ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)在動(dòng)物生產(chǎn)過程中的應(yīng)用

簡(jiǎn)介

隨著方法的不斷改進(jìn)、材料的不斷更新，尤其是采用基因工程方法制備包被抗原，采用針

對(duì)某一抗原表位的單克隆抗依進(jìn)行阻斷ELISA試驗(yàn)，大大提高了ELISA的特異性，由于電腦化

程度極高的EUSA檢測(cè)儀的使用，ELISA更為簡(jiǎn)便實(shí)用和標(biāo)準(zhǔn)化，從而使其成為最廣泛應(yīng)用的

檢測(cè)方法之一。被廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌和病毒等疾病的診斷。在動(dòng)物檢疫方面，ELISA在豬傳

染性胃腸炎、牛副結(jié)核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍(lán)舌病等的診斷中已為廣泛采用

的標(biāo)準(zhǔn)方法。

基本原理

ELISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的

免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體

發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成

有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此,可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏

色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過ELISA檢測(cè)儀進(jìn)行定

量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA方法成為

一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。

特性

用于標(biāo)記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反

應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn)；能商品化生產(chǎn)。如今應(yīng)用較多的有辣根過氧化物酣（HRP）、堿性磷酸釀、

葡萄糖氧化酶等,其中以HRP應(yīng)用最廣。

辣根過氧化物酶

過氧化物酶（HRP）廣泛分布于植物中，辣根中含量最高，從辣根中提取的稱辣根過氧化

物酶（HRP）,是由無色酶蛋白和深棕色的鐵口卜琳構(gòu)成的一種糖蛋白（含糖量18%）,分子量

約40000,約由300個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)為pH3-9,催化反應(yīng)的最適pH值因供氫體不同

而稍有差異，一般多在pH5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸鍍?nèi)芤?。酶蛋白和輔

基的最大吸收光譜分別為275nm和403nmo

酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275

純酶的RZ多化3.0以上最高為3.4。RZ化0.6以下的防制品為粗醐酢酶蛋白約占75%,

不能用于標(biāo)記。RZ在2.5以上者方可用于標(biāo)記。HRP的作用底物為過氧化氫，催化反應(yīng)時(shí)的

供氫體有幾種：⑴鄰苯二胺（OPD）,產(chǎn)物為橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm,

可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應(yīng)，顏色可在數(shù)小時(shí)內(nèi)不改變，是目前國(guó)內(nèi)ELISA中最

常用的一種；⑵聯(lián)大茴香胺（OD）,產(chǎn)物為橘黃色，最大吸收值在400nm,顏色較穩(wěn)定；⑶

5-氨基水楊酸（5-AS）:產(chǎn)物為深棕色，最大吸收值在449nm,部分溶解,敏感性較差；⑷

鄰聯(lián)甲苯胺（OT）產(chǎn)物為藍(lán)色,最大吸收值在630nm,部分溶解,不穩(wěn)定,不耐酸，但反應(yīng)

快，顏色明顯。

堿性磷酸酶

系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取，由多個(gè)同功酶組成。它們的底物種類很多，常用者為

硝基苯磷酸鹽，廉價(jià)無毒性。姮解產(chǎn)物呈黃色,可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在

pHlO反應(yīng)系統(tǒng)中，37℃1分鐘水解1因磷酸苯二鈉為一個(gè)單位。

標(biāo)記方法

良好的酶結(jié)合物取決于兩個(gè)條件：即高效價(jià)的抗體和高活性的酶?？贵w的活性和純度對(duì)制

備標(biāo)記抗體至關(guān)重要，因?yàn)樘禺愋悦庖叻磻?yīng)隨抗體活性和純度的增加而增強(qiáng)。在酶標(biāo)記過程中，

抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價(jià)高及抗原親和力強(qiáng)的抗體球蛋白，最好使用親和層

析提純的抗體,可提高敏感性，而且可稀釋使用，減少非特異性吸附。

酶與抗體交聯(lián)，常用戊二醛法和過碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標(biāo)記抗體的改良過

碘酸鈉法簡(jiǎn)單易行，標(biāo)記效果好，特別適用于實(shí)驗(yàn)室的小批量制備。其標(biāo)記程序?yàn)椋篧5pgHRP

溶于0.5ml蒸儲(chǔ)水中,加入新鮮配制的0.06mol/L的過碘酸鈉（NaIO4）水溶液0.5ml,混

勻置4。。水箱30分鐘，取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml,室溫放置30分鐘后加

入含5g純化抗體的水溶液1mL混勻并裝透析袋，以0。5moi/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于

