腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)隨著干細(xì)胞生物學(xué)以及腫瘤學(xué)研究的不斷深入，腫瘤干細(xì)胞已成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)。腫瘤干細(xì)胞的體外培養(yǎng)在腫瘤干細(xì)胞研究領(lǐng)域具有不可替代的重要地位，通過分離、純化及培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞可以對(duì)其生物學(xué)特性如異質(zhì)性、腫瘤的演化、轉(zhuǎn)移和抗藥性等進(jìn)行研究，為腫瘤的早期診斷與治療提供了新的思路和策略。腫瘤干細(xì)胞的體外培養(yǎng)多采用無血清培養(yǎng)基(serumfreemedium,SFM)，根據(jù)不同的細(xì)胞類型加入適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子聯(lián)合培養(yǎng)以防止其分化。腫瘤細(xì)胞系或者是臨床腫瘤組織聯(lián)合采用機(jī)械和膠原酶消化腫瘤組織得到單細(xì)胞懸液，經(jīng)過流式細(xì)胞儀或者免疫磁珠分選的方法得到腫瘤干細(xì)胞使用無血清培養(yǎng)基在37℃，5％CO2飽和濕度的條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)，但值得注意的是臨床腫瘤組織的獲取應(yīng)該越新鮮越好，最好是在外科手術(shù)后1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行處理否則將影響腫瘤干細(xì)胞細(xì)胞的活性，不利于體外培養(yǎng)。無血清培養(yǎng)基有很多種，針對(duì)不同的細(xì)胞類型有專門的無血清營(yíng)養(yǎng)液出售。無血清培養(yǎng)基具有以下的優(yōu)點(diǎn)：各批產(chǎn)品之間成分相對(duì)明確、質(zhì)量相對(duì)一致；便于控制培養(yǎng)的生理環(huán)境；特殊細(xì)胞類型的優(yōu)化配方有利于提高細(xì)胞的穩(wěn)定性，使不同類型的細(xì)胞能在最有利于各自生長(zhǎng)的環(huán)境中持續(xù)傳代培養(yǎng)；依據(jù)不同類型的細(xì)胞、甚至不同的細(xì)胞系(株)都可能有各自的無血清培養(yǎng)基。總的來說可以分為基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)基及附加成分兩大部分[1]?；A(chǔ)培養(yǎng)基一般采用人工合成的培養(yǎng)基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神經(jīng)干細(xì)胞專用無血清培養(yǎng)基、黑色素瘤專用培養(yǎng)基等其中以DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最為常用。附加成分是指在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入各種不同細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分，包括①營(yíng)養(yǎng)因子：胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉、牛血清白蛋白、B27、L－谷氨酰胺；②細(xì)胞因子：白血病抑制因子、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板衍化生長(zhǎng)因子等。使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化傳代后不使用血清終止胰酶的作用，可使用0.1％－0.5%大豆胰酶抑制劑(soybeantrypsininhibitor)。一、腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)中幾種常見的細(xì)胞因子(一)白血病抑制因子LIF(leukemininhibitoryfactor,LIF)是白介素6(IL-6)細(xì)胞因子家族中的一員，是典型的多功能生長(zhǎng)因子，具有多種生物學(xué)功能：對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖與分化有著廣泛的作用，抑制分化促進(jìn)干細(xì)胞增殖。胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)需要添加LIF以抑制其分化，維持其多能性。LIF可抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FibroblastGrowthFactor,FGF)、β轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(β-transformingGrowthFactor,TGFβ)和葉酸(RetinoicAcid,RA)誘導(dǎo)的細(xì)胞分化。