2025年pcr檢測上崗證考試題及答案一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共30題，60分）1.以下關(guān)于PCR引物設(shè)計(jì)的基本原則，錯(cuò)誤的是（）A.引物長度通常為18-25個(gè)核苷酸B.引物GC含量應(yīng)控制在40%-60%C.引物3’端避免連續(xù)3個(gè)G/C堿基D.引物5’端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ)答案：D（解析：引物5’端可添加酶切位點(diǎn)或標(biāo)簽，無需嚴(yán)格互補(bǔ)）2.實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線的“指數(shù)期”主要用于（）A.確定基線范圍B.計(jì)算Ct值C.判斷擴(kuò)增效率D.識別非特異性擴(kuò)增答案：B（解析：Ct值定義為熒光信號達(dá)到閾值時(shí)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，通常在指數(shù)期讀?。?.以下哪種物質(zhì)對TaqDNA聚合酶抑制作用最強(qiáng)？（）A.肝素B.EDTAC.血紅蛋白D.尿素答案：A（解析：肝素通過與Taq酶結(jié)合直接抑制活性，是PCR最常見的抑制物之一）4.臨床PCR實(shí)驗(yàn)室“三區(qū)兩通道”中，“三區(qū)”指的是（）A.試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū)B.樣本接收區(qū)、核酸提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)C.試劑儲(chǔ)存區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)D.清潔區(qū)、半污染區(qū)、污染區(qū)答案：A（解析：根據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》，標(biāo)準(zhǔn)分區(qū)為試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū)）5.進(jìn)行RNA病毒PCR檢測時(shí)，若使用一步法RT-PCR，關(guān)鍵操作是（）A.增加Taq酶用量B.優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄溫度和時(shí)間C.減少dNTP濃度D.延長變性時(shí)間答案：B（解析：一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄效率直接影響最終擴(kuò)增結(jié)果，需根據(jù)引物Tm值優(yōu)化反應(yīng)條件）6.以下關(guān)于熒光探針法（TaqMan）的描述，正確的是（）A.熒光信號強(qiáng)度與探針?biāo)饬砍煞幢菳.探針5’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，3’端標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)C.適用于多重PCR檢測D.對引物設(shè)計(jì)要求低于染料法答案：C（解析：TaqMan探針可通過不同熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)多重檢測；A應(yīng)為正比，B標(biāo)記位置相反，D探針法對引物和探針設(shè)計(jì)要求更高）7.PCR實(shí)驗(yàn)室空氣消毒首選方法是（）A.紫外線照射（波長254nm）B.75%乙醇噴霧C.過氧乙酸熏蒸D.甲醛熏蒸答案：A（解析：紫外線對DNA/RNA有強(qiáng)破壞作用，是實(shí)驗(yàn)室空氣消毒的標(biāo)準(zhǔn)方法；其他方法因殘留或毒性限制使用）8.檢測樣本為全血時(shí)，核酸提取前需先進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，主要目的是（）A.減少血紅蛋白對PCR的抑制B.提高白細(xì)胞得率C.避免紅細(xì)胞DNA干擾D.