ICS65.020

B15

!"#$

T/CIXXX-2021

!"#$%&'())$*+,-)./01234

Technicalspecificationsforpathogendetectionanddisease

resistanceidentificationofsugarcanewhiteleafdiseaseinlow

latitudeplateau

（征求意?稿）

5655787889:565578788;<

=>>?@1ABC9:

前言

本指南按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)

和起草規(guī)則》起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由中國國際科技促進(jìn)會標(biāo)準(zhǔn)化工作委員會提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由中國國際科技促進(jìn)會歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所、臨滄南華糖業(yè)有限公司、保山市農(nóng)

業(yè)技術(shù)推廣中心、耿馬南華糖業(yè)有限公司、臨滄市甘蔗技術(shù)推廣站、瀾滄縣甘蔗

技術(shù)推廣站、西盟縣經(jīng)濟(jì)作物工作站負(fù)責(zé)起草。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：黃應(yīng)昆、李文鳳、李婕、盧文潔、王曉燕、代光偉、段

兆祜、單紅麗、張榮躍、董有波、黃丕忠、李銀煳、羅志堅(jiān)、南云剛、李茅苗、

巖文、石紅軍、唐吉昌、魯賓、段明雄、白升偉、林文根、董顯華、周中、施永

祥、者林成、李文富。

本標(biāo)準(zhǔn)是首次發(fā)布。

2

低緯高原甘蔗白葉病病原檢測與抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程

1適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了低緯高原甘蔗白葉病病原檢測與抗病性鑒定的術(shù)語定義、縮略

語、癥狀及流行特點(diǎn)、病原檢測與抗病性鑒定的技術(shù)方法和標(biāo)準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于甘蔗白葉病的分子檢測和甘蔗種質(zhì)資源對甘蔗白葉病抗病性

的人工接種鑒定與評價(jià)。

2引用標(biāo)準(zhǔn)

下列文件中的條款，通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的

引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版

本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T28067甘蔗黃葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法

3術(shù)語定義

3.1巢式PCR：巢式PCR是一種使用兩對PCR引物擴(kuò)增完整的片段，第一

對PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似，第二對引物結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)

部，使得二次PCR擴(kuò)增靈敏度高于一次PCR擴(kuò)增的變異聚合酶鏈反應(yīng)。

3.2甘蔗白葉?。⊿ugarcanewhiteleaf,SCWL）：由甘蔗白葉病植原體

（Sugarcanewhiteleafphytoplasma）系統(tǒng)性侵染甘蔗使蔗葉上出現(xiàn)單條或

數(shù)條白色條紋甚至全葉變成白色葉質(zhì)柔軟，病株分蘗增多并矮縮的一種種傳植原

體病害。

4縮略語

3

bp：堿基對(basepair)

CTAB：十六烷基三甲基溴化銨(HexadecylTrimethylAmmonium

Bromide)

dNTPs：脫氧核苷三磷酸混合液(DeoxyribonucleosideTriphosphates

mixture)

ddH2O：雙蒸水

EDTA：乙二胺四乙酸(EdetateDisodium)

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerasechainreaction)

Tris：三羥甲基氨基甲烷(HydroxymethylMethylAminomethane)

5癥狀及流行特點(diǎn)

