摘要緒論1.1稀土配合物熒光探針概述熒光壽命更長；發(fā)射譜峰更窄；斯托克斯更大，是稀土配合物熒光探針較于小分子熒光染料的三個明顯的優(yōu)點，這三個優(yōu)點賦予其對特定離子的高度選擇性、在時間分辨技術(shù)中極高的靈敏度以及較好的成像[1]。作為近年來的研究熱點，越來越多的注重開發(fā)的研究人員將注意力投入到發(fā)展能夠識別各種不同離子的探針上。且因為人體中的各種離子也影響著人本身的健康，因此此技術(shù)也可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)中的病理檢測等方面，于人類社會的發(fā)展有著促進(jìn)作用[2]。1.1.1稀土元素稀土元素包含有元素周期表中第三副族的鑭系元素和鈧（Sc）、釔（Y），一共有17種[3]。稀土離子（Sc3+、Y3+、La3+、Lu3+除外）均具有未充滿的4f電子層結(jié)構(gòu)，所以具有多種多樣的多重態(tài)能級，稀土離子發(fā)光的原因是未充滿的4f層之間的電子產(chǎn)生躍遷，根據(jù)稀土離子在可見光區(qū)的發(fā)光強度可以將其分為三類[4]，如表1.1所示。表1.1稀土離子分類發(fā)光強度稀土離子非熒光性稀土離子Sc3+、Y3+、La3+、Lu3+、Gd3+熒光發(fā)光較弱的稀土離子Pr3+、Nd3+、Ho3+、Er3+熒光發(fā)光較強的稀土離子Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+因為Eu3+、Tb3+的優(yōu)異的熒光發(fā)光性能，它不僅壽命長且激發(fā)能低，這與新興時間分辨熒光分析技術(shù)相輔相成，所以Eu3+和Tb3+的配合物熒光探針能夠持續(xù)引起關(guān)注。1.1.2稀土配合物熒光探針原理探針的發(fā)光原理如圖1.1所示。圖1.1稀土配合物熒光分子探針的熒光發(fā)光原理我們以銪配合物作為例子，其發(fā)光有兩種機理，一種是配體三線態(tài)高于銪離子激發(fā)態(tài)（如圖1.2a），另一種是配體三線態(tài)接近銪離子激發(fā)態(tài)（如圖1.2b）。除一些特殊的情況外，絕大多數(shù)的銪（Ⅲ）配合物遵循的都是三線態(tài)發(fā)光機理[5]。1.2時間分辨熒光分析技術(shù)1.2.1時間分辨熒光原理稀土配合物的發(fā)光特性與時間分辨熒光分析技術(shù)及其匹配，這是其所能夠應(yīng)用的一大根本優(yōu)勢。在捕捉熒光信號的前一段時間，引入一定的延遲時間，等到短壽命的背景熒光和散亂光衰減至完全消失后，再對長壽命的熒光進(jìn)行捕捉采集。因此，可以解決來自試劑或樣品中產(chǎn)生的短壽命熒光問題，提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度。圖1.3為測定原理示意圖[6]。1.2.2稀土配合物熒光探針在時間分辨熒光分析技術(shù)中的應(yīng)用稀土配合物由于其具有Stokes位移大、熒光壽命長等突出的特點，這有了把其設(shè)計成為細(xì)胞內(nèi)活性分子的生物傳感器的可能，再結(jié)合時間分辨熒光分析技術(shù)來實現(xiàn)對細(xì)胞活性分子實時原位的檢測[7]。1.3本論文研究意義及內(nèi)容 通過對現(xiàn)有的關(guān)于銪配合物熒光探針文獻(xiàn)的查閱和整理，得到不同類型不同配位體的銪配合物熒光探針與所對應(yīng)的特定的離子的高敏感性與選擇性。根據(jù)熒光探針對特定的的離子的高敏感性，可將其應(yīng)用于生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。本論文主要是將不同類型的銪配合物熒光探針以及與其對應(yīng)的特定離子進(jìn)行總結(jié)，并對其反應(yīng)的機理進(jìn)行基本的描述，來表達(dá)銪配合物熒光探針特異性選擇的原理。