遺傳信息的轉(zhuǎn)錄與翻譯規(guī)程一、概述

遺傳信息的轉(zhuǎn)錄與翻譯是生物體將DNA中的遺傳密碼轉(zhuǎn)化為功能性蛋白質(zhì)的核心過程，對于維持生命活動至關(guān)重要。本規(guī)程詳細(xì)闡述了轉(zhuǎn)錄和翻譯的基本原理、操作步驟及注意事項(xiàng)，旨在為相關(guān)研究提供標(biāo)準(zhǔn)化參考。

二、轉(zhuǎn)錄過程

轉(zhuǎn)錄是指以DNA為模板合成RNA的過程，主要分為模板識別、RNA合成及終止三個階段。

（一）轉(zhuǎn)錄所需材料與條件

1.模板DNA：選擇目標(biāo)基因片段作為轉(zhuǎn)錄模板。

2.RNA聚合酶：根據(jù)需要選擇不同類型的RNA聚合酶（如細(xì)菌中的RNA聚合酶）。

3.四種核糖核苷三磷酸（NTPs）：包括ATP、GTP、CTP、UTP作為合成RNA的原料。

4.緩沖液：提供適宜的pH和離子環(huán)境（pH7.5-8.0，Mg2?濃度5-10mM）。

5.溫度：通?？刂圃?7°C或根據(jù)酶特性調(diào)整。

（二）轉(zhuǎn)錄操作步驟

1.模板準(zhǔn)備：

(1)提取并純化目標(biāo)DNA片段，確保無RNA污染。

(2)設(shè)計(jì)引物（如T7啟動子引物），用于啟動RNA聚合酶結(jié)合。

2.反應(yīng)體系配置：

(1)在無菌管中依次加入：模板DNA（100-500ng/μL）、RNA聚合酶（10-50U/μL）、NTPs（各0.5mM）、緩沖液、引物（10μM）。

(2)補(bǔ)充去離子水至總體積20μL。

3.轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

(1)離心混勻反應(yīng)體系。

(2)37°C水浴孵育60-90分鐘，根據(jù)模板長度調(diào)整時間。

(3)加入RNA酶抑制劑（如RNaseOut）終止反應(yīng)（可選）。

（三）產(chǎn)物檢測與純化

1.檢測方法：

(1)凝膠電泳：通過1.5%瓊脂糖凝膠分離RNA產(chǎn)物，觀察條帶大小。

(2)Northernblot：檢測特定RNA序列的特異性。

2.純化步驟：

(1)使用RNA純化試劑盒（如RNeasyMiniKit）去除未反應(yīng)的NTPs和DNA模板。

(2)乙醇沉淀法進(jìn)一步濃縮RNA（-20°C沉淀30分鐘）。

三、翻譯過程

翻譯是指以mRNA為模板合成蛋白質(zhì)的過程，由核糖體和多種tRNA共同完成。

（一）翻譯所需材料與條件

1.mRNA模板：純化的mRNA或體外合成的RNA鏈。

2.核糖體：根據(jù)宿主系統(tǒng)選擇（如E.coli核糖體）。

3.氨基酸：提供必需的20種氨基酸（濃度0.1-1mM）。

4.起始因子：如IF-1、IF-2、IF-3（細(xì)菌系統(tǒng)）。

5.能量底物：GTP或ATP（根據(jù)需要）。

（二）翻譯操作步驟

1.mRNA準(zhǔn)備：

(1)通過瓊脂糖凝膠電泳去除殘留RNA酶。

(2)凍存于-80°C備用。

2.翻譯體系配置：

(1)在無菌管中依次加入：mRNA（1μg/μL）、核糖體（50A260單位/μL）、氨基酸混合物、起始因子、緩沖液（50mMTris-HCl，pH7.8）、GTP（0.5mM）。

(3)補(bǔ)充去離子水至總體積50μL。

3.翻譯反應(yīng)：

(1)37°C水浴孵育30-60分鐘，根據(jù)蛋白質(zhì)大小調(diào)整時間。

(2)加入蛋白終止劑（如NaN?，終濃度0.1M）終止反應(yīng)。

（三）產(chǎn)物檢測與純化

1.檢測方法：

(1)SDS：通過12%聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，銀染或考馬斯亮藍(lán)染色。

(2)Westernblot：使用特異性抗體檢測目標(biāo)蛋白。

2.純化步驟：

(1)通過Ni-NTA親和層析（針對His標(biāo)簽蛋白）或離子交換層析進(jìn)行初步純化。

(2)使用超濾管濃縮至1mg/mL。

四、注意事項(xiàng)

1.酶與試劑活性：確保RNA聚合酶和核糖體處于活性狀態(tài)，避免反復(fù)凍融。

2.RNA/DNA污染：操作時使用無RNA酶的耗材（如DEPC水處理）。

3.溫度控制：轉(zhuǎn)錄和翻譯反應(yīng)需精確控制在37°C，避免非特異性結(jié)合。

4.產(chǎn)物鑒定：通過測序或質(zhì)譜驗(yàn)證RNA序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

