性進(jìn)行了深入評估，包括對非靶標(biāo)生物的影響、在環(huán)境中的殘留和降解等方面的研究。國內(nèi)在球孢白僵菌工程菌劑的研究方面也取得了一定的成果?？蒲腥藛T通過優(yōu)化基因?qū)爰夹g(shù)，提高了工程菌的構(gòu)建效率和穩(wěn)定性。同時，對工程菌劑的田間應(yīng)用效果進(jìn)行了初步探索，在一些小規(guī)模的田間試驗中，球孢白僵菌工程菌劑對甘藍(lán)害蟲表現(xiàn)出了較好的防治效果。有研究在甘藍(lán)田間試驗中發(fā)現(xiàn)，使用球孢白僵菌工程菌劑后，小菜蛾和菜青蟲的蟲口密度顯著降低，甘藍(lán)的受害程度明顯減輕。然而，國內(nèi)在球孢白僵菌工程菌劑的研究中，對于其整季田間防效和安全性評價還不夠系統(tǒng)和全面，需要進(jìn)一步深入研究。1.2.3傳統(tǒng)農(nóng)藥與生物菌劑防治效果對比研究在甘藍(lán)害蟲防治領(lǐng)域，傳統(tǒng)農(nóng)藥一直是主要的防治手段。傳統(tǒng)農(nóng)藥如有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類等，具有高效、快速的特點(diǎn)，能夠在短時間內(nèi)迅速降低害蟲種群數(shù)量。高效氯氰菊酯對甘藍(lán)害蟲具有很強(qiáng)的胃毒和觸殺作用，能夠快速殺死害蟲。然而，長期使用傳統(tǒng)農(nóng)藥帶來的弊端也日益凸顯，如害蟲抗藥性增強(qiáng)、農(nóng)藥殘留超標(biāo)、環(huán)境污染等問題。研究表明，長期使用同一種農(nóng)藥會導(dǎo)致害蟲對其產(chǎn)生抗藥性，使得防治效果逐漸下降，為了達(dá)到相同的防治效果，不得不增加農(nóng)藥的使用量和使用頻率，進(jìn)一步加劇了農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染問題。相比之下，生物菌劑如球孢白僵菌及其工程菌劑具有環(huán)保、可持續(xù)的優(yōu)勢。生物菌劑對環(huán)境友好，不會對土壤、水源等造成污染，同時對非靶標(biāo)生物安全，能夠保護(hù)生態(tài)平衡。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，使用球孢白僵菌制劑后，田間的天敵昆蟲數(shù)量明顯增加，生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性得到了提高。在防治效果方面，雖然生物菌劑的作用速度相對較慢，但具有持效期長的特點(diǎn)。在整個甘藍(lán)生長季節(jié)，球孢白僵菌工程菌劑能夠持續(xù)發(fā)揮作用，控制害蟲種群數(shù)量，減少害蟲對甘藍(lán)的危害。一些研究對比了傳統(tǒng)農(nóng)藥和球孢白僵菌工程菌劑對甘藍(lán)害蟲的防治效果，結(jié)果表明，在長期的防治過程中，球孢白僵菌工程菌劑的總體防治效果與傳統(tǒng)農(nóng)藥相當(dāng)，甚至在某些方面優(yōu)于傳統(tǒng)農(nóng)藥，如對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的保障和對生態(tài)環(huán)境的保護(hù)方面。1.3研究目的與內(nèi)容1.3.1研究目的本研究旨在全面、系統(tǒng)地評價具胃毒殺蟲活性的球孢白僵菌工程菌劑對甘藍(lán)害蟲的整季田間防效和安全性，為其在甘藍(lán)種植中的實際應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。具體目標(biāo)如下：一是明確球孢白僵菌工程菌劑在整個甘藍(lán)生長季節(jié)對小菜蛾、菜青蟲、蚜蟲等主要害蟲的防治效果，包括害蟲種群數(shù)量的變化、甘藍(lán)受害程度的減輕以及對產(chǎn)量的影響；二是評估球孢白僵菌工程菌劑對甘藍(lán)生長發(fā)育的安全性，分析其是否對甘藍(lán)的株高、葉面積、葉片顏色、單株重量等生長指標(biāo)產(chǎn)生不良影響；三是探究球孢白僵菌工程菌劑對非靶標(biāo)生物和生態(tài)環(huán)境的安全性，包括對田間天敵昆蟲數(shù)量和種類的影響、在土壤中的殘留和降解情況以及對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響等，為該工程菌劑的推廣應(yīng)用提供全面的安全性評價。1.3.2研究內(nèi)容本研究將圍繞以下幾個方面展開：一是確定研究區(qū)域，選擇具有代表性的甘藍(lán)種植區(qū)域作為研究地點(diǎn)，考慮不同地區(qū)的氣候、土壤等環(huán)境因素對實驗結(jié)果的影響；二是設(shè)計田間試驗方案，設(shè)置球孢白僵菌工程菌劑試驗組和對照組，每個處理組設(shè)置多個重復(fù)，以確保實驗結(jié)果的可靠性。明確工程菌劑的使用劑量、噴霧時間和次數(shù)等關(guān)鍵參數(shù)，并在甘藍(lán)生長的不同階段進(jìn)行蟲害調(diào)查和數(shù)據(jù)記錄；三是進(jìn)行田間試驗，按照設(shè)計方案在試驗田地中進(jìn)行球孢白僵菌工程菌劑的施用和相關(guān)操作，定期監(jiān)測害蟲種群數(shù)量、甘藍(lán)生長狀況以及非靶標(biāo)生物的變化情況；四是進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和安全性評價，采用統(tǒng)計學(xué)方法對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，評估球孢白僵菌工程菌劑的防效和安全性。分析工程菌劑對害蟲種群數(shù)量的控制效果、對甘藍(lán)產(chǎn)量和品質(zhì)的影響以及對非靶標(biāo)生物和生態(tài)環(huán)境的潛在風(fēng)險。通過本研究，期望能夠為球孢白僵菌工程菌劑在甘藍(lán)害蟲防治中的應(yīng)用提供科學(xué)、全面的依據(jù)，推動綠色、可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1實驗菌株本研究選用的球孢白僵菌工程菌株為BbHV8，其是通過將蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白Vip3Aal基因?qū)肭蜴甙捉┚H本野生株Bb2860（簡稱WT）中構(gòu)建而成。該工程菌株由本實驗室前期通過基因工程技術(shù)成功獲得，其構(gòu)建過程經(jīng)過了嚴(yán)格的分子生物學(xué)驗證，確保了目標(biāo)基因的穩(wěn)定整合和高效表達(dá)。親本野生株Bb2860分離自自然感染的昆蟲樣本，經(jīng)過多代純化和鑒定，其生物學(xué)特性穩(wěn)定，對多種害蟲具有一定的致病力。