病原微生物檢測技術規(guī)程一、概述

病原微生物檢測是保障公共衛(wèi)生安全、疾病防控和臨床診斷的重要環(huán)節(jié)。本規(guī)程旨在規(guī)范病原微生物檢測的操作流程、質量控制和技術要求，確保檢測結果的準確性和可靠性。規(guī)程涵蓋樣本采集、保存、運輸、處理、檢測方法選擇、結果判讀和報告發(fā)布等關鍵環(huán)節(jié)，適用于醫(yī)療機構、疾病預防控制機構及實驗室等場所的病原微生物檢測工作。

二、樣本采集與處理

（一）樣本采集

1.根據(jù)檢測目的選擇合適的樣本類型，常見樣本包括：

(1)呼吸道樣本：鼻拭子、咽拭子、痰液等；

(2)腸道樣本：糞便、肛拭子等；

(3)血液樣本：靜脈血、末梢血等；

(4)尿液樣本：中段尿等；

(5)創(chuàng)傷部位樣本：分泌物、組織等。

2.采集時需遵循無菌操作原則，避免污染。

3.使用一次性采樣工具，并按規(guī)范記錄樣本信息（編號、采集時間、部位等）。

（二）樣本保存與運輸

1.樣本保存條件：

(1)呼吸道樣本：4℃保存，24小時內(nèi)檢測；

(2)糞便樣本：室溫保存，4小時內(nèi)檢測；

(3)血液樣本：室溫或冷藏保存，依檢測方法要求而定。

2.運輸時使用符合要求的容器，避免樣本泄漏或變質。

（三）樣本處理

1.樣本前處理流程：

(1)消毒采樣容器外部；

(2)根據(jù)樣本類型選擇合適的處理方法（如：稀釋、均質化、離心等）；

(3)按檢測要求制備檢測樣本。

2.注意避免樣本交叉污染，使用專用處理設備。

三、檢測方法選擇與操作

（一）檢測方法分類

1.微生物學檢測：

(1)培養(yǎng)法：平板培養(yǎng)、液體培養(yǎng)等；

(2)顯微鏡觀察：染色鏡檢、熒光顯微鏡等。

2.分子生物學檢測：

(1)PCR技術：實時熒光PCR、巢式PCR等；

(2)基因芯片技術：多重檢測、快速篩查等。

3.免疫學檢測：

(1)ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗；

(2)免疫熒光：快速定性檢測。

（二）檢測操作步驟

1.PCR檢測操作：

(1)提取樣本核酸；

(2)配制PCR反應體系；

(3)進行擴增反應；

(4)結果判讀（如：凝膠電泳、熒光信號）。

2.ELISA檢測操作：

(1)包被抗體；

(2)加入樣本；

(3)結合酶標抗體；

(4)底物顯色與結果讀取。

（三）質量控制

1.每批次檢測需設置陰性對照、陽性對照和空白對照；

2.使用標準品或質控品進行校準，確保檢測線性范圍準確；

3.定期進行室內(nèi)質控，記錄質控數(shù)據(jù)并分析漂移趨勢。

四、結果判讀與報告

（一）結果判讀標準

1.陰性結果：無特異性信號或低于閾值；

2.陽性結果：出現(xiàn)特異性信號且高于閾值；

3.陰性臨界值附近結果需重復檢測確認。

（二）報告發(fā)布流程

1.填寫檢測報告，包含樣本信息、檢測項目、結果及單位；

2.審核報告內(nèi)容，確保無錯誤或遺漏；

3.按規(guī)定時間發(fā)布報告，并留存原始記錄。

（三）異常結果處理

1.如結果與預期不符，需重新檢測或進行復核；

2.必要時聯(lián)系樣本采集環(huán)節(jié)確認是否存在污染或操作失誤。

五、安全與防護

（一）個人防護

1.操作時佩戴手套、口罩、護目鏡等防護用品；

2.穿戴實驗服，避免皮膚直接接觸樣本。

（二）環(huán)境安全

1.在生物安全柜內(nèi)處理高風險樣本；

2.去除的廢棄物需按規(guī)范消毒后銷毀。

（三）消毒與滅菌

1.檢測完成后使用75%酒精或含氯消毒劑擦拭設備表面；

2.器具需高溫高壓滅菌或化學消毒。

六、附則

本規(guī)程適用于常規(guī)病原微生物檢測，特殊樣本或檢測項目可參照相關技術指南進行調整。各實驗室需根據(jù)實際情況制定具體操作細則，并定期更新。

一、概述

病原微生物檢測是保障公共衛(wèi)生安全、疾病防控和臨床診斷的重要環(huán)節(jié)。本規(guī)程旨在規(guī)范病原微生物檢測的操作流程、質量控制和技術要求，確保檢測結果的準確性和可靠性。規(guī)程涵蓋樣本采集、保存、運輸、處理、檢測方法選擇、結果判讀和報告發(fā)布等關鍵環(huán)節(jié)，適用于醫(yī)療機構、疾病預防控制機構及實驗室等場所的病原微生物檢測工作。

