44Codeofpracticeonbreedingofbacteriawilt-resistantcultivarofCasuarinaspp.I 2 2 3 6 7 8本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件主要起草人：張勇、馬海賓、魏永成、孟景祥、1木麻黃抗青枯病新品種選育技術(shù)規(guī)程由青枯雷爾氏桿菌（Ralstoniasolanacearu抗青枯病新品種newvarietyresistanttobacte切枝水培接種法pathogenicbacteriainoculationusingwater-culturecutt察切枝的發(fā)病情況，統(tǒng)計分析該遺傳材料對青枯菌的傷根接種法pathogenicbacteriainoculationthroughwoundedro2指不同來源的木麻黃遺傳材料，包括從木麻黃天然分布區(qū)和主要引種區(qū)通過控制或自由授粉獲得的雜交子代，或從實生苗人工林經(jīng)選優(yōu)后獲得的個體，經(jīng)生長和適應(yīng)性評價，部或全部變褐色；正發(fā)病植株的根、主干和使用快速檢測農(nóng)作物青枯病常用的免疫層析試紙條對發(fā)病植株根系橫切面溢出的菌膿進行檢測，剪取青枯病癥狀明顯但仍然存活的植株上直徑粗1將發(fā)病株的根系清洗干凈后剝?nèi)ネ馄ぃ⒂?5%的酒精浸泡消毒30s,置無菌水沖洗3次，將兩端切成平整的新鮮斷面，把其中一端浸泡于無菌水中，12h～36h后在病根的另一端斷面會溢出乳白色的菌培養(yǎng)48h。取發(fā)病株3cm長的根系1條，沖洗干凈表面泥土，用75%的酒精浸超凈工作臺上剝?nèi)ジ当砥?，切除兩端，再橫切成3份~5份，放入含有5mL～10mL無菌水的培養(yǎng)皿內(nèi)30min,讓根系的青枯菌滲出形成病菌懸浮液。用移植環(huán)蘸取菌液在TTC恒溫培養(yǎng)48h。在培養(yǎng)皿內(nèi)挑取不規(guī)則圓形、乳白色且中心部位淡紅色的單個菌落，在TTC培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)36將分離純化后的青枯菌接種于CPG液體培養(yǎng)基(見附錄A.2),裝入三角瓶中放在搖床上振蕩培養(yǎng)，100r/min～150r/min,30℃培養(yǎng)12h～24h。35.5致病性檢測5.5.1傷根接種法5.5.1.1材料使用2個~3個具不同抗青枯病能力的木麻黃無性系小苗(高50cm)進行菌株致病性的檢測，如易感、中等抗病和抗病的無性系。5.5.1.2接種方法先用流水沖洗干凈小苗根系的培養(yǎng)基質(zhì)，剪去部分細根形成傷口。將小苗根系放入裝有青枯菌懸浮液的容器中，置于30℃水浴鍋中培養(yǎng)1h促進青枯菌的侵染。將青枯菌懸浮液換成無菌水作為對照。5.5.1.3小苗移栽接種青枯菌后將小苗移栽至育苗盤中繼續(xù)生長，育苗基質(zhì)用黃心土：河沙：蛭石按體積比2:2:1混合，種植株行距10cm×10cm。單個無性系苗每處理使用30株，重復(fù)3次以上。5.5.1.4發(fā)病率測定人工接種小苗在育苗盤中生長15d后，小苗表現(xiàn)萎蔫甚至干枯死亡，使用青枯病免疫檢測試紙條檢測根系出現(xiàn)青枯菌特征條帶，表明木麻黃苗已發(fā)病，計算人工接種菌株小苗的發(fā)病率。發(fā)病率(Incidencerate,IR)按公式(1)計算。5.5.1.5致病性判斷人工接種青枯菌的無性系苗達到如下發(fā)病率，可以判定該菌株為強致病性菌株，判定標準見表1。表1青枯菌致病性判斷發(fā)病率(IR,%)易感中等抗病抗病5.5.2切枝水培接種法參照DB44/T2346執(zhí)行。6抗病選育6.1抗病材料初選6.1.1青枯菌懸浮液制備將5.4中的青枯菌液用無菌水稀釋為濃度10?~10?cfu/mL的懸浮液，用于木麻黃切枝水培接種。采用平板計數(shù)法計算菌液中的青枯菌數(shù)量。6.1.2切枝水培接種4），發(fā)病率小于40%的待選材料可初選為抗病材料用于下經(jīng)初選后獲得的遺傳材料采用嫩枝水培（或沙培）生根的方法繁殖無性系小苗，一般培養(yǎng)6個月高度達50cm～70cm后，從中選擇生長健壯、根系發(fā)達、大小一致的小苗用于青枯菌接種試驗。用黃心土:河沙:蛭石按體積比2:2:1混合，加2%～3%復(fù)合肥（氮磷鉀15-15-15）公式（1感病指數(shù)（diseaseindex,DI）參考地標DB44/5每塊林地面積根據(jù)測定品系的數(shù)量確定，每品系需要面積160m2～200m2。經(jīng)小苗傷根接種法復(fù)選出的抗病品系，采用嫩枝水培（或沙培）的方法繁殖無性系小苗，培養(yǎng)6個試驗采用隨機完全區(qū)組設(shè)計，各無性系種植10株/區(qū)組，重復(fù)4次～5次，每無性系共種植40株～50樹體病害分級參考DB44/T2414，采用田間試驗開展5年后（二分之一個輪伐期）即可67定容至1