(19)國家知識產(chǎn)權(quán)局(12)發(fā)明專利(10)授權(quán)公告號CN115846395B(65)同一申請的已公布的文獻(xiàn)號(43)申請公布日2023.03.28(73)專利權(quán)人山西大學(xué)地址030006山西省太原市塢城路92號(72)發(fā)明人李廣科寧夏李瑞嚴(yán)桑楠朱娜閆瑞鋒(74)專利代理機(jī)構(gòu)太原晉科知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙)14110專利代理師翟沖燕景炬輝等.中條山銅尾礦壩面土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)特征.《應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)》.2017,第23卷(第3期),第527-534頁.審查員馬琪(54)發(fā)明名稱一種構(gòu)建煤礦恢復(fù)區(qū)植物-微生物群落聯(lián)合修復(fù)體系的方法本發(fā)明屬于煤礦恢復(fù)區(qū)修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，為了解重金屬、PAHs對不同利用方式下修復(fù)植物及土壤微生物群落多樣性的影響，提供一種構(gòu)建煤礦恢復(fù)區(qū)植物-微生物群落聯(lián)合修復(fù)體系的方法。采用樣方調(diào)查方法，調(diào)查研石恢復(fù)區(qū)植被群落組矸石區(qū)土壤中細(xì)菌群落的組成及多樣性，分析礦區(qū)堆積、修復(fù)不同階段與修復(fù)區(qū)不同季節(jié)微生物群落的組成、分布及其多樣性特征，并分析其差異性，用共進(jìn)化策略篩選高效降解污染物的植物根際-微生物生態(tài)群落；構(gòu)建土壤-植物-微生物高效降解體系。篩選出可富集重金屬、有較強(qiáng)固氮作用的植物，找出耐受重金屬或可降解植物拌解(斷21.一種構(gòu)建煤礦恢復(fù)區(qū)植物-微生物群落聯(lián)合修復(fù)體系的方法，其特征在于：采用樣方調(diào)查方法，調(diào)查研石恢復(fù)區(qū)植被群落組成與結(jié)構(gòu)特征；采用Miseq高通量測序技術(shù)，檢測矸石區(qū)土壤中細(xì)菌群落的組成及多樣性，分析礦區(qū)堆積、修復(fù)不同階段與修復(fù)區(qū)不同季節(jié)微生物群落的組成、分布及其多樣性特征，并分析其差異性，采用共進(jìn)化策略篩選高效降解污染物的植物根際-微生物生態(tài)群落；最終構(gòu)建土壤-植物-微生物高效降解體系；構(gòu)建土壤-植物-微生物高效降解體系具體方法為：對于即將修復(fù)的研石堆積區(qū)，Pb、紫花苜蓿；對于Pb、PAHs污染的矸石恢復(fù)區(qū)，采取Pb超積2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種構(gòu)建煤礦恢復(fù)區(qū)植物-微生物群落聯(lián)合修復(fù)體系的方法，其特征在于：采用Miseq高通量測序技術(shù)，檢測研石區(qū)土壤中細(xì)菌群落的組成及多樣性，具體方法為：采用通用引物338F:5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和806R:5'-并進(jìn)行Miseq高通量測序，Miseq測序得到的PEreads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析；數(shù)反映物種均勻度，Shannon指數(shù)描述個(gè)體出現(xiàn)的紊亂和不確定性，Simpson指數(shù)為隨機(jī)取樣的兩個(gè)0TU屬于不同種的概率，Shannon指數(shù)數(shù)值越大，Simpson指數(shù)數(shù)值越小，群落物種分配的均勻度越高；chao和Ace指數(shù)反映群落豐富度，兩指數(shù)通過不同算法估計(jì)群落中所含OTU數(shù)目，數(shù)值越大物種數(shù)越多；β多樣性：反映不同樣本間群落組成的差異性，通過樣本相似距離值衡量；NMDS為非約束性排序分析，將多維空間的研究對象簡化到低維空間進(jìn)行定位分析和歸類，反映菌群相似性和差異性；通過NMDS衡量樣本的β多樣性，用weighted_normalized_unifrac距離，考慮樣本間進(jìn)化關(guān)系和物種豐度；微生物群落結(jié)構(gòu)：對細(xì)菌OTU進(jìn)行注釋分類，通過細(xì)菌群落柱狀圖進(jìn)行分析，以門作為分類學(xué)水平進(jìn)行分析，將相對豐度<1%的門歸入其它，以屬作為分類學(xué)水平進(jìn)行分析，將平均豐度小于1.5%的菌屬歸入其它，得到微生物群落結(jié)構(gòu)；差異性分析：LEfSe分析用于區(qū)別兩個(gè)或兩個(gè)以上生物條件或者是類群，找到與豐度有顯著性差異的類群，用線性判別分析LDA估算組即物種豐度對差異影響的大小，從門到科水平，研究LDA閾值高于2的物種，得到不同區(qū)域土壤微生物組間差異性，通過Wilcox秩和檢驗(yàn)在屬水平前進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，通過fdr多重檢驗(yàn)校正。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種構(gòu)建煤礦恢復(fù)區(qū)植物-微生物群落聯(lián)合修復(fù)體系的方法，其特征在于：采用共進(jìn)化策略篩選高效降解污染物的植物根際-微生物生態(tài)群落，具體方法為：采用多元回歸分析了解土壤中重金屬、PAHs含量對微生物α多樣性指數(shù)的影響，選擇shannon指數(shù)代表微生物均勻度，chao指數(shù)解釋微生物豐富度，利用多元回歸分析逐步法向后剔除法對污染物含量與多樣性指數(shù)之間進(jìn)行分析，得公式：shannon=3.648+0.054Pb;chao=2560.7+40.7As+13.1Nap-260.0Ace+236Flu;結(jié)果顯示：Pb含量越高各微生物相測定不同豐度區(qū)間OTU、相對豐度前30的屬、病原菌和益生菌了解微生物群落結(jié)構(gòu)的影3響：微生物與重金屬、PAHs含量的Spearman相關(guān)性，反映其對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，選擇相對豐度高于0.1%的OTU,將其分為：>1%為高豐度、0.5%-1%中等豐度和0.1%-0.5%低豐度，分析不同豐度區(qū)間OTU與污染物Spearman相關(guān)性；進(jìn)一步分析重金屬對不同類別的微生物的毒性作用，從屬水平選取相對豐度前30的微生物，并與污染物進(jìn)行相關(guān)性分析；接著選取門分類學(xué)水平總豐度前30的物種與重金屬、PAHs,并計(jì)算物種之間的斯皮爾曼等級相關(guān)系數(shù)，反映物種之間的相關(guān)性；使用Spearman相關(guān)性進(jìn)行分析污染物對病原菌和益生菌的影響；對微生物功能進(jìn)行預(yù)測：選擇Tax4Fun功能預(yù)測KEGG通路在第2級的主要功能及其層次聚類，BugBase表型預(yù)測確定微生物樣本中存在的高水平表型，通過預(yù)測的16S拷貝數(shù)對OTU進(jìn)行歸一化，然后預(yù)測微生物表型；FAPROTAX功能預(yù)測分析原核生物代謝及生態(tài)功能，將原核生物分類群映射到化學(xué)異養(yǎng)(chemoheterotrophy)、需氧化學(xué)異養(yǎng)(aerobic_chemoheterotrophy)、發(fā)酵(fermentation)生態(tài)相關(guān)功能。