2025年P(guān)CR試題及答案一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共20分）1.以下關(guān)于PCR技術(shù)的描述，錯(cuò)誤的是（）A.依賴DNA聚合酶的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)B.需已知目的基因的一段核苷酸序列設(shè)計(jì)引物C.擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度由引物在模板上的結(jié)合位置決定D.變性階段溫度通常為55-60℃答案：D（變性階段溫度通常為94-98℃，退火階段為55-60℃）2.設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，若模板DNA中G+C含量為60%，則引物的Tm值（解鏈溫度）推薦范圍是（）A.45-50℃B.50-55℃C.55-65℃D.70-75℃答案：C（引物Tm值計(jì)算公式常用經(jīng)驗(yàn)公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)，G+C含量60%時(shí)，引物長(zhǎng)度通常18-24bp，Tm值多在55-65℃）3.TaqDNA聚合酶的主要特性是（）A.具有3'→5'外切酶活性，可校正錯(cuò)配B.耐高溫（95℃仍保持活性）C.最適反應(yīng)溫度為37℃D.只能以RNA為模板合成DNA答案：B（Taq酶無(wú)3'→5'外切酶活性，無(wú)校正功能；最適溫度72℃；以DNA為模板）4.某PCR反應(yīng)體系中，dNTP濃度過(guò)高可能導(dǎo)致的后果是（）A.引物與模板結(jié)合效率降低B.非特異性擴(kuò)增減少C.酶活性被抑制，擴(kuò)增效率下降D.產(chǎn)物長(zhǎng)度變短答案：C（dNTP濃度過(guò)高會(huì)螯合Mg2+，抑制Taq酶活性；同時(shí)可能增加錯(cuò)配概率）5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）中，SYBRGreenⅠ染料的作用原理是（）A.與雙鏈DNA小溝結(jié)合，發(fā)出熒光B.特異性識(shí)別目標(biāo)序列的探針C.標(biāo)記引物的5'端，通過(guò)水解產(chǎn)生熒光D.與單鏈DNA結(jié)合，激發(fā)熒光答案：A（SYBRGreenⅠ為雙鏈DNA嵌入染料，結(jié)合后熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)）6.以下哪種情況會(huì)導(dǎo)致PCR產(chǎn)物出現(xiàn)多條非特異性條帶？（）A.引物濃度過(guò)低B.退火溫度過(guò)高C.循環(huán)次數(shù)過(guò)多D.Mg2+濃度過(guò)低答案：C（循環(huán)次數(shù)過(guò)多會(huì)增加非特異性產(chǎn)物的積累；退火溫度過(guò)高會(huì)減少非特異性結(jié)合；Mg2+濃度過(guò)低可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率下降）7.進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）時(shí)，若使用Oligo(dT)引物合成cDNA，其適用的模板是（）A.原核生物mRNAB.真核生物mRNA（含polyA尾）C.病毒雙鏈RNAD.總RNA中的rRNA答案：B（Oligo(dT)通過(guò)結(jié)合真核mRNA的polyA尾啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄）8.擴(kuò)增人類基因組中某單拷貝基因時(shí)，若模板DNA量極少（<1ng），最可能出現(xiàn)的問題是（）A.產(chǎn)物濃度過(guò)高B.引物二聚體大量形成C.擴(kuò)增效率不穩(wěn)定，結(jié)果重復(fù)性差D.退火溫度無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)算答案：C（模板量過(guò)低時(shí)，初始DNA分子數(shù)少，可能因隨機(jī)分布導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或結(jié)果波動(dòng)）9.為驗(yàn)證某PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，最直接的方法是（）A.測(cè)定產(chǎn)物的OD260/OD280比值B.進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶大小是否符合預(yù)期C.增加循環(huán)次數(shù)后再次擴(kuò)增D.降低退火溫度后重復(fù)實(shí)驗(yàn)答案：B（凝膠電泳可通過(guò)條帶大小初步判斷特異性；OD值僅反映核酸純度和濃度）10.多重PCR技術(shù)的關(guān)鍵要求是（）A.所有引物的Tm值差異不超過(guò)5℃B.模板DNA必須來(lái)自同一物種C.只能擴(kuò)增2個(gè)目標(biāo)基因D.dNTP濃度需低于常規(guī)PCR答案：A（多重PCR需多對(duì)引物在同一體系中同時(shí)擴(kuò)增，Tm值接近可保證退火效率一致）二、簡(jiǎn)答題（每題8分，共40分）1.簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的基本原理及三步反應(yīng)的具體過(guò)程和作用。答案：PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是利用DNA半保留復(fù)制原理，通過(guò)酶促反應(yīng)在體外擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)?；静襟E包括：（1）變性（Denaturation）：94-98℃加熱使雙鏈DNA解鏈為單鏈，破壞氫鍵；（2）退火（Annealing）：溫度降至引物Tm值左右（通常55-65℃），引物與單鏈模板的互補(bǔ)序列特異性結(jié)合；（3）延伸（Extension）：72℃（Taq酶最適溫度）下，TaqDNA聚合酶以dNTP為原料，從引物3'端開始沿模板5'→3'方向合成互補(bǔ)DNA鏈。通過(guò)25-35次循環(huán)，目標(biāo)DNA片段以指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。2.引物設(shè)計(jì)是PCR實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，列舉5項(xiàng)引物設(shè)計(jì)的基本原則，并說(shuō)明理由。答案：引物設(shè)計(jì)的基本原則及理由：（1）長(zhǎng)度18-24bp：過(guò)短易非特異性結(jié)合，過(guò)長(zhǎng)則Tm值過(guò)高，影響退火效率；（2）G+C含量40%-60%：避免因GC含量過(guò)高導(dǎo)致引物二聚體或Tm值過(guò)高，過(guò)低則結(jié)合不穩(wěn)定；（3）引物3'端避免連續(xù)G/C（如GGG或CCC）：易導(dǎo)致錯(cuò)配延伸或引物二聚體；（4）引物間避免互補(bǔ)（尤其3'端）：防止引物二聚體形成，消耗反應(yīng)體系資源；（5）引物與模板非目標(biāo)區(qū)域無(wú)同源性：避免擴(kuò)增非目標(biāo)序列，保證特異性；（6）Tm值差異≤5℃（多重PCR）：確保多對(duì)引物同時(shí)有效退火。3.某實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，出現(xiàn)“無(wú)目的條帶”的結(jié)果（電泳無(wú)條帶或極弱），可能的原因有哪些？請(qǐng)?zhí)岢鲋辽?項(xiàng)可能的原因及對(duì)應(yīng)的解決措施。答案：可能原因及解決措施：（1）模板質(zhì)量差（如降解、雜質(zhì)污染）：提取高質(zhì)量DNA/RNA，用OD值或電泳驗(yàn)證模板完整性；（2）引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤（如結(jié)合位點(diǎn)突變、Tm值過(guò)低）：重新設(shè)計(jì)引物并驗(yàn)證Tm值，或通過(guò)BLAST檢查引物與模板的匹配性；（3）Taq酶失活或濃度過(guò)低：更換新酶，或增加酶量（需避免過(guò)量導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增）；（4）Mg2+濃度不當(dāng)：Mg2+是Taq酶的激活劑，濃度過(guò)低會(huì)抑制酶活性，可通過(guò)梯度實(shí)驗(yàn)優(yōu)化（通常1.5-2.5mM）；（5）循環(huán)參數(shù)錯(cuò)誤（如退火溫度過(guò)高、延伸時(shí)間過(guò)短）：降低退火溫度（±2℃梯度測(cè)試），延長(zhǎng)延伸時(shí)間（一般1kb/min）；（6）模板量過(guò)低：增加模板量（需避免過(guò)量導(dǎo)致抑制），或使用巢式PCR提高靈敏度。4.比較實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）中SYBRGreenⅠ法與TaqMan探針法的優(yōu)缺點(diǎn)。答案：SYBRGreenⅠ法：優(yōu)點(diǎn)：成本低（無(wú)需合成特異性探針）、操作簡(jiǎn)單（僅需引物）、適用范圍廣（可檢測(cè)任意雙鏈DNA）；缺點(diǎn)：非特異性熒光（可能結(jié)合引物二聚體或非目標(biāo)產(chǎn)物）、無(wú)法區(qū)分不同擴(kuò)增產(chǎn)物（需通過(guò)熔解曲線分析驗(yàn)證）。TaqMan探針法：優(yōu)點(diǎn)：特異性高（探針與目標(biāo)序列互補(bǔ)結(jié)合）、準(zhǔn)確性好（減少非特異性干擾）、可進(jìn)行多重檢測(cè)（不同探針標(biāo)記不同熒光基團(tuán)）；缺點(diǎn)：成本高（探針合成費(fèi)用高）、設(shè)計(jì)復(fù)雜（需考慮探針Tm值、避免二級(jí)結(jié)構(gòu)）、僅適用于已知序列的目標(biāo)基因。5.簡(jiǎn)述PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的主要應(yīng)用，并舉例說(shuō)明。答案：PCR在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用包括：（1）病原體檢測(cè)：如通過(guò)擴(kuò)增病毒（如新冠病毒、乙肝病毒）或細(xì)菌（如結(jié)核分枝桿菌）的特異性基因片段，實(shí)現(xiàn)快速、靈敏的病原學(xué)診斷；（2）遺傳病診斷：檢測(cè)單基因遺傳?。