甘蔗白葉病癥狀及流行特點(diǎn)參見附錄A。

6病原檢測

6.1儀器與器材

儀器與器材包括臺式離心機(jī)、小型離心機(jī)、微量可調(diào)移液器、恒溫水浴鍋、

旋渦混勻儀、核酸蛋白分析儀、PCR擴(kuò)增儀、電泳槽、電泳儀等電泳裝置、凝

膠成像儀、冰箱（溫控范圍4℃和-20℃）、高壓滅菌鍋、鼓風(fēng)干燥箱、液氮罐、

電子天平、帶濾芯移液頭、PCR反應(yīng)管等。

6.2試劑

除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純。

6.2.1DNA提取試劑

DNA提取試劑及配制方法見附錄B。

4

6.2.2PCR試劑

PCR試劑及配制方法參見附錄B。

6.2.3電泳緩沖液

儲存液為50倍TAE電泳緩沖液，配制方法見附錄B，工作液用ddH2O將

儲存液稀釋50倍后獲得。

6.2.4擴(kuò)增產(chǎn)物檢測試劑

瓊脂糖、Goldenview核酸染料、6倍上樣緩沖液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

6.3采樣及樣品處理

6.3.1采樣工具

采樣工具處理按照GB/T28067的要求執(zhí)行。

6.3.2采樣方法

采樣方法參照GB/T28067的要求執(zhí)行。其中，葉片樣品采集時(shí)首選疑似甘

蔗白葉病病株，具體參見附錄A，樣品獨(dú)立分裝，編號備用。

6.3.3樣品保存

樣品存放與運(yùn)送按照GB/T28067要求執(zhí)行。

6.4DNA提取

DNA提取方法參見附錄B。

6.5巢式PCR檢測

巢式PCR檢測方法參見附錄C。

6.6結(jié)果判定

陽性對照有條帶，陰性對照和空白對照無條帶時(shí)，檢測結(jié)果有效，當(dāng)檢測結(jié)

果有效時(shí)，依據(jù)表1進(jìn)行結(jié)果判定。

表1判定表

5

目的條帶大?。╞p）樣品陽性對照陰性對照空白對照結(jié)果判定

1240有有無無含白葉病植原體

1240無有無無不含白葉病植原體

7抗病性鑒定

7.1材料選擇與處理

7.1.1材料選擇

選擇經(jīng)Nest-PCR檢測不帶SCWL植原體的健壯蔗株。

7.1.2對照材料

鑒定材料中加入甘蔗品種粵糖86-368、新臺糖25號作感病對照，粵糖83-88、

云蔗05-51作抗病對照。

7.1.3材料處理

分別切成雙芽段，在流動冷水中浸泡48h之后，用（50±0.5）℃熱水處理

2h，再用70%噻蟲嗪水分散劑和50%多菌靈可濕性粉劑1：800液浸種5min～

10min。

7.1.4土壤準(zhǔn)備

土壤經(jīng)高溫蒸煮消毒后，按消毒土壤和有機(jī)肥（3：1）混勻，裝入（?35cm×

高30cm）塑料桶內(nèi)，裝入量為桶容量的三分之二。

7.2接種病原

從甘蔗白葉病發(fā)病區(qū)域選擇具典型白葉病癥狀的高感品種粵糖86-368蔗株，

經(jīng)巢式PCR檢測篩選含SCWL植原體的蔗莖作接種病原。

7.3接種液制備

6

接種前通過壓榨作接種病原的蔗莖獲取攜帶SCWL植原體蔗汁，加入為攜

帶SCWL植原體蔗汁體積10倍量的無菌水稀釋混勻，用雙層紗布過濾，濾液即

為SCWL植原體接種液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

7.4接種方法

7.4.1接種方法選擇

接種方法可選用包衣接種法或切莖接種法。

7.4.2包衣接種法

7.4.2.1包衣接種

處理好的蔗種置于塑料膜表面，按1000kg處理好的蔗種用15kg接種液的

比例，采用電動噴霧器將接種液均勻噴灑置于塑料膜表面的蔗種，邊噴邊翻動蔗

種，噴完后將該塑料膜的一半覆蓋蔗種，于25℃下保濕24h。

7.4.2.2材料種植

接種后的供試材料分別種植在塑料桶內(nèi)，每份供試材料種植4桶，4次重復(fù)，

每桶種植8芽，共32芽，置于20℃～30℃抗病蟲鑒定防蟲溫室中培養(yǎng)。

7.4.3切莖接種法

7.4.3.1材料種植

處理后的供試材料分別種植在塑料桶內(nèi)，每份供試材料種植4桶，4次重復(fù)，

每桶種植8芽，共32芽，置于20℃～30℃抗病蟲鑒定防蟲溫室中培養(yǎng)。接種

時(shí)每桶選擇長勢較一致的8株，共32株。

7.4.3.2切莖接種

供試材料6月株齡時(shí)，在陰天的傍晚用滅菌鋒利切刀（或枝剪）把供試材料

7

植株地上部分沿土表快速切去，用移液槍將100μLSCWL植原體接種液滴入蔗

株根部切口上，每份供試材料接種32株，遮光24h。接種后置于20℃～30℃

抗病蟲鑒定防蟲溫室中培養(yǎng)觀察。

7.5病情調(diào)查

包衣接種30d和切莖接種20d后，調(diào)查各供試材料發(fā)病株率，以后每隔

15d調(diào)查1次，直至感病對照品種發(fā)病株率穩(wěn)定為止。記錄接種日期、接種芽

（株）數(shù)、出苗數(shù)、病害癥狀始現(xiàn)期、累計(jì)發(fā)病株數(shù)。

計(jì)算公式：

累計(jì)發(fā)病株率（%）按公式（1）計(jì)算：

BP=sn1/sn2×100%.............................................................(1)