4一種構(gòu)建煤礦恢復(fù)區(qū)植物-微生物群落聯(lián)合修復(fù)體系的方法技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于煤礦恢復(fù)區(qū)修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種構(gòu)建煤礦恢復(fù)區(qū)植物-微生物群落聯(lián)合修復(fù)體系的方法。背景技術(shù)[0002]當(dāng)前，主流的土壤修復(fù)技術(shù)主要分為物理修復(fù)(固化/穩(wěn)定、熱脫附和電動(dòng)修復(fù))、作為一種高效、低成本和環(huán)境友好型的修復(fù)技術(shù)，克服了物理化學(xué)修復(fù)費(fèi)用高、效果不明顯、易產(chǎn)生二次污染的缺點(diǎn)，逐漸成為研究熱點(diǎn)。通過對2010-2020年間矸石修復(fù)文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，60%以上為生物修復(fù)。植物-微生物修復(fù)技術(shù)是利用土壤-植物-微生物組成復(fù)合體系，直接或間接地吸收和降解土壤中污染物質(zhì)的一種污染治理技術(shù)。植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)以植物修復(fù)技術(shù)為基礎(chǔ)，包括植物穩(wěn)定、植物提取、植物揮發(fā)、植物降解四個(gè)過程(圖1)。重金屬主要靠植物提取，可通過添加微生物強(qiáng)化植物修復(fù)作用。而對于土壤PAHs,植物提取的貢獻(xiàn)通?？珊雎圆挥?jì)(<0.4%),主要為根際降解過程，即利用植物的根增強(qiáng)根際微生物和真菌活性間接降解多環(huán)芳烴。[0003]在矸石區(qū)，植物-微生物修復(fù)技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用，大量文獻(xiàn)篩選了適合某一礦區(qū)修復(fù)的植物(黑麥草、紫花苜蓿、高羊茅等)與微生物(Magnaportheoryzae、Burkholderiasp),效果良好。但復(fù)合污染礦區(qū)修復(fù)后期主要污染物尚不明確，修復(fù)前后生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)及健康風(fēng)險(xiǎn)的對比較少。污染地區(qū)土壤植物、微生物與自然生態(tài)系統(tǒng)不同，煤礦復(fù)墾區(qū)修復(fù)往往通過對生態(tài)系統(tǒng)加以人為干預(yù)、控制和管理，最終建立一個(gè)具有高生產(chǎn)力的、穩(wěn)定的植物群落，最終達(dá)到保護(hù)與持續(xù)利用這兩大目標(biāo)。[0004]土壤微生物群落的多樣性是決定土壤質(zhì)量的關(guān)鍵要素，它往往受污染物種類、氣生態(tài)系統(tǒng)的功能以及人群健康產(chǎn)生影響。2015年，發(fā)表于Nature上的一篇文獻(xiàn)構(gòu)建了一個(gè)概念框架，指出土地使用和管理決策會改變土壤生物多樣性進(jìn)而影響人群健康。矸石堆積和修復(fù)后理化性質(zhì)和污染物含量存在差異，微生物群落結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整以適應(yīng)不同的生境大量研究表明，與未污染對比，礦區(qū)土壤微生物多樣性和群落存在顯著變化，重金屬耐受性強(qiáng)的生物占主導(dǎo)地位。但關(guān)于礦區(qū)土壤潛在病原細(xì)菌的調(diào)查較少，其污染物-微生物-人群健康之間的關(guān)聯(lián)尚不明確。發(fā)明內(nèi)容[0005]本發(fā)明為了解重金屬、PAHs對不同利用方式下修復(fù)植物及土壤微生物群落多樣性的影響，提供了一種構(gòu)建煤礦恢復(fù)區(qū)植物-微生物群落聯(lián)合修復(fù)體系的方法，篩選出可富集重金屬、有較強(qiáng)固氮作用的植物，找出耐受重金屬或可降解PAHs的優(yōu)勢菌屬，從而有助于該地區(qū)矸石山的進(jìn)一步修復(fù)。[0006]本發(fā)明由如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種構(gòu)建煤礦恢復(fù)區(qū)植物-微生物群落聯(lián)合修復(fù)5體系的方法，采用樣方調(diào)查方法，調(diào)查矸石恢復(fù)區(qū)植被群落組成與結(jié)構(gòu)特征；采用Miseq高通量測序技術(shù)，檢測研石區(qū)土壤中細(xì)菌群落的組成及多樣性，分析礦區(qū)堆積、修復(fù)不同階段與修復(fù)區(qū)不同季節(jié)微生物群落的組成、分布及其多樣性特征，并分析其差異性，采用共進(jìn)化策略篩選高效降解污染物的植物根際-微生物生態(tài)群落；最終構(gòu)建土壤-植物-微生物高效降解體系。[0007]采用Miseq高通量測序技術(shù)，檢測研石區(qū)土壤中細(xì)菌群落的組成及多樣性，具體方法為：采用通用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-庫并進(jìn)行Miseq高通量測序，Miseq測序得到的PEreads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析；[0008]微生物多樣性分析為：α多樣性：sobs為群落豐富度實(shí)際觀測值；Shannon和Simpson指數(shù)反映物種均勻度，Shannon指數(shù)描述個(gè)體出現(xiàn)的紊亂和不確定性，Simpson指數(shù)為隨機(jī)取樣的兩個(gè)OUT屬于不同種的概率，Shannon指數(shù)數(shù)值越大，Simpson指數(shù)數(shù)值越小，群落物種分配的均勻度越高；chao和Ace指數(shù)反映群落豐富度，兩指數(shù)通過不同算法估計(jì)群落中所含OUT數(shù)目，數(shù)值越大物種數(shù)越多；β多樣性：反映不同樣本間群落組成的差異性：,通過樣本相似距離值衡量；NMDS為非約束性排序分析，將多維空間的研究對象簡化到用weighted_normalized_unifrac距離，考慮樣本間進(jìn)化關(guān)系和物種豐度；[0009]微生物群落結(jié)構(gòu)：對細(xì)菌OTU進(jìn)行注釋分類，通過細(xì)菌群落柱狀圖進(jìn)行分析，以門作為分類學(xué)水平進(jìn)行分析，將相對豐度<1%的門歸入其它，以屬作為分類學(xué)水平進(jìn)行分析，將平均豐度小于1.5%的菌屬歸入其它，得到微生物群落結(jié)構(gòu)；[0010]差異性分析：LEfSe分析用于區(qū)別兩個(gè)或兩個(gè)以上生物條件或者是類群，找到與豐度有顯著性差異的類群，用線性判別分析LDA估算組即物種豐度對差異影響的大小，從門到檢驗(yàn)在屬水平前進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，通過fdr多重檢驗(yàn)校正。