Q/LB.□XXXXX-XXXX傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范第11部分：細菌類應(yīng)急檢測技術(shù)范圍本文件規(guī)定了細菌類應(yīng)急檢測的實驗室生物安全要求、準備工作和質(zhì)量控制、常用顯微鏡檢查技術(shù)、分離培養(yǎng)、分子生物學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù)和免疫學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù)等。本文件適用于傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置中細菌類傳染病病原體的應(yīng)急檢測。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求WS233病原微生物實驗室生物安全通用準則WS288肺結(jié)核診斷《人間傳染的病原微生物目錄（2023版）》國家衛(wèi)生健康委員會術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。

致病菌pathogenicbacterium能引起人類疾病的細菌,統(tǒng)稱為致病菌或病原菌。

高通量測序high-throughputsequencing又稱“下一代”測序技術(shù)（"Next-generation"sequencingtechnology），一種大規(guī)模并行測序技術(shù)。該技術(shù)可在較短時間內(nèi)確定目標區(qū)域中核苷酸的順序，用于細菌全基組或病原宏基因測序。實驗室生物安全要求實驗人員應(yīng)根據(jù)GB19489和風險評估的要求，配備不同類型傳染病感染的個人防護裝備，包括但不限于防護服、手套、外科口罩或醫(yī)用防護口罩、防護面屏、防護帽。防護服宜每隔4h更換一次。在發(fā)生意外暴露時，根據(jù)應(yīng)急處置預(yù)案采取必要措施。實驗人員、實驗場所、感染性標本處置及消毒滅菌等應(yīng)符合WS233中的實驗室生物安全管理要求。醫(yī)療廢物處置應(yīng)按照《醫(yī)療廢物管理條例》規(guī)定執(zhí)行。準備工作和質(zhì)量控制準備工作根據(jù)實驗需要，選擇相應(yīng)的生物安全柜、移液器、漩渦震蕩儀、離心機等儀器和檢測試劑耗材。質(zhì)量控制每一批次反應(yīng)過程中應(yīng)至少設(shè)置一個陰性和陽性對照，必要時增加空白對照。常用顯微鏡檢查技術(shù)生理鹽水濕片鏡下檢測在玻片上滴加適量生理鹽水，將適量樣本與生理鹽水混合并涂抹均勻后，觀察中性粒細胞、紅細胞及其數(shù)量；觀察標本中細菌動力特征（用暗視野顯微鏡觀察）等。革蘭氏染色顯微鏡檢查直接在玻片上涂抹標本，涂片應(yīng)薄且均勻。自然干燥或恒溫干燥器上干燥后，經(jīng)甲醇固定或火焰快速固定3次，革蘭染色，晾干后讀片。革蘭染色脫色時間因選用不同的脫色劑而異。使用革蘭氏染色儀染色，應(yīng)按照廠家操作說明書進行?？顾崛旧@微鏡檢查抗酸染色鏡檢操作流程應(yīng)按照WS288執(zhí)行。熒光染色顯微鏡檢查熒光染色鏡檢步驟如下。染色：涂片經(jīng)火焰固定后，滴加金胺“O”染色劑蓋滿玻片，染色30min，流水自玻片一端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩余的水；脫色：涂膜上端外緣滴加脫色劑，蓋滿玻片，脫色3min或至無色，流水自玻片一端輕洗，洗去脫色劑；復(fù)染：加復(fù)染劑復(fù)染1min，瀝去復(fù)染液，流水自玻片一端輕洗，自然干燥后鏡檢；鏡檢：玻片涂膜面向上置于熒光或LED顯微鏡載物臺，并以卡尺固定后，以低倍鏡搜索發(fā)現(xiàn)疑為致病菌的熒光物質(zhì)，使用40×物鏡確認。在暗背景下，目標菌發(fā)出熒光，呈特征形態(tài)。其他特殊染色顯微鏡檢查細菌特殊結(jié)構(gòu)如芽孢、鞭毛、莢膜或其他細菌結(jié)構(gòu)如細胞壁、核質(zhì)、胞質(zhì)顆粒等，采用相應(yīng)的特殊染色法進行顯微鏡檢查。包括且不限于細胞壁染色、鞭毛染色、莢膜染色、芽孢染色、異染顆粒染色。分離培養(yǎng)無菌部位標本一般應(yīng)在患者使用抗生素之前采集無菌部位標本如血液標本直接接種血培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，陽性血培養(yǎng)物進行固體培養(yǎng)基分離純化，并進行后續(xù)進一步鑒定，對血培養(yǎng)陰性的標本盲傳一代。非無菌部位標本非無菌部位標本，通過直接培養(yǎng)或選擇性增菌培養(yǎng)的方式，針對不同細菌采用不同培養(yǎng)基和分離程序，得到細菌純培養(yǎng)物。