喉鱗癌中S100A4與MMP-9表達(dá)特征及相關(guān)性的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1喉鱗癌的疾病現(xiàn)狀喉癌作為頭頸部常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出一定的發(fā)病態(tài)勢(shì)。喉結(jié)構(gòu)中多為假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮，這使得90%的喉癌病理類型為鱗癌，即喉鱗癌。喉鱗癌在頭頸部腫瘤家族中占據(jù)重要地位，發(fā)病率約為10萬(wàn)分之2.1，約占全身腫瘤的1%-5%，病死率達(dá)10萬(wàn)分之1.1，在頭頸部腫瘤中排第3位。其發(fā)病年齡多集中于50-70歲，由于病因?qū)W研究已明確吸煙與喉癌發(fā)生的相關(guān)性，男性發(fā)病居多，男女比例約為4:1。在地域分布上，不同地區(qū)的喉鱗癌發(fā)病率存在差異，我國(guó)東北地區(qū)便是喉癌的高發(fā)區(qū)之一。過(guò)去十年間，我國(guó)喉癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，給患者的健康和生活質(zhì)量帶來(lái)了嚴(yán)重威脅。目前，喉癌的主要治療手段包括手術(shù)、放療和化療。然而，喉癌對(duì)放療及化療均不敏感，手術(shù)雖為主要治療方式，但腫瘤的局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移仍是臨床治療和預(yù)后的重大挑戰(zhàn)，也是導(dǎo)致患者治療失敗和死亡的主要原因。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，涉及多步驟、多階段、多途徑以及多基因的變化。在這一過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落，與基底膜粘著，產(chǎn)生蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而侵入血管或淋巴管，誘導(dǎo)腫瘤血管形成，最終在遠(yuǎn)處形成轉(zhuǎn)移灶。因此，深入研究喉鱗癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找有效的分子標(biāo)記物，對(duì)于提高喉鱗癌的治療效果和改善患者預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。1.1.2S100A4和MMP-9研究的重要性在腫瘤研究領(lǐng)域，探尋與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子標(biāo)記物一直是研究的重點(diǎn)。S100A4和MMP-9作為兩種關(guān)鍵的分子標(biāo)記物，與喉鱗癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移緊密相連，對(duì)揭示喉鱗癌的發(fā)病機(jī)制和治療策略具有不可忽視的重要意義。S100A4屬于S100家族蛋白，是一種膠質(zhì)細(xì)胞衍生性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。S100家族蛋白作為鈣離子結(jié)合蛋白，在分子結(jié)構(gòu)上具有高度同源性，擁有共同的EF雙螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸基序，即手型鈣離子結(jié)合區(qū)。這一特殊基序能夠促進(jìn)其與鈣離子高度結(jié)合，進(jìn)而參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。S100A4基因定位于1q21，編碼由101個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量約為11.7kDa。它在多種實(shí)體瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞內(nèi)外功能，如細(xì)胞生長(zhǎng)和新陳代謝，影響細(xì)胞骨架形成、改變細(xì)胞形狀、參與信號(hào)傳導(dǎo)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附等。在多種腫瘤組織中，如食管癌、胃癌、結(jié)腸癌及黑色素瘤等，均發(fā)現(xiàn)S100A4表達(dá)升高。有研究表明，在乳腺癌中上調(diào)S100A4的表達(dá)后，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，且S100A4陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后較差。然而，S100A4參與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。MMP-9是一種基質(zhì)金屬蛋白酶，屬于鋅離子依賴性肽鏈內(nèi)切酶家族，該家族包含21種以上的蛋白酶。MMP-9于1989年首次從人纖維母細(xì)胞克隆出來(lái)，其基因位于染色體20q11.1-13.1，是一種92KDA的明膠酶。當(dāng)MMP-9激活后，能夠使膠原蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變形并將其降解，通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。在正常肺組織中，MMP-9極少表達(dá)，但在一些肺部疾病，如哮喘、肺纖維化、COPD中呈高表達(dá)狀態(tài)。同時(shí)，在乳腺癌、結(jié)直腸腺瘤和胃癌等腫瘤中，MMP-9的表達(dá)也均高于相應(yīng)的正常組織，作為一種腫瘤促進(jìn)因子發(fā)揮著生物學(xué)功能?，F(xiàn)有研究表明，S100A4和MMP-9在喉鱗癌中的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。并且，有研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌PC3細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染S100A4的表達(dá)載體后，能夠在蛋白水平和mRNA水平上上調(diào)MMP-9的表達(dá)。基于此，推測(cè)在喉癌中S100A4可能調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)，兩者或許在喉癌的發(fā)生發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中起協(xié)同作用。深入研究S100A4和MMP-9在喉鱗癌中的表達(dá)情況、相互關(guān)系以及它們與喉鱗癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，將有助于揭示喉鱗癌的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供新的靶點(diǎn)和策略，具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)1.2.1研究目的本研究旨在深入探究S100A4和MMP-9在喉鱗癌組織中的表達(dá)情況，通過(guò)對(duì)大量喉鱗癌患者組織樣本的分析，明確這兩種分子標(biāo)記物在喉鱗癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析S100A4和MMP-9的表達(dá)與喉鱗癌臨床病理參數(shù)，如腫瘤的分級(jí)、分期、患者的年齡、性別、腫瘤位置以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等之間的相關(guān)性，從而為評(píng)估喉鱗癌的惡性程度和預(yù)后提供重要的理論依據(jù)。同時(shí)，本研究還將在細(xì)胞水平上，通過(guò)干擾S100A4的表達(dá)，觀察其對(duì)MMP-9表達(dá)的影響，以此來(lái)驗(yàn)證在喉癌中S100A4可能調(diào)節(jié)MMP-9表達(dá)這一假設(shè)，深入探討兩者在喉癌發(fā)生發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的協(xié)同作用機(jī)制，為揭示喉鱗癌的發(fā)病機(jī)制提供新的視角和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)而為臨床治療喉鱗癌提供新的靶點(diǎn)和策略。1.2.2創(chuàng)新點(diǎn)在研究視角方面，本研究創(chuàng)新性地將S100A4和MMP-9這兩種在腫瘤研究中備受關(guān)注但在喉鱗癌領(lǐng)域聯(lián)合研究較少的分子標(biāo)記物結(jié)合起來(lái)，從多個(gè)維度分析它們?cè)诤眵[癌中的表達(dá)、與臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)以及兩者之間的相互關(guān)系。這種多維度的研究視角能夠更全面、深入地揭示喉鱗癌的發(fā)病機(jī)制，為喉鱗癌的診療提供更豐富的理論支持。在研究方法上，本研究采用了先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。例如，在檢測(cè)S100A4和MMP-9的表達(dá)時(shí)，運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色和WesternBlot技術(shù)，能夠準(zhǔn)確地定位和定量分析這兩種蛋白在組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況。同時(shí)，利用siRNA干擾實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞水平上精確地調(diào)控S100A4的表達(dá)，從而觀察其對(duì)MMP-9表達(dá)的影響，這種精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方法能夠更直接地驗(yàn)證兩者之間的調(diào)節(jié)關(guān)系，為機(jī)制研究提供有力的證據(jù)。在結(jié)果應(yīng)用方面，本研究的成果有望為喉鱗癌的臨床治療提供新的靶點(diǎn)和策略。通過(guò)明確S100A4和MMP-9在喉鱗癌中的作用機(jī)制，為開發(fā)針對(duì)這兩種分子的靶向治療藥物提供理論基礎(chǔ)，有助于實(shí)現(xiàn)喉鱗癌的精準(zhǔn)治療，提高治療效果，改善患者的預(yù)后，這在臨床應(yīng)用上具有重要的創(chuàng)新意義。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1研究方法免疫組織化學(xué)染色：收集喉鱗癌患者手術(shù)切除的組織標(biāo)本，包括癌組織和癌旁組織，用10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后制成4μm連續(xù)切片。采用鏈菌素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶免疫組化法（S.P法）檢測(cè)S100A4和MMP-9蛋白的表達(dá)。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定方面，S100A4和MMP-9蛋白以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性顯色。在高倍視野（×400）下選擇陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)區(qū)域計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，按蛋白表達(dá)百分率分為四個(gè)等級(jí)：0%為0分，1%-50%為1分，51%-75%為2分，＞75%為3分。根據(jù)染色強(qiáng)度分為三個(gè)等級(jí)：淺黃色計(jì)為1分，棕黃色計(jì)為2分，黃褐色計(jì)為3分。以陽(yáng)性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度的分值乘積作為每一例的積分，積分＜4者判定為陰性，積分＞4為陽(yáng)性。通過(guò)免疫組化染色，能夠直觀地觀察到S100A4和MMP-9在組織中的表達(dá)位置和表達(dá)強(qiáng)度，為后續(xù)分析它們與喉鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系提供基礎(chǔ)。蛋白免疫印跡（WesternBlot）：對(duì)于收集的細(xì)胞，加入裂解液充分裂解，在低溫高速（4℃，15000轉(zhuǎn)/min，30min）條件下離心，提取上清得到總蛋白。上樣蛋白量設(shè)定為60μg，進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉。加入一抗S100A4（1:200）、MMP-9（1:200）和內(nèi)參β-actin（1:200），4℃孵育過(guò)夜，然后分別與各自對(duì)應(yīng)的二抗（1:4000）室溫孵育2小時(shí)，采用ECL顯色法顯色，最后經(jīng)自動(dòng)凝膠成像分析儀采集結(jié)果并進(jìn)行灰度值測(cè)定，以β-actin作為內(nèi)參，用于校正蛋白表達(dá)量。