ICS11.100

CCSC04

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CRHA019—2023

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人膽系上皮組織類器官構(gòu)建、質(zhì)量控制與

保藏操作指南

Guidelinesfortheestablishment，qualitycontrolandstorage

ofBiliaryepithelialtissueorganoids

2023-07-14發(fā)布2023-08-01實施

中國研究型醫(yī)院學(xué)會發(fā)布

目次

前言...................................................................................................................................................II

引言.................................................................................................................................................III

1范圍...............................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件...........................................................................................................................1

3術(shù)語和定義...................................................................................................................................1

4縮略語...........................................................................................................................................3

5基本原則.......................................................................................................................................3

6操作流程與方法...........................................................................................................................4

7檢測指標(biāo)與檢測方法...................................................................................................................6

附錄A（資料性）膽系上皮類器官培養(yǎng)用主要試劑材料與操作要點.........................................9

附錄B（資料性）短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）檢測.........................................................................11

附錄C（資料性）染色體核型檢測...............................................................................................12

附錄D（資料性）膽系上皮類器官鑒定.......................................................................................13

附錄E（資料性）標(biāo)志基因檢測實時熒光定量PCR法.............................................................16

參考文獻(xiàn)...........................................................................................................................................18

I

人膽系上皮組織類器官構(gòu)建、質(zhì)量控制與保藏操作指南

1范圍

本文件提供了人膽系上皮細(xì)胞構(gòu)建、質(zhì)量控制和保藏的基本原則、操作流程方法以及檢測指標(biāo)與檢

測方法的指導(dǎo)與建議。

本文件適用于人膽系上皮活組織類器官的培養(yǎng)、傳代、儲存、復(fù)蘇和質(zhì)量控制。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T37864—2019生物樣本庫質(zhì)量和能力通用要求（ISO20387:2018）

GB/T38736—2020人類生物樣本保藏倫理要求

GB/T42060—2022醫(yī)學(xué)實驗室樣品采集、運送、接收和處理指南（ISO/TS20658:2017）

WS233—2017病原微生物實驗室生物安全通用準(zhǔn)則

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

類器官organoids

類器官是干細(xì)胞、前體細(xì)胞和/或分化細(xì)胞通過細(xì)胞-細(xì)胞間以及細(xì)胞-基質(zhì)間的互作而自發(fā)組織形成

的體外三維結(jié)構(gòu)，能在多個方面再現(xiàn)體內(nèi)相應(yīng)組織或器官的結(jié)構(gòu)與功能。

3.2

膽系上皮biliaryepithelium

膽道系統(tǒng)主要包括肝總管、膽總管和膽囊。膽系上皮為肝外膽道系統(tǒng)上皮組織和膽囊粘膜上皮組織。

3.3

3D細(xì)胞培養(yǎng)three-dimensionalcellculture

將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng),使細(xì)胞能夠在載體的三

維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長,構(gòu)成三維的細(xì)胞-載體復(fù)合物。

3.4

膽系上皮類器官培養(yǎng)基culturemediumofbiliaryepitheliumorganoids

1

T/CRHA019—2023

適合膽系上皮干細(xì)胞生長及分化所需微環(huán)境，能維持膽系上皮細(xì)胞長期體外擴(kuò)增培養(yǎng)，保持膽管上

皮細(xì)胞/膽囊粘膜層上皮細(xì)胞特性，實現(xiàn)體外膽系上皮細(xì)胞類器官長期存活的培養(yǎng)介質(zhì)。

3.5

3D培養(yǎng)基質(zhì)膠matrix

組成成分包括但不限于層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，添加物包括但不限于

生長因子、小分子化合物和/或微量元素激素。在室溫條件下能夠聚合形成具有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)，

模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜結(jié)構(gòu)和功能，能夠為膽系上皮細(xì)胞的生長提供支架。