[0011]采用共進(jìn)化策略篩選高效降解污染物的植物根際-微生物生態(tài)群落，具體方法為：采用多元回歸分析了解土壤中重金屬、PAHs含量對微生物α多樣性指數(shù)的影響，選擇shannon指數(shù)代表微生物均勻度，chao指數(shù)解釋微生物豐富度，利用多元回歸分析逐步法向后剔除法對污染物含量與多樣性指數(shù)之間進(jìn)行分析，得公式：shannon=3.648+0.054Pb;chao=2560.7+40.7As+13.1Nap-260.0Ace+236Flu;結(jié)果顯示：Pb含量越高各微生物相[0012]測定不同豐度區(qū)間OTU、相對豐度前30的屬、病原菌和益生菌了解微生物群落結(jié)構(gòu)的影響：微生物與重金屬、PAHs含量的Spearman相關(guān)性，反映其對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，選擇相對豐度高于0.1%的OTU,將其分為：>1%為高豐度、0.5%-1%中等豐度和0.1%-0.5%低豐度，分析不同豐度區(qū)間OTU與污染物Spearman相關(guān)性；[0013]進(jìn)一步分析重金屬對不同類別的微生物的毒性作用，從屬水平選取相對豐度前30的微生物，并與污染物進(jìn)行相關(guān)性分析；接著選取門分類學(xué)水平總豐度前30的物種與重金屬、PAHs,并計(jì)算物種之間的斯皮爾曼等級相關(guān)系數(shù)，反映物種之間的相關(guān)性；使用Spearman相關(guān)性進(jìn)行分析污染物對病原菌和益生菌的影響；6[0014]對微生物功能進(jìn)行預(yù)測：選擇Tax4Fun功能預(yù)測KEGG通路在第2級的主要功能及其層次聚類，BugBase表型預(yù)測確定微生物樣本中存在的高水平表型，通過預(yù)測的16S拷貝數(shù)對OTU進(jìn)行歸一化，然后預(yù)測微生物表型；FAPROTAX功能預(yù)測分析原核生物代謝及生態(tài)功能，將原核生物分類群映射到化學(xué)異養(yǎng)(chemoheterotrophy)、需氧化學(xué)異養(yǎng)(aerobic_chemoheterotrophy)、發(fā)酵(fermentation)生態(tài)相關(guān)功能；[0015]對主控污染物脅迫下植物響應(yīng)的檢測，選取恢復(fù)區(qū)旱季0-800m不同距離的土壤樣品，通過模式植物大麥毒性指標(biāo)了解植物響應(yīng)狀況，具體方法為：通過土培，觀察大麥幼苗毒性指標(biāo)即有絲分裂指數(shù)、微核的變化；對植物毒性指標(biāo)與土壤重金屬含量指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，從而得到土壤植物毒性評估。[0016]構(gòu)建土壤-植物-微生物高效降解體系具體方法為：對于即將修復(fù)的研石堆積區(qū)，染的研石恢復(fù)區(qū)，采取Pb超積累植物+經(jīng)濟(jì)作物+假單胞菌。[0018]本發(fā)明立足于山西省煤礦恢復(fù)區(qū)土壤污染現(xiàn)狀，及國家對土壤污染調(diào)查、土壤環(huán)境安全及環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提出的新要求(GB15618-2018和GB36600-2018),選擇對主控污染物具有一定修復(fù)潛力的土著植物，采用共進(jìn)化策略篩選高效降解污染物的植物根際-微生物生態(tài)群落；最終構(gòu)建土壤-植物-微生物高效降解體系，揭示其在煤礦恢復(fù)區(qū)土壤修復(fù)中的重要足典型工業(yè)污染場地風(fēng)險(xiǎn)管控中的技術(shù)缺環(huán)，為資源循環(huán)新興產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供支撐。附圖說明[0019]圖1為植物-微生物聯(lián)合修復(fù)HMs-PAHs示意圖；圖2為植物、微生物多樣性分析技術(shù)恢復(fù)區(qū)旱季門水平優(yōu)勢菌群分析；圖5為Lefse多級物種差異判別分析，注：不同顏色節(jié)點(diǎn)表示在對應(yīng)組別中顯著富集，且對組間差異存在顯著影響的微生物類群；淡黃色節(jié)點(diǎn)表示在不同分組中均無顯著差異，或?qū)M間差異無顯著影響的微生物類群；圖6為堆積區(qū)和恢復(fù)區(qū)土壤微生物組間差異顯著性檢驗(yàn)性；圖7為相對豐度前30屬與污染物相關(guān)性熱圖；圖8為礦區(qū)土壤污染物與微生物相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖；注：圖中節(jié)點(diǎn)的大小表示物種豐度大小，不同顏色表關(guān)性系數(shù)的大小，線越粗，表示物種之間的相關(guān)性越高；線越多，表示該節(jié)點(diǎn)之間的聯(lián)系越密切；圖9為病原菌、益生菌與污染物相關(guān)性熱圖；注：黑色字體為菌；圖10為Tax4Fun2級功能衍生熱圖和層次聚類比較；圖11:(A)BugBase表型預(yù)測和(B)根重的影響；圖13為恢復(fù)區(qū)土壤對大麥葉片(A)葉綠素a、(B)葉綠素b和(C)總?cè)~綠素含量的影響；圖14為恢復(fù)區(qū)土壤對大麥葉片丙二醛含量的影響；圖15為恢復(fù)區(qū)土壤對大麥葉片(A)7具體實(shí)施方式[0020]為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例；基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。[0021]除非另有定義，所有在此使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，和本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所通常理解的意思相同，在此公開引用及他們引用的材料都將以引用的方式被并入。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到的通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)就能了解到的描述的特定實(shí)施方案的等同技術(shù)，都將包含在本申請中?