WesternBlot技術(shù)能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)S100A4和MMP-9在蛋白水平的表達(dá)量，為研究它們?cè)诤眵[癌中的表達(dá)差異提供量化的數(shù)據(jù)支持。siRNA干擾實(shí)驗(yàn)：設(shè)計(jì)針對(duì)S100A4的特異性siRNA，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組。將喉癌細(xì)胞株分為三組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，轉(zhuǎn)染具體步驟嚴(yán)格按照Hiperfect試劑說(shuō)明書進(jìn)行。通過(guò)特異性siRNA干擾S100A4的表達(dá)，觀察細(xì)胞中MMP-9表達(dá)的變化情況，以此驗(yàn)證在喉癌中S100A4對(duì)MMP-9表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，深入探究?jī)烧咴诤戆┌l(fā)生發(fā)展過(guò)程中的相互關(guān)系。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：運(yùn)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。對(duì)于各組計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)分析；采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析S100A4蛋白與MMP-9蛋白表達(dá)的關(guān)系；對(duì)于WesternBlot圖像灰度值和組化積分值，采用t檢驗(yàn)分析。設(shè)定P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，能夠準(zhǔn)確地揭示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的內(nèi)在聯(lián)系，使研究結(jié)果更具可靠性和說(shuō)服力。1.3.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如下：樣本收集：收集喉鱗癌患者手術(shù)切除的組織標(biāo)本，包括80例喉鱗癌組織和35例癌旁喉組織，所有患者均為原發(fā)，術(shù)前未接受放、化療。標(biāo)本經(jīng)HE常規(guī)染色后由兩名病理醫(yī)師明確診斷，部分標(biāo)本離體后立即放入液氮，隨后置于-70℃冰箱保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。同時(shí)，培養(yǎng)1株喉癌癌細(xì)胞株（Hep-2），用含10%新鮮胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的條件下培養(yǎng)。免疫組化實(shí)驗(yàn)：將組織標(biāo)本制成石蠟切片，采用免疫組化染色法檢測(cè)S100A4和MMP-9蛋白在喉鱗癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，按照既定的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行分析，記錄陽(yáng)性表達(dá)率和積分情況。WesternBlot實(shí)驗(yàn)：從保存的組織標(biāo)本或培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總蛋白，進(jìn)行WesternBlot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)S100A4和MMP-9蛋白的表達(dá)量，通過(guò)灰度值測(cè)定得到量化的數(shù)據(jù)。siRNA干擾實(shí)驗(yàn)：對(duì)喉癌細(xì)胞株進(jìn)行分組，分別進(jìn)行空白對(duì)照、非特異性siRNA轉(zhuǎn)染和特異性siRNA轉(zhuǎn)染處理，轉(zhuǎn)染后檢測(cè)細(xì)胞中MMP-9表達(dá)的變化，分析S100A4對(duì)MMP-9表達(dá)的影響。數(shù)據(jù)分析：收集免疫組化、WesternBlot和siRNA干擾實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析S100A4和MMP-9的表達(dá)與喉鱗癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，以及兩者之間的表達(dá)關(guān)系，最終得出研究結(jié)論。二、S100A4和MMP-9的生物學(xué)特性2.1S100A4的結(jié)構(gòu)與功能2.1.1S100A4的分子結(jié)構(gòu)S100A4作為S100家族蛋白的重要成員，在細(xì)胞的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從基因?qū)用鎭?lái)看，S100A4基因定位于人染色體1q21，其編碼產(chǎn)物S100A4蛋白由101個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量約為11.7kDa。S100家族蛋白的顯著特征之一是具有共同的EF雙螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸基序，即手型鈣離子結(jié)合區(qū)。這一特殊結(jié)構(gòu)使得S100家族蛋白能夠與鈣離子高度結(jié)合，進(jìn)而參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化等多種生理過(guò)程。S100A4蛋白也不例外，其EF手型結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基通過(guò)特定的空間排列，形成了對(duì)鈣離子具有高親和力的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生變化時(shí)，S100A4蛋白能夠迅速結(jié)合鈣離子，發(fā)生構(gòu)象變化，從而激活其下游的信號(hào)通路。S100A4蛋白以共價(jià)鍵二聚體的形式存在于細(xì)胞間質(zhì)中，這種二聚體結(jié)構(gòu)是細(xì)胞之間信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)相互聯(lián)系和相互作用的基礎(chǔ)，也是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的病理基礎(chǔ)。在二聚體結(jié)構(gòu)中，兩個(gè)S100A4單體通過(guò)特定的氨基酸殘基相互作用，形成了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)不僅有助于S100A4蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和功能發(fā)揮，還能夠增強(qiáng)其與其他蛋白質(zhì)的相互作用，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理和病理過(guò)程。2.1.2S100A4在細(xì)胞中的功能在細(xì)胞的正常生理活動(dòng)中，S100A4參與了多個(gè)關(guān)鍵過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞的正常功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起到了重要作用。在細(xì)胞生長(zhǎng)和新陳代謝方面，S100A4通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞的增殖和分化。研究表明，S100A4可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）等關(guān)鍵蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程，從而控制細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。在細(xì)胞代謝過(guò)程中，S100A4也參與了能量代謝和物質(zhì)合成等多個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)維持細(xì)胞的正常代謝功能至關(guān)重要。S100A4在細(xì)胞骨架形成和細(xì)胞形狀改變方面也發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞骨架是細(xì)胞內(nèi)的重要結(jié)構(gòu)，由微絲、微管和中間纖維等組成，對(duì)維持細(xì)胞的形態(tài)、運(yùn)動(dòng)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)裙δ芫哂嘘P(guān)鍵作用。S100A4能夠與細(xì)胞骨架蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的組裝和拆卸，從而影響細(xì)胞的形狀和運(yùn)動(dòng)能力。在細(xì)胞遷移過(guò)程中，S100A4可以通過(guò)調(diào)節(jié)微絲的動(dòng)態(tài)變化，促進(jìn)細(xì)胞偽足的形成和伸展，從而推動(dòng)細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)。信號(hào)傳導(dǎo)是細(xì)胞內(nèi)信息傳遞和調(diào)控的重要過(guò)程，S100A4在其中扮演著關(guān)鍵角色。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，S100A4能夠通過(guò)與鈣離子結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等，將信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和細(xì)胞的生理反應(yīng)。S100A4還可以與其他信號(hào)分子相互作用，形成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步精細(xì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。細(xì)胞黏附是細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互識(shí)別和結(jié)合的過(guò)程，對(duì)維持組織的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。S100A4通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞之間的黏附力。在腫瘤細(xì)胞中，S100A4的異常表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞黏附力下降，使得腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)灶脫落，進(jìn)而發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。2.1.3S100A4與腫瘤的關(guān)系大量研究表明，S100A4與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在多種實(shí)體瘤中，如食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、乳腺癌等，均發(fā)現(xiàn)S100A4表達(dá)升高。在乳腺癌中，上調(diào)S100A4的表達(dá)后，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，且S100A4陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后較差。S100A4促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制是多方面的。S100A4能夠增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性。通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化，S100A4可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的偽足形成和伸展，使其能夠更有效地在組織中遷移。S100A4可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解。腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，需要降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，以突破組織屏障。S100A4可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（如MMP-9等）的表達(dá)，增強(qiáng)其活性，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。S100A4還可以降低細(xì)胞粘附力，使腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)灶脫落，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。