3.6

類器官傳代passage

將培養(yǎng)至一定大小、狀態(tài)良好的類器官采用物理機(jī)械吹打或聯(lián)合酶消化方法使其解離為小細(xì)胞團(tuán)或

單細(xì)胞懸液，再重新接種于與原培養(yǎng)條件相同的培養(yǎng)體系內(nèi)，繼續(xù)進(jìn)行類器官培養(yǎng)。新一代類器官與原

來類器官具有相同的形態(tài)功能特征。

3.7

類器官凍存cryopreservation

將類器官解離成小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞懸液后，加入凍存保護(hù)劑，通過程序降溫最終置于-196℃液氮

中低溫保存，使其暫時脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，在需要的時候能夠通過復(fù)蘇用于試驗的

過程。

3.8

類器官復(fù)蘇thawing

將處于深低溫凍存的類器官取出恢復(fù)其繼續(xù)生長狀態(tài)的過程。

3.9

誘導(dǎo)分化induceddifferentiation

細(xì)胞培養(yǎng)中通過添加誘導(dǎo)劑將細(xì)胞向目的細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過程。

3.10

知情同意informedconsent

有自主判斷能力的供體或其法定監(jiān)護(hù)人，在獲得并充分了解樣本和數(shù)據(jù)捐贈相關(guān)信息之后，供體所

受到的風(fēng)險最小，且沒有受到任何利誘或恐嚇等不當(dāng)行為影響的前提下，自愿自主的捐贈個人生物樣本

及其關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)，并與采集者/收集者共同簽署的文件。

注：知情同意書由采集者/收集者和被收集者共同簽署，一式兩份。正本由采集者/收集者保存，被

收集者保存副本。

[來源：GB/T38736—2020]

3.11

類器官存活率organoidsviability

2

類器官保持活性的屬性（例如，新陳代謝活躍，具有增殖能力，有完整的三維結(jié)構(gòu)，或有能力恢復(fù)

這些功能）。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。（按字母順序排列）

CK19——細(xì)胞角蛋白19（Cytokeratin19）

DNA——脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

DMSO——二甲基亞砜（DimethylSμLfoxide）

EpCAM——上皮細(xì)胞黏附蛋白（EpithelialcelladhesionmolecμLe）

FOXA2——叉頭盒蛋白A2（ForkheadboxproteinA2）

H&E——蘇木精-伊紅（Hematoxylinandeosin）

LGR5——亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5（LeucinerepeatGprotein-coupledreceptor5）

Ki67——細(xì)胞增殖蛋白或“MKI67”（Markerof(Kiel-67)）

MUC1——黏蛋白1（Mucin-1）

PBS——磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferSaline）

SOX9——性別決定區(qū)框9（SexdeterminingregionY-Box9）

SOX17——性別決定區(qū)框17（SexdeterminingregionY-Box17）

STR——短串聯(lián)重復(fù)序列（shorttandemrepeat）

ZO-1——緊密連接蛋白1（zonμLaoccluden1）

5基本原則

5.1簽署知情同意

應(yīng)在樣本采集前獲得類器官細(xì)胞源供者的書面的知情同意，明確供者和樣本收集方雙方的利益和責(zé)

任，知情同意的要求應(yīng)符合GB/T38736—2020中5.3的要求。

5.2倫理要求

人膽系上皮細(xì)胞類器官的構(gòu)建和研究方案應(yīng)由倫理審查委員會審查通過。

5.3隱私保護(hù)