降低樣本黏稠度答案：A（解析：血紅蛋白中的鐵離子可螯合Mg2+，抑制Taq酶活性，需優(yōu)先去除）9.某批次PCR試劑擴(kuò)增陰性對照出現(xiàn)弱陽性，最可能的原因是（）A.引物二聚體B.試劑被擴(kuò)增產(chǎn)物污染C.樣本交叉污染D.儀器溫度偏差答案：B（解析：陰性對照陽性提示試劑或操作過程中引入外源性DNA污染，最常見為前批次產(chǎn)物污染）10.以下Ct值判讀規(guī)則中，符合《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》的是（）A.Ct≤35為陽性，35<Ct≤40為灰區(qū)，Ct>40為陰性B.Ct≤30為陽性，30<Ct≤35為灰區(qū)，Ct>35為陰性C.所有Ct值均需結(jié)合熔解曲線分析D.灰區(qū)樣本需重復(fù)檢測，重復(fù)后Ct值仍在灰區(qū)則判陰性答案：A（解析：根據(jù)規(guī)范，通常以Ct≤35為陽性，35-40需結(jié)合樣本類型重復(fù)驗(yàn)證，>40為陰性）11.進(jìn)行定量PCR時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值應(yīng)至少達(dá)到（）A.0.90B.0.95C.0.98D.1.00答案：C（解析：定量PCR要求標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2≥0.98，以保證定量準(zhǔn)確性）12.以下哪種物質(zhì)可用于PCR產(chǎn)物的滅活處理？（）A.10%次氯酸鈉B.無水乙醇C.生理鹽水D.去離子水答案：A（解析：次氯酸鈉通過氧化破壞核酸結(jié)構(gòu)，是PCR產(chǎn)物滅活的常用試劑）13.實(shí)時(shí)熒光PCR儀的溫度均勻性要求是（）A.各孔間溫差≤0.5℃B.各孔間溫差≤1.0℃C.各孔間溫差≤1.5℃D.各孔間溫差≤2.0℃答案：A（解析：溫度均勻性直接影響擴(kuò)增效率，規(guī)范要求各孔間溫差≤0.5℃）14.核酸提取過程中，加入RNase抑制劑的主要目的是（）A.防止DNA降解B.抑制樣本中的RNA酶C.提高核酸純度D.促進(jìn)核酸沉淀答案：B（解析：RNase抑制劑通過與RNA酶結(jié)合，防止樣本中的內(nèi)源性RNA酶降解目標(biāo)RNA）15.以下關(guān)于PCR實(shí)驗(yàn)室人員防護(hù)的描述，錯(cuò)誤的是（）A.樣本處理區(qū)需佩戴N95口罩B.擴(kuò)增分析區(qū)可佩戴一次性外科口罩C.所有區(qū)域需穿專用實(shí)驗(yàn)服D.接觸血液樣本時(shí)需戴雙層手套答案：B（解析：擴(kuò)增分析區(qū)可能存在氣溶膠污染，需佩戴N95口罩或醫(yī)用防護(hù)口罩）16.進(jìn)行多重PCR時(shí)，為避免引物間相互作用，關(guān)鍵措施是（）A.增加引物濃度B.優(yōu)化退火溫度C.使用熱啟動(dòng)Taq酶D.減少dNTP濃度答案：B（解析：多重PCR需通過優(yōu)化退火溫度平衡各引物對的擴(kuò)增效率，避免非特異性結(jié)合）17.以下哪種情況會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增曲線出現(xiàn)“平臺期”提前？（）A.模板濃度過高B.引物濃度過低C.Mg2+濃度不足D.退火時(shí)間過短答案：A（解析：模板濃度過高時(shí)，dNTP和引物過早耗盡，導(dǎo)致平臺期提前）18.實(shí)驗(yàn)室使用的移液器校準(zhǔn)周期應(yīng)為（）A.3個(gè)月B.6個(gè)月C.12個(gè)月D.24個(gè)月答案：B（解析：根據(jù)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制要求》，移液器需每6個(gè)月校準(zhǔn)一次）19.以下關(guān)于內(nèi)參基因（管家基因）的描述，錯(cuò)誤的是（）A.用于評估核酸提取效率B.需在樣本中穩(wěn)定表達(dá)C.擴(kuò)增效率應(yīng)與目標(biāo)基因一致D.內(nèi)參陰性可直接判樣本陰性答案：D（解析：內(nèi)參陰性提示核酸提取失敗或抑制物存在，需重新提取樣本，不能直接判陰性）20.處理PCR污染時(shí)，使用DNA酶的作用是（）A.降解環(huán)境中的DNA污染B.滅活Taq酶殘留C.