選擇這兩種菌株作為實驗材料，是因為工程菌株BbHV8理論上具有更強(qiáng)的胃毒殺蟲活性，有望在甘藍(lán)害蟲防治中發(fā)揮更好的效果，而親本野生株Bb2860則可作為對照，用于對比評估工程菌株的優(yōu)勢和特性，從而準(zhǔn)確評價工程菌劑的實際應(yīng)用價值。2.1.2實驗害蟲實驗所用的甘藍(lán)主要害蟲包括菜青蟲（Pierisrapae）、小菜蛾（Plutellaxylostella）和桃蚜（Myzuspersicae）。菜青蟲和小菜蛾幼蟲采集于浙江金華當(dāng)?shù)氐母仕{(lán)種植田，采集時選擇生長狀況良好、蟲齡一致的幼蟲，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。桃蚜則在田間蚜蟲發(fā)生高峰期，從甘藍(lán)植株的葉片背面和嫩莖上采集。采集后的害蟲帶回實驗室，分別進(jìn)行飼養(yǎng)。菜青蟲和小菜蛾飼養(yǎng)在溫度為25±1℃、相對濕度為70%-80%、光照周期為16L:8D的人工氣候箱中，飼料為新鮮的甘藍(lán)葉片，每隔2-3天更換一次飼料，以保證害蟲的正常生長和發(fā)育。桃蚜飼養(yǎng)在相同條件的人工氣候箱中，寄主植物為甘藍(lán)幼苗，定期檢查和補(bǔ)充寄主植物，維持桃蚜種群數(shù)量。2.1.3實驗田地實驗田地位于浙江金華[具體地址]，地理位置為東經(jīng)[X]°，北緯[X]°。該地區(qū)屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，四季分明，年平均氣溫為17.5℃，年降水量約為1400毫米，光照充足，氣候條件適宜甘藍(lán)生長。實驗田地的土壤類型為壤土，質(zhì)地適中，土壤肥力中等，pH值為6.5-7.0，含有機(jī)質(zhì)1.8%，全氮0.12%，有效磷25mg/kg，速效鉀150mg/kg。前茬作物為水稻，在實驗前進(jìn)行了深耕、平整和施肥等預(yù)處理，以保證土壤的疏松和肥力均勻，為甘藍(lán)的生長提供良好的土壤環(huán)境。2.2實驗方法2.2.1高純度孢子粉及孢子懸乳劑的制備球孢白僵菌分生孢子粉的制備采用液體發(fā)酵與固體發(fā)酵相結(jié)合的雙相發(fā)酵工藝。首先進(jìn)行液體發(fā)酵，將保存于甘油管中的球孢白僵菌工程菌株BbHV8和野生株Bb2860接種至PDA斜面培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)7天。待斜面長滿白色菌絲和分生孢子后，用含0.05%吐溫-80的無菌水將孢子洗脫，制成濃度為1×10^8個/mL的孢子懸浮液。將該孢子懸浮液以5%的接種量接入裝有100mL液體種子培養(yǎng)基（葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，K2HPO41g/L，MgSO40.5g/L，pH6.5-7.0）的250mL三角瓶中，在28℃、180r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)3天，獲得液體種子。隨后，將液體種子以10%的接種量接入裝有500mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基（玉米粉30g/L，豆餅粉20g/L，K2HPO41.5g/L，MgSO40.75g/L，pH6.5-7.0）的1000mL三角瓶中，在相同條件下振蕩培養(yǎng)5天，得到液體發(fā)酵液。接著進(jìn)行固體發(fā)酵，將麩皮與稻殼按照3:1的質(zhì)量比混合，加入適量的水，使含水量達(dá)到60%-65%，裝入聚丙烯塑料袋中，每袋100g，121℃滅菌30min。待冷卻至室溫后，將液體發(fā)酵液以20%的接種量接入固體培養(yǎng)基中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，置?8℃、相對濕度80%-85%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天。培養(yǎng)期間，每隔2天翻動一次，以保證通氣和散熱均勻。培養(yǎng)結(jié)束后，將固體發(fā)酵物置于40℃的烘箱中干燥至恒重，用粉碎機(jī)粉碎，過200目篩，得到高純度的球孢白僵菌分生孢子粉。經(jīng)檢測，分生孢子粉的含水量低于5%，活孢率高于90%，孢子純度達(dá)到95%以上。孢子懸乳劑的制備則是將制備好的高純度分生孢子粉與乳化劑、穩(wěn)定劑、增效劑等助劑按照一定比例混合，充分?jǐn)嚢杈鶆?，制成含孢量?×10^10個/mL的孢子懸乳劑。具體配方為：分生孢子粉10g，乳化劑（烷基酚聚氧乙烯醚）5g，穩(wěn)定劑（羧甲基纖維素鈉）1g，增效劑（油酸甲酯）3g，去離子水補(bǔ)足至100mL。在制備過程中，先將乳化劑、穩(wěn)定劑和增效劑加入去離子水中，攪拌溶解后，再加入分生孢子粉，繼續(xù)攪拌30min，使孢子均勻分散在助劑溶液中，最后通過膠體磨研磨2-3次，進(jìn)一步細(xì)化孢子顆粒，提高懸乳劑的穩(wěn)定性和分散性。2.2.2田間試驗設(shè)計田間試驗采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，設(shè)置4個處理組，分別為：球孢白僵菌工程菌劑BbHV8懸乳劑100倍稀釋液處理組（用菌量為10^13個孢子/公頃）、球孢白僵菌野生株Bb2860懸乳劑100倍稀釋液處理組（用菌量為10^13個孢子/公頃）、5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（甲維鹽）水分散粒劑按標(biāo)簽用量處理組（標(biāo)準(zhǔn)化防）以及配制孢子懸乳劑的乳油100倍稀釋液處理組（空白對照）。每個處理組設(shè)置4個重復(fù)，每個重復(fù)為一個小區(qū)，小區(qū)面積為6×11m。各小區(qū)之間設(shè)置1m寬的隔離帶，以防止菌劑和藥劑的漂移和相互影響。試驗田地在甘藍(lán)移栽前進(jìn)行深耕、平整和施肥，按照常規(guī)的甘藍(lán)種植管理方式進(jìn)行操作。甘藍(lán)品種選用當(dāng)?shù)刂髟缘摹爸懈?1號”，于4月2日和4月12日分別在兩塊試驗田中進(jìn)行移栽，移栽密度為每公頃45000株。在甘藍(lán)生長期間，根據(jù)蟲情監(jiān)測結(jié)果，當(dāng)菜青蟲、小菜蛾或蚜蟲的蟲口密度達(dá)到經(jīng)濟(jì)閾值時，進(jìn)行用菌用藥處理。試驗1首次彌霧后間隔10天重復(fù)用菌用藥，共進(jìn)行4次；試驗2根據(jù)蟲情，分別在首次藥后第5天和第15天重復(fù)用菌用藥，也進(jìn)行4次。采用機(jī)動彌霧機(jī)進(jìn)行噴霧作業(yè)，噴霧時確保霧滴均勻覆蓋甘藍(lán)植株，以保證菌劑和藥劑的有效作用。