類器官細(xì)胞源供者享有個人隱私權(quán)，其個人隱私信息的保密和保護(hù)應(yīng)符合GB/T38736-2020中6的要

求。

3

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6操作流程與方法

6.1膽系上皮組織類器官構(gòu)建

6.1.1組織的獲取

肝移植供體肝外膽管組織長度約5mm，膽囊組織大小約8cm×3.5cm。

6.1.2組織的運送

手術(shù)獲取的膽管和膽囊組織置于4℃保存的組織保存液（含2×雙抗的1640培養(yǎng)基），在4℃恒溫

的低溫條件下運送至實驗室。對運輸過程的記錄符合GB/T37864—2019中A.3、B.3條，宜記錄的內(nèi)容包

括但不限于運送方式、運送過程中的溫度，接收時溫度或溫度范圍、運送起止時間和日期。

6.1.3組織的處理

6.1.3.1組織的清洗

超凈臺將膽管組織取出，用含1×雙抗的預(yù)冷的PBS緩沖液震蕩漂洗3次（超凈臺內(nèi)手動搖晃培養(yǎng)皿

10s），膽囊組織多次漂洗去除表面血污后，用無菌外科剪剖開膽囊，漂洗去除膽囊內(nèi)的膽汁及血污。

6.1.3.2組織的消化

用無菌外科剪將膽管組織剖開成片，膽囊組織剪成1cm×1cm的組織片，加入適量1mg/mL的IV

型膠原酶，置于37℃水浴鍋中消化20min后用手術(shù)刀片刮取膽管上皮層和膽囊粘膜上皮層，獲得的上

皮組織加入細(xì)胞消化酶消化2-3min，鏡下觀察上皮組織被消化為5-20個細(xì)胞的片段后終止消化，預(yù)冷

PBS緩沖液離心漂洗2次（1000r/min,3min）終止消化。

6.1.3.3細(xì)胞的過濾

離心后的細(xì)胞沉淀用1640培養(yǎng)基重懸后通過70μm的篩網(wǎng)去除胞外基質(zhì)雜質(zhì)。

6.1.4類器官培養(yǎng)

采用酶解方法將人膽系上皮組織分散為5-20個細(xì)胞的上皮細(xì)胞片段，再將其與基質(zhì)膠混合后形成

3D培養(yǎng)空間結(jié)構(gòu)，加入適用于膽系上皮細(xì)胞生長的類器官培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，從而獲得大量的具有

膽系上皮干細(xì)胞特性的膽系上皮類器官。相關(guān)耗材和操作方法見附錄A。構(gòu)建流程圖見圖1。

4

圖1肝祖細(xì)胞類器官構(gòu)建流程圖

6.1.5類器官的傳代與保藏

6.1.5.1類器官傳代

應(yīng)選擇合適的類器官進(jìn)行科學(xué)試驗或傳代，一般為生長1周左右，飽滿度達(dá)到80%左右，顯微鏡10

×下可看到超過20個類器官，或者大小100-200μm的類器官。培養(yǎng)傳代流程見圖2。

5

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圖2膽系上皮類器官傳代流程圖

6.1.5.2類器官凍存

暫不使用的類器官應(yīng)進(jìn)行按附錄A處理，加入凍存液后移入低溫環(huán)境凍存。

6.1.5.3類器官的復(fù)蘇

類器官復(fù)蘇遵循速融原則。使用37℃水浴令其盡快融化，選擇合適的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，見

附錄A。

6.2廢棄類器官處置

類器官構(gòu)建和傳代過程中產(chǎn)生的廢棄物處置應(yīng)符合國家或地方法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范要求，符合WS233

—2017中7.8條規(guī)定，對于不合格的或者污染的類器官細(xì)胞應(yīng)遵循法律和實驗室規(guī)定丟棄到指定地點，

最終處置應(yīng)交由經(jīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)保部門資質(zhì)認(rèn)定的醫(yī)療廢物處理單位集中處置。同時應(yīng)由專人進(jìn)行書面記錄，

并存檔。

6.3操作注意事項

6

樣本采集、運送、處理以及類器官的構(gòu)建、傳代、凍存、復(fù)蘇等過程均應(yīng)無菌操作，以免污染。宜

符合GB/T42060—2022中附錄A要求，注意保持手衛(wèi)生的時間點包括但不限于接觸患者前、無菌操作前、

體液暴露后、接觸患者后、接觸試驗環(huán)境后、試驗結(jié)束后。

7檢測指標(biāo)與檢測方法

編號檢測指標(biāo)指標(biāo)描述強(qiáng)制/推薦檢測檢測方法

7.1形態(tài)光學(xué)顯微鏡低倍鏡下觀察膽系上強(qiáng)制按照附錄D檢測。

皮細(xì)胞生成的類器官，呈現(xiàn)出邊緣

清晰、折光性強(qiáng)的空心單層細(xì)胞構(gòu)

