TRIZOL試劑警告：接觸皮膚或誤吞將導(dǎo)致中毒或灼傷。接觸皮膚之后立即用去垢劑和水沖洗。若感到不適，請遵醫(yī)囑（可能的話出示標(biāo)簽）。收到藥品后，在室溫下存儲。以已證明TRIZOL在常溫下可穩(wěn)定儲存12個月。說明：TRIZOL是一種從細(xì)胞和組織中提取總RNA的現(xiàn)用試劑。該試劑是一種苯酚異硫氰酸酯單相溶液，它發(fā)展自Chomczynski和Sacchi的RNA一步抽提法。在細(xì)胞破碎和溶解細(xì)胞組分時，TRIZOL可以保持細(xì)胞勻漿或抽提物中RNA的完整性。離心后加入氯仿，將溶液分為水相和有機相。RNA只留在水相中。轉(zhuǎn)移水相后，用異丙醇沉淀回收RNA。除去水相后，樣品中的DNA和蛋白質(zhì)也可以用后續(xù)沉淀方法回收。用乙醇從相界面間沉淀DNA，異丙醇從有機相回收蛋白質(zhì)。DNA的共純化可能對樣品間RNA產(chǎn)量的正常化有用。這項提取技術(shù)對人、動物、植物或細(xì)菌來源的各種量的組織（低至50-100mg，高至≥1g）和細(xì)胞（低至5×106，高至＞107）都有良好的效果。其簡單的操作方法允許同時處理大量樣品。整個過程可在1小時內(nèi)完成。用TRIZOL提出的總RNA不含蛋白質(zhì)和DNA污染，可用來做Northern電泳分析、斑點雜交、poly(A)+選擇、體外翻譯、RNA酶保護分析和分子克隆。在PCR和擴大DNA酶Ⅰ梯度分離中，建議使用一個內(nèi)含子中的兩個引物。TRIZOL簡化了各種類型的大分子及小分子RNA的分離。例如，從鼠肝分離的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色，顯示出介于7到15kb的大分子RNA條帶,（由mRNA和hnRNA組成的）兩個約5kb（28S）和2kb（18S）核糖體RNA的條帶，以及介于0.1到0.3kb（tRNA,5S）的小分子RNA的條帶。所分離的RNA稀釋于TE時A260/A280之比大于等于1.8。謹(jǐn)防RNase的污染：在提取中任何不正確的操作方法中都可能偶然引入RNase。由于其活性難以抑制，因此只能直接避免其引入。在處理RNA時需要注意以下規(guī)則。戴一次性手套。皮膚上往往沾有污染RNA的細(xì)菌或霉菌，并成為RNase的來源。訓(xùn)練良好的微生物學(xué)操作方法以避免微生物污染。使用無菌的一次性塑料實驗用品和移液槍進行RNA操作，避免公共用具的Rnase交叉污染。例如，用RNA探針的實驗室一般會用到RNaseA或T1以降低濾器背景，而任何不能丟棄的實驗用品（如移液槍）可能沾有大量的RNaseA。TRIZOL可以有效防止RnaseA污染。下游樣品的處理需要無RnaseA得玻璃或塑料器皿。玻璃器皿應(yīng)該在150℃下烘烤4小時，塑料制品應(yīng)用0.5M的NaOH浸泡10分鐘，再用水充分沖洗，最后高壓滅菌。其他注意事項：在裝2ml體積的TRIZOL時，建議用透明的一次性聚丙烯管。用于更大體積時，用玻璃管或聚丙烯管，并試驗其能否經(jīng)受1200gTRIZOL的離心力以及氯仿的腐蝕。不要使用泄露或有裂縫的管子。離心前小心地稱重平衡。離心前玻璃管需用石蠟?zāi)し忾]管口，聚丙烯管必需加蓋。RNA分離技術(shù)指南警告：使用TRIZOL時一定要戴手套和護目鏡。避免接觸皮膚或衣服。在化學(xué)通風(fēng)櫥操作，避免吸入其蒸氣。除特殊情況外，試驗操作及試劑存儲溫度都要求在15-30℃。需要但無需補充的試劑：氯仿異丙醇75%乙醇（用于焦碳酸二乙酯處理水）不含RNase水或0.5%SDS溶液（不含RNase水的配制：將水加入不含Rnase玻璃瓶，添加焦碳酸二乙酯至0.01%(v/v)，靜置過夜，高壓滅菌；SDS溶液的配制要用焦碳酸二乙酯處理的無菌水。）勻漿化組織每50-100mg組織加入1mlTRIZOL在玻璃管中用電力勻漿機勻漿化。取樣容積不能超過用于勻漿化的TRIZOL的體積的10%。單層培養(yǎng)細(xì)胞將1mlTRIZOL加入3.5cm培養(yǎng)皿，用移液槍吹打幾次，直接將細(xì)胞消化。TRIZOL的加入量取決于培養(yǎng)皿的體積（每10cm2加1ml），而非細(xì)胞數(shù)。如果加入不足會造成提取RNA被DNA污染。