S100A4還參與了腫瘤血管生成的過(guò)程。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。S100A4可以通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)和活性，促進(jìn)腫瘤血管的形成，為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，S100A4還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬等過(guò)程，影響腫瘤細(xì)胞的生存和增殖。研究表明，S100A4可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)其生存能力，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。S100A4也參與了腫瘤細(xì)胞的自噬調(diào)節(jié)，通過(guò)影響自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝和生存。2.2MMP-9的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1MMP-9的分子結(jié)構(gòu)MMP-9作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，在細(xì)胞外基質(zhì)的代謝和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。從基因?qū)用鎭?lái)看，MMP-9基因位于染色體20q11.1-13.1，基因長(zhǎng)度為26-27kbp，擁有13個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子。其啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)含有活化蛋白（AP）-1、AP-2和刺激蛋白（SP）-1因子結(jié)合位點(diǎn)，在豬的MMP-9啟動(dòng)子區(qū)還存在核因子（NF）κB、ETS結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β抑制元件，這些調(diào)控元件對(duì)于MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有重要作用。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面，MMP-9主要由3個(gè)獨(dú)特且保守的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。其一是前肽區(qū)，也被稱為氨基末端區(qū)，該區(qū)域主要作用是保持酶原的穩(wěn)定，當(dāng)它被外源性酶切斷后，MMP-9酶原便被激活。其二是催化區(qū)，此區(qū)域含有鋅離子結(jié)合位點(diǎn)，這對(duì)于酶催化作用的發(fā)揮至關(guān)重要，是MMP-9發(fā)揮降解底物功能的關(guān)鍵區(qū)域。其三是羧基末端區(qū)，又稱為類血紅素結(jié)合蛋白酶區(qū)，與酶的底物特異性有關(guān)。與其他MMPs成員相比，MMP-9除了具備這些原型結(jié)構(gòu)外，其催化區(qū)還包括3個(gè)重復(fù)的型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域與明膠或彈性蛋白有高度的親和力，使得MMP-9能夠特異性地結(jié)合并降解這些細(xì)胞外基質(zhì)成分。MMP-9還包含一個(gè)V型的膠原蛋白結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有高度的糖基化作用，它不僅影響底物的特異性，還具有抗衰變的作用，有助于維持MMP-9在細(xì)胞外環(huán)境中的穩(wěn)定性和活性。MMP-9是以酶原的形式從胞內(nèi)分泌到胞外的。在體外，它需要通過(guò)有機(jī)汞制劑反應(yīng)才具有活性；而在體內(nèi)，MMP-9則可經(jīng)一系列蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)而激活。其V型膠原蛋白結(jié)構(gòu)域可被MMP-3、MMP-2或者次氯酸裂解，其中MMP-3可能是MMP-9最有效的激活劑。MMP-9主要的循環(huán)抑制劑是а2巨球蛋白，當(dāng)MMP-9被激活后，а2巨球蛋白會(huì)將其捕獲，并通過(guò)清除受體將其清除出循環(huán)系統(tǒng)，從而限制MMP-9的活性。金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMPs）也是MMPs家族的重要抑制劑，廣泛分布于組織和體液中，能夠共價(jià)結(jié)合MMPs并抑制其活性。以TIMP-1為例，它可與MMP-9的酶原或活化后酶的催化區(qū)的羧基末端特異性結(jié)合，形成復(fù)合物，進(jìn)而特異性抑制MMP-9的活性。血小板反應(yīng)蛋白和蛋白酶組織抑制因子2（TFPI-2）也能對(duì)MMP-9的活性起到抑制作用。2.2.2MMP-9在細(xì)胞中的功能在細(xì)胞的生理和病理過(guò)程中，MMP-9發(fā)揮著多種重要功能，其中最為關(guān)鍵的是對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解作用。細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞生存的重要微環(huán)境，由多種蛋白質(zhì)和多糖組成，包括膠原蛋白、彈性蛋白、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等，它不僅為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐，還參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、增殖、分化等過(guò)程?；啄t是位于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞下方的一層特殊細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)維持組織的結(jié)構(gòu)和功能完整性起著重要作用。MMP-9作為一種蛋白水解酶，能夠特異性地識(shí)別并降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜中的多種成分，如Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型膠原、蛋白聚糖的核心蛋白、明膠、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白等，從而破壞細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的結(jié)構(gòu)完整性。MMP-9對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解作用在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要意義。在腫瘤生長(zhǎng)階段，腫瘤細(xì)胞的快速增殖需要不斷地獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，同時(shí)排出代謝廢物。MMP-9通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了空間，使得腫瘤細(xì)胞能夠突破周圍組織的限制，不斷擴(kuò)大體積。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要腫瘤細(xì)胞突破基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的屏障，侵入周圍組織和血管、淋巴管，進(jìn)而在遠(yuǎn)處器官定植生長(zhǎng)。MMP-9能夠降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移開辟道路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和擴(kuò)散。研究表明，在腫瘤侵襲前沿，MMP-9的表達(dá)和活性往往顯著升高，這與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力密切相關(guān)。除了在腫瘤相關(guān)過(guò)程中的作用，MMP-9還參與了其他生理和病理過(guò)程。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，MMP-9參與了組織的重塑和器官的形成，它通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和分化，促進(jìn)胚胎組織的正常發(fā)育。在傷口愈合過(guò)程中，MMP-9也發(fā)揮著重要作用，它能夠降解受損組織中的細(xì)胞外基質(zhì)，為新細(xì)胞的生長(zhǎng)和修復(fù)提供空間，同時(shí)還能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子的活性，促進(jìn)傷口的愈合。在一些炎癥性疾病，如關(guān)節(jié)炎、哮喘等，MMP-9的異常表達(dá)和活性升高會(huì)導(dǎo)致組織的過(guò)度降解和損傷，加重炎癥癥狀。2.2.3MMP-9與腫瘤的關(guān)系大量的研究表明，MMP-9與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在多種腫瘤中都呈現(xiàn)出異常表達(dá)的情況。在乳腺癌中，MMP-9的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織，且其表達(dá)與腫瘤的分期、分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。高表達(dá)MMP-9的乳腺癌患者往往具有更高的腫瘤復(fù)發(fā)率和更低的生存率，這表明MMP-9在乳腺癌的惡性進(jìn)展中起到了重要的促進(jìn)作用。在結(jié)直腸腺瘤和胃癌中，MMP-9的表達(dá)也顯著高于相應(yīng)的正常組織，并且其表達(dá)水平與腫瘤的侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。隨著腫瘤的進(jìn)展，MMP-9的表達(dá)逐漸升高，提示MMP-9可能參與了腫瘤從良性到惡性轉(zhuǎn)化以及惡性腫瘤進(jìn)一步侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程。在肝癌中，MMP-9的高表達(dá)與腫瘤的大小、包膜完整性、門靜脈癌栓形成以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9能夠降解肝癌細(xì)胞周圍的細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)還能通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管的形成，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)支持。在肺癌中，MMP-9的表達(dá)與腫瘤的病理類型、分期以及患者的生存時(shí)間相關(guān)。非小細(xì)胞肺癌患者中，MMP-9的高表達(dá)往往提示預(yù)后不良，且與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MMP-9作為一種腫瘤促進(jìn)因子，其作用機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面。MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，使得腫瘤細(xì)胞能夠更容易地突破周圍組織的限制，侵入血管和淋巴管，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。MMP-9可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的活性，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β等。這些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子在腫瘤的生長(zhǎng)、血管生成和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，MMP-9通過(guò)對(duì)它們的調(diào)節(jié)，間接促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。MMP-9還可以通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移和增殖等生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明，MMP-9可以降解細(xì)胞黏附分子，降低腫瘤細(xì)胞之間以及腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附力，使得腫瘤細(xì)胞更容易脫離原發(fā)灶，發(fā)生遷移和轉(zhuǎn)移。MMP-9還可以激活一些信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。