題目：響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取夏枯草種子油的工藝目錄TOC\o"1-3"\h\u摘要 前言夏枯草(PrunellavulgarisL.)，是唇形科夏枯草屬植物，在我國(guó)分布廣泛，全國(guó)各地均產(chǎn)，資源豐富[1]。夏枯草一般以其干燥果穗入藥，是常用中藥，具有清肝明目，消腫散結(jié)之功效，主治目珠夜痛、頭痛眩暈、目赤腫痛、癭瘤、瘰疬、乳癰腫痛等，臨床上廣泛應(yīng)用于治療發(fā)燒、咽喉疼痛和促進(jìn)傷口愈合等[2]。研究表明，夏枯草富含多種苷類、有機(jī)酸類、黃酮類以及其他多糖類化學(xué)成分，其具有抗氧化作用、抗清理自由基作用和降血壓作用，以及消炎等多種生物活性,已經(jīng)在食品、醫(yī)藥等行業(yè)普遍應(yīng)用[3,4]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)夏枯草的研究主要集中于化學(xué)成分的領(lǐng)域，涉及夏枯草種子油的研究的人較少。種子油的提取方法主要有三種：常溫浸提法、索氏提取法和超聲提取法，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，常溫提取法是一種間斷式提取方法，此方法在常溫條件下進(jìn)行，對(duì)于熱不穩(wěn)定成分適用，但提取率低、耗時(shí)長(zhǎng)[5]；索氏提取法是連續(xù)式提取方法，效率高，但溫度較高，不飽和脂肪酸容易被破壞[8]；超聲提取法是間斷式提取方法的一種，提取時(shí)間短、出油率高、低溫提取可保護(hù)有效成分[9]。劉紫汀等人采用超聲輔助提取法提取夏枯草種子油單因素的試驗(yàn)，得出了最佳的超聲頻率、提取時(shí)間、料液比范圍，超聲輔助法是一種有效的提取夏枯草種子油的方法。在此單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上，做了本次響應(yīng)面優(yōu)化超聲提取法提取種子油的實(shí)驗(yàn)。1材料與儀器1.1材料1.1.1藥材藥材名產(chǎn)地采收時(shí)間夏枯草種子來(lái)源安徽亳州2017年6月1.1.2試劑試劑名C.P/A.R試劑公司石油醚A.R四川科倫藥業(yè)有限公司1.2儀器儀器儀器公司超聲機(jī)KH-2200-DB天平JJ-124-BC水浴鍋HH-4抽濾裝置SHZ-D(III)旋蒸儀真空干燥箱DZF-6020多功能粉碎機(jī)GF-02100g昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司常熟市雙杰測(cè)試儀器廠常州智博瑞儀器制造有限公司河南省予華儀器有限公司成都世紀(jì)方舟科技有限公司上海申賢恒溫設(shè)備廠上海霸輝工具有限公司2試驗(yàn)方法2.1夏枯草種子油提取工藝流程夏枯草種子→粉碎→過80目篩→精密稱取細(xì)粉→按料液比加入→超聲回流→抽濾→旋蒸→真空干燥→種子油取夏枯草種子于粉碎機(jī)中粉碎，過80目篩后避光冷凍保存。取夏枯草種子粉末5g（±0.005）于250mL錐形瓶中，相同條件進(jìn)行3組試驗(yàn)，分別為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)，分別向三組錐形瓶中加入提取溶劑（石油醚），將錐形瓶置于超聲裝置中超聲提取，超聲完畢后再將每組提取液置分別于減壓抽濾裝置中緩慢抽濾三次，刮取粉末，重復(fù)以上操作兩次，分別合并各組的提取液。之后將提取液置于旋蒸儀中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，將濃縮液全部轉(zhuǎn)移至干燥恒重的蒸發(fā)皿中，置于真空干燥器中在30℃條件下干燥60min，放在干燥缽中冷卻，精確稱重并計(jì)算提取率，求平均值。用移液槍收集種子油，放于冰箱冷凍室密封避光保存。[10]夏枯草種子油提取率計(jì)算公式為：提取率（%）=2.2單因素試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)中，經(jīng)過篩選得到提取率最好的溶劑為石油醚進(jìn)行單因素試驗(yàn)：試驗(yàn)表明，超聲時(shí)間、超聲功率和料液比對(duì)種子油提取率有顯著影響。選出三個(gè)單因素水平范圍：料液比為1∶25～1∶35、超聲功率為50～70kHz、超聲時(shí)間為30～50min，通過建立超聲波輔助提取夏枯草種子油的多元回歸模型。2.3響應(yīng)面試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定稱取樣本量為5g（±0.005），通過改變料液比1∶25～1∶35，超聲功率50～70kHz，超聲時(shí)間30～50min，測(cè)定夏枯草種子油的提取率（%）。應(yīng)用Design-Expert8.0.6軟件，由Box-Benhnken核心組合進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)。以A代表料液比，B代表超聲功率，C代表超聲時(shí)間，以夏枯草種子油提取率（%）作為響應(yīng)指標(biāo)Y，并對(duì)其提取條件進(jìn)行優(yōu)化。[11-15]3試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析3.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及回歸模型方差分析根據(jù)單因素試驗(yàn)所確定的各因素水平,進(jìn)行Box-Benhnken中心組合的試驗(yàn)設(shè)計(jì)[16]。試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表1。表1Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Table1FactorsandlevelsofBox-Benhnkenexperimentdesign編碼水平因素單位-101A(料液比)g/mL253035B（超聲功率）kHz506070C（超聲時(shí)間）min304050在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Design-Expert8.0.6軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。共設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中3，4，11，13，17號(hào)為零點(diǎn)試驗(yàn)，是區(qū)域的中心點(diǎn),用來(lái)估計(jì)試驗(yàn)誤差，其余12個(gè)點(diǎn)為析因試驗(yàn)點(diǎn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。表2夏枯草種子油提取率響應(yīng)面方案及結(jié)果Table2DesignandresultsofRSMfortheyieldofPrunellavulgarisL.Seedoil序號(hào)料液比超聲功率超聲時(shí)間種子油提取率（g/mL）（kHz）（min）(%)11∶35704022.49