二、樣本采集與處理

（一）樣本采集

1.根據(jù)檢測目的選擇合適的樣本類型，常見樣本包括：

(1)呼吸道樣本：

-鼻拭子采集：使用無菌棉簽，輕輕旋轉插入鼻腔后部，停留10-15秒后取出，避免接觸鼻孔外皮膚。

-咽拭子采集：將棉簽壓住舌根，伸至咽后壁，旋轉5-10秒后取出。

-痰液采集：指導患者深咳，收集清晨第一口痰液于無菌容器中，至少1ml。

(2)腸道樣本：

-糞便樣本：使用干凈便盆，取約2-5g成形糞便，置于無菌容器中。

-肛拭子采集：用無菌棉簽在直腸內(nèi)旋轉取樣，避免接觸糞便。

(3)血液樣本：

-靜脈血：選擇肘正中靜脈，按無菌操作規(guī)程采血，血量依檢測要求（如：血清分離需3-5ml）。

-末梢血：用酒精消毒指尖，采血量0.5-1ml，適用于快速檢測方法。

(4)尿液樣本：

-中段尿：指導患者清洗外陰，棄去前段尿液，收集中段尿5-10ml于無菌杯。

(5)創(chuàng)傷部位樣本：

-分泌物：用無菌棉簽擦拭創(chuàng)口表面，或吸取滲出液。

-組織：用無菌鑷子夾取小塊組織（約1-2mm3）。

2.采集時需遵循無菌操作原則，避免污染。

-操作前用75%酒精消毒雙手，佩戴無菌手套。

-樣本容器需經(jīng)高壓滅菌或使用無菌一次性容器。

3.使用一次性采樣工具，并按規(guī)范記錄樣本信息（編號、采集時間、部位、患者標識等）。

-樣本標簽需包含：實驗室編號、采集日期、樣本類型、患者姓名（或編號）。

-確保標簽牢固粘貼，避免脫落或模糊。

（二）樣本保存與運輸

1.樣本保存條件：

(1)呼吸道樣本：4℃保存，24小時內(nèi)檢測；若需長期保存，可凍存于-80℃。

(2)糞便樣本：室溫保存，4小時內(nèi)檢測；冷藏保存可延長至72小時。

(3)血液樣本：

-血清分離：室溫靜置30分鐘，離心后取血清，4℃保存，24小時內(nèi)檢測；

-全血：4℃保存，6小時內(nèi)檢測。

(4)尿液樣本：室溫保存，2小時內(nèi)檢測；冷藏保存可延長至24小時。

2.運輸時使用符合要求的容器，避免樣本泄漏或變質。

-呼吸道樣本：使用帶蓋無菌管，防漏包裝。

-血液樣本：使用抗凝管或血清管，防震包裝。

-運輸時避免劇烈搖晃，冷藏樣本使用保溫箱。

-運輸時間控制在2小時內(nèi)，若需長途運輸需采用干冰冷藏。

（三）樣本處理

1.樣本前處理流程：

(1)消毒采樣容器外部：用75%酒精棉片擦拭容器表面，作用30秒。

(2)根據(jù)樣本類型選擇合適的處理方法：

-呼吸道樣本：生理鹽水洗脫棉簽，收集洗脫液；或直接研磨鼻拭子/咽拭子于裂解液中。

-糞便樣本：挑取糞便碎屑，加入稀釋液（如PBS緩沖液）制成10%懸液。

-血液樣本：

-血清：4℃離心3000rpm，10分鐘，取上清。

-全血：直接用于PCR或需裂解后提取核酸。

-尿液樣本：取上清液，去除可見雜質。

-創(chuàng)傷部位樣本：分泌物直接加入裂解液；組織樣本剪碎后研磨。

(3)按檢測要求制備檢測樣本：

-PCR檢測：提取核酸（如使用磁珠法，需洗滌、洗脫）。

-ELISA檢測：制備樣本稀釋液（如1:10稀釋）。

-顯微鏡檢測：制作涂片或染色樣本。

2.注意避免樣本交叉污染，使用專用處理設備：

-設置單獨的工作臺和設備（如離心機、渦旋儀）。

-處理不同樣本時更換手套和吸頭。

-地面和臺面使用消毒液擦拭。

三、檢測方法選擇與操作

（一）檢測方法分類

1.微生物學檢測：

(1)培養(yǎng)法：

-平板培養(yǎng)：稱量樣本（如10μl），涂布或劃線接種于選擇性培養(yǎng)基（如MAC、血平板），35℃孵育18-24小時，觀察菌落特征。

-液體培養(yǎng)：樣本接種于增菌液（如TSB），35℃振蕩孵育6-12小時，轉種選擇性培養(yǎng)基。

(2)顯微鏡觀察：

-染色鏡檢：制備涂片（如革蘭染色、抗酸染色），油鏡觀察形態(tài)（如細菌大小、莢膜、芽孢）。

-熒光顯微鏡：制備樣本（如熒光標記抗體），觀察特異性熒光信號。

2.分子生物學檢測：

(1)PCR技術：

-實時熒光PCR：

-配制反應體系（10μl）：

-上游引物（10pmol/μl）1.0μl

-下游引物（10pmol/μl）1.0μl

-Taq酶（5U/μl）0.2μl

-dNTP（10mM）2.0μl

-DNA模板5.0μl

-無核酸酶水補足至10μl

-循環(huán)條件：

-95℃預變性3分鐘；

-95℃變性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，重復40次；

-72℃延伸5分鐘，95℃變性15秒，60℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，熔解曲線分析。