三、S100A4與MMP-9在喉鱗癌中的表達(dá)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1樣本收集本研究收集了中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床學(xué)院2009-2011年耳鼻咽喉頭頸外科手術(shù)切除的115例喉組織標(biāo)本，其中包括35例癌旁喉組織和80例喉鱗癌組織。所有患者均為原發(fā)性喉鱗癌，術(shù)前均未接受放療、化療等輔助治療，以確保所收集樣本未受到其他治療因素的干擾，能夠真實(shí)反映喉鱗癌組織中S100A4和MMP-9的表達(dá)情況。標(biāo)本收集后，立即進(jìn)行處理，部分癌旁喉組織（遠(yuǎn)離腫瘤至少1厘米）和癌組織離體后迅速放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱保存，用于后續(xù)的蛋白免疫印跡（WesternBlot）實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)S100A4和MMP-9蛋白的表達(dá)量。其余標(biāo)本則經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4μm連續(xù)切片，用于免疫組化染色，以觀察S100A4和MMP-9蛋白在組織中的表達(dá)位置和分布情況。所有標(biāo)本均經(jīng)過(guò)兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行HE常規(guī)染色和病理診斷，以確保標(biāo)本的病理類型和診斷的準(zhǔn)確性?；颊叩幕拘畔⒑w了多個(gè)方面，80例喉鱗癌患者中，男性患者56例，女性患者24例，男女比例約為2.33:1，這與喉鱗癌在臨床上男性發(fā)病率高于女性的特點(diǎn)相符?；颊吣挲g范圍在35-75歲之間，平均年齡為55.6歲，發(fā)病年齡多集中在50-70歲，這與喉鱗癌的好發(fā)年齡區(qū)間一致。在腫瘤部位方面，聲門型喉鱗癌42例，聲門上型喉鱗癌28例，聲門下型喉鱗癌10例，不同部位的腫瘤可能具有不同的生物學(xué)行為和臨床特征，對(duì)其進(jìn)行分類研究有助于深入了解S100A4和MMP-9在不同部位喉鱗癌中的表達(dá)差異。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期患者12例，Ⅱ期患者20例，Ⅲ期患者28例，Ⅳ期患者20例，通過(guò)對(duì)不同分期患者的研究，可以分析S100A4和MMP-9的表達(dá)與腫瘤分期之間的相關(guān)性，為臨床評(píng)估腫瘤的惡性程度和預(yù)后提供依據(jù)。此外，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者30例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者50例，研究淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與S100A4和MMP-9表達(dá)的關(guān)系，對(duì)于了解腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制和制定治療策略具有重要意義。患者的基本信息還包括吸煙史、飲酒史等生活習(xí)慣信息，這些因素可能與喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在后續(xù)的研究分析中，可作為潛在的影響因素進(jìn)行考慮。3.1.2主要試劑與儀器本實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括抗體、試劑盒和轉(zhuǎn)染試劑等。S100A4兔單克隆抗體、MMP-9羊單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司，這兩種抗體具有較高的特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別并結(jié)合S100A4和MMP-9蛋白，為后續(xù)的免疫組化和WesternBlot實(shí)驗(yàn)提供可靠的檢測(cè)工具。Hiperfect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自QIAGEN生物公司，該轉(zhuǎn)染試劑具有高效、低毒的特點(diǎn)，能夠?qū)⑻禺愋詓iRNA高效地轉(zhuǎn)染到喉癌細(xì)胞中，用于干擾S100A4的表達(dá)，從而研究其對(duì)MMP-9表達(dá)的影響。SP免疫組化試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，SP免疫組化試劑盒用于免疫組化染色實(shí)驗(yàn)，其操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，能夠準(zhǔn)確地顯示S100A4和MMP-9蛋白在組織中的表達(dá)位置和分布情況；DAB酶底物顯色試劑盒則用于免疫組化染色后的顯色反應(yīng)，通過(guò)與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合，產(chǎn)生棕黃色沉淀，使陽(yáng)性信號(hào)得以顯現(xiàn)，便于觀察和分析。實(shí)驗(yàn)所需的主要儀器包括自動(dòng)脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)、攤片機(jī)、烤片機(jī)、光學(xué)顯微鏡、恒溫箱、離心機(jī)、電泳儀、轉(zhuǎn)印儀、凝膠成像分析儀等。自動(dòng)脫水機(jī)用于對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行脫水處理，使組織能夠更好地進(jìn)行石蠟包埋；石蠟包埋機(jī)將脫水后的組織包埋在石蠟中，制成石蠟塊，便于后續(xù)的切片制作；切片機(jī)能夠?qū)⑹瀴K切成厚度均勻的切片，本實(shí)驗(yàn)中切片厚度為4μm；攤片機(jī)用于將切片在水面上展開，使其平整，便于后續(xù)的貼片操作；烤片機(jī)則用于將貼片后的切片進(jìn)行烘烤，使切片牢固地附著在載玻片上。光學(xué)顯微鏡用于觀察免疫組化染色后的切片，通過(guò)不同放大倍數(shù)的物鏡，能夠清晰地觀察到S100A4和MMP-9蛋白在組織細(xì)胞中的表達(dá)位置和染色強(qiáng)度。恒溫箱用于孵育抗體和顯色反應(yīng)，確保實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定性。離心機(jī)用于提取細(xì)胞總蛋白時(shí)的離心操作，通過(guò)高速離心，將細(xì)胞裂解物中的蛋白質(zhì)分離出來(lái)。電泳儀和轉(zhuǎn)印儀則用于WesternBlot實(shí)驗(yàn)，電泳儀將蛋白質(zhì)樣品在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小將其分離開來(lái)；轉(zhuǎn)印儀則將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，便于后續(xù)的抗體雜交和檢測(cè)。凝膠成像分析儀用于對(duì)WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行采集和分析，通過(guò)掃描PVDF膜上的蛋白質(zhì)條帶，獲取其灰度值，從而定量分析S100A4和MMP-9蛋白的表達(dá)量。3.1.3實(shí)驗(yàn)方法免疫組化染色：標(biāo)本用10%中性福爾馬林溶液固定后，經(jīng)過(guò)石蠟包埋，制成4μm連續(xù)切片。采用鏈菌素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶免疫組化法（S.P法）檢測(cè)S100A4和MMP-9蛋白表達(dá)。具體操作步驟如下：將切片依次放入3個(gè)裝有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸15分鐘，進(jìn)行脫蠟處理，以去除石蠟對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響；依次放入2個(gè)裝有無(wú)水乙醇的玻璃缸，每缸5分鐘，再依次放入2個(gè)裝有95%乙醇的玻璃缸，每缸5分鐘，然后依次放入90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇的玻璃缸，每缸2分鐘，進(jìn)行水化處理，使切片恢復(fù)到含水狀態(tài)；放入自來(lái)水、蒸餾水的玻璃缸中清洗，重復(fù)3次，以去除殘留的乙醇。將切片浸入1%檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，高壓煮沸后繼續(xù)加熱2分鐘，然后停止加熱讓切片自然冷卻，進(jìn)行抗原修復(fù)，以暴露被掩蓋的抗原表位，提高抗體的結(jié)合效率；抗原修復(fù)過(guò)度或不足，均會(huì)影響最終染色結(jié)果，且切片驟冷可致脫片，必須自然冷卻。放入3%H?O?溶液的玻璃缸中，浸泡15分鐘，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，避免其對(duì)顯色反應(yīng)的干擾；放入蒸餾水的玻璃缸中清洗，重復(fù)3次，再放入PBS緩沖液的玻璃缸中，浸泡5分鐘。甩去PBS余液，將組織片平鋪在濕盒中，加正常山羊血清1滴（20μl，試劑盒中的A液，根據(jù)組織大小調(diào)整用量），28℃放置20分鐘，進(jìn)行封閉，以減少非特異性結(jié)合；甩干后，加稀釋好的一抗1滴（20-50μl，根據(jù)組織塊大小進(jìn)行調(diào)整），置于濕盒4℃過(guò)夜，使一抗與抗原特異性結(jié)合；置PBS緩沖液的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗5分鐘，更換PBS緩沖液，同法操作4次，甩干，以去除未結(jié)合的一抗。加入生物素偶聯(lián)的二抗20-50μl（試劑盒中的B液，根據(jù)組織塊大小進(jìn)行調(diào)整），放置濕盒，37℃放置20分鐘，使二抗與一抗結(jié)合；置PBS緩沖液的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗5分鐘，更換PBS緩沖液，同法操作3次，甩干。滴加鏈霉菌抗生物素－過(guò)氧化物酶溶液（試劑D），室溫下孵育10分鐘；PBS沖洗三次，每次3分鐘。每張切片加2滴新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察（3-10分鐘），陽(yáng)性顯色為棕色；自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1％鹽酸分化，PBS沖洗返藍(lán)，使細(xì)胞核染色，便于觀察細(xì)胞形態(tài)；切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封固，制成永久切片。結(jié)果判定方面，S100A4和MMP-9蛋白以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性顯色。在高倍視野（×400）下選擇陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)區(qū)域計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，按S100A4和MMP-9蛋白表達(dá)百分率分為四個(gè)等級(jí)：0%為0分，1%-50%為1分，51%-75%為2分，＞75%為3分；根據(jù)染色強(qiáng)度分為三個(gè)等級(jí)：淺黃色計(jì)為1分，棕黃色計(jì)為2分，黃褐色計(jì)為3分。以陽(yáng)性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度的分值乘積作為每一例的積分，積分＜4者判定為陰性，積分＞4為陽(yáng)性。蛋白免疫印跡（WesternBlot）：在收集的細(xì)胞內(nèi)加入裂解液充分裂解，裂解液中含有蛋白酶抑制劑，能夠防止蛋白質(zhì)降解；在低溫高速（4℃，15000轉(zhuǎn)/min，30min）條件下離心，提取上清為總蛋白。上樣蛋白量設(shè)定為60μg，進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，在電泳過(guò)程中，蛋白質(zhì)在電場(chǎng)的作用下，根據(jù)其分子量大小在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行分離；隨后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，轉(zhuǎn)印過(guò)程中使用的轉(zhuǎn)印緩沖液能夠保證蛋白質(zhì)的有效轉(zhuǎn)移；用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，以減少非特異性結(jié)合；加入一抗S100A4（1:200）、MMP-9（1:200）和內(nèi)參β-actin（1:200），4℃孵育過(guò)夜，使一抗與相應(yīng)的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合；然后分別與各自對(duì)應(yīng)的二抗（1:4000）室溫孵育2小時(shí)，二抗能夠與一抗結(jié)合，增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度；采用ECL顯色法顯色，ECL試劑中的發(fā)光底物在辣根過(guò)氧化物酶的催化下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號(hào)；最后經(jīng)自動(dòng)凝膠成像分析儀采集結(jié)果并進(jìn)行灰度值測(cè)定，以β-actin作為內(nèi)參，用于校正蛋白表達(dá)量，通過(guò)比較不同樣本中S100A4和MMP-9蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值，能夠準(zhǔn)確地定量分析S100A4和MMP-9蛋白的表達(dá)量。