ICS11.220CCSB.4145豬鏈球菌2型抗體的檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附法IDB45/T2732—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并宣貫。本文件由廣西畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西學(xué)刊聯(lián)信息科技有限公司。本文件主要起草人：韋顯凱、鄭敏、閉璟珊、周慶安、劉捷、鄒聯(lián)斌、蘇姣秀、施開創(chuàng)、尹彥文、謝守玉、馮淑萍、屈素潔、龍鳳、陸文俊、陳芳芳、張燦星、李軍。DB45/T2732—20231豬鏈球菌2型抗體的檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附法本文件規(guī)定了豬鏈球菌2型抗體的酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)的原理、試劑、器材、試驗(yàn)樣品準(zhǔn)備、操作方法、注意事項(xiàng)等要求。本文件適用于廣西壯族自治區(qū)行政區(qū)域內(nèi)豬鏈球菌2型抗體的檢測(cè)和豬只接種豬鏈球菌2型疫苗后的免疫效果評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求。3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)enzyme-linkedimmunosorbentassay簡(jiǎn)稱ELISA，是一種酶聯(lián)免疫技術(shù)。將已知的抗原或抗體吸附在固相載體，加入待測(cè)的標(biāo)本，通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比，從而測(cè)定抗體或抗原含量。3.2光密度opticaldensity簡(jiǎn)稱OD，測(cè)量被檢測(cè)物吸收掉的光以及有多少光穿過(guò)了這個(gè)物體。4原理在固相載體微孔板上預(yù)包被純化的豬鏈球菌2型特異性抗原，當(dāng)被檢血清中含有豬鏈球菌2型抗體時(shí)，抗體與微孔壁上的抗原形成抗原-抗體復(fù)合物，再與羊（兔）抗豬免疫球蛋白G（IgG）酶標(biāo)記物反應(yīng)，最后通過(guò)測(cè)定酶作用底物催化后的產(chǎn)物顏色反應(yīng)判斷結(jié)果，檢測(cè)豬鏈球菌2型抗體水平。5試劑使用的試劑如下：——預(yù)包被豬鏈球菌2型抗原的微孔板；——血清稀釋液；——豬鏈球菌2型陽(yáng)性對(duì)照血清；2DB45/T2732—2023——豬鏈球菌2型陰性對(duì)照血清；——羊（兔）抗豬免疫球蛋白G（IgG）酶（HRP）標(biāo)記二抗；——樣品稀釋液，配制方法見附錄A中的A.2；——10×濃縮洗滌液，配制方法見附錄A中的A.3；——顯色液A，配制方法見附錄A中的A.4；——顯色液B，配制方法見附錄A中的A.5；——終止液，配制方法見附錄A中的A.6；——商品化試劑盒：可選擇同類的商品化試劑盒，如豬鏈球菌2型抗體檢測(cè)試劑盒。6器材使用的器材如下：——一次性移液器吸頭；——振蕩器；——酶標(biāo)儀，含450nm波長(zhǎng)濾光片；——37℃恒溫培養(yǎng)箱或水浴箱；——容量為100mL、1000mL的量筒；——離心機(jī)；——封板膜；——一次性乳膠手套、口罩，護(hù)目鏡；——吸水紙巾；——一次性采血器，最大量程5mL或10mL。7試驗(yàn)樣品準(zhǔn)備7.1血液樣品采集與處理采血方式為前腔靜脈或耳靜脈無(wú)菌采血。將生豬保定好后，用碘酊消毒采血部位，再用75％酒精棉球二次消毒，最后用脫脂棉球拭干，使用5mL或10mL一次性采血器采集不少于2mL的非抗凝性全血。室溫下傾斜靜置2h，待血清自然析出后，放置于2℃~8℃條件下不少于2h，4000r/min離心10min，使用1000μL量程的移液器小心吸出上層血清。7.2血清樣品保存與運(yùn)輸血清樣品若在分離后一周內(nèi)完成檢測(cè)，可置于2℃~8℃條件下短期保存；若超過(guò)一周后檢測(cè)，應(yīng)置于－20℃及以下條件冷凍保存。血清樣品運(yùn)輸時(shí)，按照GB19489的要求進(jìn)行樣品的生物安全標(biāo)識(shí)，應(yīng)用恒溫箱加冰袋或干冰密封等方式冷藏運(yùn)輸，運(yùn)輸時(shí)間應(yīng)盡量縮短，確保血清樣品有效。