成的球形結(jié)構(gòu)，高倍鏡下可見核質(zhì)

比較大、緊密連接的單層上皮細(xì)

胞。

7.2體外可培養(yǎng)從捐獻(xiàn)者獲得的人肝外膽管和膽強(qiáng)制顯微鏡觀察，消化后臺

囊組織，通過機(jī)械和消化酶聯(lián)用的盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活

方法獲得上皮細(xì)胞的細(xì)胞片段，3D死，H&E染色和FFPE組

培養(yǎng)方式生成類器官后，可以在體織病理切片對比

外維持長期培養(yǎng)，且核型正常，傳

代10代以上。

7.3體外可重建當(dāng)類器官解離成5-20個細(xì)胞組成強(qiáng)制顯微鏡觀察。

的細(xì)胞片段后，仍能進(jìn)行體外重建

成為新的類器官，新培養(yǎng)出的類器

官與原來類器官具有相同的形態(tài)、

細(xì)胞組成、細(xì)胞核型等特征。

7.4存活率新復(fù)蘇的膽系上皮類器官存活率強(qiáng)制按照附錄D檢測。

不低于80%。且存活的類器官在體

外可以進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)。

7.5染色體核型正常核型應(yīng)為46，XY或46，XX。推薦按照附錄C檢測。

7.6標(biāo)志基因表膽系上皮細(xì)胞中干性標(biāo)志CK19、強(qiáng)制基因表達(dá)按照附錄E檢

達(dá)EpCAM、FOXA2、LGR5、SOX9、SOX17測。

等，增殖標(biāo)志物Ki67，粘膜上皮標(biāo)

蛋白質(zhì)表達(dá)按照附錄

志物MUC-1及上皮細(xì)胞緊密連接

D.1.2檢測。

標(biāo)志物ZO-1。

7.7微生物真菌、細(xì)菌、支原體、病毒等應(yīng)為強(qiáng)制

陰性。

7.7.1細(xì)菌及真菌真菌、細(xì)菌應(yīng)為陰性。強(qiáng)制按照《中華人民共和國

藥典（四部）》中“1101

無菌檢查法”項檢測。

7

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7.7.2支原體支原體應(yīng)為陰性。強(qiáng)制按照《中華人民共和國

藥典（四部）》“3301

支原體檢測法”項檢

測。

7.7.3外源病毒因外源病毒因子應(yīng)為陰性。強(qiáng)制按照《中華人民共和國

子藥典》中“3302外源病

毒因子檢查法”項檢

測。

7.8STR體外培養(yǎng)的類器官，應(yīng)進(jìn)行STR檢推薦按照附錄B檢測。

測及分型鑒定，無樣品間的交叉污

染。

受檢類器官STR位點的基因分型

數(shù)據(jù)與其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系（其原

始組織或衍生細(xì)胞系）STR基因分

型數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，兩者的匹配度應(yīng)

≥80%。

8

附錄A

（資料性）

膽系上皮類器官培養(yǎng)用主要試劑材料與操作要點

A.1主要試劑材料

A.1.1培養(yǎng)基主要構(gòu)成

表A.1膽系上皮類器官培養(yǎng)基的主要成份表

中文名稱英文名稱

培養(yǎng)基AdvancedDMEM/F12

谷氨酰胺GlutaMAX

4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液HEPES

青霉素/鏈霉素penicillin/streptomycin

N-乙酰半胱氨酸N-acetylcysteine

尼可酰胺Niacinamide

無血清添加劑B27

表皮生長因子EGF

成纖維細(xì)胞生長因子10FGF10

肝細(xì)胞生長因子HGF

Wnt-3a重組蛋白Wnt-3a

胃泌素IGastrinI

R-Spondin-1重組蛋白R-Spondin1

頭蛋白Noggin

TGFβ抑制劑A83-01

ROCK抑制劑*Y-27632

*分離培養(yǎng)前三天加。

A.1.2類器官培養(yǎng)3D支架材料

3D基質(zhì)膠提取自基底膜的基質(zhì)，主要由層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等組成，