siRNA干擾實(shí)驗(yàn)：設(shè)計(jì)針對(duì)S100A4的特異性siRNA，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組。將喉癌細(xì)胞株分為三組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。轉(zhuǎn)染具體步驟嚴(yán)格按照Hiperfect試劑說(shuō)明書進(jìn)行：在轉(zhuǎn)染前一天，將喉癌細(xì)胞接種到6孔板中，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到50%-70%的匯合度；轉(zhuǎn)染時(shí)，將Hiperfect試劑與特異性siRNA或非特異性siRNA按照一定比例混合，室溫孵育5-10分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)，更換新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，采用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)MMP-9的表達(dá)變化，通過(guò)比較空白對(duì)照組、非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組和特異性siRNA轉(zhuǎn)染組中MMP-9蛋白的表達(dá)量，分析干擾S100A4表達(dá)對(duì)MMP-9表達(dá)的影響，從而驗(yàn)證在喉癌中S100A4可能調(diào)節(jié)MMP-9表達(dá)的假設(shè)。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1S100A4在喉鱗癌組織中的表達(dá)免疫組化染色結(jié)果顯示，S100A4蛋白主要在細(xì)胞漿表達(dá)，在喉鱗癌組織中S100A4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為41.3%（33/80），而在癌旁喉組織中S100A4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為11.4%（4/35），喉鱗癌組織中S100A4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁喉組織（P＜0.01）。這表明S100A4在喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起著重要作用，其高表達(dá)可能與喉鱗癌的惡性生物學(xué)行為相關(guān)。進(jìn)一步分析S100A4表達(dá)與喉鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示S100A4的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤原發(fā)部位、組織學(xué)分化程度及T分期無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。然而，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗癌患者中，S100A4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為63.3%（19/30），顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的26.0%（14/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在臨床分期中，Ⅲ+Ⅳ期患者S100A4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為55.0%（22/40），高于Ⅰ+Ⅱ期患者的27.5%（11/40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這說(shuō)明S100A4的表達(dá)與喉鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)，可作為評(píng)估喉鱗癌轉(zhuǎn)移潛能和惡性程度的參考指標(biāo)之一。如圖1所示，為喉鱗癌組織和癌旁喉組織中S100A4表達(dá)的免疫組化染色圖，從圖中可以直觀地看到喉鱗癌組織中S100A4陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞明顯多于癌旁喉組織。[此處插入圖1：喉鱗癌組織和癌旁喉組織中S100A4表達(dá)的免疫組化染色圖（×400），A為喉鱗癌組織，B為癌旁喉組織，陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒]WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，喉鱗癌組織中S100A4蛋白的表達(dá)量（灰度值）顯著高于癌旁喉組織（P＜0.05），進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫組化的結(jié)果，表明S100A4在喉鱗癌組織中的蛋白表達(dá)水平明顯升高。如圖2所示，為喉鱗癌組織和癌旁喉組織中S100A4蛋白表達(dá)的WesternBlot條帶圖，從圖中可以清晰地看到喉鱗癌組織中S100A4蛋白條帶的灰度值明顯高于癌旁喉組織。[此處插入圖2：喉鱗癌組織和癌旁喉組織中S100A4蛋白表達(dá)的WesternBlot條帶圖，1-3為喉鱗癌組織，4-6為癌旁喉組織，β-actin為內(nèi)參]3.2.2MMP-9在喉鱗癌組織中的表達(dá)免疫組化染色顯示，MMP-9蛋白主要在細(xì)胞漿表達(dá)，在喉鱗癌組織中MMP-9蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為68.8%（55/80），而在癌旁喉組織中MMP-9蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為22.9%（8/35），喉鱗癌組織中MMP-9蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁喉組織（P＜0.01）。這表明MMP-9在喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用，其高表達(dá)可能促進(jìn)了喉鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。分析MMP-9表達(dá)與喉鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示MMP-9的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤原發(fā)部位無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。在組織學(xué)分化程度方面，高分化喉鱗癌組織中MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為52.9%（9/17），中分化喉鱗癌組織中為66.7%（28/42），低分化喉鱗癌組織中為85.7%（18/21），低分化組MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于高分化組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示MMP-9的表達(dá)與喉鱗癌的組織學(xué)分化程度相關(guān)，其表達(dá)水平可能隨著腫瘤分化程度的降低而升高。在T分期方面，T1+T2期患者M(jìn)MP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為55.6%（20/36），T3+T4期患者為79.5%（35/44），T3+T4期患者M(jìn)MP-9陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于T1+T2期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明MMP-9的表達(dá)與喉鱗癌的T分期密切相關(guān)，隨著腫瘤浸潤(rùn)深度的增加，MMP-9的表達(dá)水平也升高。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗癌患者中，MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為86.7%（26/30），顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的58.0%（29/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在臨床分期中，Ⅲ+Ⅳ期患者M(jìn)MP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為82.5%（33/40），高于Ⅰ+Ⅱ期患者的55.0%（22/40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這說(shuō)明MMP-9的表達(dá)與喉鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)，可作為評(píng)估喉鱗癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力的重要指標(biāo)。如圖3所示，為喉鱗癌組織和癌旁喉組織中MMP-9表達(dá)的免疫組化染色圖，從圖中可以明顯看出喉鱗癌組織中MMP-9陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞多于癌旁喉組織。[此處插入圖3：喉鱗癌組織和癌旁喉組織中MMP-9表達(dá)的免疫組化染色圖（×400），A為喉鱗癌組織，B為癌旁喉組織，陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒]WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，喉鱗癌組織中MMP-9蛋白的表達(dá)量（灰度值）顯著高于癌旁喉組織（P＜0.05），與免疫組化結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了MMP-9在喉鱗癌組織中的高表達(dá)。如圖4所示，為喉鱗癌組織和癌旁喉組織中MMP-9蛋白表達(dá)的WesternBlot條帶圖，從圖中可以清晰地看到喉鱗癌組織中MMP-9蛋白條帶的灰度值明顯高于癌旁喉組織。[此處插入圖4：喉鱗癌組織和癌旁喉組織中MMP-9蛋白表達(dá)的WesternBlot條帶圖，1-3為喉鱗癌組織，4-6為癌旁喉組織，β-actin為內(nèi)參]3.2.3S100A4與MMP-9表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析S100A4蛋白與MMP-9蛋白表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果顯示在喉鱗癌組織中，S100A4蛋白表達(dá)與MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.385，P＜0.01）。這表明在喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，S100A4和MMP-9可能存在協(xié)同作用，共同促進(jìn)喉鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。當(dāng)S100A4表達(dá)升高時(shí)，可能會(huì)誘導(dǎo)或促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)喉鱗癌細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。如表1所示，為S100A4與MMP-9在喉鱗癌組織中表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果，從表中可以直觀地看出兩者表達(dá)的相關(guān)性。[此處插入表1：S100A4與MMP-9在喉鱗癌組織中表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果]在siRNA干擾實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)特異性siRNA轉(zhuǎn)染喉癌細(xì)胞，干擾S100A4的表達(dá)后，采用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)MMP-9的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組相比，特異性siRNA轉(zhuǎn)染組中S100A4蛋白的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），同時(shí)MMP-9蛋白的表達(dá)也顯著降低（P＜0.05）。這進(jìn)一步驗(yàn)證了在喉癌中S100A4對(duì)MMP-9表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，為兩者在喉癌發(fā)生發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中起協(xié)同作用提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。