8操作方法8.1試劑配制將10×濃縮洗滌液恢復(fù)至室溫，搖勻，然后用蒸餾水或去離子水進(jìn)行1:10稀釋，將pH調(diào)節(jié)至7.4。DB45/T2732—202338.2樣品稀釋將已分離好的待檢豬血清樣品用樣品稀釋液進(jìn)行1:10稀釋，即取50μL樣品加到450μL樣品稀釋液中，并充分混勻。8.3操作步驟8.3.1酶標(biāo)板上陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和待檢樣品的分布參見表1。在A1、B1加入陽(yáng)性對(duì)照，每孔100μL；C1、D1加入陰性對(duì)照，每孔100μL；E1、F1加入空白對(duì)照，每孔100μL表1加樣記錄表123456789APBPCNDNEBFBGH8.3.2用封板膜覆蓋板條，置于37℃恒溫箱或水浴箱中孵育2h。8.3.3棄凈孔中液體，用力拍干，每孔加入稀釋好的洗滌液300μL，靜置1min后棄凈、拍干，如此8.3.4除空白對(duì)照外，其余每孔加入酶標(biāo)記物50μL，置于37℃恒溫箱或水浴箱中孵育1h。8.3.5按8.3.3重復(fù)操作。8.3.6每孔各加入顯色液A、B50μL，置37℃避光環(huán)境條件中顯色10min。8.3.7每孔加入終止液50μL，混勻后避光作用10min，終止反應(yīng)后20min之內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。8.3.8計(jì)算S/P值。S——樣本的吸光度值；P——陽(yáng)性對(duì)照的吸光度值；A——被檢血清OD450nm值；NC——陰性對(duì)照OD450nm值；PC——陽(yáng)性對(duì)照OD450nm值。DB45/T2732—202348.4試驗(yàn)成立判定陽(yáng)性對(duì)照OD450nm值＞0.6，且陰性對(duì)照OD450nm值＜0.3，試驗(yàn)成立；否則，試驗(yàn)不成立，需重新試驗(yàn)。8.5結(jié)果判定8.5.1如樣品S/P值≥0.60時(shí)，判為豬鏈球菌2型抗體陽(yáng)性。8.5.2如樣品S/P值＜0.60時(shí)，判為豬鏈球菌2型抗體陰性。8.5.3若采用商品化試劑盒，應(yīng)根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行操作及結(jié)果判定。9注意事項(xiàng)9.1所有操作應(yīng)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室生物安全相關(guān)規(guī)定。9.2用于加樣的移液器應(yīng)定期進(jìn)行校準(zhǔn)。9.310×濃縮洗滌液在低溫保存時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生白色結(jié)晶，應(yīng)加熱使其溶解后再使用。9.4酶標(biāo)記物溶液和終止液對(duì)呼吸道、眼睛及皮膚有刺激作用，使用過(guò)程中應(yīng)戴口罩、護(hù)目鏡、手套等防護(hù)用具，不應(yīng)直接接觸和吸入。9.5酶標(biāo)記物溶液應(yīng)避光保存，避免與氧化劑接觸，盛裝底物溶液的容器應(yīng)保持潔凈。9.6所有試劑均應(yīng)按照相關(guān)要求進(jìn)行保存，使用前恢復(fù)至室溫。9.7血清稀釋板的微孔只能使用一次。同步進(jìn)行多板檢測(cè)時(shí)，反應(yīng)板不宜疊放在37℃溫箱中，宜將反應(yīng)板平放于濕盒內(nèi)或覆蓋封板膜后直接平放于溫箱中，不宜采用密封袋。DB45/T2732—20235溶液的配制A.1磷酸鹽緩沖液取氯化鈉8.0g，磷酸二氫鉀0.2g，磷酸氫二鈉2.9g，氯化鉀0.2g，加蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)溶液pH至8.0后用蒸餾水定容至1000mL。室溫保存。A.2樣品稀釋液取甘油40.0mL，酪蛋白20.0g，硫柳汞鈉0.1g，吐溫-201.0mL，加入956mL磷酸鹽緩沖液使其溶解。室溫保存。A.310×濃縮洗滌液取氯化鈉8.0g，磷酸二氫鉀0.2g，磷酸氫二鈉2.9g，氯化鉀0.2g，吐溫-205.0mL，硫柳汞0.1g，加80mL蒸餾水溶解，用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至7.4后用蒸餾水定容至100mL。室溫保存。A.4顯色液A取四甲基聯(lián)苯胺0.2g，二甲基亞砜8.0mL，加蒸餾水