實時熒光定量PCR檢測方法的實際應(yīng)用分析案例目錄TOC\o"1-3"\h\u4079實時熒光定量PCR檢測方法的實際應(yīng)用分析案例 123351.1材料和儀器 148541.1.1材料 1223151.1.2主要試劑 2244661.1.3儀器設(shè)備 263321.2試驗方法 2168471.2.1增菌方法對比 296801.2.2增菌試驗 313631.2.3樣品驗證 322151.3試驗結(jié)果 430131.3.1增菌方法的選擇 4171661.3.2增菌試驗結(jié)果 5254621.3.3果汁樣品驗證結(jié)果 6222451.4總結(jié) 8由于實際濃縮蘋果汁樣品中脂環(huán)酸芽孢桿菌含量較低，無法達(dá)到所建立檢測方法的檢測限。為了使建立的方法能夠應(yīng)用到實際工廠檢測中，嘗試多種富集增菌方法盡量縮短不同濃度、不同菌種達(dá)到檢測限的富集時間。另外，對果汁樣品進(jìn)行檢測，完善樣品檢測流程，為果汁加工企業(yè)檢測脂環(huán)酸芽孢桿菌提供可靠的技術(shù)方法，最終得到快速、簡便、高效的檢測方法。1.1材料和儀器1.1.1材料脂環(huán)酸芽孢桿菌屬A.acidoterrestris（DSM3923）、A.acidiphilus（DSM14558）、A.cycloheptanicus（DSM4006）、A.herbarius（DSM13609）購自德國生物材料資源中心（DSM），所有菌株均保存在-80℃冰箱中。濃縮蘋果汁來自于國投中魯股份有限公司乳山研發(fā)中心。菌株培養(yǎng)條件見表4-1。AAM固體培養(yǎng)基：制備A溶液和B溶液，滅菌（121℃×20min）。

A：酵母浸粉2.0g，硫酸銨0.4g，硫酸鎂1.0g，磷酸二氫鉀1.2g，氯化鈣0.38g，500mL蒸餾水，用1mol/LH2SO4或1mol/LNaOH調(diào)pH至1.0。

B：瓊脂20.0g，葡萄糖2.0g，溶于500mL蒸餾水中加熱溶解。為防止瓊脂在酸性條件下水解，待A溶液和B溶液滅菌后冷卻至50℃，將A溶液和B溶液混合，盡量避免產(chǎn)生氣泡。AAM液體培養(yǎng)基：酵母浸粉2.0g，葡萄糖2.0g，硫酸銨0.4g，硫酸鎂1.0g，磷酸二氫鉀1.2g，氯化鈣0.38g，蒸餾水1L，用1mol/LH2SO4或1mol/LNaOH調(diào)pH至1.0。（121℃×20min）殺菌。表4-1菌株培養(yǎng)條件Table4-1Straincultureconditions編號種屬培養(yǎng)基溫度DSM3923A.acidoterrestrisAAM45℃DSM14558A.acidiphilusAAM45℃DSM4006A.cycloheptanicusAAM45℃DSM13609A.herbariusAAM55℃1.1.2主要試劑試驗所用主要試劑如表4-2所示。表4-2主要試劑Table4-2Mainreagents試劑名稱生產(chǎn)廠家純度瓊脂四川西隴化工有限公司AR乙醇四川西隴化工有限公司AR丙三醇四川西隴化工有限公司AR氯化鈉四川西隴化工有限公司AR葡萄糖四川西隴化工有限公司AR硫酸銨四川西隴化工有限公司AR硫酸鎂四川西隴化工有限公司AR氯化鈣四川西隴化工有限公司AR磷酸二氫鉀四川西隴化工有限公司AR可溶性淀粉四川西隴化工有限公司AR酵母浸粉北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司AR2×UltraSYBRMixture天根生化科技（北京）有限公司AR1.1.3儀器設(shè)備試驗所用主要試劑同表2-2。1.2試驗方法1.2.1增菌方法對比根據(jù)前期靈敏度試驗結(jié)果得知A.acidoterrestris（DSM3923）的檢出限為2.6×102CFU/mL；A.acidiphilus（DSM14558）的檢出限為7.4×101CFU/mL；A.cycloheptanicus（DSM4006）的檢出限為2.8×102CFU/mL；A.herbarius（DSM13609）的檢出限為3.1×102CFU/mL。由于實際蘋果濃縮汁樣品中脂環(huán)酸芽孢桿菌含量一般較低，初期不能檢出。為進(jìn)一步提高檢測效率，現(xiàn)采用兩種方法進(jìn)行快速增菌試驗，使細(xì)菌快速生長至可檢測的濃度，并確定四株菌在不同培養(yǎng)濃度下達(dá)到檢出限的培養(yǎng)時間。選取A.acidoterrestris（DSM3923）作為試驗菌株進(jìn)行兩種增菌方法的對比。取保藏在-80℃超低溫冰箱中的DSM3923，將保存菌株接種在AAM液體培養(yǎng)基中，在45℃條件下振蕩（180rpm）培養(yǎng)以至菌株重新活化再次接種進(jìn)行二代活化，置于搖床培養(yǎng)，使其達(dá)到對數(shù)生長期。采取濾膜富集培養(yǎng)法和培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)法進(jìn)行增菌試驗，根據(jù)試驗結(jié)果選擇較優(yōu)的增菌方法。