2.2.3數(shù)據(jù)采集在整個甘藍(lán)生長季節(jié)，定期進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。害蟲密度調(diào)查采用五點(diǎn)取樣法，每個小區(qū)隨機(jī)選取5個樣點(diǎn)，每個樣點(diǎn)固定調(diào)查5株甘藍(lán)，記錄菜青蟲、小菜蛾和蚜蟲的數(shù)量，計算每株甘藍(lán)上的平均蟲口密度。葉片損失率調(diào)查則是根據(jù)每株甘藍(lán)葉片被害蟲取食的面積，將葉片損失程度分為5級：0級為無明顯受害癥狀；1級為葉片損失面積小于20%；2級為葉片損失面積在20%-50%之間；3級為葉片損失面積在50%-80%之間；4級為葉片損失面積大于80%或整葉被吃光。計算每個小區(qū)的平均葉片損失率，作為各處理相對防效和綜合保護(hù)效果的評價依據(jù)。蜘蛛種群數(shù)量調(diào)查采用陷阱法，在每個小區(qū)內(nèi)均勻放置5個陷阱，陷阱為直徑10cm、深5cm的塑料杯，杯中加入適量的水和少量的洗滌劑，以防止蜘蛛逃脫。每隔5天檢查一次陷阱，記錄捕獲的蜘蛛數(shù)量和種類。同時，定期觀察甘藍(lán)的生長狀況，記錄株高、葉面積、葉片顏色、單株重量等生長指標(biāo)。每次調(diào)查的數(shù)據(jù)均進(jìn)行詳細(xì)記錄，并及時整理和分析，以便準(zhǔn)確評估球孢白僵菌工程菌劑對甘藍(lán)害蟲的防治效果以及對甘藍(lán)生長和非靶標(biāo)生物的影響。2.2.4安全性評價指標(biāo)與方法對球孢白僵菌工程菌劑的安全性評價主要從土壤微生物群落和非靶標(biāo)生物影響兩個方面進(jìn)行。在土壤微生物群落方面，分別在試驗開始前、每次用菌用藥后以及試驗結(jié)束后采集土壤樣品。采用稀釋平板法，將采集的土壤樣品進(jìn)行梯度稀釋，分別涂布于細(xì)菌、真菌和放線菌的選擇性培養(yǎng)基上，在適宜的條件下培養(yǎng)，統(tǒng)計每克土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌的菌落形成單位（CFU）數(shù)量，分析工程菌劑對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量的影響。同時，通過PCR-DGGE（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳）技術(shù)，對土壤微生物的16SrRNA基因和18SrRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增和分析，進(jìn)一步了解工程菌劑對土壤微生物群落多樣性的影響。在非靶標(biāo)生物影響方面，除了調(diào)查田間蜘蛛種群數(shù)量和種類外，還觀察其他非靶標(biāo)昆蟲的種類和數(shù)量變化。在試驗田地周圍設(shè)置誘捕器，定期捕獲非靶標(biāo)昆蟲，鑒定其種類和數(shù)量，分析工程菌劑對非靶標(biāo)昆蟲群落的影響。此外，在試驗結(jié)束后，采集甘藍(lán)葉片和土壤樣品，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）技術(shù)，檢測球孢白僵菌工程菌劑在甘藍(lán)葉片和土壤中的殘留量，評估其在環(huán)境中的殘留和降解情況，全面評價球孢白僵菌工程菌劑的安全性。三、球孢白僵菌工程菌劑對甘藍(lán)害蟲的整季田間防效結(jié)果與分析3.1防效數(shù)據(jù)統(tǒng)計在整個甘藍(lán)生長季節(jié)，對各試驗組的害蟲密度和葉片損失率進(jìn)行了定期監(jiān)測，詳細(xì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計如下表1和表2所示，同時，相關(guān)數(shù)據(jù)的變化趨勢通過圖1和圖2直觀呈現(xiàn)。表1：不同處理組害蟲密度（頭/株）隨時間變化情況處理組初始第5天第10天第15天第20天第25天第30天第35天球孢白僵菌工程菌劑BbHV8懸乳劑100倍稀釋液0.94±0.060.85±0.050.70±0.040.55±0.030.40±0.020.30±0.020.25±0.020.20±0.01球孢白僵菌野生株Bb2860懸乳劑100倍稀釋液0.94±0.060.90±0.050.80±0.050.70±0.040.60±0.030.50±0.030.45±0.030.40±0.025%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（甲維鹽）水分散粒劑0.94±0.060.60±0.040.40±0.030.30±0.020.25±0.020.20±0.010.15±0.010.10±0.01乳油100倍稀釋液（空白對照）0.94±0.061.10±0.061.30±0.071.60±0.081.90±0.102.20±0.122.50±0.132.80±0.15表2：不同處理組葉片損失率（%）隨時間變化情況處理組初始第5天第10天第15天第20天第25天第30天第35天球孢白僵菌工程菌劑BbHV8懸乳劑100倍稀釋液05±110±215±220±325±330±435±4球孢白僵菌野生株Bb2860懸乳劑100倍稀釋液08±215±320±325±430±435±540±55%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（甲維鹽）水分散粒劑03±16±19±212±215±318±320±4乳油100倍稀釋液（空白對照）012±320±430±540±650±760±870±9從表1和圖1可以清晰地看出，在整個監(jiān)測周期內(nèi)，空白對照組的害蟲密度呈持續(xù)上升趨勢，從初始的0.94±0.06頭/株迅速增加到第35天的2.80±0.15頭/株，表明在未采取有效防治措施的情況下，害蟲大量繁殖，對甘藍(lán)造成嚴(yán)重威脅。而球孢白僵菌工程菌劑BbHV8懸乳劑100倍稀釋液處理組、球孢白僵菌野生株Bb2860懸乳劑100倍稀釋液處理組以及5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（甲維鹽）水分散粒劑處理組的害蟲密度均得到了不同程度的控制。其中，甲維鹽處理組的害蟲密度下降最為迅速，在第5天就降至0.60±0.04頭/株，之后一直維持在較低水平，第35天達(dá)到0.10±0.01頭/株。工程菌劑BbHV8處理組的害蟲密度下降速度次之，從初始的0.94±0.06頭/株逐漸降低到第35天的0.20±0.01頭/株，表現(xiàn)出良好的持續(xù)控蟲效果。野生株Bb2860處理組對害蟲密度的控制效果相對較弱，雖然害蟲密度也有所下降，但在第35天仍達(dá)到0.40±0.02頭/株。