如圖5所示，為siRNA干擾實(shí)驗(yàn)中S100A4和MMP-9蛋白表達(dá)的WesternBlot條帶圖，從圖中可以清晰地看到特異性siRNA轉(zhuǎn)染組中S100A4和MMP-9蛋白條帶的灰度值明顯低于空白對(duì)照組和非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組。[此處插入圖5：siRNA干擾實(shí)驗(yàn)中S100A4和MMP-9蛋白表達(dá)的WesternBlot條帶圖，1為空白對(duì)照組，2為非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組，3為特異性siRNA轉(zhuǎn)染組，β-actin為內(nèi)參]四、S100A4與MMP-9表達(dá)相關(guān)性的機(jī)制探討4.1信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制4.1.1相關(guān)信號(hào)通路分析在喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，S100A4和MMP-9的表達(dá)受到多種信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)控，其中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路扮演著關(guān)鍵角色。PI3K-Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活、代謝以及遷移等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。PI3K由一個(gè)調(diào)節(jié)亞基和一個(gè)催化亞基組成，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性以及磷脂酰肌醇激酶活性。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合后，可激活PI3K，使其催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）的3位羥基磷酸化，生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募蛋白激酶B（Akt）和磷酸肌醇依賴性激酶-1（PDK1）到質(zhì)膜上，PDK1進(jìn)而磷酸化Akt蛋白的308號(hào)位蘇氨酸（T308），使其部分活化，隨后在其他激酶的作用下，Akt的473號(hào)位絲氨酸（S473）也被磷酸化，從而實(shí)現(xiàn)Akt的完全活化?；罨腁kt可以進(jìn)一步激活下游一系列調(diào)控通路，對(duì)細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K-Akt信號(hào)通路常常異常激活，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖、存活和遷移，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。MAPK信號(hào)通路同樣是一條從細(xì)胞膜傳導(dǎo)向細(xì)胞核的重要信號(hào)通路，其主要特征是基于激酶的級(jí)聯(lián)放大過(guò)程。該通路主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）三條主要的分支。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、應(yīng)激刺激等多種信號(hào)時(shí)，首先激活小G蛋白R(shí)as，活化的Ras招募并激活Raf蛋白激酶，Raf進(jìn)一步磷酸化并激活MEK蛋白激酶，MEK再磷酸化激活ERK、JNK或p38MAPK。這些被激活的MAPK可以進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Jun、ATF-2等，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移等生物學(xué)過(guò)程。在腫瘤細(xì)胞中，MAPK信號(hào)通路的異常激活與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)。4.1.2通路中關(guān)鍵分子的作用在PI3K-Akt信號(hào)通路中，Akt作為關(guān)鍵分子，對(duì)S100A4和MMP-9的表達(dá)及活性具有重要的調(diào)控作用。研究表明，Akt可以通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)S100A4的表達(dá)。Akt可能通過(guò)磷酸化某些轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)S100A4基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加S100A4的表達(dá)。在乳腺癌細(xì)胞中，激活PI3K-Akt信號(hào)通路后，Akt能夠磷酸化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核，與S100A4基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進(jìn)S100A4的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而上調(diào)S100A4的表達(dá)。Akt還可能通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，影響S100A4的表達(dá)水平。在肺癌細(xì)胞中，Akt可以通過(guò)磷酸化RNA結(jié)合蛋白HuR，增強(qiáng)HuR與S100A4mRNA的結(jié)合，從而提高S100A4mRNA的穩(wěn)定性，增加S100A4的表達(dá)。Akt對(duì)MMP-9的調(diào)控作用也十分顯著。Akt可以直接磷酸化MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如AP-1、NF-κB等，增強(qiáng)它們與啟動(dòng)子的結(jié)合活性，促進(jìn)MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加MMP-9的表達(dá)。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，激活PI3K-Akt信號(hào)通路后，Akt能夠磷酸化NF-κB，使其與MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)MMP-9的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而上調(diào)MMP-9的表達(dá)。Akt還可以通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-9的翻譯后修飾，影響其活性。Akt可以磷酸化MMP-9的前體蛋白，促進(jìn)其活化，增強(qiáng)MMP-9對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力。在MAPK信號(hào)通路中，ERK、JNK和p38MAPK等關(guān)鍵分子也參與了對(duì)S100A4和MMP-9的調(diào)控。ERK可以通過(guò)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos等，調(diào)節(jié)S100A4基因的轉(zhuǎn)錄。在黑色素瘤細(xì)胞中，激活MAPK信號(hào)通路后，ERK能夠磷酸化Elk-1，使其與S100A4基因啟動(dòng)子區(qū)域的血清反應(yīng)元件（SRE）結(jié)合，促進(jìn)S100A4的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而上調(diào)S100A4的表達(dá)。JNK和p38MAPK則主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，間接影響S100A4和MMP-9的表達(dá)。在炎癥刺激下，JNK和p38MAPK被激活，它們可以磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如c-Jun、ATF-2等，這些轉(zhuǎn)錄因子可以與S100A4和MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的相關(guān)序列結(jié)合，調(diào)節(jié)它們的表達(dá)。在口腔鱗癌細(xì)胞中，炎癥因子刺激可激活JNK和p38MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)S100A4和MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子還可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路，間接影響S100A4和MMP-9的表達(dá)。ERK可以激活PI3K-Akt信號(hào)通路，通過(guò)兩條信號(hào)通路的協(xié)同作用，增強(qiáng)對(duì)S100A4和MMP-9的調(diào)控。在肝癌細(xì)胞中，激活MAPK信號(hào)通路后，ERK可以磷酸化PI3K的調(diào)節(jié)亞基，激活PI3K-Akt信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)S100A4和MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。4.2轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制4.2.1轉(zhuǎn)錄因子的影響轉(zhuǎn)錄因子在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著核心作用，它們能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列，通過(guò)招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。對(duì)于S100A4和MMP-9基因而言，多種轉(zhuǎn)錄因子參與了它們的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其中核因子κB（NF-κB）、激活蛋白1（AP-1）和特異性蛋白1（Sp1）等轉(zhuǎn)錄因子的作用尤為顯著。NF-κB是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NF-κB通常以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，與抑制蛋白IκB結(jié)合形成復(fù)合物。當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1（IL-1）、脂多糖（LPS）等炎癥因子，或者紫外線、電離輻射等物理因素，以及生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等的刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)激活一系列信號(hào)通路，導(dǎo)致IκB激酶（IKK）被激活。激活的IKK能夠磷酸化IκB，使其與NF-κB解離，從而釋放出活化的NF-κB?；罨腘F-κB迅速?gòu)募?xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在S100A4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，NF-κB起著重要的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細(xì)胞中，如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等，激活NF-κB信號(hào)通路能夠顯著上調(diào)S100A4的表達(dá)。通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，NF-κB能夠直接結(jié)合到S100A4基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)，招募RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，促進(jìn)S100A4基因的轉(zhuǎn)錄。在乳腺癌細(xì)胞中，TNF-α刺激能夠激活NF-κB信號(hào)通路，使NF-κB與S100A4基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，從而上調(diào)S100A4的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。NF-κB對(duì)MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控也至關(guān)重要。在腫瘤細(xì)胞中，NF-κB能夠結(jié)合到MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)，增強(qiáng)MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄活性。