(二)干細(xì)胞因子(stemcellfactor,SCF)又稱肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子(MGF)，Kit配體(KL)及Steel因子(SLF)，SCF可以誘導(dǎo)干和祖細(xì)胞增生。SCF主要由腦、肝臟、骨髓、胎盤等組織(尤其骨髓)中的基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞產(chǎn)生。SCF是一種作用于最早期造血干祖細(xì)胞的造血細(xì)胞因子，在維持造血及肥大細(xì)胞存活、促進(jìn)造血細(xì)胞增殖和分化、調(diào)控各系造血細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要作用。(三)表皮生長(zhǎng)因子(epidermalgrowthfactor,EGF)是含有53個(gè)氨基酸的多肽,早期研究中發(fā)現(xiàn)其有剌激表皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,是表皮細(xì)胞培養(yǎng)的最常用的添加因子之一。EGF可顯著促使細(xì)胞分裂、增殖，在一定濃度范圍內(nèi)(5~20ng/ml),隨EGF濃度提高,效應(yīng)加強(qiáng)。(四)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)1975年Gospodarowicz及其同事從牛大腦和垂體中分離純化出一種分子量為16-18kD由146個(gè)氨基酸組成的陽(yáng)離子多肽，并將其命名為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。bFGF具有多種生物學(xué)功能，可以促進(jìn)和調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等多種起源于中胚層、神經(jīng)外胚層源性的許多種細(xì)胞的增殖和分化。二、腫瘤干細(xì)胞目前腫瘤干細(xì)胞已經(jīng)在多種腫瘤細(xì)胞系以及白血病、腦瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等多種腫瘤組織中分離鑒定和培養(yǎng)。不同組織來源的腫瘤特性不同的，培養(yǎng)條件也不完全相同，本章就已有報(bào)道的從不同腫瘤細(xì)胞系或者腫瘤組織分離的腫瘤干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系加以闡述，在實(shí)際操作中讀者需要經(jīng)過摸索才能針對(duì)不同的腫瘤干細(xì)胞建立穩(wěn)定的體外培養(yǎng)條件。(一)白血病干細(xì)胞ALL急性淋巴細(xì)胞白血病干細(xì)胞(CD34+/CD10–/CD19–)采用懸浮培養(yǎng)體系培養(yǎng)[2]。ALL急性淋巴細(xì)胞白血病患者來源的骨髓用Ficoll分離得到單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，使用IMDM(Gibco)添加50%FCS(Gibco)和10%DMSO二甲基亞砜(ManorParkPharmaceuticals)凍存液將分離得到的MNC在液氮中備用。培養(yǎng)時(shí)以5×105個(gè)/mL密度接種在IMDM無血清培養(yǎng)基中，添加了10μg/mL人胰島素，200μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma-Aldrich)和2%HAS。使用時(shí)以下兩組生長(zhǎng)因子任選其一：①20ng/mL重組人Fms樣酪氨酸激酶3(rhFlt3)配體、20ng/mL重組人白介素3(rhIL-3)、20ng/mLrhIL-6、20ng/mLrhGM-CSF、20ng/mLrhG-CSF和50ng/mLSCF。②20ng/mLrhIL-3、10ng/mLrhIL-7和50ng/mLSCF(R&DSystems)。每周半量換液一次，培養(yǎng)6周后收集細(xì)胞用于細(xì)胞遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)分析。(二)乳腺癌干細(xì)胞乳腺癌干細(xì)胞培養(yǎng)多參考MaxWicha及其同事建立的人乳腺上皮干/祖細(xì)胞體外懸浮培養(yǎng)體系[3]，在無血清培養(yǎng)基中乳腺上皮干細(xì)胞呈懸浮非分化形式生長(zhǎng)，我們稱之為乳腺干細(xì)胞球。原代培養(yǎng)時(shí)在超低粘附板(Corning)以20000個(gè)/mL活性細(xì)胞傳代時(shí)以1000個(gè)/mL密度進(jìn)行培養(yǎng)。