ICS

備案號(hào)：

團(tuán)體MA標(biāo)準(zhǔn)

T/CVMAXXXXX—XXXX

布魯氏菌A19疫苗株鑒定熒光定量

PCR檢測(cè)方法

Real-TimePCRforIdentificationofBrucellaA19Vaccinestrain

（征求意見(jiàn)稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布

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布魯氏菌A19疫苗株鑒定熒光定量PCR檢測(cè)方法

1范圍

本文件規(guī)定了布魯氏菌A19疫苗株鑒定熒光定量PCR檢測(cè)方法。

本文件適用于動(dòng)物血液樣品、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、流產(chǎn)物、環(huán)境樣品等樣本中布魯氏菌A19疫

苗株的核酸進(jìn)行鑒別診斷。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T20001.4-2015標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)

GB/T18646動(dòng)物布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)

NY/T1467奶牛布魯氏菌病PCR診斷技術(shù)

3試劑與耗材

3.1提取試劑

宜選取商品化的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。

3.2熒光定量PCR擴(kuò)增試劑

宜按照不同的熒光定量PCR平臺(tái)的說(shuō)明書(shū)選取推薦的熒光定量PCR擴(kuò)增試劑。

3.3引物探針

布魯氏菌通檢上游引物(BuF)：5＇-CGCTCGCGCGGTGGAT-3＇

布魯氏菌通檢下游引物(BruR)：5＇-CTTGAAGCTTGCGGACAGTCACC-3＇

1

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布魯氏菌通檢探針(BruP)：5＇-FAM-ACGACCAAGCTGCATGCTGTTGTCGATG-BHQ1-3＇

A19鑒定上游引物(A19F)：5＇-CGCGGGCTTCCTGATG-3＇

A19鑒定下游引物(A19R)：5＇-GGCCCAGACCGGGAAATA-3＇

A19鑒定探針(A19P)：5＇-VIC-ACCTTGCAGGAATTCGGCATCATCC-BHQ1-3＇

4儀器與設(shè)備

生物安全柜、分析天平、水浴鍋、高速離心機(jī)、熒光PCR儀、組織研磨器、-20℃冰箱、渦旋震蕩

儀。

5操作步驟

5.1樣品的采集及運(yùn)輸

按照GB/T18646和NY/T1467執(zhí)行。

5.2樣品的處理

按照GB/T18646和NY/T1467執(zhí)行。

5.3細(xì)菌基因組提取

按照所選取的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取。

5.4分型熒光定量PCR擴(kuò)增方法

按照表1配制布魯氏菌A19疫苗株鑒定熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。

2

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表1

試劑終濃度體積

布魯氏菌

2×酶混合液a/10μL

A19疫苗株

BruF（10pmol/μL）0.3μmol/L0.6μL

鑒定熒光定

BruR（10pmol/μL）0.3μmol/L0.6μL

量PCR擴(kuò)

BruP（10pmol/μL）0.3μmol/L0.6μL

增反應(yīng)體系

A19F（10pmol/μL）0.3μmol/L0.6μL

A19R（10pmol/μL）0.3μmol/L0.6μL

A19P（10pmol/μL）0.3μmol/L0.6μL

DNA模板/2μL

無(wú)菌無(wú)核酸酶水/4.4μL

總體積/20.0μL

注：a為熒光定量PCR擴(kuò)增試劑。

將表1中所有試劑加到熒光PCR反應(yīng)管后，充分混勻，做好標(biāo)記。布魯氏菌A19疫苗株鑒定熒光定量

PCR擴(kuò)增所用熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM和VIC，淬滅基團(tuán)為BHQ或None。在熒光定量PCR儀上按表2所示程序進(jìn)

行擴(kuò)增反應(yīng)。

表2布魯氏菌A19疫苗株鑒定熒光定量PCR擴(kuò)增程序

步驟溫度持續(xù)時(shí)間循環(huán)數(shù)

3

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195℃2min1

295℃15s40

360℃1min

注：在每個(gè)循環(huán)第二步（60℃35s）收集熒光信號(hào)。

5.5布魯氏菌A19疫苗株鑒定熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的對(duì)照

在進(jìn)行布魯氏菌A19疫苗株鑒定熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。以提取的布魯氏