ㄈ绲刂泻Ｘ氀?、囊性纖維化）的致病基因突變（如點(diǎn)突變、缺失）；（3）腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)：通過(guò)擴(kuò)增癌基因（如BRCA1/2）或融合基因（如BCR-ABL），輔助腫瘤早期診斷和分型；（4）器官移植配型：分析HLA基因多態(tài)性，評(píng)估供受者組織相容性；（5）法醫(yī)學(xué)鑒定：通過(guò)擴(kuò)增STR（短串聯(lián)重復(fù)序列）位點(diǎn)，進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。例如，新冠病毒核酸檢測(cè)即利用qPCR技術(shù)擴(kuò)增病毒的ORF1ab和N基因，通過(guò)Ct值判斷樣本中病毒載量。三、案例分析題（每題20分，共40分）案例1：某實(shí)驗(yàn)室開展人源樣本中EB病毒（EBV）DNA的PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)步驟如下：①提取樣本DNA（經(jīng)檢測(cè)OD260/OD280=1.8，濃度50ng/μL）；②配制反應(yīng)體系（25μL）：10×Buffer2.5μL，dNTP（2.5mM）2μL，引物（10μM）各0.5μL，Taq酶（5U/μL）0.2μL，模板2μL，補(bǔ)水至25μL；③循環(huán)參數(shù)：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s（35次循環(huán)）；72℃7min。電泳結(jié)果顯示：陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)清晰條帶（200bp），陰性對(duì)照無(wú)條帶，但所有樣本均無(wú)條帶。問題：分析樣本無(wú)條帶的可能原因，并提出3項(xiàng)驗(yàn)證或改進(jìn)措施。答案：可能原因及改進(jìn)措施：（1）引物與EBV目標(biāo)序列不匹配：可能因EBV毒株變異導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)突變。驗(yàn)證方法：通過(guò)NCBIBLAST比對(duì)引物序列與EBV參考基因組（如B95-8株）的同源性；改進(jìn)措施：重新設(shè)計(jì)覆蓋保守區(qū)域的引物。（2）Taq酶活性不足：體系中Taq酶用量為0.2μL×5U/μL=1U，常規(guī)用量為1-2.5U/25μL體系，可能因酶量不足導(dǎo)致擴(kuò)增效率低。驗(yàn)證方法：更換新批次Taq酶；改進(jìn)措施：增加酶量至1.5-2U。（3）模板中存在PCR抑制劑：雖然OD值顯示純度良好，但樣本可能含肝素、血紅蛋白等抑制劑（如全血樣本未徹底去除）。驗(yàn)證方法：將樣本DNA做10倍稀釋后重復(fù)實(shí)驗(yàn)（稀釋可降低抑制劑濃度）；改進(jìn)措施：優(yōu)化DNA提取步驟（如增加洗滌次數(shù)）。（4）延伸時(shí)間過(guò)短：目標(biāo)片段200bp，延伸時(shí)間30s（Taq酶延伸速率約1kb/min）理論足夠，但可能因模板復(fù)雜（如GC含量高）導(dǎo)致延伸不完全。驗(yàn)證方法：延長(zhǎng)延伸時(shí)間至45s；改進(jìn)措施：調(diào)整循環(huán)參數(shù)中的延伸時(shí)間。案例2：某研究小組使用qPCR檢測(cè)小鼠肝臟組織中基因X的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：-樣本：正常組（3只）、模型組（3只）；-操作：提取總RNA→逆轉(zhuǎn)錄為cDNA→以GAPDH為內(nèi)參基因，用SYBRGreen法檢測(cè)基因X和GAPDH的表達(dá)量；-結(jié)果：正常組基因X的Ct值為25.3±0.5，GAPDHCt值為18.2±0.3；模型組基因XCt值為28.1±0.7，GAPDHCt值為18.5±0.4。問題：（1）計(jì)算模型組相對(duì)于正常組基因X的相對(duì)表達(dá)量（采用2^-ΔΔCt法）；（2）分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中可能影響結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，并提出改進(jìn)建議。答案：（1）相對(duì)表達(dá)量計(jì)算：正常組ΔCt=Ct(基因X)-Ct(GAPDH)=25.3-18.2=7.1模型組ΔCt=28.1-18.5=9.6ΔΔCt=模型組ΔCt-正常組ΔCt=9.6-7.1=2.5相對(duì)表達(dá)量=2^-ΔΔCt=2^-2.5≈0.177（即模型組基因X表達(dá)量約為正常組的17.7%）（2）可能影響準(zhǔn)確性的因素及改進(jìn)建議：①樣本量不足：每組僅3只小鼠，個(gè)體差異可能影響結(jié)果穩(wěn)定性。改進(jìn)：增加樣本量（如每組5-6只），或進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)（每樣本測(cè)3次技術(shù)重復(fù)）。②逆轉(zhuǎn)錄效率差異：若不同樣本的RNA濃度或逆轉(zhuǎn)錄效率不一致，會(huì)影響cDNA質(zhì)量。改進(jìn)：測(cè)定RNA濃度并統(tǒng)一上