本規(guī)程適用于基礎(chǔ)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)錄與翻譯操作，實(shí)際應(yīng)用時可根據(jù)具體需求調(diào)整參數(shù)。

一、概述

遺傳信息的轉(zhuǎn)錄與翻譯是生物體將DNA中的遺傳密碼轉(zhuǎn)化為功能性蛋白質(zhì)的核心過程，對于維持生命活動至關(guān)重要。本規(guī)程詳細(xì)闡述了轉(zhuǎn)錄和翻譯的基本原理、操作步驟及注意事項(xiàng)，旨在為相關(guān)研究提供標(biāo)準(zhǔn)化參考。

二、轉(zhuǎn)錄過程

轉(zhuǎn)錄是指以DNA為模板合成RNA的過程，主要分為模板識別、RNA合成及終止三個階段。

（一）轉(zhuǎn)錄所需材料與條件

1.模板DNA：選擇目標(biāo)基因片段作為轉(zhuǎn)錄模板。

(1)模板DNA的質(zhì)量和純度直接影響轉(zhuǎn)錄效率，建議使用PCR純化或凝膠回收的片段，純度應(yīng)>98%。

(2)若為質(zhì)粒載體，需先進(jìn)行質(zhì)粒小量提取并驗(yàn)證插入基因的正確性。

2.RNA聚合酶：根據(jù)需要選擇不同類型的RNA聚合酶（如細(xì)菌中的RNA聚合酶）。

(1)通用型RNA聚合酶（如T7、T3、SP6）：適用于線性DNA模板，需預(yù)設(shè)計(jì)啟動子序列（如T7啟動子）。

(2)逆轉(zhuǎn)錄酶（如AMV、M-MLV）：用于反轉(zhuǎn)錄病毒或cDNA合成，需在酸性條件下（pH5.5）反應(yīng)。

3.四種核糖核苷三磷酸（NTPs）：包括ATP、GTP、CTP、UTP作為合成RNA的原料。

(1)NTPs濃度需精確控制，過高會導(dǎo)致非特異性延伸，過低則影響產(chǎn)量。建議終濃度各為0.5-1.0mM。

4.緩沖液：提供適宜的pH和離子環(huán)境（pH7.5-8.0，Mg2?濃度5-10mM）。

(1)商業(yè)試劑盒通常包含優(yōu)化緩沖液，若自配需精確稱量Tris、KCl、NaCl等成分。

5.溫度：通常控制在37°C或根據(jù)酶特性調(diào)整。

(1)T7RNA聚合酶最適溫度為37°C，而E.coliRNA聚合酶需45-50°C。

（二）轉(zhuǎn)錄操作步驟

1.模板準(zhǔn)備：

(1)質(zhì)粒模板：使用限制性內(nèi)切酶線性化質(zhì)粒，或直接提取質(zhì)粒作為模板。線性化時需確保切在啟動子上游。

(2)PCR產(chǎn)物模板：通過凝膠電泳回收目標(biāo)片段，使用AmpureXP柱進(jìn)行純化（去除PCR酶殘留）。

2.引物設(shè)計(jì)：

(1)引物需包含RNA聚合酶識別的啟動子序列（如T7RNA聚合酶的TAATACGACTCACTATAGAA）。

(2)引物長度15-25bp，GC含量40%-60%，避免發(fā)夾結(jié)構(gòu)和二聚體形成。

3.反應(yīng)體系配置：

(1)在無菌管中依次加入：模板DNA（100-500ng/μL）、RNA聚合酶（10-50U/μL）、NTPs（各0.5mM）、緩沖液、引物（10μM）。

(2)補(bǔ)充去離子水至總體積20μL，混勻后短暫離心。

4.轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

(1)熱啟動：95°C預(yù)變性5分鐘，然后降至37°C進(jìn)行延伸。

(2)程序控制：建議使用熱循環(huán)儀設(shè)置以下參數(shù)：37°C反應(yīng)60-90分鐘（根據(jù)模板長度調(diào)整）。

(3)終止反應(yīng)：加入RNA酶抑制劑（如RNaseOut，20U/μL）或熱處理（70°C15分鐘）滅活酶活性。

（三）產(chǎn)物檢測與純化

1.檢測方法：

(1)凝膠電泳：

-配制1.5%-2.0%瓊脂糖凝膠，加入核酸染料（如Goldview）。

-電泳電壓5-10V/cm，根據(jù)RNA分子量估算遷移時間。

-通過UV燈觀察條帶，預(yù)期大小與基因長度一致。

(2)Northernblot：

-將RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜（42°C預(yù)雜交30分鐘）。

-使用32P標(biāo)記的探針（或地高辛標(biāo)記）雜交（65°C過夜）。

-X光片曝光或化學(xué)發(fā)光成像檢測。

2.純化步驟：

(1)乙醇沉淀法：

-加入等體積異丙醇，-20°C沉淀30分鐘。

-12,000rpm離心15分鐘，棄上清。