-巢式PCR：第一輪PCR產(chǎn)物1μl作為模板，加入內(nèi)引物重復上述步驟。

(2)基因芯片技術：

-樣本核酸變性（95℃10分鐘）；

-探針雜交（42℃1小時）；

-洗滌（42℃）；

-顯色（化學發(fā)光或熒光檢測）。

3.免疫學檢測：

(1)ELISA：

-間接法檢測抗體：

-包被（抗原100μl/孔，4℃過夜）；

-洗滌（PBST洗3次）；

-封閉（封閉液200μl/孔，37℃1小時）；

-洗滌；

-加入樣本（100μl/孔）；

-洗滌；

-加入二抗（100μl/孔）；

-洗滌；

-底物顯色（TMB底物，室溫30分鐘）；

-終止（1MH?SO?終止液50μl/孔）；

-讀板（酶標儀450nm檢測）。

-雙抗體夾心法檢測抗原：流程類似，包被抗體、封閉后加入樣本和檢測抗體。

(2)免疫熒光：

-制備樣本涂片；

-甲醇固定（-20℃10分鐘）；

-PBS洗滌；

-加入一抗（37℃孵育1小時）；

-PBS洗滌；

-加入熒光二抗（37℃孵育30分鐘）；

-DAPI復染（5分鐘）；

-封閉（抗熒光淬滅封片劑）；

-熒光顯微鏡觀察。

（二）檢測操作步驟

1.PCR檢測操作：

(1)提取樣本核酸：

-磁珠法：樣本裂解（加入裂解緩沖液+蛋白酶K），磁珠吸附核酸，洗滌（70%乙醇洗脫）。

-試劑盒法：按說明書操作（如QIAampKit）。

(2)配制PCR反應體系：參照前述體系，調整模板濃度（如5-10ng/μl）。

(3)進行擴增反應：使用PCR儀，設置循環(huán)參數(shù)（見前述）。

(4)結果判讀：

-凝膠電泳：跑膠（1%瓊脂糖，EB染色），觀察條帶（預期大小100-500bp）。

-熒光檢測：實時監(jiān)控系統(tǒng)熒光曲線，閾值線判斷陽性。

2.ELISA檢測操作：

(1)包被抗體：將100μl/孔包被液加入板孔，4℃過夜。

(2)加入樣本：用樣本稀釋液將樣本1:10稀釋，加入100μl/孔。

(3)結合酶標抗體：加入100μl/孔（如辣根過氧化物酶標記抗體）。

(4)底物顯色與結果讀取：參照前述步驟，酶標儀讀數(shù)。

-陽性判斷：OD值>臨界值（通過標準品繪制標準曲線計算）。

（三）質量控制

1.每批次檢測需設置對照：

-陰性對照：無模板對照（NTC），用于排除假陽性。

-陽性對照：已知陽性樣本，確保方法有效性。

-空白對照：無樣本對照，用于檢測試劑污染。

2.使用標準品或質控品進行校準：

-PCR：使用WHO標準品（如HIV-1核酸測定標準物質），計算Ct值線性范圍（如4-35）。