破壞引物二聚體D.清除RNA污染答案：A（解析：DNA酶可特異性降解環(huán)境中的DNA分子，消除擴(kuò)增產(chǎn)物污染）21.以下哪種樣本處理方式會(huì)導(dǎo)致核酸降解？（）A.全血樣本4℃保存超過24小時(shí)B.血清樣本-20℃凍存C.組織樣本用RNAlater保存D.唾液樣本加入裂解液后室溫放置答案：A（解析：全血中的白細(xì)胞會(huì)釋放核酸酶，4℃保存超過24小時(shí)可能導(dǎo)致核酸降解）22.實(shí)時(shí)熒光PCR儀的熒光通道校準(zhǔn)應(yīng)使用（）A.標(biāo)準(zhǔn)熒光染料B.去離子水C.陽性樣本D.陰性對照答案：A（解析：需使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)熒光染料（如FAM、HEX等）校準(zhǔn)各通道靈敏度）23.以下關(guān)于PCR結(jié)果記錄的要求，錯(cuò)誤的是（）A.需記錄儀器型號、試劑批號B.原始數(shù)據(jù)至少保存2年C.灰區(qū)結(jié)果需標(biāo)注“重復(fù)檢測”D.電子數(shù)據(jù)可替代紙質(zhì)記錄答案：D（解析：電子數(shù)據(jù)需與紙質(zhì)記錄同步保存，不可單獨(dú)替代）24.進(jìn)行新冠病毒PCR檢測時(shí)，若樣本Ct值為38，正確的處理是（）A.直接判陰性B.重復(fù)檢測，若重復(fù)Ct≤40且熔解曲線符合則判陽性C.稀釋樣本后重新檢測D.報(bào)告“檢測結(jié)果不確定”答案：B（解析：根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案》，Ct值35-40需重復(fù)檢測，確認(rèn)后判讀）25.以下哪種操作會(huì)增加氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)？（）A.使用帶濾芯的吸頭B.手動(dòng)反復(fù)吹打樣本C.離心前密封管蓋D.樣本處理區(qū)使用生物安全柜答案：B（解析：反復(fù)吹打易產(chǎn)生氣溶膠，應(yīng)避免；其他選項(xiàng)為防污染措施）26.定量PCR中，擴(kuò)增效率（E）的計(jì)算公式為（）A.E=10^(-1/斜率)-1B.E=斜率×10+1C.E=10^(斜率)-1D.E=1/斜率×100%答案：A（解析：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（S）與擴(kuò)增效率關(guān)系為E=10^(-1/S)-1，理想E=1（100%））27.核酸提取儀的日常維護(hù)不包括（）A.清潔磁珠模塊B.校準(zhǔn)加樣針液面感應(yīng)C.更換廢液桶過濾膜D.檢測擴(kuò)增儀溫度答案：D（解析：擴(kuò)增儀維護(hù)屬于另一設(shè)備，與提取儀無關(guān)）28.以下關(guān)于實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理的描述，正確的是（）A.一次性手套可直接投入普通垃圾桶B.核酸提取廢液需用1mol/LNaOH處理30分鐘C.陽性樣本管需高壓蒸汽滅菌（121℃，30分鐘）后丟棄D.廢棄吸頭可放入專用利器盒答案：C（解析：陽性樣本含感染性物質(zhì)，需高壓滅菌后處理；A需投入醫(yī)療廢物桶，B應(yīng)用含氯消毒劑處理，D吸頭屬醫(yī)療廢物，非利器）29.進(jìn)行突變檢測（如SNP）時(shí)，最適宜的PCR方法是（）A.普通PCRB.熒光染料法PCRC.高分辨率熔解曲線（HRM）分析D.巢式PCR答案：C（解析：HRM通過熔解曲線差異區(qū)分突變型與野生型，適用于SNP檢測）30.實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制中，“室內(nèi)質(zhì)控”的核心目的是（）A.評估實(shí)驗(yàn)室間檢測一致性B.監(jiān)控檢測過程的穩(wěn)定性C.驗(yàn)證新試劑的準(zhǔn)確性D.滿足認(rèn)證評審要求答案：B（解析：室內(nèi)質(zhì)控通過定期檢測已知濃度的質(zhì)控品，監(jiān)控檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性）二、多項(xiàng)選擇題（每題3分，共10題，30分）1.