還包含生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等?；|(zhì)膠在室溫條件下聚合形成具有生物學(xué)活性的三維支架，模擬

體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能。該結(jié)構(gòu)不僅有利于體外細(xì)胞的培養(yǎng)和分化，而且能夠

為膽系上皮細(xì)胞的生長提供支架?；|(zhì)膠在零度以下低溫環(huán)境呈液態(tài)，故凡是涉及基質(zhì)膠的試驗操作皆

應(yīng)置冰盒操作。

A.1.3組織消化酶

9

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膽系上皮組織消化中涉及的消化酶主要有IV型膠原酶（collagenaseIV）和細(xì)胞消化酶。其作用是水

解膽道系統(tǒng)ECM中的膠原蛋白和細(xì)胞釋放的核酸成分，從而使膽系上皮組織與其他結(jié)締組織分離出來，

以及上皮組織消化為小細(xì)胞片段。

A.1.4類器官凍存液

類器官凍存液為無血清凍存液，一般宜含有10%的二甲基亞砜(DMSO)。

A.2膽系上皮類器官培養(yǎng)操作要點

A.2.1類器官污染的處置

膽系上皮類器官培養(yǎng)過程中應(yīng)定期觀察、拍照，每3-5天更換一次類器官培養(yǎng)基。一般在第4-10天

于倒置顯微鏡下可以觀察到少量40-60μm的類器官小球，到第10-14天可觀察到250-500μm的膽系上皮

組織類器官。定期觀察有利于及時發(fā)現(xiàn)污染。如果在培養(yǎng)3天內(nèi)出現(xiàn)基質(zhì)膠渾濁，提示可能有霉菌和細(xì)

菌污染，需及時采取丟棄處理。在類器官培養(yǎng)過程中也有可能出現(xiàn)支原體污染，被污染的類器官生長會

變得緩慢，此時需進(jìn)行支原體檢測確認(rèn)，若無法恢復(fù)類器官生長狀態(tài)及時采取丟棄處理。

A.2.2類器官培養(yǎng)物接種注意事項

將獲取的細(xì)胞懸液與3D基質(zhì)膠按照1:1混勻吹打，吹打過程中切忌產(chǎn)生大量氣泡，以免影響后續(xù)培

養(yǎng)物接種。24孔板可提前于37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱30min，以加速3D基質(zhì)膠的凝固。

A.2.3類器官傳代注意事項

膽系上皮類器官可以連續(xù)傳代超過10代或持續(xù)培養(yǎng)6個月以上。與類器官有關(guān)的試驗研究宜在連續(xù)

傳代10代以內(nèi)或者持續(xù)培養(yǎng)6個月內(nèi)進(jìn)行。

A.3類器官凍存注意事項

凍存前每孔加入500μL的類器官收集液，將類器官吸至試管內(nèi)，按照50μL膠加500μL的類器官收

集液，置于冰上60min，去除基質(zhì)膠，離心清洗后，加入細(xì)胞消化酶消化3-5min，使其消化成單細(xì)胞懸

液，1000r/min離心5min。棄上清后加入適量類器官凍存液混勻，分裝于1mL低溫凍存管中，放入程序

性凍存盒內(nèi)于-80℃深低溫冰箱過夜保存，次日將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。