；攸c(diǎn)修復(fù)。在熱帶地區(qū)草類、豆類甚至喬木都可種植。這幾種植物各有優(yōu)勢，草的生長范圍廣闊，適應(yīng)性強(qiáng)；豆科植物可通過根瘤菌進(jìn)行固氮，供給植物更多營養(yǎng)；喬木最大的優(yōu)勢是固土，減少水土流失?；謴?fù)區(qū)主要修復(fù)植物見表1,共有8科13屬13種，豆科植物占物種總[0023]表1:恢復(fù)區(qū)主要修復(fù)植物刺槐RobmhapseudozcnchaLmn,油松PinustabuiformisCarzióre側(cè)柏PlancladusoriertalisL)F山桃Amygdahsdianvldikma(Carére)deVos側(cè)拍綠籬HedgeofPiapyclachusoriez紫葉櫻Pranus×eisrenaNEHans紫穗槐AmorphafruticosaLnn.白車軸草TrfoltumrepensL[0025]二、煤礦恢復(fù)區(qū)微生物多樣性分析[0026]1、土壤微生物基因組DNA的提取和16SrDNAPCR擴(kuò)增[0027]從-80℃冰箱中取出預(yù)存土樣，提取基因組DNA,用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測提取液中DNA濃度和純度(OD260/OD280),通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。以提取的DNA為模板，擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNAV3-V4區(qū)，通用引物為338F(5'-TransGenAP221-02:TransStartFastpfuDNAPolymerase,PCR儀為ABIGeneAmp97008結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測定量，之后按照每個(gè)樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。[0028]2、文庫構(gòu)建和上機(jī)測序：通過PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端，使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HC1緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢[0029]3、生物信息分析：Miseq測序得到的PEreads首先根據(jù)overla時(shí)對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析。[0030]4、微生物多樣性指數(shù)分析：通過對土壤樣品中細(xì)菌16SrRNA基因1luminaMiSeq測序，獲得優(yōu)化序列776548條，物種注釋得到38個(gè)門，132個(gè)綱，316個(gè)目，501個(gè)科，984個(gè)測序結(jié)果可以代表樣本真實(shí)情況。[0031]α多樣性可反映微生物群落內(nèi)部多樣性，常通過一些指數(shù)來表征。sobs為群落豐富度實(shí)際觀測值；Shannon和Simpson指數(shù)反映物種均勻度，Shannon指數(shù)描述個(gè)體出現(xiàn)的紊亂和不確定性，Simpson指數(shù)為隨機(jī)取樣的兩個(gè)0UT屬于不同種的概率，Shannon指數(shù)數(shù)值越大，Simpson指數(shù)數(shù)值越小，群落物種分配的均勻度越高。chao和Ace指數(shù)反映群落豐富度，兩指數(shù)通過不同算法估計(jì)群落中所含OUT數(shù)目，數(shù)值越大物種數(shù)越多。表2為細(xì)菌α多樣性結(jié)果。區(qū)域采樣點(diǎn)[0034]不同區(qū)域(D雨季、H雨季),堆積區(qū)sobs值高于恢復(fù)區(qū)，其實(shí)際物種數(shù)較多，兩區(qū)域細(xì)菌均勻度和豐富度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，不同季節(jié)(H雨季、H旱季),雨季微生物均勻度和豐富度較高。本發(fā)明選取的研石堆積區(qū)人為擾動(dòng)大，一方面相較于其它研石山污染較輕，多數(shù)微生物生長不受限制，另一方面，該堆積區(qū)準(zhǔn)備覆土修復(fù)，屬于恢復(fù)9兩處微生物多樣性和豐富度無顯著差異。慮樣本間進(jìn)化關(guān)系和物種豐度。不同區(qū)域樣本中，堆積區(qū)樣本差異較大，恢復(fù)區(qū)樣本差異較過細(xì)菌群落柱狀圖進(jìn)行分析。[0037]以門作為分類學(xué)水平進(jìn)行分析，將相對豐度<1%的門歸入其它，共獲得14種主要細(xì)菌。如圖4,采樣點(diǎn)土壤中相對豐度較高的細(xì)菌依次為放線菌門(Actinobacteria),變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria),厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadota),黏細(xì)菌(Myxobacteria)、芽孢桿菌門(Patesclbacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria),恐球菌(deinococcota)、浮霉菌門(planctomycetota)、嗜甲基菌(Methyloirabilota),WPS-2。[0038]總體來看，不同區(qū)域，矸石堆積區(qū)微生物包括14個(gè)門，矸石恢復(fù)區(qū)微生物為10個(gè)，兩個(gè)優(yōu)勢菌群放線菌門、變形菌門在堆積區(qū)占比0.6左右，在恢復(fù)區(qū)占比高于0.7,恢復(fù)區(qū)微已形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的微生物群落，部分處于劣勢的微生物已被淘汰。[0039]以屬作為分類學(xué)水平進(jìn)行分析，將平均豐度小于1.5%的菌屬歸入其它，共獲得26(Blastococcus)、馬賽菌屬(Massilia)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、微枝形桿菌屬(Microvirga)、微紅微球菌(Rubellimicrobium)、芽孢桿菌(Bacillus)、鏈霉菌屬(Treptomyces)、紅桿菌(Solirubrobacte)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)。與門水平相似，不同區(qū)域?qū)偎缴弦脖憩F(xiàn)為，恢復(fù)區(qū)優(yōu)勢菌群占比較高，恢復(fù)區(qū)旱雨兩季優(yōu)勢屬占比均在0.4-0.6之間，差異較小。不同距離處，在堆積區(qū)和恢復(fù)區(qū)(雨季)均隨距離增加相對豐度升高，新草螺菌(Noviherbaspirillum)在在堆積區(qū)隨距離增加相對豐度升高，在恢復(fù)區(qū)(雨季)則相反。