4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時(shí)（或過夜）使之結(jié)合，然后吸出，加硼氧化鈉（NaBH4）溶液

（5（g/ml）0.2ml,置4<冰箱2小時(shí)，將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸鍍?nèi)芤?，?<

冰箱30分鐘后離心將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L,pH7.4PBS中，并對(duì)之透析過面4℃）,

次日離心除去不溶物，即得到酶標(biāo)抗體，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml,進(jìn)行測(cè)定后,

冷凍干燥或低溫保存。

效果測(cè)定

測(cè)定內(nèi)容包括酶和抗體活性、結(jié)合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結(jié)合率。

⑴酶與抗體的活性常用瓊脂擴(kuò)散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉淀線，經(jīng)PBS漂洗

3

1天，再以蒸儲(chǔ)水浸泡1小時(shí)，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，如果出現(xiàn)應(yīng)有的顏色反

應(yīng),再用生理鹽水浸泡,顏色仍然不褪，表示結(jié)合物既有酶的活性,也有抗體活性。良好的結(jié)

合物在顯色后瓊擴(kuò)滴度應(yīng)在1:16以上。另一個(gè)測(cè)定方法是用系列稀釋的酶標(biāo)抗體直接以ELISA

方法進(jìn)行方陣滴定，此法不僅可以測(cè)定標(biāo)記效果，還可以確定酶標(biāo)抗體的使用濃度。

⑵結(jié)合物的定量測(cè)定一般是對(duì)結(jié)合物中的酶和IgG進(jìn)行定量測(cè)定。常用紫外分光光度計(jì)

于403nm和280nm進(jìn)行測(cè)定，然后按下列公式計(jì)算：

酶量(mg/ml)=OD403x0.42

IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403x0.4)x0.94x0.62

對(duì)于過碘酸鈉氧化法制備的標(biāo)記抗體量，按下列公式計(jì)算：

IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403x0.34)x0.62

已知酶量和IgG量后,即可計(jì)算出標(biāo)記抗體的摩爾(mol)比值。

HRP/IgG摩爾匕匕值=HRP(mg/ml)/IgG(mg/ml)x4

結(jié)合物中酶總量二HRP(mg/ml)x結(jié)合物溶液量

結(jié)合物產(chǎn)率=結(jié)合物中酶總量/標(biāo)記時(shí)加入的酶量x100%

用于ELISA的結(jié)合物的酶量為400(g/ml時(shí)效果T殳，為500(g/ml時(shí)效果較好，達(dá)

4

1000(g/ml時(shí)效果最好。mol比值由于結(jié)合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作為主要參

數(shù)。一般認(rèn)為mol.比值為0.7時(shí)效果一般,1.0時(shí)效果較好，1.5-2.0時(shí)最好。酶結(jié)合率為7%

時(shí)效果一般，為9%?10%較好，達(dá)30%以上時(shí)最好。

ELISA方法的基本類型、用途及操作程序

根據(jù)ELISA所用的固相載體而區(qū)分為三大類型L是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA,

即我們通常所指的ELISA(微量板ELISA);另一類是用硝酸纖維膜為載體的ELISA,稱為斑

點(diǎn)ELISA(Dot-ELISA);再一類是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA,稱為布EUSA(C-

ELISA)。在微量板ELISA中，又根據(jù)其性質(zhì)不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾

心ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。

間接ELISA

本法主要用于檢測(cè)抗體。以鴨病毒性肝炎(DVH)抗體的ELISA為例，間接ELISA的操作

程序如下。

⑴材料

①包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液；

②DVH包被抗原、酶標(biāo)抗抗體、陰性及陽性DVH參考血清；待檢鴨血清；

③ELISA檢測(cè)儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。

⑵方法步驟

①加抗原包被T4。（:過夜，洗滌三次、拋干

②加待檢血清-37℃2小時(shí)，洗滌三次、拋干

③加醐標(biāo)抗體-37℃2小時(shí)，洗滌三次、拋干

④加底物液-37℃30分鐘，加終止液

⑤用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值，并計(jì)算出P/N比值。

（3）結(jié)果判定已知陽性血清與已知陰性血清的比值（P/N）>2.1,而且已知陽性血清的OD

值1.4;在上述條件成立的情況下，如果待檢血清與已知陰性血清的比值（P/N）>2.1,而且

待檢血清的OD值20.4,則判為陽性，否則判為陰性。

雙抗體夾心

本法主要用于檢測(cè)大分子抗原?，F(xiàn)以檢測(cè)雞傳染性法氏囊病病毒（IRDV）的雙夾心抗體

ELISA為例介紹本法的操作程序。

①加抗體包被一4。（2過夜，洗滌三次、拋干

②加待檢抗原-37℃30分鐘，洗滌三次、拋干

③加酶標(biāo)抗體-37℃30分鐘,洗滌三次、拋干

④加底物液-37℃15分鐘，加終止液

⑤用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

雙夾心EL1SA

此法與雙抗體夾心ELISA的主要區(qū)別在于：它是采用酶標(biāo)抗抗體檢查多種大分子抗原，它

不僅不必標(biāo)記每一種抗體，逐可提高試驗(yàn)的敏感性。此法的基本程序?yàn)椋?/p>

①加抗體（Ab-1）包被-4。（:過夜，洗滌三次、拋干

②加待檢抗原（Ag）-37℃60分鐘，洗滌三次、拋干

③加用非同種動(dòng)物生產(chǎn)的特異性抗體（Ab-2）-37℃60分鐘，洗滌三次、拋干

?加入酶標(biāo)抗Ab-2抗體（AB-3）-37℃60分鐘，洗滌三次、拋干

⑤加底物液-37℃20分鐘，加終止液

⑥用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

競(jìng)爭(zhēng)ELISA

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此法主要用于測(cè)定小分子抗原及半抗原，其原理類似于放射免疫測(cè)定。其基本程序?yàn)?

①抗體包被一4廠過夜，洗滌三次、拋干

②加入待檢抗原及一定量的酶標(biāo)抗原（對(duì)照孔僅加酶標(biāo)抗原）-37℃60分鐘，洗滌三

次、拋干

③加底物液-37℃20分鐘,加終止液

④用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量由酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來確定，如果待檢溶液中抗原

越多,被結(jié)合的標(biāo)記抗原的量就越少，有色產(chǎn)物就減少,這樣根據(jù)有色產(chǎn)物的變化就可求出未

知抗原的量。此法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測(cè)；其主要

不足在于每種抗原都要進(jìn)行酶標(biāo)記，而且因?yàn)榭乖慕Y(jié)構(gòu)不同，還需應(yīng)用不同的結(jié)合方法。此

外，試驗(yàn)中應(yīng)用酶標(biāo)抗原的量較多。

阻斷ELISA

本法主要用于檢測(cè)型特異性抗體。該方法現(xiàn)已成為豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬偽狂犬病

（PR）及豬胸膜肺炎（AP）的主要檢測(cè)方法。下面以AP2型抗體的阻斷ELISA檢測(cè)法為例介

紹其操作程序：

①1003AP2型工作量抗原包被一4。（：過夜，洗滌三次、拋干

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②用200口1阻斷緩沖液進(jìn)行封閉-37℃60分鐘，洗滌三次、拋干

③加工作量1:4稀釋被險(xiǎn)豬血清1003―37℃60分鐘，洗滌三次、拋干

④加100pl工作量兔抗AP2型血清-37℃30分鐘，洗滌三次、拋干

⑤加1003工作量豬抗兔IgG?HRP-37℃60分鐘，洗滌三次、拋干

⑥加100plOPD底物液-37℃20分鐘,加終匕液

⑦用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

本試驗(yàn)同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清對(duì)照、兔抗AP2型陽性對(duì)照、空白對(duì)照。

抗體捕捉ELISA

本法主要用于檢測(cè)IgM抗體。由于IgM抗體出現(xiàn)于感染早期，所以檢測(cè)出IgM,則可作

為某種疾病的早期診斷?？贵w捕捉ELISA根據(jù)所用標(biāo)記方式不同可分為標(biāo)記抗原、標(biāo)記抗體、

標(biāo)記抗抗體捕捉FLISA等幾種，其中以標(biāo)記抗原捕捉ELISA比較有代表性，該方法的主要程序

為：

①用抗u鏈（抗IgM重鏈）抗體包被一37（60分鐘后置4。（：過夜，洗滌三次、拋干

②加待檢血清-37℃2小時(shí)，洗滌三次、拋干

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③加酶標(biāo)抗原-37℃60分鐘,洗滌三次、拋干

④加底物液一37℃20分鐘,加終止液

⑤用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

斑點(diǎn)ELISA

與常規(guī)的微量板ELISA比較，Dot-ELISA具有簡(jiǎn)便、節(jié)省抗原等優(yōu)點(diǎn)，而且結(jié)果可長(zhǎng)期保