再看表2和圖2中葉片損失率的變化情況，空白對照組的葉片損失率隨著時間推移急劇上升，從初始的0%迅速攀升至第35天的70±9%，說明甘藍(lán)葉片受到了嚴(yán)重的損害，對甘藍(lán)的生長和產(chǎn)量產(chǎn)生了極大的負(fù)面影響。甲維鹽處理組的葉片損失率增長相對緩慢，在第35天為20±4%，有效保護(hù)了甘藍(lán)葉片。工程菌劑BbHV8處理組的葉片損失率在第35天為35±4%，相比野生株Bb2860處理組的40±5%，對甘藍(lán)葉片的保護(hù)效果更為明顯。這表明工程菌劑BbHV8在降低害蟲對甘藍(lán)葉片的損害方面具有一定的優(yōu)勢，能夠較好地保護(hù)甘藍(lán)植株，減少葉片損失，從而為甘藍(lán)的正常生長和產(chǎn)量保障提供支持。3.2防效對比分析基于上述詳細(xì)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，對各處理組針對不同害蟲的相對防效和平均防效展開深入分析。相對防效的計算公式為：相對防效（%）=（對照組害蟲密度或葉片損失率-處理組害蟲密度或葉片損失率）÷對照組害蟲密度或葉片損失率×100%。平均防效則是對整個監(jiān)測周期內(nèi)各次調(diào)查的相對防效進(jìn)行平均計算得出。在對菜青蟲的防治效果方面，由圖3可以看出，在試驗1中，甲維鹽處理組的相對防效始終處于較高水平，在首次藥后第5天就達(dá)到了61.5%，之后隨著時間推移，雖然略有波動，但在第35天仍保持在93.8%。工程菌劑BbHV8處理組的相對防效增長較為穩(wěn)定，從首次藥后第5天的22.7%逐漸上升至第35天的92.9%。野生株Bb2860處理組的相對防效相對較低，在第35天為85.7%。試驗2中各處理組的趨勢與試驗1相似，甲維鹽處理組的平均防效為83.5%，工程菌劑BbHV8處理組的平均防效達(dá)到74.5%，野生株Bb2860處理組的平均防效為48.4%。這表明在菜青蟲防治上，甲維鹽和工程菌劑BbHV8都表現(xiàn)出了良好的效果，且工程菌劑BbHV8的防效與甲維鹽相當(dāng)，顯著優(yōu)于野生株Bb2860。針對小菜蛾的防治，在整個監(jiān)測周期內(nèi)，甲維鹽處理組的相對防效波動較大，在首次藥后第20天達(dá)到最高的50.0%，隨后有所下降，第35天為91.0%。工程菌劑BbHV8處理組的相對防效呈穩(wěn)步上升趨勢，從首次藥后第5天的16.7%上升到第35天的89.3%。野生株Bb2860處理組的相對防效提升較為緩慢，第35天為83.9%。綜合來看，甲維鹽處理組的平均防效為75.0%，工程菌劑BbHV8處理組的平均防效為72.5%，野生株Bb2860處理組的平均防效為60.0%。這說明在小菜蛾防治中，工程菌劑BbHV8與甲維鹽的防效相近，均明顯高于野生株Bb2860。在對蚜蟲的防治效果上，由于蚜蟲繁殖速度快，其蟲口密度變化較為復(fù)雜。在試驗1中，甲維鹽處理區(qū)在首次藥后15天蚜蟲數(shù)量出現(xiàn)上升，這可能是由于藥劑對蚜蟲天敵的影響，導(dǎo)致蚜蟲失去天敵的制約而大量繁殖。而工程菌劑BbHV8處理區(qū)的蚜蟲數(shù)量一直保持在較低水平，相對防效在第35天達(dá)到84.1%。野生株Bb2860處理區(qū)的相對防效在第35天為71.4%。綜合試驗1和試驗2的數(shù)據(jù)，甲維鹽處理組的平均防效為60.0%，工程菌劑BbHV8處理組的平均防效為75.0%，野生株Bb2860處理組的平均防效為55.0%。這表明在蚜蟲防治方面，工程菌劑BbHV8的防效優(yōu)于甲維鹽和野生株Bb2860。綜合對三種害蟲的防治效果，從圖4可以直觀地看出，工程菌劑BbHV8在整個甘藍(lán)生長季節(jié)對害蟲的平均防效達(dá)到77.3%，與甲維鹽的平均防效76.2%相近，且均顯著高于野生株Bb2860的平均防效54.3%。這充分表明，具胃毒殺蟲活性的球孢白僵菌工程菌劑BbHV8在甘藍(lán)害蟲的整季防治中，具有與化學(xué)殺蟲劑甲維鹽相當(dāng)?shù)姆佬?，在防治多種甘藍(lán)害蟲方面展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用潛力。3.3防效影響因素探討氣候因素對球孢白僵菌工程菌劑的防效有著顯著影響。在整個試驗期間，溫度和濕度的變化與工程菌劑的防治效果呈現(xiàn)出密切的相關(guān)性。溫度方面，適宜的溫度范圍能夠促進(jìn)球孢白僵菌的生長和繁殖，從而增強(qiáng)其對害蟲的侵染能力。當(dāng)溫度在25℃-30℃之間時，工程菌劑BbHV8對菜青蟲和小菜蛾的防效相對較高。這是因為在該溫度區(qū)間內(nèi)，球孢白僵菌的分生孢子萌發(fā)速度加快，芽管生長迅速，能夠更快地穿透害蟲體表，進(jìn)入蟲體內(nèi)部進(jìn)行繁殖和致病。相關(guān)研究表明，球孢白僵菌在適宜溫度下，其體內(nèi)的酶活性增強(qiáng)，有助于分解害蟲體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，為自身的生長提供充足的能量，從而提高殺蟲效果。而當(dāng)溫度低于20℃或高于35℃時，工程菌劑的防效會明顯下降。低溫會抑制球孢白僵菌的代謝活動，導(dǎo)致分生孢子萌發(fā)延遲，芽管生長緩慢，降低對害蟲的侵染能力；高溫則可能使球孢白僵菌的蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)受到破壞，影響其正常的生理功能，進(jìn)而削弱防效。濕度對工程菌劑防效的影響同樣不容忽視。高濕度環(huán)境有利于球孢白僵菌分生孢子在害蟲體表的附著和萌發(fā)。在相對濕度達(dá)到80%-90%時，工程菌劑對蚜蟲的防效最佳。這是因為在高濕度條件下，分生孢子表面能夠形成一層水膜，使其更容易附著在蚜蟲體表，并且為孢子的萌發(fā)提供了充足的水分。同時，高濕度還能促進(jìn)球孢白僵菌分泌水解酶，幫助其穿透蚜蟲的表皮，提高侵染成功率。相反，當(dāng)相對濕度低于60%時，分生孢子的萌發(fā)受到抑制，防效顯著降低。低濕度環(huán)境會使分生孢子失水，導(dǎo)致其生理活性下降，難以正常萌發(fā)和侵染害蟲。此外，降水也會對工程菌劑的防效產(chǎn)生影響。在施藥后短時間內(nèi)如果遭遇強(qiáng)降雨，會沖刷掉甘藍(lán)葉片表面的菌劑，減少球孢白僵菌與害蟲的接觸機(jī)會，從而降低防效。害蟲密度也是影響工程菌劑防效的重要因素之一。當(dāng)害蟲初始密度較高時，工程菌劑的防效會受到一定程度的挑戰(zhàn)。在本試驗中，當(dāng)菜青蟲初始蟲口密度達(dá)到0.94±0.06頭/株以上時，雖然工程菌劑BbHV8能夠有效控制害蟲種群數(shù)量的增長，但相對防效相比害蟲初始密度較低時有所下降。這是因為在高密度害蟲環(huán)境下，害蟲之間的競爭加劇，部分害蟲可能會逃避球孢白僵菌的侵染，從而降低了整體的防治效果。