[0040]6、樣本間差異比較：LEfSe分析可以用于區(qū)別兩個(gè)或兩個(gè)以上生物條件(或者是類群),找到與豐度有顯著性差異的類群，用線性判別分析(LDA)估算組(物種)豐度對差異影[0041]為進(jìn)一步了解堆積區(qū)和恢復(fù)區(qū)微生物差異，通過Wilcox秩和檢驗(yàn)在屬水平前進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，通過fdr多重檢驗(yàn)校正。結(jié)果如圖6所示，顯示堆積區(qū)馬賽菌屬(Massilia)、微枝形桿菌屬(Microvirga)較低。馬賽菌為等營養(yǎng)物質(zhì)充足時(shí)生長，有利于提高植物抗病性，如產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶抑制青枯菌，從而提高甜菜幼苗的抗病性。微枝桿菌屬α-變形桿菌門的根瘤菌，是一種能夠結(jié)瘤固氮的共生根瘤菌。[0042]通過16SrRNA測序研究土壤的微生物多樣性群落、組成多樣性。結(jié)果顯示：矸石恢復(fù)區(qū)植被共有8科13屬13種，豆科植物占物種總數(shù)的50%。植被主要分喬木、灌木、地被植物三類。微生物α多樣性顯示，實(shí)際物種數(shù)堆積區(qū)高于恢復(fù)區(qū)，但微生物均勻度和豐富度無顯著差異；恢復(fù)區(qū)雨季微生物物種高于旱季，且雨季微生物均勻度和豐富度較高。矸石區(qū)及周相對豐度較低。矸石山近處、周邊重金屬污染高處假單胞菌、鞘氨醇單胞菌含量較高。樣本間差異比較中，LEfSe分析顯示堆積區(qū)有更多特征微生物富集，相較于堆積區(qū)，恢復(fù)區(qū)馬賽菌屬和微枝形桿菌屬顯著富集。樣性的影響，對該研石區(qū)(包含堆積區(qū)雨季、恢復(fù)區(qū)雨季和恢復(fù)區(qū)旱季)污染物含量和多樣性進(jìn)行分析，選擇shannon指數(shù)代表微生物均勻度，chao指數(shù)解釋微生物豐富度，利用多元回歸分析逐步法向后剔除法對污染物含量與多樣性指數(shù)之間進(jìn)行分析。得出式子如下：shannon=3.648+0.054Pb;chao=2560.7+40.7As+重金屬、PAHs對微生物shannon指數(shù)的影響，結(jié)果顯示在該研石區(qū)微生物均勻度受Pb影響，[0046]B、污染物對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[0047]污染物對不同豐度區(qū)間OTU的影響：微生物與重金屬、PAHs含量的性，可反映其對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。選擇相對豐度高于0.1%的374個(gè)0TU,將其分為高豐度(>1%)、中等豐度(0.5%-1%)和低豐度(0.1%-0.5%),分析不同豐度區(qū)間0TU與污染物關(guān)的OTU數(shù)量為12~37,重金屬影響排序?yàn)锳s>Zn>Cd>Cu>Pb>Cr,As、Cd、Cu和Zn為負(fù)相關(guān)為正相關(guān)的2.7-6.4倍，而Cr和Pb正負(fù)相關(guān)數(shù)相同。對高豐度的微生物Cd和Pb影響較大，均為負(fù)相關(guān)；低豐度微生物中，As和Zn的影響較大。與重金屬相比，PAHs顯著相關(guān)的OTU數(shù)量較少，范圍為7~29,Flt、Pyr和BaP的影響較大占20%以上，Nap影響最小為6個(gè)，其次是Flu有8個(gè)。高豐度的微生物受Phe和Chy影響較大，中等豐度微生物主要受Acy影響?？傮w而言，該區(qū)域相對豐度值高于0.1%的微生物受重金屬影響較大。[0048]表3:不同豐度區(qū)間OTU與污染物顯著相關(guān)性百分比11e高豐度(>1%)中等豐度(0.5%-1%)低豐度(0.1%-0.5%)比(%)占比(%)含計(jì)(%)占比(%)合計(jì)(%)占比(%)合計(jì)(%)000000o區(qū)間高豐度(>1%)中等豐度(0.5%-1%)低豐度(0.1%-0.5%)比(%)占比(%)合計(jì)(%)占比(%)合計(jì)(%)占比《%)合計(jì)(%)00o0oo0000o000000000000[0050]污染物對相對豐度前30屬的影響：為進(jìn)一步分析重金屬對不同類別的微生物的毒性作用，我們從屬水平選取相對豐度前30的微生物，并與污染物進(jìn)行相關(guān)性分析(圖7)。重金屬與相對豐度前30的微生物均為負(fù)相關(guān)關(guān)系，重金屬顯著相關(guān)數(shù)量排序?yàn)镻b(4)>Cd、Cu桿菌屬(Arthrobacter)也與多種PAHs顯著負(fù)相關(guān)。[0051]物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖主要反映某一環(huán)境條件下各分類水平的物種相關(guān)性。選取門分類學(xué)水平總豐度前30的物種與重金屬、PAHs,并計(jì)算物種之間的斯皮爾曼等級相關(guān)系數(shù)，以反映物種之間的相關(guān)性。如圖8,已明確分類的微生物中，假單胞菌屬(Pseudomonas)與多數(shù)[a]蒽。其次鏈霉菌屬(Streptomyces)和纖維單胞菌屬(Celluomonas)也顯示與污染物的負(fù)相關(guān)關(guān)系。[0052]2、污染物對病原菌和益生菌的影響：為了闡明研石恢復(fù)區(qū)及周邊土壤重金屬、[0053]病原菌、益生菌與污染物相關(guān)性分析顯示(圖9),污染物與病原菌的相關(guān)性更強(qiáng)，Pb和兩種病原菌正相關(guān)，BkF、BaP等7種PAHs與1種病原菌顯著正相關(guān)，這里軍團(tuán)菌(Legionella)與重金屬Pb和多數(shù)PAHs顯著正相關(guān)，軍團(tuán)菌為革蘭氏陰性菌，廣泛存在于水生系統(tǒng)和土壤中，在游泳池、工業(yè)冷卻液、廢水處理廠均有發(fā)現(xiàn)，通過攝入污染水源進(jìn)入人體，爆發(fā)源通常為維護(hù)不善的冷卻塔，該屬常見的致病微生物為嗜肺軍團(tuán)菌，可引起肺炎型疾病。Pb的另一個(gè)顯著正相關(guān)微生物為棒狀桿菌(Corynebacterium),其典型病原菌為白喉良影響。[0054]有研究顯示，低濃度的重金屬會生存-致病權(quán)衡規(guī)律，即當(dāng)脅迫增強(qiáng)時(shí)，病原細(xì)菌必須提升其抵御脅迫能力以保證自身的生存，這往往伴有細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的資源攝入能力降低、毒性基因丟失、毒性基因表達(dá)準(zhǔn)確度的降低以及有害突變的增加等，即生存成本提高，這樣分配給致病相關(guān)特性(如生長、繁殖、毒性因子等)的資源相對減少，即表現(xiàn)為致病能力下降。軍團(tuán)菌與多種污染物呈顯著正[0056]1、預(yù)測方法：16SrRNA基因可以對系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因進(jìn)行分析，但不能提高群落功能能力的直接證據(jù)，因此，利用微生物功能預(yù)測分析群落功能。