(2)洗滌：用75%乙醇洗滌沉淀，重復(fù)離心。

(3)干燥：真空干燥5分鐘，加入DEPC水溶解RNA。

(2)試劑盒純化：

-使用RNeasyMiniKit（Qiagen）等商品化試劑盒，按說明書操作。

-包括洗脫、離心等步驟，可同時去除DNA和蛋白質(zhì)雜質(zhì)。

三、翻譯過程

翻譯是指以mRNA為模板合成蛋白質(zhì)的過程，由核糖體和多種tRNA共同完成。

（一）翻譯所需材料與條件

1.mRNA模板：純化的mRNA或體外合成的RNA鏈。

(1)mRNA需無二級結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾環(huán)），可使用熱變性（70°C5分鐘）處理。

(2)純度要求>95%，可通過SDS或AgilentBioanalyzer驗(yàn)證。

2.核糖體：根據(jù)宿主系統(tǒng)選擇（如E.coli核糖體）。

(1)商業(yè)試劑盒通常包含完整核糖體系統(tǒng)（含30S和50S亞基）。

(2)自制時需提取純化E.coli細(xì)胞裂解物，通過蔗糖密度梯度離心分離核糖體。

3.氨基酸：提供必需的20種氨基酸（濃度0.1-1mM）。

(1)需額外添加甲硫氨酸（起始密碼子AUG對應(yīng)的氨基酸）。

(2)對于真核系統(tǒng)，還需補(bǔ)充UTP、GTP等能量底物。

4.起始因子：如IF-1、IF-2、IF-3（細(xì)菌系統(tǒng)）。

(1)商業(yè)試劑盒已預(yù)混起始因子，無需額外添加。

(2)若自配，需精確復(fù)性IF-2（含GDP-GTP交換酶活性）。

5.能量底物：GTP或ATP（根據(jù)需要）。

(1)終濃度通常設(shè)為2-5mM（GTP）。

（二）翻譯操作步驟

1.mRNA準(zhǔn)備：

(1)線性化處理：若mRNA為環(huán)狀，需用DNaseI或RNase-FreeDNase處理去除殘留DNA。

(2)脫氧處理：加入DTT或β-巰基乙醇（10mM）消除氧化應(yīng)激。

2.翻譯體系配置：

(1)在無菌管中依次加入：mRNA（1μg/μL）、核糖體（50A260單位/μL）、氨基酸混合物、起始因子、緩沖液（50mMTris-HCl，pH7.8）、GTP（0.5mM）。

(2)補(bǔ)充去離子水至總體積50μL，混勻后短暫離心。

3.翻譯反應(yīng)：

(1)預(yù)孵育：37°C孵育5分鐘，使各組分充分結(jié)合。

(2)加入ATP：補(bǔ)充ATP（5mM）以供起始密碼子識別。

(3)程序控制：37°C反應(yīng)30-60分鐘（根據(jù)蛋白質(zhì)大小調(diào)整時間）。

(4)終止反應(yīng)：加入蛋白終止劑（如NaN?，終濃度0.1M）終止反應(yīng)。

（三）產(chǎn)物檢測與純化

1.檢測方法：

(1)SDS：

-配制12%聚丙烯酰胺凝膠，加入蛋白上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）。

-電泳電壓12V/cm，根據(jù)分子量估算遷移時間。

-銀染或考馬斯亮藍(lán)染色后觀察條帶。

(2)Westernblot：

-將SDS分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。

-使用特異性抗體（如兔抗His標(biāo)簽）孵育（4°C過夜）。

-HRP標(biāo)記的二抗孵育后，化學(xué)發(fā)光成像檢測。

2.純化步驟：

(1)Ni-NTA親和層析（針對His標(biāo)簽蛋白）：

-將表達(dá)蛋白溶液過Ni-NTA柱（預(yù)洗脫緩沖液）。

-用咪唑梯度（50-500mM）洗脫目標(biāo)蛋白。

(2)離子交換層析：

-根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)選擇CM或SP離子交換柱。

-用鹽梯度（0.1-1.0M）分離純化目標(biāo)蛋白。

(3)超濾濃縮：

-使用10kDa超濾管濃縮至1mg/mL，去除鹽離子雜質(zhì)。

四、注意事項(xiàng)

1.酶與試劑活性：確保RNA聚合酶和核糖體處于活性狀態(tài)，避免反復(fù)凍融。

(1)RNA聚合酶需儲存于-20°C，避免反復(fù)凍融。使用前需在4°C解凍30分鐘。

(2)核糖體若需自備，需在-80°C儲存，避免多次離心操作。

2.RNA/DNA污染：操作時使用無RNA酶的耗材（如DEPC水處理）。

(1)所有試劑需使用RNA酶-Free處理（如高壓滅菌前加入DEPC）。

(2)實(shí)驗(yàn)