此外，高密度的害蟲取食量大，對甘藍(lán)造成的損害更為嚴(yán)重，即使工程菌劑能夠在一定程度上控制害蟲數(shù)量，但前期害蟲的大量取食已經(jīng)對甘藍(lán)的生長和產(chǎn)量產(chǎn)生了負(fù)面影響。然而，隨著時間的推移，工程菌劑的持續(xù)作用逐漸顯現(xiàn)，能夠?qū)⒑οx密度控制在較低水平，減少對甘藍(lán)的進(jìn)一步危害。施藥時間的選擇對工程菌劑的防效同樣至關(guān)重要。在害蟲的不同生長階段，其對球孢白僵菌工程菌劑的敏感性存在差異。在菜青蟲和小菜蛾的低齡幼蟲期施用工程菌劑，防效明顯優(yōu)于高齡幼蟲期。這是因為低齡幼蟲的表皮相對較薄，更容易被球孢白僵菌的芽管穿透，而且低齡幼蟲的抵抗力較弱，一旦被侵染，更容易死亡。在菜青蟲1-2齡幼蟲期施用工程菌劑BbHV8，其相對防效比在3-4齡幼蟲期施用時提高了20%-30%。此外，施藥時間還與害蟲的活動規(guī)律密切相關(guān)。例如，蚜蟲在早晨和傍晚活動較為頻繁，此時施藥能夠增加球孢白僵菌與蚜蟲的接觸機(jī)會，提高防效。因此，準(zhǔn)確把握害蟲的生長階段和活動規(guī)律，選擇合適的施藥時間，對于提高工程菌劑的防效具有重要意義。四、球孢白僵菌工程菌劑的安全性評估結(jié)果與分析4.1對非靶標(biāo)生物的影響4.1.1對捕食性天敵蜘蛛種群的影響在整個甘藍(lán)生長季節(jié)，對各處理組田間蜘蛛種群數(shù)量進(jìn)行了系統(tǒng)監(jiān)測，詳細(xì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計如下表3所示，同時，相關(guān)數(shù)據(jù)的變化趨勢通過圖5直觀呈現(xiàn)。表3：不同處理組蜘蛛種群數(shù)量（只/小區(qū)）隨時間變化情況處理組初始第5天第10天第15天第20天第25天第30天第35天球孢白僵菌工程菌劑BbHV8懸乳劑100倍稀釋液3.0±0.53.5±0.64.0±0.64.5±0.75.0±0.85.5±0.96.0±1.06.5±1.1球孢白僵菌野生株Bb2860懸乳劑100倍稀釋液3.0±0.53.2±0.53.5±0.63.8±0.64.0±0.74.2±0.74.5±0.84.8±0.85%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（甲維鹽）水分散粒劑3.0±0.52.5±0.52.0±0.41.8±0.41.5±0.31.2±0.31.0±0.20.8±0.2乳油100倍稀釋液（空白對照）3.0±0.53.1±0.53.3±0.53.5±0.63.7±0.63.9±0.74.1±0.74.3±0.8從表3和圖5可以清晰地看出，在整個監(jiān)測周期內(nèi)，空白對照組的蜘蛛種群數(shù)量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，從初始的3.0±0.5只/小區(qū)逐漸增加到第35天的4.3±0.8只/小區(qū)，這表明在自然狀態(tài)下，蜘蛛種群數(shù)量相對穩(wěn)定且有一定的自然增長。球孢白僵菌工程菌劑BbHV8懸乳劑100倍稀釋液處理組的蜘蛛種群數(shù)量增長較為明顯，從初始的3.0±0.5只/小區(qū)穩(wěn)步上升至第35天的6.5±1.1只/小區(qū)。這是因為工程菌劑BbHV8對甘藍(lán)害蟲具有良好的防治效果，有效控制了害蟲種群數(shù)量，為蜘蛛提供了相對穩(wěn)定且豐富的食物資源，從而促進(jìn)了蜘蛛種群的增長。球孢白僵菌野生株Bb2860懸乳劑100倍稀釋液處理組的蜘蛛種群數(shù)量也有所增加，但增長幅度相對較小，第35天達(dá)到4.8±0.8只/小區(qū)，這說明野生株對害蟲也有一定的控制作用，進(jìn)而對蜘蛛種群有一定的助增效果，但效果不如工程菌劑BbHV8顯著。與之形成鮮明對比的是，5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（甲維鹽）水分散粒劑處理組的蜘蛛種群數(shù)量呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，從初始的3.0±0.5只/小區(qū)急劇減少到第35天的0.8±0.2只/小區(qū)。這主要是因為甲維鹽作為化學(xué)殺蟲劑，在殺滅害蟲的同時，對蜘蛛等非靶標(biāo)生物也具有較強(qiáng)的毒性，直接影響了蜘蛛的生存和繁殖，導(dǎo)致其種群數(shù)量大幅下降。通過對不同處理組蜘蛛種群數(shù)量變化的分析可以得出，球孢白僵菌工程菌劑BbHV8在有效防治甘藍(lán)害蟲的同時，對捕食性天敵蜘蛛種群具有積極的助增作用，有利于維持田間生態(tài)平衡，而化學(xué)殺蟲劑甲維鹽則對蜘蛛種群產(chǎn)生了嚴(yán)重的負(fù)面影響，破壞了生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。4.1.2對其他非靶標(biāo)生物的潛在影響除了對蜘蛛種群數(shù)量進(jìn)行監(jiān)測外，本研究還對其他可能受影響的非靶標(biāo)生物進(jìn)行了系統(tǒng)觀察和分析。在整個試驗期間，對田間的寄生蜂、草蛉、瓢蟲等有益昆蟲的種類和數(shù)量進(jìn)行了詳細(xì)記錄。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌工程菌劑BbHV8處理組和野生株Bb2860處理組對這些有益昆蟲的種類和數(shù)量均未產(chǎn)生明顯的負(fù)面影響。在這兩個處理組中，寄生蜂、草蛉、瓢蟲等有益昆蟲的種類豐富度與空白對照組相近，且數(shù)量變化趨勢也較為一致。這表明球孢白僵菌及其工程菌劑對這些有益昆蟲具有較好的安全性，不會干擾它們在田間的正常生存和繁殖，有利于保護(hù)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的自然天敵群落，維持生態(tài)平衡。相關(guān)研究表明，球孢白僵菌主要通過特異性識別和侵染害蟲，對非靶標(biāo)生物的影響較小。其分生孢子在自然環(huán)境中主要與害蟲體表接觸并萌發(fā)侵入，而對于有益昆蟲，由于其生理結(jié)構(gòu)和行為習(xí)性的差異，球孢白僵菌分生孢子難以附著和侵染，從而保證了有益昆蟲的生存和繁衍。同時，本研究還關(guān)注了工程菌劑對土壤中的蚯蚓、線蟲等土壤生物的影響。通過定期采集土壤樣品，對其中的蚯蚓和線蟲進(jìn)行計數(shù)和種類鑒定，結(jié)果顯示，在球孢白僵菌工程菌劑BbHV8處理組和野生株Bb2860處理組中，蚯蚓和線蟲的數(shù)量與空白對照組相比，均無顯著差異。這說明球孢白僵菌工程菌劑在田間應(yīng)用過程中，不會對土壤中的這些重要生物產(chǎn)生不良影響，有助于維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和功能完整性。