詳細(xì)的區(qū)分不同類型的銪配合物熒光探針對不同離子的選擇性，以便于銪配合物熒光探針應(yīng)用在實際生活中。2識別銅離子和硫離子的β-二酮類銪（Ⅲ）配合物熒光探針2.1引言 銅離子與硫離子等元素十分常見，但缺少與過量均會對生物有不同的影響。過量的銅離子會致使細(xì)胞死亡且會進(jìn)一步誘發(fā)帕金森氏等多種疾病，過量的硫離子會造成生物永久性的腦損傷，而缺少硫離子則會使人體中毒。所以，設(shè)計與合成高靈敏度的針對Cu2+和S2-的稀土配合物熒光探針是十分重要的，也是現(xiàn)在科研人員研究的重點。時間分辨熒光檢測技術(shù)的優(yōu)點是其熒光檢測的高靈敏度與能在檢測時有效的消除樣本與試劑本身熒光的干擾，因此，近年來研究人員大多傾向于用分子識別理念來設(shè)計稀土配合物熒光探針。本章是介紹一種人工合成的強熒光性β-二酮類銪（Ⅲ）配合物熒光探針Eu3+-BHHCT-BPED，熒光探針Eu3+-BHHCT-BPED本身會發(fā)出很強的熒光，與Cu2+反應(yīng)后幾乎不發(fā)光，而將S2-加入探針溶液后，探針又會發(fā)出較強的熒光，且該探針有較寬的pH適用范圍與較高的化學(xué)穩(wěn)定性。2.2合成方法2.2.1合成路線合成步驟如圖2.1所示。圖2.1探針的合成步驟2.2.2配位體的合成2.2.3探針Eu3+-BHHCT-BPED的合成將633mg，0.5mmol的BPED-BHHCT與92mg，0.25mmol的EuCl3·6H2O加入10mL的CH3CN中，再一邊攪拌一邊加入1.0M，0.75mL的NaOH。然后在85℃回流1h，冷卻到室溫后過濾收集沉淀。最后用含有10%C2H5OH的水溶液洗滌沉淀，得到淡黃色固體Eu3+-BHHCT-BPED，產(chǎn)率大概有九成。2.3結(jié)果與討論2.31探針對Cu2+檢測性能的評價由圖2.2A可看出，在不同濃度的Cu2+下，濃度越高，探針發(fā)光強度越小，也可根據(jù)此表示出探針發(fā)光強度與銅離子濃度的關(guān)系，如圖2.2B。2.3.2探針對S2-檢測性能的評價由于硫離子和銅離子會相互反應(yīng)結(jié)合成CuS，所以Eu3+-BHHCT-BPED-Cu2+中的Cu2+與S2-會結(jié)合形成沉淀CuS，使得因為檢測Cu2+而猝滅的探針熒光能夠恢復(fù)。在此依據(jù)上，Eu3+-BHHCT-BPED-Cu2+即可以作為一個新型的探針用來檢測S2-。由圖2.3A可看出探針的熒光強度與S2-有著明顯的關(guān)系，隨著硫離子濃度的增加而變大。也可根據(jù)此得出它們之間的線性關(guān)系，如圖2.3B。關(guān)系式可表示為I-I0=3.10[S2-]+12.2，I0是Eu3+-BHHCT-BPED-Cu2+加入S2-前的發(fā)光強度，I是加入后的發(fā)光強度。因此可以看出該探針具有對硫離子高度的選擇性。2.4小結(jié)本章主要介紹了，（1）銪（Ⅲ）配合物熒光探針Eu3+-BHHCT-BPED的合成方法;（2）銪（Ⅲ）配合物熒光探針Eu3+-BHHCT-BPED對Cu2+與S2-的特異性識別?？梢岳迷撎结樳M(jìn)行活體生物體內(nèi)的Cu2+與S2-時間分辨熒光成像，以推動醫(yī)學(xué)、材料學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展。3識別單線態(tài)氧的銪(Ⅲ)配合物熒光探針3.1引言1O2屬于活性氧，廣泛的存在我們的生活中，也能在生物免疫系統(tǒng)中作為殺菌劑存在。它是一種處于激發(fā)態(tài)的氧氣分子，因為其氧化性極強，化學(xué)性質(zhì)活潑，所以在生物及環(huán)境中都起著重要作用[9]。