式中：BP——累計(jì)發(fā)病株率（%）

sn1——累計(jì)發(fā)病株數(shù)

sn2——累計(jì)總株數(shù)

7.6抗病性評價(jià)

按以下分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗病性評價(jià)，見表2。

表2甘蔗抗白葉病鑒定評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

級別發(fā)病率%抗病性

1級0-3.0高抗(HR)

2級3.1-10.0抗病(R)

3級10.1-20.0中抗(MR)

4級20.1-40.0感病(S)

8

5級40.1-100高感(HS)

9

DEF

G資料.DEH

%&'()IJ及流?特點(diǎn)

FKL%&')IJ

?蔗?葉病癥狀類型可歸納為?葉型和草苗型兩類。?葉型病株葉?表現(xiàn)為

葉質(zhì)柔軟，葉綠素含量減少??化。有的整葉?化，有的呈條紋狀?化，有的呈

斑駁狀?化。草苗型病株莖部現(xiàn)???條紋，分蘗明顯增多，病株矮縮，莖細(xì)，

節(jié)間縮短，頂部葉?叢?，外觀如草苗。草苗型病株和?葉型病株?；旌铣霈F(xiàn)，

這種混合型病株最容易枯死，即使成活也常不成莖。僅葉??化??分蘗過多的

病株雖可枯死，但不枯死的病株可恢復(fù)，有的恢復(fù)?例也較?，有的甚?恢復(fù)到

與健株外觀難以區(qū)別，但到宿根蔗?再現(xiàn)典型癥狀，?圖A.1。

ABCD

MFKL%&'()IJ

A：病葉；B：病株；C：病叢；D：病?

FK5%&'()流?特點(diǎn)

?蔗?葉病(Sugarcanewhiteleaf,SCWL)是由16SrXI組中的?蔗?葉病植

原體（Sugarcanewhiteleafphytoplasma）引起的?種檢疫性?蔗重要病害。

SCWL植原體為?細(xì)胞壁原核微?物，尚不能在??培養(yǎng)基離體培養(yǎng)，潛育期較

?，最短的約為30天(少數(shù))，?般為2～3個(gè)?，有的甚??達(dá)?年之久。寄主

主要有?蔗（Sugarcane）、百慕?草（Bermudagrass）。

SCWL植原體存在于病株韌?部篩管中，?蔗是?性繁殖作物，SCWL可通

過帶病蔗種進(jìn)?遠(yuǎn)距離傳播，且傳播性極強(qiáng)。此外，SCWL在?間還可通過細(xì)針

葉蟬MatsumuratettixhiroglyphicusMatsumura和條紋閉顏葉蟬Yamatotettix

flavovittatusMatsumura傳播。?病蔗留種，特別是基部數(shù)節(jié)留種，?出的幼苗?

乎全為病苗，萌發(fā)后1個(gè)?左右就死亡。病害的發(fā)?受品種抗性，種蔗帶毒率、

傳毒?媒葉蟬的數(shù)量及環(huán)境條件等諸因素的影響。如品種?度感病，種蔗帶毒率

?，加上環(huán)境條件?有利于介體昆?的繁殖和傳毒活動，則病害往往發(fā)?較重，

反之則發(fā)?較輕。宿根蔗?般?新植蔗發(fā)病重。

10

DEN

O3P.DEQ

RSTUVWXFYZ

NKLWXFYZRSTU

DNA提取試劑配制?法?表B.1。

[FKL5\]^FN_Y`ab

組分配制量（L）配制?法

-1

1.0mol·L1稱取121.0gTris，溶解于800mL的ddH2O中，?6

-1

Tris-HCl(pH8.0)?液mol·L的HCL調(diào)節(jié)pH?8.0后，?ddH2O定容到

1.0L。

-1

0.5mol·L1稱取186.0gNa2EDTA·2H2O，加?800mLddH2O，充

EDTA(pH8.0)的?液分?jǐn)嚢瑁?2mol·L-1的NaOH調(diào)節(jié)pH?8.0后，?