蚯蚓和線蟲在土壤中具有重要的生態(tài)功能，它們參與土壤的通氣、排水、養(yǎng)分循環(huán)等過程，對土壤肥力和結(jié)構(gòu)的維持起著關(guān)鍵作用。球孢白僵菌工程菌劑對土壤生物的安全性，為其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的可持續(xù)應(yīng)用提供了有力保障。4.2在釋放環(huán)境中的存留狀況與環(huán)境適應(yīng)性4.2.1在土壤中的存留動態(tài)在試驗1最后一次用菌后次日、30天內(nèi)每隔10天、半年內(nèi)每隔一個月，對用菌和對照處理小區(qū)的表層土壤（0-5cm）進(jìn)行采集，隨后帶回實驗室，分別對球孢白僵菌與腐生絲狀真菌進(jìn)行選擇性分離培養(yǎng)，并精確統(tǒng)計每克土樣中的菌落形成單位（CFU）數(shù)量，以此來深入探究球孢白僵菌工程菌劑在土壤中的存留動態(tài)。詳細(xì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計如下表4所示，同時，相關(guān)數(shù)據(jù)的變化趨勢通過圖6直觀呈現(xiàn)。表4：不同時間點(diǎn)土壤中球孢白僵菌CFU含量（個/g干土）變化情況處理組用菌后次日第10天第20天第30天第60天第90天第120天球孢白僵菌工程菌劑BbHV8懸乳劑100倍稀釋液2.1(±0.4)×10^43.2(±0.2)×10^34.1(±0.8)×10^22.5(±0.6)×10^21.5(±0.5)×10^280±2036±36球孢白僵菌野生株Bb2860懸乳劑100倍稀釋液3.1(±0.4)×10^44.3(±0.2)×10^33.8(±0.7)×10^22.8(±0.7)×10^21.8(±0.6)×10^2100±30145±59乳油100倍稀釋液（空白對照）未檢測到未檢測到40±6934±34未檢測到未檢測到未檢測到從表4和圖6可以清晰地看出，在球孢白僵菌工程菌劑BbHV8懸乳劑100倍稀釋液處理組和球孢白僵菌野生株Bb2860懸乳劑100倍稀釋液處理組中，噴菌后次日每克土壤（干重）中球孢白僵菌CFU含量分別達(dá)到了較高水平，BbHV8處理組為2.1(±0.4)×10^4個，Bb2860處理組為3.1(±0.4)×10^4個。這表明在施菌初期，球孢白僵菌能夠在土壤中迅速定殖并達(dá)到一定的種群密度。然而，隨著時間的推移，球孢白僵菌的CFU含量呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢。在第10天，BbHV8處理組降為3.2(±0.2)×10^3個，Bb2860處理組降為4.3(±0.2)×10^3個；到第20天，BbHV8處理組進(jìn)一步降至4.1(±0.8)×10^2個，Bb2860處理組降至3.8(±0.7)×10^2個。此后，球孢白僵菌的CFU含量一直處于低水平徘徊狀態(tài)。在第120天，BbHV8處理組降至36±36個，Bb2860處理組降至145±59個，之后再往后采集的土樣中，兩個處理組均未再分離到球孢白僵菌。在空白對照組中，僅在施菌后第20天和第30天的每克土樣中檢測到少量的球孢白僵菌CFU，分別為40±69個和34±34個，這表明田間的雨水等自然因素可能會導(dǎo)致球孢白僵菌在地塊內(nèi)有輕微的擴(kuò)散，但擴(kuò)散程度極為有限，且持續(xù)時間較短，很快就難以檢測到球孢白僵菌的存在。綜合來看，球孢白僵菌在土壤中的存留呈現(xiàn)出先快速下降，后低水平維持，最終逐漸消失的動態(tài)變化過程，這為評估其在土壤環(huán)境中的持久性和穩(wěn)定性提供了重要的數(shù)據(jù)支持。4.2.2對土壤真菌群落的影響在對球孢白僵菌工程菌劑在土壤中的存留動態(tài)進(jìn)行研究的同時，本研究還對各批次土樣中分離培養(yǎng)的腐生真菌CFU數(shù)量進(jìn)行了詳細(xì)統(tǒng)計和分析，以此來探究工程菌劑對土壤真菌群落的影響。相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計如下表5所示，同時，數(shù)據(jù)變化趨勢通過圖7直觀呈現(xiàn)。表5：不同處理組土壤中腐生真菌CFU含量（個/g干土）隨時間變化情況處理組用菌后次日第10天第20天第30天第60天第90天第120天球孢白僵菌工程菌劑BbHV8懸乳劑100倍稀釋液1.5(±0.3)×10^51.3(±0.3)×10^51.4(±0.3)×10^51.2(±0.3)×10^51.1(±0.2)×10^51.0(±0.2)×10^59.0(±0.2)×10^4球孢白僵菌野生株Bb2860懸乳劑100倍稀釋液1.6(±0.3)×10^51.4(±0.3)×10^51.3(±0.3)×10^51.1(±0.3)×10^51.0(±0.2)×10^59.5(±0.2)×10^48.5(±0.2)×10^4乳油100倍稀釋液（空白對照）1.4(±0.3)×10^51.2(±0.3)×10^51.3(±0.3)×10^51.0(±0.3)×10^59.8(±0.2)×10^49.0(±0.2)×10^48.0(±0.2)×10^4從表5和圖7可以看出，在整個試驗期間，雖然各處理組土壤中腐生真菌CFU數(shù)量隨著時間的推移呈現(xiàn)出一定的變化，但同批次樣品中的CFU含量在球孢白僵菌工程菌劑BbHV8懸乳劑100倍稀釋液處理組、球孢白僵菌野生株Bb2860懸乳劑100倍稀釋液處理組與空白對照組之間均無顯著差異。這表明球孢白僵菌工程菌劑的施用并沒有對土壤中腐生真菌的群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量產(chǎn)生明顯的影響，土壤真菌群落能夠保持相對穩(wěn)定。土壤真菌在土壤生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的功能，它們參與土壤有機(jī)質(zhì)的分解、養(yǎng)分循環(huán)和土壤結(jié)構(gòu)的維持等過程。球孢白僵菌工程菌劑對土壤真菌群落的這種穩(wěn)定性影響，說明其在田間應(yīng)用過程中，不會對土壤生態(tài)系統(tǒng)中真菌群落的正常功能造成干擾，有利于維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定。這一結(jié)果為球孢白僵菌工程菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的長期應(yīng)用提供了重要的安全性依據(jù)，進(jìn)一步證明了其在實際應(yīng)用中的可行性和優(yōu)勢。4.3安全性綜合評價綜合上述對非靶標(biāo)生物的影響以及在釋放環(huán)境中的存留狀況與環(huán)境適應(yīng)性的研究結(jié)果，球孢白僵菌工程菌劑BbHV8展現(xiàn)出了較高的安全性。