無血清培養(yǎng)基選擇無血清乳腺上皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基MEGM(BioWhittaker)，添加了B27(Invitrogen)、20ng/mlEGF、20ng/mLbFGF(BDBiosciences)和4μg/mL肝磷脂(Sigma)，不添加牛垂體浸膏。乳腺干細(xì)胞球培養(yǎng)7－10天后用0.05%胰酶和地消化細(xì)胞球在完全新鮮的培養(yǎng)液中傳代單個(gè)活小的聚集物。CD133為肺癌干細(xì)胞標(biāo)記。(八)卵巢癌小鼠乳腺癌細(xì)胞系MOVCAR7和4306在含有4%FBS(MIS-free)DMEM并添加了L-谷氨酰胺，1%青霉素/鏈霉素，1%胰島素－轉(zhuǎn)鐵蛋白－硒ITS(GIBCO)37°C,5%CO2,在T175培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)[15]。臨床標(biāo)本去除紅細(xì)胞后，10%FBSRPMI，1%青霉素/鏈霉素和1%兩性霉素。(九)肝癌干細(xì)胞人肝癌細(xì)胞系HuH7細(xì)胞系中分選得到的SP細(xì)胞使用無血清培養(yǎng)基DMEM/Ham’sF-12(Invitrogen)中，作者[16]嘗試了添加干細(xì)胞因子SCF(Chemicon),血小板衍生的生長(zhǎng)因PDGF(PeproTech),堿性成纖維生長(zhǎng)因子bFGF(R&DSystems)和白血病抑制因子LIF(Chemicon)，最終確立了添加20ng/ml重組人LIF,可以有效的培養(yǎng)HuH7細(xì)胞系中的腫瘤干細(xì)胞。(十)鼻咽癌干細(xì)胞人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-1、CNE－2等分選SP細(xì)胞即為鼻咽癌細(xì)胞干細(xì)胞，將分選后的細(xì)鼻咽癌干細(xì)胞ultraMEM培養(yǎng)基(cambrex)添加5％FBS，10ng/mlbFGF(sigma)和10ng/mlEGF(sigma)1mmol/LL－谷氨酰胺(sigma)50U/ml青霉素G和50μg/ml鏈霉素[17]。干細(xì)胞培養(yǎng)最初用飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)，其缺點(diǎn)為操作復(fù)雜，有多種交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，目前較少采用。實(shí)際上飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)揮著關(guān)鍵作用的是飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，因此，使用無血清培養(yǎng)基中添加一定量的LIF、EGF、bFGF等細(xì)胞因子完全可以取代飼養(yǎng)層細(xì)胞,抑制干細(xì)胞分化并維持其增殖。但是，由于干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中存在自發(fā)分化趨勢(shì)，通常認(rèn)為干細(xì)胞包括胚胎、骨髓血、臍帶血干細(xì)胞以及腫瘤干細(xì)胞只能做短期培養(yǎng)，從而限制了干細(xì)胞的擴(kuò)增和研究。AkioSoeda[18]等從臨床腦腫瘤組織中原代培養(yǎng)并建立了一個(gè)腦腫瘤干細(xì)胞系，腦腫瘤細(xì)胞在有血清培養(yǎng)基中貼壁單層培養(yǎng)后換無血清培養(yǎng)基仍可以形成新的細(xì)胞球并且移植到免疫缺陷鼠中有致瘤能力。重新形成的細(xì)胞球保持了干細(xì)胞特性，而且從中分離得到的單個(gè)腫瘤干細(xì)胞可以形成新的細(xì)胞球和腫瘤甚至可以在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)超過2年時(shí)間。這說明了腫瘤干細(xì)胞中有部分細(xì)胞在非貼壁或貼壁條件下傳代多次后仍然保持了干細(xì)胞的特性。胰腺癌、食管癌、頭頸部皮膚癌中腫瘤干細(xì)胞也已經(jīng)分離和鑒定但是到目前為止還未見有體外培養(yǎng)的報(bào)道。因此，如何建立穩(wěn)定的干細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件，防止腫瘤干細(xì)胞的分化仍然是一個(gè)急需解決的問題。(江蘇大學(xué)徐學(xué)靜，錢暉)參考文獻(xiàn)：[1]司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正主編。細(xì)胞培養(yǎng)。西安：世界圖書出版公司，2004.[2]CoxCV,EvelyRS,OakhillA,PamphilonDH,GouldenNJ,BlairA.Characterizationofacutelymphoblasticleukemiaprogenitorcells.Blood,2004,104(9):2919-2925.