分子生物學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù)核酸提取試劑盒法提取核酸根據(jù)標本類型選擇相應(yīng)商品化離心柱法或磁珠法基因組核酸提取試劑盒。選擇非人源性內(nèi)參時，待提取標本中宜加入相應(yīng)的內(nèi)參模板。常溫一步法提取核酸根據(jù)標本類型選擇相應(yīng)商品化的裂解試劑，將試劑加入標本中，常溫裂解。煮沸法提取核酸標本離心、重懸后使用煮沸法進行簡易模板制備：取1接種環(huán)（約2μL～5μL）擴大培養(yǎng)物放入裝有500μL純水或TE的1.5mL離心管內(nèi)，混勻；100℃加熱10min；12,000rpm離心10min；吸取上清即為PCR模板。選擇非人源性內(nèi)參時，在待提取標本中宜加入相應(yīng)的內(nèi)參模板。等溫擴增技術(shù)反應(yīng)體系配制（引物、鏈置換型核酸合成酶、基質(zhì)、模板）后置于指定溫度下（60℃～65℃），經(jīng)一個步驟即可完成。具體參照相應(yīng)細菌核酸檢測試劑盒說明書。陰性對照、陽性對照結(jié)果成立時，可使用以下方法進行結(jié)果判定：濁度檢測：肉眼觀察反應(yīng)管內(nèi)出現(xiàn)白色渾濁判定為陽性，未渾濁判為陰性；指示劑檢測：加入熒光等指示劑后，根據(jù)試劑盒說明書判定結(jié)果。實時熒光PCR技術(shù)反應(yīng)體系配制（PCR反應(yīng)液、酶、引物、探針及模板）及反應(yīng)程序設(shè)置（反應(yīng)溫度、循環(huán)數(shù)及熒光通道）應(yīng)參照相應(yīng)細菌核酸檢測試劑盒說明書。陰性對照、陽性對照、內(nèi)參（如有）結(jié)果成立時，進行結(jié)果判斷：陰性顯示無Ct值、無S形擴增曲線；陽性顯示Ct值小于或等于細菌核酸檢測試劑盒說明書規(guī)定值，且有S形擴增曲線。數(shù)字PCR技術(shù)根據(jù)PCR儀器和試劑的要求制備反應(yīng)體系，將體系分配到微小分區(qū)或微滴中并封蓋，進行PCR反應(yīng)。使用熒光染料或探針監(jiān)測目標核酸的擴增，配套軟件統(tǒng)計分析各反應(yīng)中的陽性液滴數(shù)。當陰性對照、陽性對照、內(nèi)參（如有）結(jié)果成立時，進行結(jié)果判斷，確定目標核酸及其定量信息，包括標本中每個熒光通道的濃度、精度、誤差，依據(jù)試劑盒說明書進行結(jié)果判讀。微流體芯片檢測技術(shù)參照相應(yīng)的多病原檢測試劑盒（微流體芯片法）說明書。當陰性對照、陽性對照、內(nèi)參（如有）結(jié)果成立時，進行結(jié)果判斷，查看各標本擴增曲線的形態(tài)及對應(yīng)的Ct值，對照試劑盒說明書規(guī)定值進行判讀。確定各個病原體靶點陽性擴增所對應(yīng)的標本編號，報告該標本為對應(yīng)病原體檢測項目陽性。高通量宏基因組測序測序時機傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急檢測中，出現(xiàn)且不限于多病原核酸檢測陰性、分離培養(yǎng)陰性、免疫學(xué)檢測陰性等情況時，宜使用宏基因組測序。實驗過程對符合要求的核酸進行文庫構(gòu)建、上機測序、數(shù)據(jù)分析等。具體反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照相應(yīng)測序平臺及試劑盒說明書，根據(jù)應(yīng)急檢測實際選擇是否執(zhí)行去宿主操作。數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)質(zhì)量控制數(shù)據(jù)質(zhì)量控制要求如下：標本經(jīng)過高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)，應(yīng)該在去除接頭、低質(zhì)量數(shù)據(jù)和宿主基因組序列后再進行下一步分析。測序完成后，對Q20和Q30進行統(tǒng)計，標本測序的堿基質(zhì)量應(yīng)同時符合：Q201）≥90%、Q302）≥85%。每個標本的高質(zhì)量序列（Q20）數(shù)目應(yīng)大于2×107條，對于宿主含量較多而又未在核酸提取步驟進行去宿主操作的標本，數(shù)據(jù)量適當增加到4×107～8×107條。測序數(shù)據(jù)中，堿基識別質(zhì)量值為20的堿基識別準確率為99%，或錯誤率為1%。測序數(shù)據(jù)中，堿基識別質(zhì)量值為30的堿基識別準確率為99.9%，或錯誤率為0.1%。