-ELISA：使用國際生物標準品（如乙肝核心抗體標準品），繪制標準曲線。

3.定期進行室內(nèi)質控：

-每日檢測1-2個質控品，記錄結果。

-分析質控數(shù)據(jù)漂移趨勢，超標時需重做實驗。

四、結果判讀與報告

（一）結果判讀標準

1.陰性結果：無特異性信號或低于閾值：

-PCR：Ct值>35或無條帶。

-ELISA：OD值<臨界值。

-顯微鏡：無目標微生物形態(tài)。

2.陽性結果：出現(xiàn)特異性信號且高于閾值：

-PCR：Ct值<35且與陽性對照一致。

-ELISA：OD值>臨界值且與陽性對照一致。

-顯微鏡：觀察到典型形態(tài)且符合鑒定標準。

3.陰性臨界值附近結果需重復檢測確認：

-如Ct值=34或OD值=臨界值±10%，需用原始樣本重測。

（二）報告發(fā)布流程

1.填寫檢測報告，包含以下信息：

-樣本編號、患者信息（隱去姓名）；

-檢測項目（如：肺炎鏈球菌PCR檢測）；

-檢測方法（如：實時熒光PCR）；

-結果（陽性/陰性，或具體數(shù)值）；

-檢測日期、報告日期。

2.審核報告內(nèi)容：

-檢查樣本信息與原始記錄是否一致；

-核對結果與質控數(shù)據(jù)；

-必要時請上級技師復核。

3.按規(guī)定時間發(fā)布報告：

-急性樣本6小時內(nèi)完成；

-慢性樣本24小時內(nèi)完成。

-報告通過電子系統(tǒng)或紙質版提交。

（三）異常結果處理

1.如結果與預期不符，需重新檢測或進行復核：

-PCR假陰性：檢查核酸提取效率、反應體系完整性。

-ELISA假陽性：檢查樣本污染、標準曲線準確性。

2.必要時聯(lián)系樣本采集環(huán)節(jié)確認是否存在污染或操作失誤：

-如多次出現(xiàn)同類異常，需優(yōu)化前處理流程。

五、安全與防護

（一）個人防護

1.操作時佩戴防護用品：

-必須佩戴手套（一次性，接觸不同樣本更換）；

-必須佩戴醫(yī)用口罩（防噴濺）；

-必要時佩戴護目鏡或面屏。

-穿實驗服或防滲透圍裙。

2.嚴格執(zhí)行手衛(wèi)生：

-操作前后使用抗菌洗手液；

-接觸污染物品后需消毒雙手。

（二）環(huán)境安全

1.在生物安全柜內(nèi)處理高風險樣本：

-活病毒檢測需使用II級或III級生物安全柜；

-每次使用后需清潔消毒工作臺面。

2.去除的廢棄物需按規(guī)范消毒后銷毀：

-污染性廢棄物