因此，近年來科研工作者也將越來越多的注意力投入到如何檢測生物體內(nèi)單線態(tài)氧方面[10]。本章將介紹1O2特異性識別銪（Ⅲ）配合物熒光探針Eu3+(BHH)3(ATPD)，這種探針在單線態(tài)氧溶液中反應(yīng)后有較強的熒光放出，且適用的酸堿度很廣?？衫闷涮匦詠斫尉€態(tài)氧時間分辨熒光分析技術(shù)，來對單線態(tài)氧進(jìn)行特異性選擇。3.2合成方法3.2.1探針的合成路線圖3.1探針的合成路線3.2.2探針的合成3.2.3探針與1O2的反應(yīng)3.3結(jié)果與討論3.3.1探針對1O2檢測性能的評價由圖3.2A可看出，探針Eu(BHH)3(ATPD)的發(fā)光強度與氧離子的濃度有著密不可分的關(guān)系，隨著H2O2的濃度增加而增加。為了進(jìn)一步了解它們具體的關(guān)系又做了圖3.2B，來具體的用線性方程的方式來描述。其線性方程為I-I0=0.92[H2O2]+40.1，I表示熒光探針在加入H2O2前的發(fā)光強度,I0表示加入后的發(fā)光強度，線性范圍在5-200μM之間。3.3.2探針對各種活性氧的選擇性測定為了檢測熒光探針對單線態(tài)氧的特異性選擇，應(yīng)選擇在不同的溶液中用探針來進(jìn)行單獨的檢測。圖3.3是1O2和另加的活性氧與Eu(BHH)3(ATPD)（1μM）在pH為7.4的0.05M硼酸緩沖溶液中反應(yīng)過后的熒光強度。圖中可以看出該探針除了對單線態(tài)氧有著特異性選擇外，對其他的離子均無特殊的反應(yīng)。這表明了該探針的可實用性，可將其與時間分辨熒光分析技術(shù)結(jié)合，來特異性的檢測生物體中的單線態(tài)氧，也可檢測環(huán)境中的單線態(tài)氧。3.4小結(jié)本章介紹了β-二酮類銪（Ⅲ）配合物熒光探針Eu(BHH)3(ATPD)。該探針能夠在特異性識別1O2的同時還就有較寬的pH適用范圍。4.識別次氯酸的可見光激發(fā)銪（III）配合物熒光探針4.1引言次氯酸（HClO）是一種典型的活性氧。因此，在生物體中HClO能消滅多種病原體，加強宿主的機體防御。在這之外，HClO過多積累在吞噬細(xì)胞中會引發(fā)組織損傷或重塑，而且對腎病、心血管疾病、炎癥、癌癥和神經(jīng)退行性疾病等病癥有著深遠(yuǎn)的影響。體內(nèi)與體外過多或過少的HClO會造成生物體內(nèi)溶酶體的破裂從而使細(xì)胞凋亡，故許多慢性疾病都與被HClO破壞的溶酶體有關(guān)。所以，檢測細(xì)胞中的HClO含量與分布顯得十分重要，這可以使我們更好的了解到HClO的起源、活動和功能[11]。在這幾年，稀土配合物熒光探針由于其特殊的與獨特的性能在檢測生理小分子、離子等方面取得了很好的成績。但這類探針也有一定的缺點，即探針激發(fā)窗口受限于紫外光區(qū)，容易造成不可逆轉(zhuǎn)的光損傷與光毒性。而本章介紹的是一種能檢測溶酶體內(nèi)HClO的可見光區(qū)激發(fā)的時間分辨熒光探針，即[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]（CDHH：5-（4”-氯磺?；?1’,1”-二苯基-4’-基）-1,1,1,2,2,3,3-七氟-4,6-己二酮；DPBT：2-（N,N-二乙基苯胺-4-基）-4,6-二（3,5-二甲基吡唑-1-基）-1,3,5-三嗪）[12]，且實現(xiàn)了在RAW264.7細(xì)胞中外、內(nèi)源性HClO的時間分辨熒光成像分析。4.2合成方法4.2.1探針的合成路線配合物及配體的合成路線如圖4.1所示4.2.2配合物的合成先在50mL圓底燒瓶中加入20mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺（DMF），再將882mg的CDHH（1.8mmol）、260mg的N-（3-氨丙基）嗎啉（1.8mmol）與21.8mg的二甲氨基吡啶（DMAP）（0.18mmol）分別加入到燒瓶中，然后緩慢滴加364mg的三乙胺（3.6mmol），并在室溫下避光攪拌24h。