微生物功能預(yù)測方法包括功能預(yù)測等。[0057]其中，PICRUSt功能預(yù)測和Tax4F宏基因組比較，預(yù)測工具針對土壤等環(huán)境樣本使用時(shí)會產(chǎn)生較大的誤差，但各預(yù)測軟件的結(jié)果準(zhǔn)確性并沒有本質(zhì)的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)兩者差異較小，可選用一種進(jìn)行分析。此外Tax4Fun功能預(yù)測以SILVA數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，最后一次更新于2015年，而PICRUSt功能預(yù)測以GreenGene為基礎(chǔ)，更新于2013年，因此本發(fā)明選擇Tax4Fun功能預(yù)測。BugBase表型預(yù)測可以確定微生物樣本中存在的高水平表型。過程為通過預(yù)測的16S拷貝數(shù)對OTU進(jìn)行歸一化，然后使用提供的預(yù)先計(jì)算的文件預(yù)測微生物表型。FAPROTAX功能預(yù)測主要分析原核生物代謝及生態(tài)功能。它以人工培養(yǎng)的代表文獻(xiàn)為基礎(chǔ)，人工構(gòu)建數(shù)據(jù)庫，將原核生物分類群(如屬或種)映射[0058]2、微生物功能預(yù)測結(jié)果：基于Tax4Fun功能預(yù)測KEGG通路在第2級的主要功能及其層次聚類結(jié)果如圖10所示。聚類分析結(jié)果表明，土壤樣品可以根據(jù)群落功能分為兩組為雨季，一組為旱季。恢復(fù)區(qū)研石山處感染性疾病病毒(Infectiondiseaseviral)豐度極高。受高含量污染物影響，堆積區(qū)農(nóng)田微生物排泄系統(tǒng)(Excertorysystem)和免疫系統(tǒng)[0059]BugBase表型預(yù)測涉及的表型相對豐度由高到低排序?yàn)樯锬ば纬?Forming_Element)、革蘭氏陽性(GramPositive)、革蘭氏陰性(GramNegative)、致病性[0060]BugBase表型預(yù)測結(jié)果顯示(圖11A),恢復(fù)區(qū)存在更多的厭氧(Aerobic)過程，堆積區(qū)潛在致病性(Potentially_Pathogenic)相對豐度更高。[0061]FAPROTAX功能預(yù)測微生物注釋到53個(gè)生態(tài)功能類群，選取占比高于1%的前12個(gè)功能進(jìn)行分析(圖11B)?；謴?fù)區(qū)化學(xué)異養(yǎng)(chemoheterotrophy)、需氧化學(xué)異養(yǎng)(aerobic_chemoheterotrophy)顯著高于堆積區(qū)，堆積區(qū)發(fā)酵(fermentation)顯著高于恢復(fù)區(qū)。[0062]污染物與微生物α多樣性指數(shù)多元回歸分析表明，sha微生物，PAHs中高豐度的微生物受Phe和Chy影響較大，中等豐度微生物受BbF和Chy影響較大，低豐度微生物主要受Acy影響。在相對豐度前30的屬中馬賽菌屬、新草節(jié)桿菌屬與Pb和多種PAHs顯著負(fù)相關(guān)?；謴?fù)區(qū)矸石山處感染性疾病病毒豐度極高，堆積區(qū)農(nóng)田微生物排泄系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)豐度較高。結(jié)合病原菌相關(guān)興奮，軍團(tuán)菌和棒狀桿菌可能是該區(qū)域主要潛在致病菌。取恢復(fù)區(qū)旱季0~800m不同距離的土壤樣品，通過模式植物大麥毒性指標(biāo)了解植物響應(yīng)狀土壤采自距礦區(qū)5km外的未受污染的地點(diǎn)。每個(gè)采樣點(diǎn)去除表層土壤后，然后通過梅花布點(diǎn)法采集3~5個(gè)子樣本，采樣深度為0~20cm,四分法充分混勻土壤，去除石頭和植物殘留物后，所有收集的樣品均存儲在密封的聚乙烯袋中，并在自然干燥條件下移至實(shí)驗(yàn)室。[0065]2、大麥種子的處理：大麥種子發(fā)芽前用3%(v/v)的H?O?溶液表面滅菌30min,用去離子水沖洗干凈。然后將種子在蒸餾水中浸泡4~6小時(shí)。隨后挑選顆粒飽滿的種子移至潮濕的濾紙上發(fā)芽。36~48h后，選擇根長為1.5~2cm左右的大麥種子移植入圓形塑料花盆中(上部直徑9cm,下部直徑7cm,高度為7cm),每盆放置10粒種子，且每盆稱取距矸石山不同距離的200g土樣。所有試驗(yàn)組以光照：黑暗周期為12h:12h的條件下在25±1℃的恒溫培養(yǎng)箱中生長。實(shí)驗(yàn)過程中每天定時(shí)添加蒸餾水。[0066]3、大麥幼苗生長實(shí)驗(yàn)：大麥種子種植7天后，收集各處理組幼苗并測量其莖葉長和根長，此外，將每組的所有幼苗用蒸餾水洗滌并干燥，然后剪下莖葉和根部稱重(新鮮重量)。[0067]4、葉綠素含量的測定：大麥幼苗暴露7天后，采集新鮮葉片(0.1g)剪碎后浸入10mL提取液中(95%乙醇：80%丙酮=1:1),然后在黑暗室溫條件下浸提18h,提取上清液在酶標(biāo)素a(mg/g)=(12.7A?63-2.69A?45)×V/W/1000;葉綠素b(mg/g)=(22.9A645-4.68A?63)×V/W/1000;總?cè)~綠素(mg/g)=葉綠素a+葉綠素b。[0068]5、氧化應(yīng)激反應(yīng)測定：暴露7天后，將重量為0.1g的新鮮葉片在研缽中用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L,pH=7.4)研磨勻漿，隨后將勻漿液在4℃下以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min用Bradford法測定上清液中的蛋白含量，結(jié)果以U/mg蛋白表達(dá)。[0069]6、大麥根尖有絲分裂指數(shù)和微核的測定：大麥幼苗暴露2天后，將其根系從土壤中移出并用自來水徹底沖洗，除去粘附在根部的土壤，然后自根尖頂端切下1~1.5cm長的幼根并用卡諾固定液(乙醇：乙酸=3:1)固定24小時(shí)，隨后轉(zhuǎn)入70%的乙醇中保存。取固定好的根部用蒸餾水沖洗后加入適量1mol/L的鹽酸，放入60℃的水浴中水解8分鐘。用Schiff試劑染色后，將根尖分生組織切下并滴入45%的乙酸，加蓋玻片，常規(guī)壓片。有絲分裂指數(shù)(MI)表示為有絲分裂細(xì)胞在根尖細(xì)胞總數(shù)(1000個(gè)細(xì)胞)中所占的百分比，微核率(MN)表示為每1000個(gè)細(xì)胞中含有微核的細(xì)胞數(shù)。每個(gè)處理約觀察5000個(gè)根尖細(xì)胞。并使用帶有內(nèi)置數(shù)碼相機(jī)的光學(xué)顯微鏡以1000倍的放大倍率觀察并記錄。[0070]7、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析：采用Origin8.