21∶2550 4021.20

31∶3060 40 24.26

4 1∶3060 40 24.20

51∶2560 50 19.52

6 1∶2560 30 19.22

71∶3560 30 20.43

8 1∶3050 30 20.39

91∶3560 50 23.53

101∶3550 40 21.62

111∶3060 40 24.21

121∶3070 50 22.56

131∶3060 40 24.19141∶2570 40 17.79

151∶3050 50 22.80

161∶3070 30 19.56171∶30604024.243.2建立模型與顯著性分析利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，建立因素（料液比，超聲功率，超聲時(shí)間）與響應(yīng)值（夏枯草種子油提取率）數(shù)學(xué)回歸模型，從而求出多元二次回歸方程，通過對(duì)回歸方程的分析，來(lái)解決多變量問題，尋找最優(yōu)工藝參數(shù)。響應(yīng)值（夏枯草種子油提取率）的回歸方程為：Y=+24.22+1.29×A?0.45×B+1.10×C+1.07×A×B+0.70×A×C+0.15×B×C?2.05×對(duì)二次方程進(jìn)行方差分析見表3。表3響應(yīng)面回歸模型ANOVA分析結(jié)果Table3ANOVAforresponsesurfacequadraticmodelanalysisofvariancetable方差來(lái)源平方和自由度均方F值Prob＞F顯著性模型70.6197.8570.43<0.0001**A-料液比13.36113.36119.97<0.0001**B-超聲功率1.6311.6314.620.0065**C-超聲時(shí)間9.7019.7087.09<0.0001**AB4.5814.5841.110.0004**AC1.9611.9617.590.0041**BC0.08710.0870.780.4061A17.67117.67158.65<0.0001**B8.2118.2173.69<0.0001**C9.4319.4384.62<0.0001**LackofFit0.7830.26304.460.0681