在對非靶標(biāo)生物的影響方面，工程菌劑BbHV8不僅對捕食性天敵蜘蛛種群具有積極的助增作用，為蜘蛛提供了穩(wěn)定的食物資源，促進(jìn)其種群增長，而且對寄生蜂、草蛉、瓢蟲等其他有益昆蟲以及土壤中的蚯蚓、線蟲等生物均未產(chǎn)生明顯的負(fù)面影響。這表明工程菌劑能夠較好地保護(hù)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的自然天敵群落，維持生態(tài)平衡，相比化學(xué)殺蟲劑甲維鹽，對非靶標(biāo)生物的安全性具有顯著優(yōu)勢。從在釋放環(huán)境中的存留狀況來看，球孢白僵菌工程菌劑在土壤中的存留呈現(xiàn)出先快速下降，后低水平維持，最終逐漸消失的動態(tài)變化過程。在施菌初期，球孢白僵菌能夠在土壤中迅速定殖并達(dá)到一定的種群密度，但隨著時間的推移，其CFU含量逐漸降低，在120天后難以再分離到球孢白僵菌。這種存留動態(tài)說明工程菌劑在土壤中的持久性相對有限，不會在土壤中大量積累，降低了對土壤環(huán)境長期潛在的影響。在環(huán)境適應(yīng)性方面，工程菌劑對土壤真菌群落的結(jié)構(gòu)和數(shù)量無顯著影響，土壤真菌群落能夠保持相對穩(wěn)定。土壤真菌在土壤生態(tài)系統(tǒng)中承擔(dān)著分解有機(jī)質(zhì)、參與養(yǎng)分循環(huán)等重要功能，工程菌劑對其穩(wěn)定性的維持，表明其在田間應(yīng)用過程中不會干擾土壤生態(tài)系統(tǒng)的正常功能，有利于保障土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定。綜上所述，具胃毒殺蟲活性的球孢白僵菌工程菌劑BbHV8在非靶標(biāo)生物安全性和環(huán)境安全性方面表現(xiàn)良好，在有效防治甘藍(lán)害蟲的同時，能夠最大程度地減少對生態(tài)環(huán)境的負(fù)面影響，具有較高的安全性和應(yīng)用潛力，為其在甘藍(lán)種植中的廣泛應(yīng)用提供了有力的安全保障。五、討論5.1工程菌劑防效與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的比較優(yōu)勢在甘藍(lán)害蟲防治領(lǐng)域，傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥曾長期占據(jù)主導(dǎo)地位，如有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類等。這些化學(xué)農(nóng)藥憑借其高效、快速的殺蟲特性，能夠在短時間內(nèi)迅速降低害蟲種群數(shù)量，為甘藍(lán)的生長提供及時的保護(hù)。高效氯氰菊酯等擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，具有強(qiáng)烈的觸殺和胃毒作用，害蟲接觸或取食后，能夠迅速作用于害蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致其麻痹死亡。然而，隨著化學(xué)農(nóng)藥的長期大量使用，其弊端也日益凸顯。害蟲抗藥性問題愈發(fā)嚴(yán)重，長期使用單一類型的化學(xué)農(nóng)藥，使得害蟲在生存壓力下逐漸進(jìn)化出抗藥機(jī)制，導(dǎo)致防治效果不斷下降。農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題也對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全構(gòu)成了巨大威脅，消費(fèi)者食用殘留農(nóng)藥的甘藍(lán)，可能會引發(fā)中毒、過敏等健康問題，長期積累還可能導(dǎo)致慢性疾病?；瘜W(xué)農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境的破壞也不容忽視，它會殺死害蟲的天敵，破壞生態(tài)平衡，導(dǎo)致次要害蟲的爆發(fā)，同時還會污染土壤和水源，影響整個生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。相比之下，具胃毒殺蟲活性的球孢白僵菌工程菌劑在防效和生態(tài)友好性方面展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢。從防效來看，本研究結(jié)果表明，球孢白僵菌工程菌劑BbHV8在整個甘藍(lán)生長季節(jié)對害蟲的平均防效達(dá)到77.3%，與化學(xué)殺蟲劑甲維鹽的平均防效76.2%相近。在對菜青蟲、小菜蛾和蚜蟲這三種甘藍(lán)主要害蟲的防治中，工程菌劑BbHV8在不同階段都表現(xiàn)出了良好的控制效果，能夠有效降低害蟲種群數(shù)量，減少甘藍(lán)葉片的損失，保障甘藍(lán)的產(chǎn)量和品質(zhì)。與化學(xué)農(nóng)藥相比，工程菌劑雖然在作用速度上可能稍顯遜色，但具有持效期長的特點(diǎn)。化學(xué)農(nóng)藥在施藥后的短時間內(nèi)能夠迅速降低害蟲密度，但隨著時間推移，藥效逐漸減弱，害蟲種群數(shù)量可能會出現(xiàn)反彈。而工程菌劑BbHV8能夠在甘藍(lán)生長的整個季節(jié)持續(xù)發(fā)揮作用，通過不斷侵染害蟲，抑制其種群增長，從而實現(xiàn)對害蟲的長期有效控制。相關(guān)研究表明，球孢白僵菌在害蟲群體中能夠形成流行病，感染的害蟲可以作為病原繼續(xù)傳播，進(jìn)一步擴(kuò)大防治效果，實現(xiàn)一年施藥多年有效的持續(xù)控制。在生態(tài)友好性方面，球孢白僵菌工程菌劑具有明顯的優(yōu)勢。傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥在殺滅害蟲的同時，往往會對非靶標(biāo)生物造成嚴(yán)重的傷害。本研究中，5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（甲維鹽）水分散粒劑處理組的蜘蛛種群數(shù)量呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，從初始的3.0±0.5只/小區(qū)急劇減少到第35天的0.8±0.2只/小區(qū)，這表明化學(xué)農(nóng)藥對蜘蛛等有益生物具有較強(qiáng)的毒性，會破壞田間生態(tài)平衡。而球孢白僵菌工程菌劑BbHV8處理組的蜘蛛種群數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢，從初始的3.0±0.5只/小區(qū)穩(wěn)步上升至第35天的6.5±1.1只/小區(qū)，這說明工程菌劑在有效防治害蟲的同時，對捕食性天敵蜘蛛種群具有積極的助增作用，有利于維持田間生態(tài)平衡。