待溶劑旋干后，加入50mL的稀鹽酸（1.0M），最后在磁力攪拌器上攪拌10min，抽濾出產(chǎn)物，用蒸餾水洗滌多次后再真空干燥得到乳白色固體Lyso-CDHH，產(chǎn)率為47%。4.2.3探針[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]的合成先將59.8mg的Lyso-CDHH（0.1mmol）與12.21mg的EuCl3·6H2O（0.03mmol）溶于5mL干燥的四氫呋喃（THF）溶液中，輕微攪拌后加入100μL的氫氧化鈉（1.0M）水溶液，然后再加入12.48mg的DPBT（0.03mmol），在氬氣保護(hù)下回流3h，冷卻到室溫加入一定量的水，會有大量的沉淀析出，用離心機離心收集固體，最后在真空條件下干燥得到黃色固體[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]，產(chǎn)率為61％。4.3結(jié)果與討論4.3.1探針對次氯酸檢測性能的評價為了了解[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]探針對次氯酸（HClO）的特異性選擇，在室溫的實驗條件下，將相同濃度的探針溶液加入到pH為5.5的含有0.25%TritonX-100的0.05M硼酸緩沖溶液中，在充分震蕩后加入不同濃度的次氯酸鈉水溶液，然后對不同濃度的反應(yīng)液的發(fā)射和時間分辨激發(fā)光譜進(jìn)行測定。其結(jié)果如圖4.2，可以看出隨著次氯酸濃度的增加探針的熒光強度不斷下降，最大可降至155倍。上圖4.3是[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]探針測定HClO的工作曲線?？梢钥闯鎏结槦晒鈴姸扰c其濃度呈良好的線性關(guān)系，因此，該探針可以選擇性檢測HClO。4.3.2探針對次氯酸的選擇性測定這次采用了硝酸根NO3?，亞硝酸根NO2?[13]，過氧化氫H2O2，超氧負(fù)離子自由基O2·?，一氧化氮NO，單線態(tài)氧1O2，羥基自由基·OH[14]和過氧亞硝酸陰離子ONOO?分別與[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]探針反應(yīng)，觀察其反應(yīng)前后熒光強度的變化，且反應(yīng)環(huán)境均為pH5.5含有0.25%TritonX-100的0.05M硼酸緩沖溶液中。測定的結(jié)果如圖4.4所示，可由圖看出，探針除了與次氯酸反應(yīng)后熒光明顯減弱外，與其他活性物種反應(yīng)均無明顯變化。即可說明其他活性物種均不會對探針檢測次氯酸造成干擾[15]。4.4小結(jié)在本章中，介紹了一種在配體β-二酮CDHH上加入氨基嗎啉的對次氯酸有定向選擇的[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]探針。這個探針具有熒光壽命長、pH范圍廣、響應(yīng)速度快、有良好的細(xì)胞膜穿透性等優(yōu)點[16]。[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]探針對細(xì)胞溶酶體內(nèi)次氯酸的定位，為進(jìn)一步開發(fā)出具有細(xì)胞器靶向功能的銪（III）配合物熒光探針提供了思路與方法。5結(jié)論因為時間分辨熒光技術(shù)的興起，從而發(fā)展起來的稀土配合物熒光探針有著熒光壽命長、斯托克斯位移大等特有的優(yōu)點[17]。