RRR0.98910.97500.8259 注：“*”表示顯著（P＜0.05）“**”表示極顯著（P＜0.01）從表3中，通過比較F值的大小得知，三種自變量對(duì)夏枯草種子油的提取率的影響程度為：料液比>超聲時(shí)間>超聲功率。一次項(xiàng)A、B、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2，交互項(xiàng)AB、AC對(duì)夏枯草種子油的提取率達(dá)到極顯著水平，交互項(xiàng)BC項(xiàng)對(duì)夏枯草種子油的提取率不顯著。進(jìn)一步分析方程方差可知，該回歸模型P值＜0.0001（P＜0.01），說明該回歸模型極顯著；其LackofFit（失擬項(xiàng)）的P值=0.0681（P＞0.05），說明差異不顯著，可見該模型對(duì)夏枯草種子油提取試驗(yàn)擬合效果良好，方差分析的結(jié)果說明了回歸方程的有效性，并且可以用于對(duì)二次回歸方程的相應(yīng)值進(jìn)一步預(yù)測(cè)；回歸模型決定系數(shù)R2=0.9891，表明預(yù)測(cè)值和真實(shí)值之間相關(guān)性較高；而變異系數(shù)C.V.=1.5，說明試驗(yàn)可操作性較好；決定系數(shù)R2=0.9891和校正決定系數(shù)R2adj=0.9750說明模型97.50%響應(yīng)值的變化,只有總變異的2.50%不可以用此模型解釋,說明該模型的擬合度較好[17]。3.3響應(yīng)面交互作用分析從圖1-1能夠看出，等高線為橢圓形，表明料液比和超聲功率交互性顯著；從圖1-2能夠看出，料液比的曲線坡度遠(yuǎn)大于超聲功率的曲線坡度，則表明料液比與超聲功率相比，料液比對(duì)提取率的影響程度更大。從圖2-1能夠看出，等高線為橢圓形，表明料液比和超聲時(shí)間的交互性顯著；從圖2-2能夠看出，料液比曲線坡度略微大于超聲時(shí)間，則表明料液比與超聲時(shí)間相比，料液比對(duì)提取率的影響略大于超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響。從圖3-1能夠看出，等高線近似橢圓形，表明超聲功率和超聲時(shí)間的交互程度不及上述明顯；從圖3-2能夠看出，超聲時(shí)間的曲線坡度遠(yuǎn)大于超聲功率，則表明超聲時(shí)間與超聲功率相比，超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響大于超聲頻率對(duì)提取率的影響。綜合圖來(lái)看，響應(yīng)曲面料液比的坡度大于超聲時(shí)間的坡度、超聲功率的坡度，超聲時(shí)間的坡度大于超聲功率的坡度，所以三種自變量對(duì)夏枯草種子油提取率的影響程度為：料液比>超聲時(shí)間>超聲功率。這與回歸方程的方差分析結(jié)果相一致。并且料液比、超聲時(shí)間和超聲功率之間不存在協(xié)同增效作用，對(duì)提取率的影響增加達(dá)到最高之后又下降[18]。圖1-1Y=f（A，B）的響應(yīng)等高線圖圖1-2Y=f（A，B）的響應(yīng)曲面圖2-1Y=f（A，C）的響應(yīng)等高線圖圖2-2Y=f（A，C）的響應(yīng)曲面圖3-1Y=f（B，C）的響應(yīng)等高線圖圖3-2Y=f（B，C）的響應(yīng)曲面3.4最優(yōu)化工藝條件以及模型驗(yàn)證試驗(yàn)為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性,對(duì)模型優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證。模型預(yù)測(cè)的最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶35(g/mL)、超聲功率62.21kHz、超聲時(shí)間42.02min，在此條件下的提取率的理論值為24.07%。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在此最優(yōu)條件下進(jìn)行提取，但由于實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限，為了讓驗(yàn)證試驗(yàn)有可操作性，實(shí)際提取條件修正為：料液比1∶35（g/mL）、超聲功率60kHz、超聲時(shí)間40min。在此優(yōu)化條件下做3組平行試驗(yàn)驗(yàn)證，得出夏枯草種子油的提取率分別為23.95%、24.01%、23.98%，與預(yù)測(cè)值24.07%接近，可見模型預(yù)測(cè)效果較好[17]。4結(jié)論本試驗(yàn)基于單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert8.0.6軟件的Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化得到夏枯草種子油的最佳提取條件為：料液比1∶35(g/mL)、超聲功率60kHz、超聲時(shí)間40min，種子油提取率可達(dá)到24.00%。根據(jù)方差分析和響應(yīng)面圖分析得知，在本試驗(yàn)范圍內(nèi)，各因素對(duì)夏枯草種子油提取率影響作用大小依次為：料液比＞超聲時(shí)間＞超聲功率。且料液比、超聲時(shí)間、超聲功率、料液比和超聲時(shí)間的交互項(xiàng)以及料液比和超聲功率的交互項(xiàng)對(duì)夏枯草種子油提取率的影響都是極顯著的，只有超聲時(shí)間和超聲功率的交互項(xiàng)對(duì)夏枯草種子油的提取率的影響不顯著。參考文獻(xiàn)國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:280.陳宇航,郭巧生,王澄亞.夏枯草本草及其入藥部位變化的考證[J].中國(guó)中藥雜志,2010,35(2):242-246.曹小燕,楊海濤.夏枯草總黃酮的抗氧化活性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2016(9):2316-2318.Wang

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