具體操作如下：（1）濾膜富集培養(yǎng)法 取10mL活化好的菌懸液加入到90mL無菌水中搖勻，進(jìn)行10倍梯度稀釋，取100μL稀釋液進(jìn)行涂布計數(shù)，每個梯度平行三次，裝入自封袋以防干裂，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后將不同濃度的菌懸液全部過濾膜富集，將富集的濾膜置于10mLAAM液體培養(yǎng)基中，確保濾膜全部浸入培養(yǎng)基，置于45℃搖床培養(yǎng)。每隔2h取出計數(shù)一次，時間范圍為24h。確定不同濃度菌懸液達(dá)到檢測限的時間。（2）培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)法取10mL活化好的菌懸液加入到90mLAAM液體培養(yǎng)基中搖勻，進(jìn)行10倍梯度稀釋，取100μL稀釋液于平板中進(jìn)行涂布，每個梯度平行三次，裝入自封袋以防干裂，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將不同濃度的菌懸液直接置于45℃搖床培養(yǎng)，每隔2h取出計數(shù)一次，時間范圍為24h。確定不同濃度菌懸液達(dá)到檢測限的時間。1.2.2增菌試驗對比兩種不同增菌方法的結(jié)果，選擇增菌速度較快的方法進(jìn)行后續(xù)增菌試驗。選取A.acidoterrestrisDSM3923、A.acidiphilusDSM14558、A.cycloheptanicusDSM4006、A.herbariusDSM13609菌株活化兩代，按照培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)法進(jìn)行富集增菌。每隔2h取出計數(shù)一次，時間范圍為24h。1.2.3樣品驗證人工污染的蘋果汁作為加標(biāo)樣品，以評估所建立方法的性能。由國投中魯股份有限公司乳山研發(fā)中心提供的濃縮蘋果汁（68°Brix）用蒸餾水稀釋至可溶性固形物含量為11-12°Brix。將每種菌株的細(xì)胞懸浮液（A.acidoterrestrisDSM3923、A.acidiphilusDSM14558、A.cycloheptanicusDSM4006、A.herbariusDSM13609）接種到制備的蘋果汁中，最終濃度為10-1、100和101CFU/mL。用0.45μm濾膜過濾加標(biāo)樣品以收集細(xì)菌，并將收集到的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到AAM培養(yǎng)基（pH1.0）中進(jìn)行培養(yǎng)，按照增菌試驗得出的培養(yǎng)時間進(jìn)行培養(yǎng)。在此基礎(chǔ)上，通過建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測以評估所建立的檢測方法在果汁中的適用性。1.3試驗結(jié)果1.3.1增菌方法的選擇已知A.acidoterrestris（DSM3923）的檢出限為2.6×102CFU/mL，根據(jù)定時取樣計數(shù)結(jié)果可知，采取濾膜富集培養(yǎng)法進(jìn)行增菌，培養(yǎng)濃度為101CFU/mL可在2h達(dá)到檢出限；培養(yǎng)濃度為101CFU/mL可在4h達(dá)到檢出限；培養(yǎng)濃度為10-1CFU/mL可在6h達(dá)到檢出限。培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)法與濾膜富集培養(yǎng)法結(jié)果相同，結(jié)果見表4-4。表4-4增菌方法對比結(jié)果Table4-4Comparisonresultsofbacteriaenrichmentmethods增菌方法濾膜富集培養(yǎng)法培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)法10110010-110110010-10h2h+--+--4h++-++-6h++++++8h++++++10h++++++12h++++++14h++++++16h++++++18h++++++20h++++++22h++++++24h++++++注：“+”表示達(dá)到檢出限，可檢出；“-”表示未達(dá)檢出限，不可檢出。根據(jù)表4-4可以看出，在相同的培養(yǎng)濃度下，兩種增菌方法達(dá)到檢出限的時間一致，而培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)法操作相較簡單，因此選擇培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行后續(xù)增菌試驗。1.3.2增菌試驗結(jié)果已知A.acidoterrestrisDSM3923的檢出限為2.6×102CFU/mL；A.acidiphilusDSM14558的檢出限為7.4×101CFU/mLCFU/mL；A.cycloheptanicusDSM4006的檢出限為2.8×102CFU/mL；A.herbariusDSM13609的檢出限為3.1×102CFU/mL。