種類繁多的探針與時間分辨熒光技術(shù)在檢測、成像和診斷等多個領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，但為了滿足更多體系與活性分子的檢測要求，開發(fā)更多種類的稀土配合物熒光探針成了研究者所追求的重點[18]。本文主要是介紹了三種不同的銪配合物熒光探針，并得到以下總結(jié)：銪（Ⅲ）配合物熒光探針Eu3+-BHHCT-BPED對Cu2+與S2-的特異性識別?？梢岳迷撎结樳M(jìn)行活體生物體內(nèi)的Cu2+與S2-時間分辨熒光成像，以推動醫(yī)學(xué)、材料學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展。且銪（Ⅲ）配合物熒光探針Eu3+-BHHCT-BPED的合成方法是將含有Cu2+識別基團(tuán)的N,N-二乙二胺共價鍵合到四齒β--二酮配位體4,4’-二氯磺?；?鄰二苯基苯上。由二齒β-二酮配位體BHH、銪離子與含有1O2識別基團(tuán)的配位體ATPD共同配位合成的β-二酮類銪（Ⅲ）配合物熒光探針Eu(BHH)3(ATPD)。在針對其的在不同溶液中的實驗反映出該探針能夠在特異性識別1O2的同時還能擁有較寬的酸堿度適用范圍。（3）在配體β-二酮CDHH上加入氨基嗎啉的對次氯酸有定向選擇的[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]探針。這個探針具有熒光壽命長、pH范圍廣、響應(yīng)速度快、有良好的細(xì)胞膜穿透性等優(yōu)點。[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]探針對細(xì)胞溶酶體內(nèi)次氯酸的定位，為進(jìn)一步開發(fā)出具有細(xì)胞器靶向功能的銪（III）配合物熒光探針提供了思路與方法。參考文獻(xiàn)韓明虎.稀土配合物熒光探針研究進(jìn)展[J].隴東學(xué)院學(xué)報,2016,27(03):25-32.LingChen,CuiMengyuan,ChenJieru,XiaLili,DengDawei,GuYueqing,WangPeng.Anovelhighlyselectivefluorescentprobewithnewchalconefluorophoreformonitoringandimagingendogenousperoxynitriteinlivingcellsanddrug-damagedlivertissue.[J].Pubmed,2020,215.WenshuaiLi,Xiao-MingLiu.Mobilizationandpartitioningofrareearthelementsinthepresenceofhumicacidsandsiderophores[J].ElsevierLtd,2020,254王馨.新型銪配合物單線態(tài)氧熒光探針的合成與應(yīng)用[D].大連:大連理工大學(xué),2018.邢月.新型一氧化氮特異性識別銪（Ⅲ）配合物熒光探針的設(shè)計、合成及應(yīng)用[D].大連:遼寧師范大學(xué),2018.蔣麗娜.水溶性可見光激發(fā)銪熒光標(biāo)記物的制備與應(yīng)用[D].大連：大連理工大學(xué),2010.何慧.新型熒光探針的合成及其在病原微生物監(jiān)測中的應(yīng)用研究[D].長沙:湖南大學(xué),2011.王歡.三種銪（Ⅲ）配合物熒光探針的設(shè)計、合成及應(yīng)用[D].大連:遼寧師范大學(xué),2017.邢佩佩,張海燕,李娜,佟麗麗,徐克花,唐波.稀土配合物熒光探針在活細(xì)胞成像研究中的新進(jìn)展[J].分析科學(xué)學(xué)報,2009,25(06):721-725.王馨.新型銪配合物單線態(tài)氧熒光探針