A.4類器官復(fù)蘇注意事項

從液氮罐中取出的類器官凍存管要快速放入37℃水浴鍋中令其盡快融化。吸出類器官凍存物移至15

mL無菌離心管中，再加入10倍體積的AdvancedDMEM/F12培養(yǎng)基混勻。之后操作同前述的類器官傳代

培養(yǎng)過程。

10

附錄B

（資料性）

短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）檢測

STR檢測流程詳見圖B.1，先提取細(xì)胞DNA,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序，最后進(jìn)行結(jié)果分析。

圖B.1STR檢測流程

人源細(xì)胞STR鑒定結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：

受檢細(xì)胞STR位點的基因分型數(shù)據(jù)與其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系（其原始組織或衍生細(xì)胞系）STR基因分

型數(shù)據(jù)進(jìn)行比對：

B.1若兩者的匹配度≥80%，則判定受檢細(xì)胞系為標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系或為標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系的衍生細(xì)胞系。

B.2若兩者的匹配度在56%-80%之間，建議結(jié)合細(xì)胞系形態(tài)、細(xì)胞系特異性標(biāo)記物等輔助分析進(jìn)行綜合

判斷。

B.3若兩者的匹配度≤56%，則判定受檢細(xì)胞樣本與其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系不相關(guān)。

11

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附錄C

（資料性）

染色體核型檢測

C.1試驗當(dāng)天保證細(xì)胞處于對數(shù)生長期，一般一個6cm的培養(yǎng)皿細(xì)胞長到80%的密度能做一次試驗。

C.2將待測細(xì)胞從37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中拿出，添加秋水仙素（終濃度為0.2μg/mL），搖勻后37℃孵

育1-2h。

C.3等待的同時，配制低滲溶液0.075MKCl(配制:8mL無菌水+44.7mgKCl)，放入37℃水浴預(yù)熱。

C.4孵育后的細(xì)胞用胰酶消化，1200r/min，離心5min，收集于離心管中，去除上清液，用8mL低滲液

重懸，打勻后放37℃水浴箱40min。

C.5加入新鮮配制的固定液（甲醇/冰乙酸=2/1~3/1）2mL混勻，室溫下放10min后，1000r/min離心10min，

去上清液（留500μL,先將底部細(xì)胞吹勻），新加入8mL固定液，1200r/min，離心10min，重復(fù)三次后，

滴片，放入80℃烘箱老化3h。

C.6再將烤干的玻片放入新鮮配制的胰酶（0.25%）中消化1min（嚴(yán)格控制時間）后，再放入吉姆薩染

液中染色5-10min（先用1片染5min,根據(jù)顏色調(diào)整后面的染色時間），取出用流水沖去染液后，在顯

微鏡下觀察結(jié)果。

12

附錄D

（資料性）

膽系上皮類器官鑒定

D.1類器官形態(tài)學(xué)鑒定

D.1.1顯微鏡下培養(yǎng)形態(tài)評估

將膽系上皮類器官培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下，在20倍視野下計數(shù)類器官數(shù)目。類器官數(shù)目不少于60

個/視野表明類器官生長狀態(tài)良好。生長活力好的類器官平均直徑約為100μm-200μm。若個別類器官體

積過大（可達(dá)1000μm）則提示類器官趨向衰老，應(yīng)盡早傳代，以防止衰老的類器官影響類器官傳代。

D.1.2類器官的形態(tài)學(xué)及免疫標(biāo)記鑒定

膽管膽囊組織及膽系上皮類器官成功構(gòu)建后，通過制備冰凍切片或者石蠟包埋切片，進(jìn)行蘇木素/

伊紅染色（H&E）進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，通過免疫熒光或者免疫組化染色進(jìn)行生物標(biāo)志物檢測。干細(xì)胞標(biāo)