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞離心沉淀細(xì)胞。在TRIZOL中反復(fù)吹打使細(xì)胞消化。每5-10×106個動物、植物或酵母細(xì)胞或每LINKWord.Document.8"C:\\DocumentsandSettings\\Administrator\\桌面\\px\\Trizol-RNA抽提.doc""OLE_LINK1"\a\r1×107個細(xì)菌細(xì)胞加1ml消化劑。在加入LINKWord.Document.8"C:\\DocumentsandSettings\\Administrator\\桌面\\px\\Trizol-RNA抽提.doc""OLE_LINK2"\a\rTRIZOL之前先不要洗細(xì)胞，因為這會促進RNA的降解。如果需要破碎酵母或細(xì)菌細(xì)胞就要用到勻漿器。任選：當(dāng)處理樣品是一些含有大量蛋白、脂肪、多糖和胞外物質(zhì)的材料如肌肉、脂肪組織、植物的塊莖部分等時，還需要添加額外的分離步驟。均一化結(jié)束后，在2-8℃下以12000g離心10分鐘從勻漿中除去不容部分。該部分含有細(xì)胞膜、多糖和大分子DNA，而RNA含在上清液中。脂肪組織樣品需要將上層過剩的脂肪收集除去。每次都將清除過得勻漿液轉(zhuǎn)移到新管中，加入氯仿，按前述步驟分離固液相。2．相分離將經(jīng)過勻漿化處理的樣品在15-30℃下孵育5分鐘，使核蛋白復(fù)合體完全分離。每1mlLINKWord.Document.8"C:\\DocumentsandSettings\\Administrator\\桌面\\px\\Trizol-RNA抽提.doc""OLE_LINK2"\a\rTRIZOL加0.2ml氯仿，小心加蓋。用手劇烈震管子15秒，然后在15-30℃孵育2-3分鐘。在2-8℃下以最高12000g離心力離心15分鐘，混合物分為成下層紅色苯酚-氯仿相、相界面和上層無色水相。RNA只存在于水相。水相體積約占均一化LINKWord.Document.8"C:\\DocumentsandSettings\\Administrator\\桌面\\px\\Trizol-RNA抽提.doc""OLE_LINK2"\a\rTRIZOL試劑體積的60%。3．RNA沉淀將水相轉(zhuǎn)到新管，如果需要分離DNA或蛋白質(zhì)的話保存有機相。向水相加入異丙醇沉淀RNA，每1mlLINKWord.Document.8"C:\\DocumentsandSettings\\Administrator\\桌面\\px\\Trizol-RNA抽提.doc""OLE_LINK2"\a\rTRIZOL加0.5ml異丙醇。在15-30℃下孵化樣品10分鐘，在2-8℃下以最高12000g離心力離心10分鐘。通常不可見的RNA在離心后在管底形成膠狀沉淀。4．RNA洗滌棄去上清。用75%乙醇洗滌RNA一次，每1ml每1mlLINKWord.Document.8"C:\\DocumentsandSettings\\Administrator\\桌面\\px\\Trizol-RNA抽提.doc""OLE_LINK2"\a\rTRIZOL加1ml75%乙醇。渦旋混合樣品，并在在2-8℃下以最高7500g離心力離心5分鐘。5．再溶解RNA結(jié)束時簡單干燥RNA沉淀（空氣干燥或真空干燥5-10分鐘）。不要用真空離心的方法干燥RNA。防止RNA完全干燥非常重要，因為那樣會明顯降低RNA的溶解性。部分溶解RNA樣品使其A260/280比<1.6。加入無RNase水或0.5%的SDS溶液，用移液槍吹打幾次，在55-60℃下孵育10分鐘，溶解沉淀。（如果RNA要用于酶促反應(yīng)，就要避免加入SDS。）RNA也可以溶于100%的甲酰胺（去離子），-70℃保存。RNA分離注意事項：從少量組織（1-10mg）或細(xì)胞(102-104)樣品中分離RNA：向組織或細(xì)胞中加入800μlLINKWord.Document.8"C:\\DocumentsandSettings\\Administrator\\桌面\\px\\Trizol-RNA抽提.doc""OLE_LINK2"\a\rTRIZOL，用相同的方法加入氯仿按照相分離第二步操作。用異丙醇沉淀RNA之前，先加入5-10μg淀粉作為轉(zhuǎn)入水相的載體。為降低粘度，在加入氯仿之前現(xiàn)用26計