ddH2O定容到1.0L。

2倍CTAB抽提緩沖液1依次加?20g的CTAB粉末，100mL的1.0mol·L-1的

Tris-HCl(pH8.0)?液，40mL的0.5mol·L-1的

EDTA(pH8.0)的?液，81.8g的NaCl，?滅菌雙蒸定

容到1.0L。

NK5WXFYZ

DNA提取?法如下：

a)取數(shù)?1.5mL?DNA酶的Eppendorf管，1管陽性對照、1管陰性對照，

對每個(gè)管進(jìn)?編號。

b)稱取0.2g新鮮葉?樣品剪細(xì)，加液氮充分研磨成粉末狀后，轉(zhuǎn)?2.0mL

滅菌離?管。

c)?即加?1.0mL預(yù)熱（約65°C）的2倍CTAB抽提緩沖液，震蕩混勻，65°C

?浴30min，室溫12,000rpm離?10min。

d)取上清加等體積的氯仿/異戊醇(V/V=24:1)，劇烈振蕩混勻，室溫12,000rpm

離?10min。

e)取750μL上清?另?新的滅菌離?管中，加2/3體積異丙醇，顛倒混勻，

-20°C放置1h，12000rpm離?10min。

f)沉淀加?70%?醇500μL，12000rpm離?5min，棄上清，沉淀于中室溫

下1.5mL滅菌離?管??，溶于50μLddH2O。

g)?核酸蛋?分析儀測定波?260nm和280nm處吸光值，當(dāng)A260/A280?值

在1.8～2.0之間時(shí)，將樣品于-20°C保存?zhèn)?。

11

DE]

G3P.DEH

cde]f*+ghij

]KLklRSTU

PCR擴(kuò)增試劑配制配制?法如下。

]KLKLcdmnoe]fpqrsb

巢式第?次PCR反應(yīng)混合液配制?表C.1。

表C.1巢式PCR反應(yīng)混合液(25μL體系)

組分使?量（μL）終濃度

DNA1.0-

20μmol·L-1上游引物P11.00.4μmol·L-1

20μmol·L-1下游引物P71.00.4μmol·L-1

10倍PCR緩沖液2.51倍

-1-1

25mmol·LMgCl22.00.8μmol·L

10mmol·L-1dNTPs2.00.8μmol·L-1

5U·μL-1Taq酶0.20.32U·μL-1

ddH2O15.3-

]KLK5cdmtoe]fpqrsb

巢式第?次PCR反應(yīng)混合液配制?表C.2。

表C.2巢式PCR反應(yīng)混合液(25μL體系)

組分使?量（μL）終濃度

DNA1.0-

20μmol·L-1上游引物R16F2n1.00.4μmol·L-1

20μmol·L-1下游引物R16R21.00.4μmol·L-1

10倍PCR緩沖液2.51倍

-1-1

25mmol·LMgCl22.00.8μmol·L

10mmol·L-1dNTPs2.00.8μmol·L-1

5U·μL-1Taq酶0.20.32U·μL-1

ddH2O15.3-

]K5uv

陽性對照：確認(rèn)含?蔗?葉病植原體樣品的DNA做陽性對照。

陰性對照：確認(rèn)不含?蔗?葉病植原體樣品的DNA做陰性對照。

空?對照：?等體積ddH2O替代樣品做空?對照。

]Kwxy

]KwKLxyz{

巢式第?次PCR上游引物P1：5’-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3’，下游引

物P7：5’-CGTCCTTCATCGGCTCCT-3’。

巢式第?次PCR上游引物R16F2n：5’-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3’，下游引

物R16R2：5’-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3’。

]KwK5xy|TU

-1

上述巢式PCR引物?ddH2O稀釋?濃度為20μmol·L。

]K}cde]fkl

]K}KLcde]f~?TU

12

巢式PCR體系配制?法如下：

a)在冰上融化各反應(yīng)試劑組分，瞬間低速離?（2,000rpm下離?3s～5s），

加?陽性對照、陰性對照和空?對照。根據(jù)測試樣品數(shù)量，計(jì)算各試劑使?量，

每份樣品設(shè)置2個(gè)平?反應(yīng)。

b)第?次PCR反應(yīng)：25μLPCR反應(yīng)體系，按表C.1依次加?反應(yīng)試劑，

瞬間低速離?混勻。

c)第?次PCR反應(yīng)：取第?次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋30倍，取1.0μL作擴(kuò)增模