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果描述為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。使用單因素方差分析(One-wayANOVA)分析處理組之間的顯著性差異，然后進(jìn)行Fisher最小顯著差異(LSD)檢驗(yàn)。為了確定重金屬與植物毒性之[0072]1、恢復(fù)區(qū)周邊土壤對大麥幼苗生長的影響：為了更好的評估研石山恢復(fù)區(qū)及其周邊土壤污染對植物生長的危害，運(yùn)用了植物毒性評估方法來全面預(yù)測調(diào)查區(qū)域的植物毒性。[0073]圖12為矸石山恢復(fù)區(qū)下游不同距離土壤對大麥幼苗芽長、根長、芽重與根重的影響?？傮w來說，四個(gè)生長指標(biāo)隨著距矸石山距離的增加呈現(xiàn)出先降低后上升再降低的趨勢，所有土壤暴露組與對照組相比均有顯著性差異。在100m土壤的暴露下，大麥幼苗的芽長達(dá)到最低，比對照組減少了36%。大麥根長在800m土壤的暴露下達(dá)到最低值，比對照組減少了27%。在矸石山恢復(fù)區(qū)不同距離土壤的暴露下，大麥幼苗的芽重顯著降低(p<0.001),在200m土壤的處理下達(dá)到最低值，為對照組芽重的39%,同時(shí)，在距研石山0m的土壤暴露下，根重達(dá)到了最低值，比對照組顯著降低了約34%。[0074]2、恢復(fù)區(qū)周邊土壤對大麥幼苗葉綠素含量的影響：不同距離土壤樣品處理7天后，大麥葉片葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量的變化如圖13所示。在0m、100m、400m和600m土壤的暴露下，大麥葉綠素a含量顯著降低，與對照組相比分別降低了19%、12%、20%和17%,在400m時(shí)達(dá)到最低。而不同土壤處理組下的葉綠素b的含量與對照組相比無任何顯著性變化，說明葉綠素b對土壤中的污染物不敏感。大麥幼苗總?cè)~綠素含量在0m、400m和600m土壤的暴露下同樣顯著降低(p<0.05),比對照組減少了16%、12%和11%。[0075]3、恢復(fù)區(qū)周邊土壤對大麥幼苗丙二醛含量的影響：圖14為研石山下游不同距離土壤暴露7天后，大麥幼苗丙二醛含量變化大小。隨著距矸石山距離的增加，大麥幼苗丙二醛含量逐漸升高，其在200m土壤的暴露下，達(dá)到了對照組土壤的2.06倍。而MDA的含量在400m、600m和800m土壤的暴露下無顯著變化。[0076]4、恢復(fù)區(qū)周邊土壤對大麥幼苗抗氧化防御系統(tǒng)中酶系與非酶系的影響：為了抵抗外界污染環(huán)境引起的植物損傷，植物自身保護(hù)系統(tǒng)會產(chǎn)生一系列抗氧化防御酶與非酶來抵御污染物的脅迫，它們的活性水平可作為植物逆境生長和受危害的顯著指標(biāo)。因此，接下來的暴露下顯著上升(p<0.01),分別比對照組增加了約30%與35%。SOD的活性只有在200m土壤的暴露下才呈現(xiàn)出顯著上升的趨勢(p<0.01),比對照組增加了約33%。在所有土壤處理組的暴露下，大麥幼苗的CAT活性均顯著下降(p<0.001),0m、100m、200m、400m、600m和矸石山距離的增加，總體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，和POD的活性變化趨勢基本一致，在200m和800m土壤的暴露下，GSH的活性相比對照顯著上升了約1.81倍和1.16倍。[0077]5、恢復(fù)區(qū)周邊土壤對大麥根尖有絲分裂指數(shù)的影響：表4為矸石山下游不同距離的土壤對大麥根尖細(xì)胞48h有絲分裂指數(shù)的影響。僅在0m和200m土壤的暴露下，有絲分裂指數(shù)相比對照組有顯著降低，分別降低了21%和24%。在有絲分裂相分布中，不同距離的土壤暴露組中的前期指數(shù)相比對照組均有顯著性降低，且隨著距離的增加，呈現(xiàn)出先降低后上期指數(shù)相比對照組無顯著變化。[0078]表4:矸石山下游不同距離的土壤對大麥根尖細(xì)胞48h有絲分裂指數(shù)的影響......有絲分裂指數(shù)前期(%±SD)中期(%±SD)[0080]6、恢復(fù)區(qū)周邊土壤對大麥根尖細(xì)胞微核的影響：矸石山周邊的重金屬污染土壤除了能夠抑制大麥根尖有絲分裂指數(shù)，同時(shí)能夠在細(xì)胞中誘導(dǎo)微核的發(fā)生。如圖16所示，矸石山下游不同距離的土壤均能夠顯著誘導(dǎo)大麥根尖微核的產(chǎn)生，0m、100m、200m、400m、明細(xì)胞遺傳毒性中微核的發(fā)生率是植物遭受外界污染環(huán)境脅迫的敏感監(jiān)測工具。[0081]7、恢復(fù)區(qū)周邊土壤重金屬含量與植物毒性之間的相關(guān)關(guān)系：為了查明恢復(fù)區(qū)污染土壤中重金屬與植物毒性的關(guān)系，接下來使用了皮爾森相關(guān)系數(shù)來解釋它們之間的關(guān)系。如表5所示，大麥幼苗的芽長和根長與6種重金屬之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著的相關(guān)性，而芽重與Cr元素呈顯著的正相關(guān)(p<0.01),根重與As元素呈正相關(guān)(p<0.05)。同時(shí)還觀察到Cu元素與大麥幼苗中葉綠素b和總?cè)~綠素含量呈顯著的負(fù)相關(guān)，說明土壤中Cu元素的存在能夠影響大麥葉片光合作用的進(jìn)行。此外，Pb和Zn與根尖微核的發(fā)生率之間分別為顯著的負(fù)相關(guān)和正相關(guān)關(guān)系，并且本研究土壤中Pb和Zn的含量明顯高于山西省土壤背景值，并且具有一定的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，因此，這些結(jié)果說明微核實(shí)驗(yàn)是檢測重金屬污染土壤的敏感指標(biāo)。[0082]表5:恢復(fù)區(qū)土壤重金屬含量與植物毒性之間的相關(guān)關(guān)系[0084]結(jié)果如下：距矸石山不同距離的土壤均導(dǎo)致大麥幼苗的生長受抑，根長、根重、芽長和芽重均顯著下降，在200m土壤的暴露下達(dá)到最低值；暴露于0m、400m和600m土壤后，大麥葉片總?cè)~綠素含量顯著降低；暴露于100m和200m土壤后，大麥幼苗中的MDA含量顯著升高；在不同距離的土壤暴露下，大麥葉片中SOD、POD和GSH的活性被顯著誘導(dǎo)，而CAT的活性顯著降低；暴露于0m和200m污染土壤中大麥根尖的有絲分裂指數(shù)顯著降低，并且暴露于不同距離的土壤后，所有處理組的微核率顯著上升；相關(guān)性分析表明，大麥芽重與Cr元素呈顯著的正相關(guān)，根重與As元素呈正相關(guān)，Cu元素與葉綠素b和總?cè)~綠素含量呈顯著的負(fù)相關(guān)，Pb和Zn與根尖微核的發(fā)生率之間分別為顯著的負(fù)相關(guān)和正相關(guān)關(guān)系。[0085]七、煤礦恢復(fù)區(qū)后期生態(tài)修復(fù)：礦區(qū)開采對環(huán)境造成的破壞是不可逆的，威脅到生態(tài)和人體健康，其生態(tài)修復(fù)是漫長的。