以下屬于PCR實(shí)驗(yàn)室“三查”內(nèi)容的是（）A.查試劑有效期B.查儀器狀態(tài)C.查樣本信息D.查人員資質(zhì)答案：ABC（解析：“三查”指操作前查試劑、查儀器、查樣本）2.導(dǎo)致PCR假陰性的可能原因包括（）A.樣本中存在抑制物B.引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤C.擴(kuò)增循環(huán)數(shù)不足D.模板濃度過高答案：ABC（解析：模板濃度過高可能導(dǎo)致平臺期提前，但不會(huì)直接導(dǎo)致假陰性）3.實(shí)時(shí)熒光PCR的質(zhì)量控制應(yīng)包括（）A.陽性對照B.陰性對照C.內(nèi)參對照D.空白對照答案：ABCD（解析：需同時(shí)設(shè)置陽性、陰性、內(nèi)參及空白對照，全面監(jiān)控污染和抑制）4.核酸提取過程中，影響得率的因素有（）A.樣本量B.裂解時(shí)間C.洗脫體積D.離心轉(zhuǎn)速答案：ABCD（解析：樣本量不足、裂解不充分、洗脫體積過大或離心轉(zhuǎn)速不夠均會(huì)影響得率）5.以下關(guān)于PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)管理的要求，正確的是（）A.各區(qū)物品嚴(yán)格專用，不得交叉使用B.樣本處理區(qū)需配備生物安全柜C.擴(kuò)增分析區(qū)可存放擴(kuò)增產(chǎn)物D.試劑準(zhǔn)備區(qū)需使用專用移液器答案：ABD（解析：擴(kuò)增分析區(qū)禁止存放擴(kuò)增產(chǎn)物，避免污染）6.進(jìn)行RNA檢測時(shí)，需特別注意的操作包括（）A.實(shí)驗(yàn)臺面用RNaseZap處理B.使用DEPC水配制試劑C.樣本避免反復(fù)凍融D.離心管經(jīng)高溫高壓滅菌答案：ABC（解析：高溫高壓不能完全滅活RNase，需使用RNase-free器材）7.以下屬于PCR污染防控措施的是（）A.實(shí)驗(yàn)室采用負(fù)壓通風(fēng)B.擴(kuò)增后產(chǎn)物不在前區(qū)操作C.使用dUTP代替dTTP并加入U(xiǎn)NG酶D.每日工作后進(jìn)行紫外線消毒答案：ABCD（解析：四項(xiàng)均為標(biāo)準(zhǔn)防污染措施）8.定量PCR結(jié)果不準(zhǔn)確的可能原因有（）A.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋誤差B.擴(kuò)增效率偏離100%C.熒光采集時(shí)間錯(cuò)誤D.樣本核酸降解答案：ABCD（解析：所有選項(xiàng)均會(huì)影響定量準(zhǔn)確性）9.以下關(guān)于PCR報(bào)告的要求，正確的是（）A.需注明檢測方法和試劑名稱B.灰區(qū)結(jié)果應(yīng)提示“建議重復(fù)檢測”C.陽性結(jié)果需標(biāo)注Ct值D.報(bào)告需經(jīng)雙人審核答案：ABCD（解析：均符合《臨床檢驗(yàn)報(bào)告規(guī)范》）10.實(shí)驗(yàn)室發(fā)生擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏時(shí)，應(yīng)急處理措施包括（）A.立即停止實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記污染區(qū)域B.用10%次氯酸鈉覆蓋污染區(qū)30分鐘C.更換污染的實(shí)驗(yàn)服和手套D.對相關(guān)區(qū)域進(jìn)行紫外線消毒4小時(shí)答案：ABCD（解析：四項(xiàng)均為標(biāo)準(zhǔn)泄漏處理流程）三、簡答題（每題8分，共5題，40分）1.簡述PCR實(shí)驗(yàn)室“三區(qū)兩通道”的具體設(shè)置及各區(qū)域功能。答案：“三區(qū)”指試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū)；“兩通道”指工作人員通道和樣本/試劑傳遞通道。-試劑準(zhǔn)備區(qū)：用于PCR試劑的配制、分裝和保存，需嚴(yán)格避免核酸污染，配備超凈工作臺。