板，按表C.2依次加?反應(yīng)試劑，瞬間低速離?混勻。

]K}K5cde]fkl4z

在Bio-RadC1000PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)?擴(kuò)增，巢式PCR擴(kuò)增程序如下：

a)第?次PCR反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性3min；94°C變性30s，55°C退?60s，

72°C延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min。

b)第?次反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性3min；94°C變性30s，57°C退?30s，72

°C延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min。

]K€????…*+,???‰??

瓊脂糖電泳檢測與凝膠成像分析?法如下：

a)配制濃度為1.5%（W/V）的瓊脂糖凝膠（即1倍TAE電泳緩沖液100mL

加1.5g瓊脂糖），加熱融化混勻，冷卻?60°C左右，加?濃度為0.005%Goldenview

核酸染料（按每100mL瓊脂糖溶液中加?5μL核酸染料溶液的?例），混勻后

倒?膠槽，插上樣品梳。

b)室溫下待凝膠凝固后，垂直向上拔出固定在凝膠中的樣品梳，將瓊脂糖

凝膠和膠板置于電泳槽中，使樣本孔位于電場負(fù)極，向電泳槽中加?1倍TAE

電泳緩沖液。

c)取10μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物，加2μl上樣緩沖液并混勻，然后依次將DNA分

?量標(biāo)準(zhǔn)、檢測樣品、陽性對照、陰性對照、空?對照上樣到點(diǎn)樣孔中。電泳電

壓為130V，當(dāng)上樣緩沖液中的溴酚藍(lán)條帶遷移?凝膠1/2的位置，停?電泳。

d)取出瓊脂糖凝膠，置于凝膠成像儀成像拍照、保存。

A___________________________

_________________________________

13

?錄

前?............................................................................................................................2

低緯?原?蔗?葉病病原檢測與抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程............................................3

1適?范圍....................................................................................................................3

2引?標(biāo)準(zhǔn)....................................................................................................................3

3術(shù)語定義....................................................................................................................3

4縮略語........................................................................................................................3

5癥狀及流?特點(diǎn)........................................................................................................4

6病原檢測....................................................................................................................4

6.1儀器與器材.......................................................................................................4

6.2試劑...................................................................................................................4

6.3采樣及樣品處理...............................................................................................5

6.4DNA提取.........................................................................................................5

6.5巢式PCR檢測...............................................................................................5

6.6結(jié)果判定...........................................................................................................5

7抗病性鑒定................................................................................................................6

7.1材料選擇與處理...............................................................................................6

7.2接種病原...........................................................................................................6

7.3接種液制備.......................................................................................................6

7.4接種?法...........................................................................................................7

7.5病情調(diào)查...........................................................................................................8

7.6抗病性評價(jià).......................................................................................................8

附錄A（資料性附錄）?蔗?葉病癥狀及流?特點(diǎn)..................................10

A.1?蔗?病癥狀................................................................................................10

A.2?蔗?葉病流?特點(diǎn)....................................................................................10

附錄B........................................................................................................................11

附錄C........................................................................................................................12

（規(guī)范性附錄）...........................................................................................................12

巢式PCR檢測操作?法............................................................................................12

表C.1巢式PCR反應(yīng)混合液(25μL體系)............................................................12

表C.2巢式PCR反應(yīng)混合液(25μL體系)............................................................12

A___________________________............................................................................13

1

低緯高原甘蔗白葉病病原檢測與抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程

1適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了低緯高原甘蔗白葉病病原檢測與抗病性鑒定的術(shù)語定義、縮略

語、癥狀及流行特點(diǎn)、病原檢測與抗病性鑒定的技術(shù)方法和標(biāo)準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于甘蔗白葉病的分子檢測和甘蔗種質(zhì)資源對甘蔗白葉病抗病性

的人工接種鑒定與評價(jià)。

2引用標(biāo)準(zhǔn)

下列文件中的條款，通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的

引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版

本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T28067甘蔗黃葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法

3術(shù)語定義

3.1巢式PCR：巢式PCR是一種使用兩對PCR引物擴(kuò)增完整的片段，第一

對PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似，