物種注釋數(shù)據(jù)質(zhì)控后對標本數(shù)據(jù)進行物種注釋，宜選用得到廣泛認可的數(shù)據(jù)庫進行物種注釋，包括但不限于FoodandDrugAdministrationdAtabaseforReferenceGrademicrObialSequences（FDA-ARGOS），WorldDataCentreforMicroorganisms（WDCM），GenomeTaxonomyDataBase（GTDB）等。除特殊方法外，對于已知物種，數(shù)據(jù)庫中序列相似度95%以上，覆蓋度90%以上。微生物豐度計算數(shù)據(jù)質(zhì)控后進行物種相對豐度計算，并記錄計算方法或軟件。除特殊方法外，應(yīng)將高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)比對到組裝好的參考基因集或合適的數(shù)據(jù)庫上，按相似度95%以上，覆蓋度90%以上進行統(tǒng)計，得到基因水平上的相對豐度分布情況，再將注釋到同一物種和同一屬的分類水平的基因序列相對豐度進行疊加，得到種水平和屬水平的相對豐度結(jié)果。結(jié)果判定結(jié)果判定規(guī)則如下：結(jié)合《人間傳染的病原微生物目錄》或其他相關(guān)的病原微生物目錄篩選出物種注釋中的致病菌和條件致病菌的信息，針對不同標c本類型并結(jié)合檢出病原微生物的種類進行解讀，確認致病微生物時，應(yīng)區(qū)分無菌部位（血、無菌體液、組織、骨髓等）與正常有菌部位（如呼吸道、尿液、開放性傷口）。正常有菌部位應(yīng)綜合分析檢出細菌是否為導(dǎo)致感染的致病病原。對于條件致病菌3），應(yīng)綜合考慮臨床表現(xiàn)和物種豐度等信息謹慎進行判斷。對于致病菌，當種特異性序列數(shù)較低時（小于3條）一般不考慮為致病病原，但檢出菌為敏感度較低的菌株，如結(jié)核分支桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，布魯氏菌，諾卡菌等以及烈性傳染病的時候（包括鼠疫，炭疽等),應(yīng)結(jié)合臨床癥狀考慮感染可能，并使用分離培養(yǎng)、涂片染色或抗體檢測等手段予以確認或排除。如果疑似暴發(fā)疫情標本大部分都報告相應(yīng)序列且能夠排除標本之間或環(huán)境污染時即可認定其為此次疫情的致病菌。對于無菌部位檢出病原菌時，在排除標本污染的情況下，高度懷疑其為致病菌。對于鑒定出可分離培養(yǎng)的病原菌，應(yīng)按相應(yīng)操作指南對原始標本進行分離培養(yǎng)。在一定條件下，原來不致病的細菌成為致病菌，稱為條件致病菌或機會致病菌。免疫學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù)膠體金檢測技術(shù)檢測標本的類型、上樣體積及操作步驟參照相應(yīng)的試劑盒說明書。實驗完成后按照試劑盒要求的時間觀察結(jié)果，當檢測線和質(zhì)控線均為陽性結(jié)果時，判定對應(yīng)的檢測項目陽性結(jié)果；當質(zhì)控線為陽性結(jié)果，檢測線為陰性結(jié)果時，判定對應(yīng)的檢測項目為陰性結(jié)果；當質(zhì)控線為陰性結(jié)果時，判定結(jié)果為無效結(jié)果，需重復(fù)實驗。酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）參照說明依次加入抗原包被（如需要）、待檢標本及對照、酶標記物、底物、終止液，具體流程參照相應(yīng)細菌ELISA檢測試劑盒說明書。以空白對照調(diào)零，讀取酶標儀器上各孔450nm和（或）492nm等波長的OD值，參照說明書要求設(shè)置參比波長并計算陽性值，判定結(jié)果?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)參照說明依次加入磁性顆?？乖弧⒋龣z及對照血清、堿性磷酸酶標記的蛋白、底物、堿性磷酸酶催化底物液發(fā)光，具體流程參照相應(yīng)細菌化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒說明書。根據(jù)化學(xué)發(fā)光試劑盒的生物參考區(qū)間判定實驗結(jié)果。每一批次化學(xué)發(fā)光實驗過程中應(yīng)做質(zhì)控品，質(zhì)控品結(jié)果成立時，進行結(jié)果判定。凝集試驗包括玻片凝集試驗、試管凝集試驗、乳環(huán)凝集試驗等，通過已知抗體或抗原成份，與相應(yīng)的菌體抗原或抗體結(jié)合產(chǎn)生肉眼可見凝集反應(yīng)。按照試劑盒要求的時間觀察結(jié)果，出現(xiàn)肉眼可見的凝集反應(yīng)判為陽性；液體均勻混濁、未見到凝集反應(yīng)判為陰性4）。布魯氏菌病試管凝集試驗抗體滴度為1:100++及以上，或者