志物CK19、EpCAM、FOXA2、SOX9、SOX17、LGR5，膽管標(biāo)志物CRTF,功能標(biāo)志MUC1，緊密連接

蛋白ZO-1。

同時進(jìn)行類器官整體染色：培養(yǎng)大小約100-200μm的類器官，加入類器官收集液，置于冰上放置1h

以溶解基質(zhì)膠，預(yù)冷PBS漂洗類器官，低速離心（600r/min）2次。加入0.125%TritonX-100破膜液，室

溫作用10min，室溫PBS漂洗3次后封閉用血清（10%二抗血清）封閉1h。將類器官分別放置相應(yīng)染色

組別的共聚焦小室中，10%二抗血清作為配制一抗的稀釋液，根據(jù)不同稀釋比配制一抗抗體組合，滴加

一抗，4℃孵育過夜后PBS漂洗3次。不同組別分別滴加各種熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光作用1h。PBS

漂洗3次后加入DAPI染核液，室溫作用10min后PBS漂洗3次。加入水性封片劑，避光濕盒保存，共聚焦

顯微鏡下觀察采集圖像并三維重建類器官結(jié)構(gòu)。

D.2類器官存活率評估

D.2.1原代組織消化

膽管及膽囊組織酶解后獲得單細(xì)胞懸液，采用采取臺盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)。將離心后的細(xì)胞沉

淀用AdvancedDMEM/F12培養(yǎng)基重懸（約100μL），經(jīng)吹打均勻后吸取18μL置于1.5mL的EP管，向EP

管中加入2μL的0.4%的臺盼藍(lán)染液充分混勻，染色3min，取10μL細(xì)胞懸液加入血細(xì)胞計數(shù)板，在倒置

顯微鏡10倍物鏡下計數(shù)，分別計數(shù)四大格中未染成藍(lán)色和染成藍(lán)色的細(xì)胞總數(shù)。利用如下公式計算每100

μL體積中細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞存活率：

細(xì)胞總數(shù)按照公式D.1進(jìn)行計算：

3

N總=((N活+N死)/4)×10×1.11×100……………………（D.1）

式中：

N總：細(xì)胞總數(shù)；

13

T/CRHA019—2023

N活：未染成藍(lán)色細(xì)胞數(shù)；

N死：染成藍(lán)色細(xì)胞數(shù)。

細(xì)胞存活率按照公式D.2進(jìn)行計算：

X=N活/(N總)×100%………………………（D.2）

式中：

X：細(xì)胞存活率；

N活：未染成藍(lán)色細(xì)胞數(shù)；

N總：細(xì)胞總數(shù)。

注：活細(xì)胞比率應(yīng)>90%可用于類器官細(xì)胞培養(yǎng)。

D.2.2類器官傳代及凍存復(fù)蘇

類器官傳代前、酶解為5-20個細(xì)胞的小細(xì)胞團(tuán)后以及類器官復(fù)蘇后，應(yīng)使用D.2.1中方法進(jìn)行類器

官存活率計算。如果要利用類器官進(jìn)行藥物篩選或者化合物安全性評價，則使用商品化的CellTiter-Glo?

發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒對類器官的活力進(jìn)行檢測。

D.3類器官功能性評價

D.3.1羅丹明-123染色

D.3.1.1膽道類器官用PBS洗兩遍；

D.3.1.2避光加入100μM羅丹明-123試劑；

D.3.1.337℃培養(yǎng)箱孵育5min；

D.3.1.4PBS洗三遍，加入PBS在激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝取圖像；

D.3.1.5若評估MDR1蛋白對羅丹明-123的阻斷效果，在細(xì)胞中加入10μMVerapamil（MDR1抑制劑），

37℃培養(yǎng)箱孵育30min；

D.3.1.6PBS洗三遍，加入PBS在激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝取圖像。

D.3.2堿性磷酸酶染色

收集膽道類器官，加入BCIP/NBT檢測底物，操作按照商品化說明書進(jìn)行染色。膽道類器官應(yīng)該具

備堿性磷酸酶活性。

D.3.3細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號檢測

D.3.3.1在膽道類器官培養(yǎng)基中加入25μMFluo-4AM鈣離子熒光探針在37℃孵箱作用60min；

D.3.3.2用Williams’E培養(yǎng)基洗三遍；

D.3.3.3在膽道類器官培養(yǎng)基中分別加入1μMacetylcholine和30μMATP；

D.3.3.4倒置熒光顯微鏡觀察并拍照；

D.3.3.5Volocity軟件處理圖像；

D.3.4CFTR活性檢測

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D.3.4.1使用8mMMQAE（Lifetechnology）和5μM的forskolin在37℃孵育膽道類器官4h；