根據(jù)增菌試驗計數(shù)結(jié)果，最終確定不同菌種在不同培養(yǎng)濃度下達(dá)到檢出限的培養(yǎng)時間。根據(jù)定時取樣計數(shù)結(jié)果可知，A.acidoterrestrisDSM3923培養(yǎng)濃度為101CFU/mL可在2h達(dá)到檢出限，即2.6×102CFU/mL；培養(yǎng)濃度為100CFU/mL可在4h達(dá)到檢出限；培養(yǎng)濃度為10-1CFU/mL可在6h達(dá)到檢出限。A.acidiphilusDSM14558培養(yǎng)濃度為101CFU/mL可在2h達(dá)到檢出限，即7.4×101CFU/mL；培養(yǎng)濃度為100CFU/mL可在4h達(dá)到檢出限；培養(yǎng)濃度為10-1CFU/mL可在6h達(dá)到檢出限。A.cycloheptanicusDSM4006培養(yǎng)濃度為101CFU/mL可在6h達(dá)到檢出限，即2.8×102CFU/mL；培養(yǎng)濃度為100CFU/mL可在8h達(dá)到檢出限；培養(yǎng)濃度為10-1CFU/mL可在10h達(dá)到檢出限。A.herbariusDSM13609培養(yǎng)濃度為101CFU/mL可在14h達(dá)到檢出限，即3.1×102CFU/mL；培養(yǎng)濃度為100CFU/mL可在18h達(dá)到檢出限；培養(yǎng)濃度為10-1CFU/mL可在20h達(dá)到檢出限。匯總結(jié)果見表4-5。表4-5增菌試驗結(jié)果Table4-5Enrichmenttestresults菌種DSM3923DSM14558DSM4006DSM1360910110010-110110010-110110010-110110010-10h2h+--+4h++-+6h++++++8h+++++++10h++++++++12h++++++++14h+++++++++--16h+++++++++--18h++++++++++-20h+++++++++++22h+++++++++++24h+++++++++++注：“+”表示達(dá)到檢出限，可檢出；“-”表示未達(dá)檢出限，不可檢出。1.3.3果汁樣品驗證結(jié)果為了進(jìn)一步評估已建立的快速增菌方法和實時熒光定量PCR檢測方法的性能，對加標(biāo)了不同細(xì)菌（DSM3923、DSM14558、DSM4006、DSM13609）不同濃度（10-1、100和101CFU/mL）的蘋果汁樣品進(jìn)行分析。為檢測A.acidoterrestris，向蘋果汁中加入標(biāo)準(zhǔn)菌株DSM3923使?jié)舛葹?0-1、100和101CFU/mL，培養(yǎng)時間分別為6、4和2h，檢測獲得了陽性結(jié)果；向蘋果汁中加入濃度為10-1、100和101CFU/mL的DSM14558，培養(yǎng)時間分別為6、4和2h，檢測結(jié)果均為陽性；向蘋果汁中加入濃度為10-1、100和101CFU/mL的DSM4006，培養(yǎng)時間分別為10、8和6h，檢測獲得了陽性結(jié)果；向蘋果汁中加入濃度為10-1、100和101CFU/mL的DSM13609，培養(yǎng)時間分別為20、18和14h，檢測結(jié)果為陽性。檢測結(jié)果如圖4-1、4-2、4-3、4-4。因此，培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)法與熒光定量PCR分析相結(jié)合適用于檢測果汁樣品中的目標(biāo)細(xì)菌。圖4-1A.acidoterrestris加標(biāo)驗證結(jié)果Figure4-1JuiceverificationresultsofA.acidoterrestris圖4-2A.acidiphilus加標(biāo)驗證結(jié)果Figure4-2JuiceverificationresultsofA.acidiphilus圖4-3A.cycloheptanicus加標(biāo)驗證結(jié)果Figure4-3JuiceverificationresultsofA.cycloheptanicus圖4-4A.herbarius加標(biāo)驗證結(jié)果Figure4-4JuiceverificationresultsofA.herbarius1.4總結(jié)（1）采用濾膜富集培養(yǎng)法和培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)法進(jìn)行快速增菌試驗，在相同的培養(yǎng)濃度下，兩種增菌方法達(dá)到檢出限的時間一致，而培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)法相較濾膜富集培養(yǎng)法操作更簡單，因此選擇培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行后續(xù)增菌試驗。（2）根據(jù)增菌試驗結(jié)果，確定不同菌種在不同培養(yǎng)濃度下達(dá)到檢出限的培養(yǎng)時間。A.acidoterrestrisDSM3923培養(yǎng)濃度為101CFU/mL可在2h達(dá)到檢出限