礦區(qū)植物-微生物修復(fù)不僅能夠改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤質(zhì)量，減少土壤污染物含量，同時(shí)，對提高當(dāng)?shù)厣锒鄻有裕嵘?dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性也具有重要作用。[0086]由主控污染物生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和健康風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果，該矸石恢復(fù)區(qū)后期修復(fù)重點(diǎn)是Pb和PAHs,這些污染物在矸石區(qū)周邊農(nóng)田處也有較高含量，Pb含量高于山西省土壤背景值的2險(xiǎn)。如果不能在后期工作中給予針對性修復(fù)，這些主控污染物降解或去除效率極低，將會延長生態(tài)恢復(fù)時(shí)間，對周邊居民健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。因此，我們需要進(jìn)一步利用好植物-微生物聯(lián)合修復(fù)模式，加快矸石區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建。實(shí)驗(yàn)測試修復(fù)效果，但從長遠(yuǎn)來看，本地物種更具修復(fù)潛力。在溫帶氣候中，草和豆類物種最適合用于退化地點(diǎn)修復(fù)。在熱帶地區(qū)草類、豆類甚至喬木都可種植。這幾種植物各有優(yōu)木最大的優(yōu)勢是固土，減少水土流失。我國礦區(qū)常用修復(fù)植物見表6。[0088]表6:礦區(qū)修復(fù)常用植物物種英文名術(shù)向日葵馬鞭草科牡荊屬景天科景天廈.物以及非共生微生物。已有大量研究分離出用于修復(fù)的微生物，如表7。根瘤菌是一類廣泛分布于土壤中的革蘭氏陰性細(xì)菌，它本身離體生長慢且無固氮能力。在侵染豆科植物根部后，根瘤菌可以從單獨(dú)細(xì)菌發(fā)展成含108個(gè)菌體的根瘤，每個(gè)植株有100左右根瘤，可以固定空氣中分子的態(tài)氮形成氨，為植物提供氮素營養(yǎng)，改良土壤。根瘤菌可以改善共生植物對重金屬的抵抗力和植物提取能力然而，重金屬對根瘤菌結(jié)瘤率影響遠(yuǎn)大于對植物生長的影響。重金屬濃度過高，直接對根瘤菌結(jié)瘤產(chǎn)生強(qiáng)抑制，從而難以形成聯(lián)合修復(fù)體系。菌根真菌根真菌應(yīng)用廣泛，但受土壤環(huán)境、共生植物種類、污染物種類與濃度的影響，其修復(fù)效果不一。原土根際微生物的數(shù)量取決于根系分泌物的組成、植物種類、根系類型、植物年齡以及土壤類型。很多根際微生物屬于植物生長促進(jìn)細(xì)菌(PGPB),它們定居在植物根的不同生態(tài)位，能夠比單一物種/菌株更有效地降解污染物，但不具有廣泛適用性。但大多數(shù)土壤微生物(>99%)尚未被培養(yǎng)出來，但它們可能在植物修復(fù)中起著重要作用。[0091]表7:礦區(qū)修復(fù)微生物物種Ganoderm,CaophoraE油田天然氣站點(diǎn)[0093]3、不同復(fù)墾階段矸石山修復(fù)措施：對于即將修復(fù)的矸石堆積區(qū)，采取豆科植物+馬賽菌屬。[0094]植被演替順序?yàn)榈桶墓嗄緟驳交旌瞎嗄?、針葉、落葉樹種，礦區(qū)植被復(fù)墾優(yōu)先選用一年生草本植物，該區(qū)域豆科植物較多且長勢良好。微生物多樣性均顯示馬賽菌屬與污染物呈負(fù)相關(guān)，該菌有重金屬抗性和PAHs降解能力，且在恢復(fù)區(qū)含量明顯升高，而相較于單一微生物多微生物菌劑適用性更強(qiáng)。因此，該礦區(qū)后期可通過豆科植物(如紫花苜蓿)結(jié)合含馬賽菌屬的菌劑進(jìn)行后續(xù)修復(fù)。[0096]超富集植物PterisvittataL.和經(jīng)濟(jì)植物蓖麻(RicinuscommunityL.)聯(lián)合們可以考慮Pb超積累植物與蓖麻、苜蓿(飼料)等經(jīng)濟(jì)作物聯(lián)合種植。Pb超積累草本植物商陸(PhytolaccaAcinosaRoxb)中Pb的積累可隨著PbCl?濃度的增加而增加；當(dāng)PbCl?含量達(dá)到最高濃度200mg/kg時(shí)，地上部分Pb含量最高為1.763mg/gDW,可利用商陸結(jié)合Thysanolaenalatifolia和Mimosapudica等Pb超積累植物。綠藻假單胞菌表現(xiàn)出溶解磷酸鹽和固定鉛的能力。此外假單胞菌對PAHs也表現(xiàn)出高效降解能力。[0097]因此，該礦區(qū)恢復(fù)區(qū)后期可通過Pb超積累植物+經(jīng)濟(jì)作物+假單胞菌進(jìn)行后續(xù)修[0098]本發(fā)明立足于山西省煤礦恢復(fù)區(qū)土壤污染現(xiàn)狀，分析主控污染物脅迫下植物與微生物多樣性響應(yīng)，篩選并構(gòu)建高效降解主控污染物的植物-微生物群落修復(fù)體系。主要結(jié)論[0099]植物、微生物多樣性分析表明，矸石恢復(fù)區(qū)植被共有8科13屬13種，豆科植物占物種總數(shù)的50%。矸石區(qū)及周邊土壤微生物群落，門水平主要有放線菌門，變形菌門，綠彎菌氨醇單胞菌含量較高。堆積區(qū)有更多特征微生物富集，相較于堆積區(qū)，恢復(fù)區(qū)馬賽菌屬和微枝形桿菌屬顯著富集。響，微生物結(jié)構(gòu)相對豐度值高于0.1%的微生物受重金屬影響較大，Cd和Pb對高豐度的微生中高豐度的微生物受Phe和Chy影響較大，中等豐度微生物受BbF和Chy影響較大，低豐度微生物主要受Acy影響。在相對豐度前30的屬中馬賽菌屬、新草菌屬、黏附桿菌和節(jié)桿菌屬與Pb和多種PAHs顯著負(fù)相關(guān)?；謴?fù)區(qū)矸石山處感染性疾病病毒豐度極高，堆積區(qū)農(nóng)田微生物排泄系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)豐度較高。結(jié)合病原菌相關(guān)性分析，軍團(tuán)菌和棒狀桿菌可能是該區(qū)域主要潛在致病菌。[0101]植物毒性實(shí)驗(yàn)表明，距矸石山不同距離的土壤均導(dǎo)致大麥幼苗的生長受抑，根長、含量顯著升高，有絲分裂指數(shù)顯著降低，并且暴露于不同距離的土壤后，所有處理組的微核率顯著上升。相關(guān)性分析表明，大麥芽重與Cr元素呈顯著的正相關(guān)，根重與As元素呈正相關(guān)，Cu元素與葉綠素b和總?cè)~綠素含量呈顯著的負(fù)相關(guān)，Pb和Zn與根尖微核的發(fā)生率之間分別為顯著的負(fù)相關(guān)和正相關(guān)關(guān)系。[0102]根據(jù)本發(fā)明結(jié)果提出以下建議：進(jìn)一步利用好植物-微生物聯(lián)合修復(fù)模式，加快矸累植物+經(jīng)濟(jì)作物+假單胞菌。[0103]最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實(shí)施