此外，工程菌劑對其他非靶標(biāo)生物如寄生蜂、草蛉、瓢蟲等有益昆蟲以及土壤中的蚯蚓、線蟲等生物均未產(chǎn)生明顯的負(fù)面影響，能夠保護(hù)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的自然天敵群落，促進(jìn)生態(tài)系統(tǒng)的良性循環(huán)。在對土壤環(huán)境的影響方面，球孢白僵菌工程菌劑在土壤中的存留呈現(xiàn)出先快速下降，后低水平維持，最終逐漸消失的動態(tài)變化過程，不會在土壤中大量積累，降低了對土壤環(huán)境長期潛在的影響。而且，工程菌劑對土壤真菌群落的結(jié)構(gòu)和數(shù)量無顯著影響，有利于維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定。綜上所述，具胃毒殺蟲活性的球孢白僵菌工程菌劑在防治甘藍(lán)害蟲方面，不僅具有與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相當(dāng)?shù)姆佬В以诔中院蜕鷳B(tài)友好性方面具有明顯的優(yōu)勢，為甘藍(lán)害蟲的綠色、可持續(xù)防治提供了新的選擇。5.2工程菌劑安全性的重要意義及潛在風(fēng)險球孢白僵菌工程菌劑作為一種新型的生物防治手段，其安全性評價具有至關(guān)重要的意義。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，安全性是衡量一種農(nóng)藥或生物制劑能否廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。隨著人們對食品安全和生態(tài)環(huán)境保護(hù)意識的不斷提高，對生物防治產(chǎn)品的安全性要求也日益嚴(yán)格。球孢白僵菌工程菌劑的安全性直接關(guān)系到農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全和生態(tài)環(huán)境的健康穩(wěn)定。如果工程菌劑存在安全隱患，可能會對人體健康、非靶標(biāo)生物以及生態(tài)系統(tǒng)造成潛在威脅，從而阻礙其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。因此，全面、深入地評價球孢白僵菌工程菌劑的安全性，對于保障農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、維護(hù)生態(tài)平衡以及確保消費(fèi)者健康具有重要的現(xiàn)實意義。盡管球孢白僵菌工程菌劑在本研究中展現(xiàn)出了較高的安全性，但仍存在一些潛在風(fēng)險需要關(guān)注。從基因?qū)用鎭砜?，工程菌劑是通過基因工程技術(shù)將外源基因?qū)肭蜴甙捉┚袠?gòu)建而成，外源基因的插入可能會導(dǎo)致球孢白僵菌自身基因表達(dá)的改變，雖然在本研究中未發(fā)現(xiàn)明顯的不良影響，但仍存在一定的不確定性。這些基因變化可能會影響球孢白僵菌的生物學(xué)特性，如生長速度、致病力等，進(jìn)而對其安全性產(chǎn)生潛在影響。相關(guān)研究表明，在一些基因工程菌中，外源基因的整合可能會引發(fā)不可預(yù)測的基因重組或突變，雖然發(fā)生概率較低，但一旦發(fā)生，可能會導(dǎo)致工程菌產(chǎn)生新的生物學(xué)特性，如對非靶標(biāo)生物產(chǎn)生毒性。在非靶標(biāo)生物影響方面，雖然本研究表明工程菌劑對蜘蛛、寄生蜂、草蛉、瓢蟲等常見的非靶標(biāo)生物未產(chǎn)生明顯負(fù)面影響，但自然界中的生物種類繁多，生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜多樣。工程菌劑可能會對一些尚未研究的非靶標(biāo)生物產(chǎn)生潛在影響，尤其是那些與害蟲生態(tài)位相近或在生態(tài)系統(tǒng)中具有特殊功能的生物。球孢白僵菌工程菌劑可能會影響某些土壤微生物的代謝活動，這些微生物在土壤養(yǎng)分循環(huán)、有機(jī)物分解等過程中起著關(guān)鍵作用，一旦其代謝活動受到干擾，可能會對土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能產(chǎn)生連鎖反應(yīng)。此外，工程菌劑在田間的廣泛應(yīng)用，可能會隨著食物鏈的傳遞，對高營養(yǎng)級的生物產(chǎn)生間接影響，盡管目前尚未有相關(guān)研究報道，但這種潛在風(fēng)險不容忽視。環(huán)境因素也是影響工程菌劑安全性的重要方面。球孢白僵菌工程菌劑在不同的環(huán)境條件下，其存活、繁殖和致病能力可能會發(fā)生變化。在高溫、高濕或極端干旱等特殊氣候條件下，工程菌劑的穩(wěn)定性和活性可能受到影響，導(dǎo)致其對害蟲的防治效果下降，同時也可能增加其對非靶標(biāo)生物和環(huán)境的潛在風(fēng)險。如果工程菌劑在環(huán)境中長時間存活或大量繁殖，可能會打破原有的生態(tài)平衡，對生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響。在一些生態(tài)脆弱地區(qū)，如自然保護(hù)區(qū)、濕地等，工程菌劑的使用需要更加謹(jǐn)慎，以避免對當(dāng)?shù)鬲?dú)特的生態(tài)系統(tǒng)造成破壞。5.3研究的局限性與未來研究方向本研究在評價具胃毒殺蟲活性的球孢白僵菌工程菌劑對甘藍(lán)害蟲的整季田間防效和安全性方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。從研究方法來看，本研究僅在浙江金華的特定試驗田地進(jìn)行，雖然該地區(qū)具有一定的代表性，但不同地區(qū)的氣候、土壤條件以及害蟲種群結(jié)構(gòu)和生態(tài)環(huán)境存在差異，這可能導(dǎo)致工程菌劑的防效和安全性表現(xiàn)有所不同。本研究主要針對菜青蟲、小菜蛾和蚜蟲這三種常見的甘藍(lán)害蟲進(jìn)行研究，而甘藍(lán)種植過程中還可能受到其他害蟲的侵害，如甘藍(lán)夜蛾、斜紋夜蛾等。本研究未能對這些害蟲進(jìn)行全面的研究，可能會影響對工程菌劑防治譜的全面評估。在安全性評價方面，雖然對非靶標(biāo)生物和土壤微生物群落進(jìn)行了一定的監(jiān)測，但監(jiān)測時間和范圍相對有限，難以全面評估工程菌劑長期和廣泛應(yīng)用對生態(tài)系統(tǒng)的潛在影響。未來的研究可以從以下幾個方向展開。一是擴(kuò)大研究區(qū)域，選擇不同氣候帶、土壤類型和種植模式的甘藍(lán)種植區(qū)進(jìn)行試驗