D.3.4.2用標(biāo)準(zhǔn)林格氏液（含NaCl,KCl,CaCl2,MgCl2glucose，HEPES）孵育細(xì)胞，使用顯微鏡實時拍

攝熒光成像；

D.3.4.3用改良林格氏液（含NaNO3,KNO3,CaNO3,MgNO3,glucoseandHEPES）替代標(biāo)準(zhǔn)林格氏液孵

育細(xì)胞，顯微鏡連續(xù)拍攝實時成像。

D.3.5γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）酶活性檢測

D.3.5.1將檢測試劑盒（MaxDiscovery?γ-GlutamylTransferase(GGT)EnzymaticAssayKit）組份平衡

至室溫；

D.3.5.2取10μL膽道類器官培養(yǎng)上清以及標(biāo)準(zhǔn)品加入到檢測微孔板中；

D.3.5.3加入240μL的GGT檢測試劑混合物；

D.3.5.4立即在405nm下檢測每個樣品的吸光度，10min后再次檢測吸光度；

D.3.5.5按照試劑盒要求計算相應(yīng)吸光度的增長值。

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T/CRHA019—2023

B

附錄E

（資料性）

標(biāo)志基因檢測實時熒光定量PCR法

E.1類器官樣本制備

體外培養(yǎng)的類器官，吸掉培養(yǎng)基。加入等體積的PBS緩沖液（pH為7.4），吸掉緩沖

液。重復(fù)一次。

E.2類器官RNA提取

E.2.1收集細(xì)胞：待類器官長到一定的數(shù)量后，將24孔板中的培養(yǎng)基去除，加入1mL的PBS

進(jìn)行清洗1遍。去除PBS后，加入1mL的無動物源性重組胰酶，并用1mL量程的移液槍

將基質(zhì)膠打散，以利于消化酶與類器官進(jìn)行充分的接觸與消化。30min后，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)

移至RNase-Free的離心管中離心（300×g，5min），收集細(xì)胞沉淀，仔細(xì)吸除所有上清；

E.2.2裂解處理：輕彈離心管底部，使細(xì)胞沉淀松散，加入適量裂解液RL（350μL），旋渦

震蕩；

E.2.3將所有溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱CS上(過濾柱CS放在收集管中)，13,400×g離心2min，收

集濾液；

E.2.4向濾液中加入1倍體積70%乙醇（通常為350μL或600μL），混勻（此時可能會出現(xiàn)

沉淀），得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中（吸附柱CR3放入收集管中），13,400×g

離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

E.2.5向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，13,400×g離心30-60s，倒掉收集管中的

廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

E.2.6DNaseI工作液的配制：取10μLDNaseI儲存液放入新的RNase-Free離心管中，加

入70μL去除DNA緩沖液RDD，輕柔混勻；

E.2.7向吸附柱CR3中央加入80μL的DNaseI工作液，室溫放置15min；

E.2.8向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，13,400×g離心30-60s，倒掉收集管中的

廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

E.2.9向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW（按照說明加入乙醇），室溫靜置2min，13,400×g

離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

E.2.10重復(fù)步驟2.9；

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E.2.11離心（13,400×g，2min），倒掉廢液。將吸附柱CR3置于室溫放置至少2min，以徹

底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

E.2.12將吸附柱CR3轉(zhuǎn)入一個新的RNase-Free離心管中，加入30-100μLRNase-FreeddH2O

室溫放置2min，離心（13,400×g，2min），得到RNA溶液。

E.3類器官cDNA制備

取1μgE.2.12提取的RNA，利用水浴鍋，按照商品化