-樣本處理區(qū)：用于樣本接收、核酸提取及加樣，需生物安全柜，處理感染性樣本時(shí)需二級生物安全防護(hù)。-擴(kuò)增分析區(qū)：用于PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物分析，需實(shí)時(shí)熒光PCR儀，禁止任何核酸模板進(jìn)入。“兩通道”確保人員和物品單向流動(dòng)（試劑準(zhǔn)備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴(kuò)增分析區(qū)），避免交叉污染。2.列舉5種常見的PCR抑制物及其來源，并說明對應(yīng)的解決措施。答案：（1）肝素（來源：抗凝全血）：改用EDTA抗凝管，或使用肝素酶處理樣本。（2）血紅蛋白（來源：溶血樣本）：增加紅細(xì)胞裂解步驟，減少殘留。（3）膽鹽（來源：糞便樣本）：使用磁珠法提取核酸，利用磁珠特異性吸附核酸。（4）尿素（來源：尿液樣本）：稀釋樣本或增加洗滌步驟。（5）多糖（來源：植物或組織樣本）：使用高鹽緩沖液（如CTAB）裂解，去除多糖干擾。3.簡述實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果判讀的標(biāo)準(zhǔn)流程。答案：（1）檢查對照：陰性對照無擴(kuò)增（Ct>40或無曲線），陽性對照Ct值在預(yù)期范圍內(nèi)，內(nèi)參對照均擴(kuò)增（Ct≤35）。（2）分析樣本曲線：觀察擴(kuò)增曲線是否呈典型S型，排除引物二聚體（熔解曲線單峰）。（3）判定Ct值：Ct≤35為陽性；35<Ct≤40為灰區(qū)，需重復(fù)檢測，重復(fù)后Ct≤40且曲線符合則判陽性；Ct>40為陰性。（4）記錄異常：如無擴(kuò)增曲線、曲線形態(tài)異常等，需標(biāo)注并分析原因（如抑制物、提取失敗）。4.闡述PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及具體措施。答案：（1）人員培訓(xùn)：定期進(jìn)行操作規(guī)范、生物安全培訓(xùn)，考核合格后方可上崗。（2）試劑管理：驗(yàn)收時(shí)核查效期、批次；使用前做性能驗(yàn)證（靈敏度、特異性）；保存條件符合要求（-20℃或4℃）。（3）儀器校準(zhǔn)：PCR儀定期校準(zhǔn)溫度均勻性（±0.5℃）和熒光通道；移液器每6個(gè)月校準(zhǔn)（誤差≤5%）。（4）室內(nèi)質(zhì)控：每日檢測高、中、低值質(zhì)控品，繪制質(zhì)控圖，失控時(shí)停止檢測并排查原因。（5）室間質(zhì)評：每年參加至少2次國家級或省級室間質(zhì)評，評估實(shí)驗(yàn)室檢測能力。5.設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案，驗(yàn)證某批次PCR試劑的靈敏度（最低檢測限）。答案：（1）樣本準(zhǔn)備：使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（如病毒核酸質(zhì)粒），10倍梯度稀釋至理論濃度1000拷貝/μL、100拷貝/μL、10拷貝/μL、1拷貝/μL。（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)置：每個(gè)濃度設(shè)置8-10個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陰性對照（3孔）和陽性對照（3孔）。（3）檢測流程：按試劑說明書進(jìn)行核酸提?。ㄈ魹榧兒怂峥芍苯蛹訕樱?、配制反應(yīng)體系、擴(kuò)增（設(shè)置正確的循環(huán)條件）。（4）結(jié)果分析：統(tǒng)計(jì)各濃度的陽性檢出率（陽性孔數(shù)/總孔數(shù)）。最低檢測限定義為檢出率≥95%的最低濃度（如10拷貝/μL檢出9/10孔，1拷貝/μL檢出5/10孔，則靈敏度為10拷貝/μL）。（5）驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)：陰性對照無擴(kuò)增，陽性對照Ct值符合預(yù)期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次結(jié)果一致。四、案例分析題（20分）某實(shí)驗(yàn)室開展新冠病毒核酸檢測時(shí)，出