[3]DontuG,AbdallahWM,FoleyJM,JacksonKW,ClarkeMF,KawamuraMJ,WichaMS.Invitropropagationandtranscriptionalprofilingofhumanmammarystem/progenitorcells.GenesDev,2003,17(10):1253-1270.[4]PontiD,CostaA,ZaffaroniN,PratesiG,PetrangoliniG,CoradiniD,PilottiS,PierottiMA,DaidoneMG.IsolationandInvitroPropagationofTumorigenicBreastCancerCellswithStem/ProgenitorCellProperties.CancerRes,2005,65(13):5506-5511.[5]PhillipsTM,McBrideWH,PajonkF.TheResponseofCD24?/low/CD44+BreastCancer–InitiatingCellstoRadiation.JNatlCancerInst,2006,98(24):1777-1785.[6]SinghSK,ClarkeID,TerasakiM,BonnVE,HawkinsC,SquireJ,DirksPB.IdentificationofaCancerStemCellinHumanBrainTumors.CancerRes,2003,63(18):5821-5828.[7]SinghSK,HawkinsC,ClarkeID,SquireJA,BayaniJ,HideT,HenkelmanRM,CusimanoMD,DirksPB.Identificationofhumanbraintumourinitiatingcells.Nature,2004,432(7015):396-401.[8]KondoT,SetoguchiT,TagaT.Persistenceofasmallsubpopulationofcancerstem-likecellsintheC6gliomacellline.ProcNatlAcadSciUSA,2004,101(3):781-786.[9]GhodsAJ,IrvinD,LiuG,YuanX,AbdulkadirIR,TuniciP,KondaB,Wachsmann-HogiuS,BlackKL,YuJS.SpheresIsolatedfrom9LGliosarcomaRatCellLinePossessChemoresistantandAggressiveCancerStem-LikeCells.StemCells,2007,25(7):1645-1653.[10]FangD,NguyenTK,LeishearK,FinkoR,KulpAN,HotzS,VanBellePA,XuX,ElderDE,HerlynM.ATumorigenicSubpopulationwithStemCellPropertiesinMelanomas.CancerRes,2005,65(20):9328-9337.[11]DouJ,PanM,WenP,LiY,TangQ,ChuL,ZhaoF,JiangC,HuW,HuK,GuN.IsolationandIdentificationofCancerStem-LikeCellsfromMurineMelanomaCellLines.CellMolImmunol,2007,4(6):467-472.[12]Ricci-VitianiL,LombardiDG,PilozziE,BiffoniM,TodaroM,PeschleC,DeMariaR.Identificationandexpansionofhumancolon-cancer-initiatingcells.Nature,2007,445(7123):111-115.[13]CollinsAT,BerryPA,HydeC,StowerMJ,MaitlandNJ.ProspectiveIdentificationofTumorigenicProstateCancerStemCells.CancerRes,2005,65(23):10946-10951.[14]EramoA,LottiF,SetteG,PilozziE,BiffoniM,DiVirgilioA,ConticelloC,RucoL,PeschleC,DeMariaR.Identificationandexpansionofthetumorigeniclungcancerstemcellpopulation.CellDeathDiffer,2008,15(3):504-514.[15]SzotekPP,Pieretti-VanmarckeR,MasiakosPT,DinulescuDM,ConnollyD,FosterR,DombkowskiD,PrefferF,MaclaughlinDT,DonahoePK.Ovariancancersidepopulationdefinescellswithstemcell-likecharacteristicsandMullerianInhibitingS