菌A19疫苗株基因組DNA溶液和非A19疫苗株的布魯氏菌基因組DNA溶液作為陽(yáng)性對(duì)照；以細(xì)菌基因組提取

試劑盒的洗脫液替代DNA模板作為陰性對(duì)照。各對(duì)照PCR擴(kuò)增體系中，除模板外，其余組分和PCR擴(kuò)增程

序同5.4。

6結(jié)果判定

6.1閾值設(shè)定

閾值線設(shè)定于剛剛超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。

6.2結(jié)果判定

6.2.1陽(yáng)性對(duì)照：布魯氏菌A19疫苗株基因組DNA溶液，F(xiàn)AM熒光信號(hào)Ct值≤38并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲

線，VIC熒光信號(hào)無(wú)Ct值并且無(wú)特定擴(kuò)增曲線；非A19疫苗株的布魯氏菌基因組DNA溶液，F(xiàn)AM熒光信號(hào)Ct

值≤38并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，VIC熒光信號(hào)Ct值≤38并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線；陰性對(duì)照FAM和VIC熒光

信號(hào)均無(wú)Ct值并且無(wú)特定擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果不成立。

6.2.2被檢樣品FAM熒光信號(hào)Ct值≤38并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，VIC熒光信號(hào)無(wú)Ct值并且無(wú)特定擴(kuò)增

曲線，判斷為布魯氏菌A19疫苗株核酸陽(yáng)性。

6.2.3被檢樣品FAM熒光信號(hào)Ct值≤38并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，VIC熒光信號(hào)Ct值≤38并出現(xiàn)特定的

擴(kuò)增曲線，判斷為非A19疫苗株的布魯氏菌核酸陽(yáng)性，但不排除樣品中A19疫苗株核酸陽(yáng)性,應(yīng)結(jié)合免疫

背景綜合判斷。

6.2.4被檢樣品中FAM或VIC熒光信號(hào)38＜Ct值≤40并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，需重新取樣提取基因組

DNA，擴(kuò)增后結(jié)果判定仍是可疑的，可判定為陽(yáng)性。

6.2.5被檢樣品VIC熒光信號(hào)Ct值≤38并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，F(xiàn)AM熒光信號(hào)無(wú)Ct值并且無(wú)特定擴(kuò)增

曲線，判定為結(jié)果無(wú)效。

6.2.6無(wú)擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。

4

XX/TXXXXX—XXXX

_________________________________

5

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前??言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

本文件不涉及專利。

本文件由中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)提出并歸口。

本文件起草單位：中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國(guó)食品藥品檢定研究院、

臨沂大學(xué)。

本文件主要起草人：董浩、原霖、王傳彬、彭小薇、范學(xué)政、劉洋、秦玉明、畢一鳴、馮宇、張興

林、牛建蕊。

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布魯氏菌A19疫苗株鑒定熒光定量PCR檢測(cè)方法

1范圍

本文件規(guī)定了布魯氏菌A19疫苗株鑒定熒光定量PCR檢測(cè)方法。

本文件適用于動(dòng)物血液樣品、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、流產(chǎn)物、環(huán)境樣品等樣本中布魯氏菌A19疫

苗株的核酸進(jìn)行鑒別診斷。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T20001.4-2015標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)

GB/T18646動(dòng)物布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)

NY/T1467奶牛布魯氏菌病PCR診斷技術(shù)

3試劑與耗材

3.1提取試劑

宜選取商品化的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。

3.2熒光定量PCR擴(kuò)增試劑

宜按照不同的熒光定量PCR平臺(tái)的說(shuō)明書(shū)選取推薦的熒光定量PCR擴(kuò)增試劑。

3.3引物探針

布魯氏菌通檢上游引物(BuF)：5＇-CGCTCGCGCGGTGGAT-3＇

布魯氏菌通檢下游引物(BruR)：5＇-CTTGAAGCTTGCGGACAGTCACC-3＇

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