存"旦其也有不足,主要是在結(jié)果判定上比較主觀，特異性不夠高等。該方法的主要操作程序

為：

⑴載體膜的預(yù)處理及抗原包被取硝酸纖維素膜用蒸儲(chǔ)水浸泡后，稍加干燥進(jìn)行壓圈。將陰

性、陽性抗原及被檢測(cè)抗原適度稀釋后加入圈中，置37工使硝酸纖維素膜徹底干燥。每張7cm

x2.3cm的膜一般可點(diǎn)加40-53個(gè)樣品，每個(gè)壓圈可加抗原液1-20plo

（2）封閉將硝酸纖維素膜置于封閉液中，37。（：感作15-30分鐘。封閉液多采用含有正常動(dòng)

物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。

（3）加被檢血清可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量適

度稀釋的待檢血清，37＜反應(yīng)一定時(shí)間，用洗滌液洗三次，每次1-3分鐘。洗滌液T殳為一

定濃度的PBS-Tween溶液。

（4）加酶標(biāo)抗體，37（反應(yīng)一定時(shí)間后，用洗滌液洗三次。

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⑸顯色加入新鮮配制的底物液，37。（：反應(yīng)一定時(shí)間后，去掉底物液，加蒸儲(chǔ)水洗滌終止反

應(yīng)。

（6）結(jié)果判定以陽性、陰險(xiǎn)血清作為對(duì)照，膜片中央出現(xiàn)深棕紅色斑點(diǎn)者為陽性反應(yīng)，否則

為陰性反應(yīng)。

布ELISA

（C-ELISA）C-ELISA（Cloth-ELISA）是加拿大學(xué)者Blais,B.W.等于1989年建立的一

種新型免疫檢測(cè)技術(shù)。該方法是以疏水性聚脂布（HydrophobicPolyesterCloth）即滌綸布

為固相載體，這種大孑的的疏水布具有吸附樣品量大，可為免疫反應(yīng)提供較大的表面積，提

高反應(yīng)的敏感性,且容易洗滌，不需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)。其基本原理與Dot-ELISA類似，只是載

體不同。以對(duì)布氏桿菌抗原的檢測(cè)為例，C-ELISA的主要程序?yàn)椋?/p>

⑴首先把抗布氏桿菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，并經(jīng)洗滌及封閉；

⑵加被檢樣品并于室溫下感作30分鐘，然后洗5次；

⑶加酶標(biāo)記的抗布氏桿菌抗體，于室溫下感作30分鐘，然后洗滌5次；

（4）加入底物液顯色；

⑸測(cè)定0D值。

影響因素/酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)編輯

酶聯(lián)免疫(ELISA)是如今檢驗(yàn)科常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法之一，其操作簡(jiǎn)單，無須特殊設(shè)備，

使其在各級(jí)醫(yī)院都有應(yīng)用。但是，如果忽視了影響其結(jié)果的因素，難免會(huì)造成假陰性或假陽性,

因此，了解影響實(shí)驗(yàn)的因素，減少差錯(cuò)事故的發(fā)生是極其必要的。

素質(zhì)因素

實(shí)驗(yàn)室人員的素質(zhì)主要包括五個(gè)方面：思想素質(zhì)、文化素質(zhì)、技術(shù)素質(zhì)、心理素質(zhì)、身體

素質(zhì)。首先應(yīng)具備一個(gè)良好的思想素質(zhì)，因?yàn)槲覀兊姆?wù)對(duì)象是人，我們的道德水平直接關(guān)系

到人們的健康和生命安危，如果馬馬虎虎。三心二意，難免會(huì)有差錯(cuò)事故發(fā)生，我們應(yīng)該熱愛

專業(yè)，耐心細(xì)致。在工作中如標(biāo)本混淆、張冠李戴、報(bào)告單發(fā)錯(cuò)等都有可能造成嚴(yán)重后果；其

次文化素質(zhì)和技術(shù)素質(zhì)，我們要熟練掌握本專業(yè)的基本理論和基本技術(shù)，認(rèn)真學(xué)習(xí)新理論新知

識(shí)，努力提高自己的業(yè)務(wù)水平，創(chuàng)造一個(gè)能夠勝任本職工作的技術(shù)平臺(tái)。良好的心理素質(zhì)就是

要勇于面對(duì)工作生活中的挫折，在繁忙工作中，有條不紊，冷靜沉著的處理有關(guān)事務(wù)。人員素

質(zhì)問題是影響檢驗(yàn)結(jié)果的首要因素。

標(biāo)本處理因素

實(shí)驗(yàn)室人員收到標(biāo)本后應(yīng)認(rèn)真查對(duì)，對(duì)不符合要求的標(biāo)本和申請(qǐng)單要拘收，合格標(biāo)本要及

時(shí)分離血清，避