在肝癌細(xì)胞中，炎癥因子刺激激活NF-κB信號(hào)通路，NF-κB與MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。當(dāng)使用NF-κB抑制劑處理肝癌細(xì)胞時(shí)，MMP-9的表達(dá)明顯降低，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力也顯著減弱，這進(jìn)一步證實(shí)了NF-κB對(duì)MMP-9基因轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用。AP-1是一種由c-Jun和c-Fos等蛋白組成的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，它在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。AP-1能夠識(shí)別并結(jié)合基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列，即12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA）反應(yīng)元件（TRE），通過(guò)招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。在S100A4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，AP-1也發(fā)揮著重要作用。研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞中，激活A(yù)P-1信號(hào)通路能夠上調(diào)S100A4的表達(dá)。通過(guò)基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)c-Jun和c-Fos能夠增強(qiáng)S100A4基因啟動(dòng)子的活性，促進(jìn)S100A4的轉(zhuǎn)錄。在黑色素瘤細(xì)胞中，生長(zhǎng)因子刺激能夠激活A(yù)P-1信號(hào)通路，使AP-1與S100A4基因啟動(dòng)子區(qū)域的TRE位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)S100A4的表達(dá)，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。AP-1對(duì)MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控同樣顯著。在腫瘤細(xì)胞中，AP-1能夠結(jié)合到MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的TRE位點(diǎn)，促進(jìn)MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄。在口腔鱗癌細(xì)胞中，炎癥因子刺激激活A(yù)P-1信號(hào)通路，AP-1與MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的TRE位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。使用AP-1抑制劑處理口腔鱗癌細(xì)胞時(shí)，MMP-9的表達(dá)明顯降低，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力也顯著減弱，這表明AP-1在MMP-9基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起到關(guān)鍵的促進(jìn)作用。Sp1是一種廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，它含有3個(gè)高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地結(jié)合富含GC的DNA序列，即Sp1結(jié)合位點(diǎn)，參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在S100A4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，Sp1也參與其中。研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細(xì)胞中，Sp1能夠結(jié)合到S100A4基因啟動(dòng)子區(qū)域的Sp1結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)S100A4的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，Sp1與S100A4基因啟動(dòng)子區(qū)域的Sp1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后，能夠招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，促進(jìn)S100A4基因的轉(zhuǎn)錄。在胃癌細(xì)胞中，Sp1的表達(dá)水平與S100A4的表達(dá)呈正相關(guān)，過(guò)表達(dá)Sp1能夠上調(diào)S100A4的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Sp1對(duì)MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控也具有重要意義。在腫瘤細(xì)胞中，Sp1能夠結(jié)合到MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的Sp1結(jié)合位點(diǎn)，增強(qiáng)MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄活性。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，Sp1與MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的Sp1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。當(dāng)使用Sp1抑制劑處理結(jié)直腸癌細(xì)胞時(shí)，MMP-9的表達(dá)明顯降低，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力也顯著減弱，這表明Sp1在MMP-9基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。4.2.2基因啟動(dòng)子區(qū)域分析基因啟動(dòng)子區(qū)域是基因轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵部位，它包含多種順式作用元件和反式作用因子結(jié)合位點(diǎn)，這些元件和位點(diǎn)相互作用，共同調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。對(duì)于S100A4和MMP-9基因而言，深入分析它們的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)構(gòu)和功能，有助于揭示它們?cè)诤眵[癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。S100A4基因啟動(dòng)子區(qū)域位于基因的5'端上游，長(zhǎng)度約為1-2kb。通過(guò)生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，S100A4基因啟動(dòng)子區(qū)域包含多個(gè)重要的順式作用元件，如TATA盒、CAAT盒、GC盒等，這些元件對(duì)于啟動(dòng)子的基本活性和轉(zhuǎn)錄起始的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。S100A4基因啟動(dòng)子區(qū)域還存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如NF-κB、AP-1、Sp1等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的存在，使得S100A4基因的轉(zhuǎn)錄能夠受到多種信號(hào)通路的調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，相應(yīng)的信號(hào)通路被激活，轉(zhuǎn)錄因子被活化并結(jié)合到S100A4基因啟動(dòng)子區(qū)域的相應(yīng)位點(diǎn)，從而調(diào)節(jié)S100A4基因的轉(zhuǎn)錄。在喉鱗癌組織中，研究發(fā)現(xiàn)S100A4基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)與S100A4的表達(dá)密切相關(guān)。甲基化是一種常見的DNA修飾方式，它能夠影響基因的表達(dá)。通過(guò)甲基化特異性PCR（MSP）和亞硫酸氫鹽測(cè)序（BSP）等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在S100A4高表達(dá)的喉鱗癌組織中，其基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平較低；而在S100A4低表達(dá)的喉鱗癌組織中，其基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平較高。這表明S100A4基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)可能通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而調(diào)節(jié)S100A4的表達(dá)。當(dāng)啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平較低時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子能夠順利結(jié)合到相應(yīng)位點(diǎn)，促進(jìn)S100A4基因的轉(zhuǎn)錄；而當(dāng)啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平較高時(shí)，甲基化修飾可能阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，抑制S100A4基因的轉(zhuǎn)錄。MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域位于基因的5'端上游，長(zhǎng)度約為2-3kb。MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域包含多個(gè)順式作用元件，如TATA盒、CAAT盒、AP-1結(jié)合位點(diǎn)、NF-κB結(jié)合位點(diǎn)、Sp1結(jié)合位點(diǎn)等。這些順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子被激活，結(jié)合到MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的相應(yīng)位點(diǎn)，招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，啟動(dòng)MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄。在喉鱗癌組織中，MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白修飾狀態(tài)也與MMP-9的表達(dá)密切相關(guān)。組蛋白修飾是一種重要的表觀遺傳調(diào)控方式，它包括甲基化、乙?；?、磷酸化等多種修飾形式，能夠影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀-測(cè)序（ChIP-seq）等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在MMP-9高表達(dá)的喉鱗癌組織中，其基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白H3賴氨酸9（H3K9）乙?；捷^高，而組蛋白H3賴氨酸27（H3K27）甲基化水平較低；在MMP-9低表達(dá)的喉鱗癌組織中，其基因啟動(dòng)子區(qū)域的H3K9乙?；捷^低，而H3K27甲基化水平較高。這表明MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白修飾狀態(tài)可能通過(guò)影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)。當(dāng)啟動(dòng)子區(qū)域H3K9乙?；捷^高、H3K27甲基化水平較低時(shí)，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)較為松散，轉(zhuǎn)錄因子能夠更容易地結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄；而當(dāng)啟動(dòng)子區(qū)域H3K9乙酰化水平較低、H3K27甲基化水平較高時(shí)，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)較為緊密，轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合受到阻礙，抑制MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄。4.3其他潛在機(jī)制4.3.1非編碼RNA的調(diào)控非編碼RNA（ncRNA）是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)的研究表明，miRNA、lncRNA等非編碼RNA對(duì)S100A4和MMP-9的表達(dá)具有顯著的調(diào)控作用，它們通過(guò)與靶基因的mRNA相互作用，影響mRNA的穩(wěn)定性、翻譯效率或轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而參與喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展。miRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促進(jìn)其降解，從而調(diào)控基因的表達(dá)。在喉鱗癌中，多種miRNA參與了對(duì)S100A4和MMP-9的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，miR-203在喉鱗癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，且與S100A4的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，miR-203能夠直接結(jié)合到S100A4mRNA的3'UTR上，抑制其翻譯過(guò)程，從而降低S100A4的表達(dá)。過(guò)表達(dá)miR-203可以抑制喉鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而敲低miR-203則會(huì)促進(jìn)這些過(guò)程，同時(shí)伴隨著S100A4表達(dá)的變化。這表明miR-203通過(guò)調(diào)控S100A4的表達(dá)，在喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的抑制作用。miR-145也被報(bào)道在喉鱗癌中對(duì)S100A4和MMP-9具有調(diào)控作用。miR-145在喉鱗癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織，其低表達(dá)與喉鱗癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后因素相關(guān)。研究證實(shí)，miR-145能夠直接靶向S100A4和MMP-9的mRNA，抑制它們的表達(dá)。在喉鱗癌細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-145可以顯著降低S100A4和MMP-9的蛋白水平，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力；而抑制miR-145的表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致S100A4和MMP-9表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。這表明miR-145通過(guò)同時(shí)調(diào)控S100A4和MMP-9的表達(dá)，抑制喉鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。lncRNA是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，它們?cè)诨虮磉_(dá)調(diào)控中具有多種作用機(jī)制，如通過(guò)與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，影響基因的轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯等過(guò)程。在喉鱗癌中，一些lncRNA也參與了對(duì)S100A4和MMP-9的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAHOTAIR在喉鱗癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，且與S100A4和MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，HOTAIR可以通過(guò)與EZH2蛋白結(jié)合，形成復(fù)合物，抑制某些抑癌基因的表達(dá)，從而間接促進(jìn)S100A4和MMP-9的表達(dá)。敲低HOTAIR可以抑制喉鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時(shí)降低S100A4和MMP-9的表達(dá)，表明HOTAIR通過(guò)調(diào)控S100A4和MMP-9的表達(dá)，在喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著促進(jìn)作用。lncRNAMALAT1在喉鱗癌中也表現(xiàn)出對(duì)S100A4和MMP-9的調(diào)控作用。MALAT1在喉鱗癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與喉鱗癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。研究表明，MALAT1可以通過(guò)吸附miR-124，解除miR-124對(duì)S100A4和MMP-9的抑制作用，從而上調(diào)S100A4和MMP-9的表達(dá)。在喉鱗癌細(xì)胞中，敲低MALAT1會(huì)導(dǎo)致miR-124表達(dá)上調(diào)，S100A4和MMP-9表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到抑制；而過(guò)表達(dá)MALAT1則會(huì)促進(jìn)這些過(guò)程。這表明MALAT1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）機(jī)制，調(diào)控miR-124對(duì)S100A4和MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而影響喉鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。4.3.2細(xì)胞微環(huán)境的影響腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移的重要場(chǎng)所，它由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等組成，其中細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中對(duì)S100A4和MMP-9的表達(dá)產(chǎn)生重要影響，進(jìn)而調(diào)控喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展。細(xì)胞因子是一類由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞分泌的具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，它們?cè)诩?xì)胞間的信號(hào)傳遞和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在喉鱗癌的腫瘤微環(huán)境中，多種細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）等對(duì)S100A4和MMP-9的表達(dá)具有調(diào)控作用。研究表明，TNF-α可以通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)S100A4和MMP-9的表達(dá)。在喉鱗癌細(xì)胞中，TNF-α刺激能夠使NF-κB活化并進(jìn)入細(xì)胞核，與S100A4和MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，從而上調(diào)它們的表達(dá)，增強(qiáng)喉鱗癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。IL-6在喉鱗癌的腫瘤微環(huán)境中也發(fā)揮著重要作用。IL-6可以通過(guò)JAK/STAT信號(hào)通路，調(diào)節(jié)S100A4和MMP-9的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6與喉鱗癌細(xì)胞表面的IL-6受體結(jié)合后，激活JAK激酶，使STAT3磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，與S100A4和MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進(jìn)它們的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而上調(diào)S100A4和MMP-9的表達(dá)。阻斷IL-6/JAK/STAT3信號(hào)通路可以抑制S100A4和MMP-9的表達(dá)，降低喉鱗癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。TGF-β是一種多功能的細(xì)胞因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有復(fù)雜的作用。在喉鱗癌中，TGF-β可以通過(guò)Smad信號(hào)通路，調(diào)控S100A4和MMP-9的表達(dá)。TGF-β與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活Smad蛋白，使其進(jìn)入細(xì)胞核，與S100A4和MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的Smad結(jié)合元件結(jié)合，調(diào)節(jié)它們的轉(zhuǎn)錄。研究表明，TGF-β可以促進(jìn)S100A4和MMP-9的表達(dá)，增強(qiáng)喉鱗癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。然而，TGF-β在腫瘤發(fā)展的不同階段可能具有不同的作用，在腫瘤早期，它可能具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，而在腫瘤晚期，它可能促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。免疫細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等，它們?cè)谀[瘤的免疫監(jiān)視和免疫逃逸中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，同時(shí)也對(duì)S100A4和MMP-9的表達(dá)產(chǎn)生影響。巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中數(shù)量較多的免疫細(xì)胞之一，根據(jù)其功能和表型可分為M1型和M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤活性，能夠分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，激活免疫應(yīng)答，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；而M2型巨噬細(xì)胞則具有促腫瘤作用，能夠分泌一些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，在喉鱗癌的腫瘤微環(huán)境中，M2型巨噬細(xì)胞可以通過(guò)分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子，上調(diào)S100A4和MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)喉鱗癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。阻斷M2型巨噬細(xì)胞的功能或抑制其分泌的細(xì)胞因子，可以降低S100A4和MMP-9的表達(dá)，抑制喉鱗癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。T淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫中也發(fā)揮著重要作用。CD4+輔助性T細(xì)胞（Th細(xì)胞）可以分為Th1、Th2、Th17等不同亞群，它們分泌不同的細(xì)胞因子，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生不同的影響。在喉鱗癌中，Th17細(xì)胞分泌的IL-17可以通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)S100A4和MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)喉鱗癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。而CD8+細(xì)